CN109628471B - 一种提高豆科植物根瘤形成进而促进其生长的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种提高豆科植物根瘤形成进而促进其生长的方法，属于农业生物技术领域。利用组成型过表达大豆转录因子SHORT‑ROOT(SHR)，促进大豆根皮层细胞分裂进而促进大豆根瘤形成，从而实现大豆通过根良好的氮固定和营养运输促进植大豆的生长发育。利用35S启动子组成型表达SHR，显著性促进大豆根皮层细胞的分裂，从而增加大豆根瘤的数目，促进大豆的生物固氮效率。组成型表达SHR的大豆植株生长发育显著优于对照组野生型亲本。该方法对提高大豆产量和品质具有重要意义，在未来各种作物生物技术改良中具有很大潜力。

Description

一种提高豆科植物根瘤形成进而促进其生长的方法

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种提高豆科植物根瘤形成进而促进其生长的方法。

背景技术

我们农业生产中化肥的大量使用以及石油、煤炭等大量消耗，导致整个地球元素循环系统中氮元素循环遭到严重破坏，对自然生态环境造成了重大影响。随着世界人口数量的增长，人类对农产品的需求不断增加，农业生产中化肥的大量使用成为必然，自然生态环境则会进一步恶化，因此减少化肥的使用量改善自然生态环境同时养活世界人口是人类社会面临的实际问题。通过生物固氮的方法减少化肥的使用，是自然界中植物获取氮素营养的最经济、最有效、最广泛途径。而通过基因工程创制结瘤数目多和固氮效率高的新品种来提高大豆产量和品质，从而有效减少氮肥的使用，是未来农业生物技术的重要发展方向之一。

根瘤的形成和发育直接影响豆科植物氮固定的效率。根瘤器官发生起始于皮层细胞，在大豆中，根瘤原基形成起始于外部皮层细胞， 随后是中柱鞘细胞和内皮层细胞的平周分裂。由此可见，内皮层和皮层细胞的分裂对于根瘤器官的形成至关重要。因此这在未来具有固氮功能的豆科植物生物技术改良中具有很大潜力。

发明内容

本发明的目的是针对豆科植物自身固氮效率低，影响生长发育的问题，提供一种提高豆科植物根瘤形成进而促进其生长的方法。通过基因工程技术手段，在豆科植物中组成型过表达转录因子SHR，促进大豆根皮层细胞分裂，进而促进大豆根瘤的形成和发育，从而达到促进大豆植株生长发育的效果。该方法对提高大豆产量和品质具有重要意义。

为实现上述目的，提供以下技术方案：

一种提高豆科植物根瘤形成的重要转录因子，SHORT-ROOT (SHR) (AT4G37650)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种含有上述SHR转录因子的植物表达载体。

一种含有上述SHR转录因子基因的宿主菌。

一种提高豆科植物根瘤形成进而促进其生长的方法：通过过表达转录因子SHR，促进豆科植物根瘤形成进而促进植物的生长发育。

进一步的，通过组成型过表达转录因子SHR促进豆科植物根瘤结构形成。

更进一步的，通过组成型过表达转录因子SHR促进大豆根皮层细胞分裂最终促进根瘤的形成和发育。

上述一种提高豆科植物根瘤形成进而促进其生长的方法在促进豆科植物根瘤形成，培育高产、低肥料使用植物中的应用。

本发明使用大豆SHR，但是SHR在作物中的直向同源基因功能高度保守，因此使用其他高等植物来源的SHR也涵盖在本发明中。

本发明的有益效果 ：本发明通过基因工程技术手段，在豆科植物中组成型过表达转录因子SHR，促进根皮层细胞分裂，有效促进根瘤原基形成，进而达到促进根瘤形成的效果，形成的根瘤数目显著增加，植株生物固氮作用显著增强，植株高度、叶片面积明显增加。本发明对利用生物技术培育高固氮能力的各种作物品种的具有重要意义。

附图说明

图1 组成型过表达SHR改变大豆根结构实验：A：为大豆根横茎；B：大豆根的皮层数目；WT：对照组野生型亲本大豆植株，OX：组成型过表达SHR的大豆植株。

图2表达SHR促进大豆植株生长以及根瘤数目试验结果图。A：组成型过表达SHR大豆植株高度及叶面生长发育表型图；B：野生型亲本大豆植株根瘤形成试验；C：组成型过表达SHR大豆植株根瘤形成试验；D：组成型过表达SHR的大豆植株高度测定；E：组成型过表达SHR的大豆植株叶片面积测定；F：组成型过表达SHR的大豆植株根瘤的数目测定；G：组成型过表达SHR的大豆植株固氮酶活力测定；WT：对照组野生型亲本大豆植株，OX：组成型过表达SHR大豆植株。

