CN111635955B

CN111635955B - Shr-scr在豆科植物皮层细胞命运决定和改造非豆科植物皮层细胞分裂潜能中的应用

Info

Publication number: CN111635955B
Application number: CN202010543164.4A
Authority: CN
Inventors: 王二涛; 董文涛; 朱亚云; 常会中
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2020-06-15
Filing date: 2020-06-15
Publication date: 2023-05-09
Anticipated expiration: 2040-06-15
Also published as: CN111635955A; WO2021254077A1; US20240287624A1

Abstract

本发明属于生物技术和植物学领域；涉及细胞属性改造，调节根瘤共生的方法，特别是基于SHR‑SCR构成的植物体内新机制在改造皮层细胞分裂潜能中的应用。本发明还提供了新型的用于鉴定植物的性状的途径，从而为植物的有效鉴定提供了可行的方法，为植物的育种筛选提供了有力的工具。

Description

SHR-SCR在豆科植物皮层细胞命运决定和改造非豆科植物皮层细胞分裂潜能中的应用

技术领域

本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及细胞属性改造，调节根瘤共生的方法。

技术背景

固氮共生是植物与固氮微生物之间形成的互惠互利的共生方式。根据共生菌的不同可以分为蓝细菌共生、放线根瘤菌共生和根瘤菌共生。通常所说的根瘤共生即为豆科植物与根瘤菌之间的共生。根瘤菌在植物形成的新器官――根瘤中将空气中游离态的氮气转变成含氮化合物提供给植物生长，增强豆科植物适应低氮肥土壤的能力，同时，豆科植物为根瘤菌提供合适的环境及生长所必须的碳水化合物。另外，当豆科植物死后，固定的氮素就会释放到土壤中被其他植物利用，对于肥沃土壤起到了重要的作用。根瘤共生对于维持地球上氮素的循环、植物的氮代谢至关重要。

目前中国农业种植主要依赖于外界施加氮肥。过量施用氮肥已经造成了地表、地下水污染和土壤酸化等严重的环境问题，成为破坏生态平衡的重要原因之一，严重地威胁着农业的可持续发展。如何解决这些问题，除了合理施用化肥外，一个更重要的途径是通过对根瘤共生的研究，实现非豆科植物结瘤。

近些年随着分子生物学、生物信息学等一系列学科的发展，豆科植物与根瘤菌共生的信号通路已基本建立。然而，有关细胞分裂的调控机制还知之甚少。在植物与共生菌建立共生的过程中，宿主植物皮层分裂细胞具有容纳固氮菌的能力，进行共生固氮。有趣的是，固氮菌不能侵入正在分裂的侧根原基细胞，对豆科植物而言，其根瘤组织主要源于皮层细胞的分裂。因此，皮层细胞的分裂潜能是共生能否建立的前提条件。所以，深入研究豆科植物根皮层细胞分裂潜能的遗传基础，不仅有助于深入阐明根瘤共生的分子机制，也将为非豆科植物共生固氮奠定理论基础。

因此，本领域需要对根瘤共生中细胞的分裂调控机制进行深入研究，以明确豆科植物的根瘤生长机制，提高借助基因工程技术来改造非豆科植物使其共生的可能性。

发明内容

本发明的目的在于提供改造植物根皮层细胞分裂潜能的方法，最终目的为实现非豆科植物结瘤。

在本发明的第一方面，提供一种鉴定植物的性状的方法，包括：分析植物的SCARECROW基因的启动子；若同时存在顺式作用元件AT1 Box和Enhancer，则其正常表达SCARECROW基因，其性状正常；若缺少AT1 Box和Enhancer中任一个，则其SCARECROW基因表达异常，其性状异常；其中，所述性状包括：侵染线形成，