具体实施方式

实施例1

实例一：SHR表达体系构建

按照OMEGA公司的E.Z.N.A.® Plant RNA Kit试剂盒说明书提取大豆根部RNA。再按照TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(TRANS) 说明书将其反转录获得大豆cDNA。在大豆基因组网站（http://www.arabidopsis.org/）查找SHR的cDNA序列，设计引物：

SEQ ID NO.2 SHR(+)：5’-AAAAAGCAGGCTCCATGGATACCACGTTGTTTAGGG-3’和SEQ IDNO.3 SHR(-)：5’-AGAAAGCTGGGTCCGTCAAGGCCCTCCATGCACT-’3；以大豆cDNA为模板，以引物SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3 为引物，PCR扩增SHR的cDNA目的片段，所得目的片段大小为1431 bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。回收目的片段，通过BP反应将回收片段连接到中间载体pDNONR221上。制备大肠杆菌DH5α感受态，用热激法将连接产物转入DH5α中，在含有终浓度为100mg/L卡那霉素的LB平板上涂布均匀，放在37℃培养箱中过夜。第二天挑取单菌落，在含有终浓度为100mg/L卡那霉素LB液体培养基中，转速为200rpm，温度为37℃活化菌16小时后，提取质粒，PCR验证，阳性质粒送公司测序。将检测正确的质粒与表达载体35S:pGWB602按摩尔比3：1混合均匀，此表达载体有35S启动子元件，基因连接到此载体上，构建为由35S启动子驱动目的基因表达的组成型过表达载体。加入LR酶，放在25℃金属浴反应5小时，利用LR反应将目的片段连接到表达载体上，转化DH5α感受态，涂布在含终浓度为100mg/L壮‎观霉素的抗性平板上筛选阳性菌落，提取质粒，PCR验证，最终获得表达载体35S:pGWB602-GmSHR。

实例二：建立植物表达体系

（1）制备GV3101农杆菌感受态细胞，将35S:pGWB602-GmSHR表达载体转入GV3101农杆菌感受态细胞中，涂布于含有终浓度为100 mg/L壮‎观霉素、50 mg/L利福平和15 mg/L庆大霉素的平板筛选阳性菌落；

（2）大豆种子灭菌后，待发芽后准备转化；

（3）准备携带目的基因的农杆菌，用含有终浓度为100mg/L的壮‎观霉素、50mg/L利福平和15mg/L庆大霉素的液体LB培养基在 28℃下大批量摇菌，摇至OD₆₀₀=1.2~1.6。将农杆菌2000 r/min离心10 min，收集菌体，用5wt%的蔗糖溶液重悬农杆菌 (OD₆₀₀=0.8)，获得农杆菌悬液。

（4）以步骤（3）制备好的农杆菌悬液侵染大豆子叶；

（5） 分别在诱导愈伤培养基、诱导芽培养基以及生根培养基培养后获得再生大豆植株。

实例三：表达SHR后根结构表型验证

SHR在植物中的功能是非常保守的，在拟南芥中能够通过调控皮层细胞分裂，进而影响植株根的发育。因此，我们将SHR这个功能运用到大豆中，能够有效改变大豆根的结构。

（1）利用大豆营养液培养组成型过表达SHR的大豆幼苗，培养15 d后，测定大豆的根横茎，并拍照（图1A）。图中结果表明，过表达SHR的大豆植株相较于野生型亲本，根横茎显著增粗。

（2）根皮层结构观察试验：将培养15 d的大豆植株，取根成熟区位置，利用5 wt%的琼脂糖包埋大豆根，进一步利用震荡切片机，将根切成100 μm的薄片，在微分干涉显微镜下观察根的横向结构变化（图1B）。图中结果表明，过表达SHR的大豆植株相较于野生型亲本，根的皮层数目显著增加，从野生型亲本中的8层，增加到过表达SHR植株中的10层。

实例四：表达SHR促进大豆植株生长以及根瘤数目试验

根瘤的形成和发育直接影响豆科植物氮固定的效率。因此探究SHR能否通过其保守功能促进根瘤原基形成，进而促进根瘤的形成。

（1）利用大豆营养液培养组成型表达SHR大豆幼苗，培养15 d后，测定大豆的高度/叶面积并拍照（图2）。

（2）配置大豆根瘤菌培养液，其配方为：取10 g甘露醇，0.2 g MgSO₄.7H₂O，0.1 gNaCl，3 g酵母粉，0.25 g KH₂PO₄，0.25 g K₂HPO₄，15 g琼脂，调整PH为6.8-7，最后双蒸水定容至1L。取1 mL根瘤菌BXYD3，接种于300 mL的大豆根瘤菌培养液中，28℃，200 rpm，在震荡摇床培养4 d；收集活化的根瘤菌。收集方法为将根瘤菌分装在50 mL的离心管中，利用离心机，在4000 rpm转速下，常温离心10min，收集菌体，利用低氮营养液重悬菌体，此营养液的母液为1000倍液，所以使用该营养液时稀释1000倍使用（见表1）。将大豆幼苗根浸泡根瘤菌重悬液中2 h。然后在大豆低氮营养液中继续培养 25 d，统计根瘤的数目；并利用运用乙炔还原法结合气相色谱测定根瘤固氮酶活性（图2）。

图2结果显示，过表达大豆SHR后，植株高度、叶片面积、根瘤数目、固氮酶活力，显著高于亲本植株。表明过表达大豆SHR能够有效促进豆科植物的固氮效率，显著促进大豆的生长发育。为未来农业通过基因工程创制结瘤数目多和固氮效率高的新品种来提高农作物产量和品质，从而有效减少氮肥的使用，发展绿色农业奠定基础。

表1低氮营养液品配方

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种提高豆科植物根瘤形成进而促进其生长的方法

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1431

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggatacca cgttgtttag ggtagtgagt agtttccaac accaacacca acccgatcac 60

gatcaatccc tcaacaactc caccacaagc agcagctctc gatcctccag acaacaacaa 120

aactatccct acccacaaga agacgaagaa tgcttcaact ttttcatgga tgaagaagac 180

ctatcctcgt cttcttccaa gcactattgt ccctatcaac cccaccctcc ctccactacc 240

accatccacc actccttctc ccccactccc tgcgactttg aattctccgg caagtgggcc 300

caggacatcc tcctcgaaac cgcacgggcc gtggccgaca agaacaccac gcgcctccaa 360

caactcatgt ggatgctaaa cgagctaagc tccccctacg gcgacaccga ccagaaactg 420

gcctcgtact tcctccaagc cttcttcagc cgcatctccc aagccgggga ccgaacctac 480

cgaaccttag cttcggcctc ggagaaaaca tgctccttcg aatcgacccg caagacggtg 540

ctcaagttcc aggaggtgag tccctggaca accttcggcc acgtggcgtc caatggcgcc 600

atcttggaag ccttggaagg cgagcccaaa ctacacataa ttgacatcag caacacctat 660

tgcacccaat ggccaaccct cttcgaagcc ttggccactc gaaatgacga cactccgcac 720

ctccgtttaa cctccgtcgt caccgctgac gccaccgcgc agaaactcat gaaggaaatc 780

ggcgccagaa tggagaaatt cgccagactc atgggcgtgc cctttaaatt caacgtcgtt 840

catcacgtag gtcaactctc tgacttggat ttcagcatgt tggacattaa agaagacgag 900

gccttggcga ttaactgcgt caacaccttg cattcgatcg ccgccgttgg gaaccaccgt 960

gacgcggtga tatcttcctt gaggaggttg aaaccgagga tcgtcacgct ggtggaggag 1020

gaggctgatt tggacgtggg attggagggg tttgagtttg tgaaagggtt cgaagagtgt 1080

ttgaggtggt ttagggttta ctttgaggcg ttggacgaga gttttccgcg gacgagcaac 1140

gagaggttgt tgctggagag ggcggcgggg agggcggtgg tggacctagt ggcgtgttcg 1200

gcggcggagt cggtggagcg gagagagacg gcggcgcggt gggcgaggag gatgcatgga 1260

ggggggttaa atacggtggc gtttagcgaa gaggtttgcg atgatgtgag ggcgttgctg 1320

aggaggtata gggaggggtg ggcaatgaca cagtgctccg acgccggaat attcctgacg 1380

tggaaggagc agccggtggt gtgggccagt gcatggaggg ccttgacgta g 1431

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> SHR(+)

<400> 2

aaaaagcagg ctccatggat accacgttgt ttaggg 36

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> SHR(-)

<400> 3

agaaagctgg gtccgtcaag gccctccatg cact 34

Claims (4)

1.一种提高豆科植物根瘤形成进而促进其生长的方法，其特征在于：通过过表达转录因子SHR，促进豆科植物根瘤形成进而促进植物的生长发育，所述转录因子SHR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种提高豆科植物根瘤形成进而促进其生长的方法，其特征在于：通过组成型过表达转录因子SHR促进豆科植物根瘤结构形成。

3.如权利要求1所述方法在促进豆科植物根瘤形成中的应用。

4.如权利要求1所述方法在培育高产、低肥料使用植物中的应用。

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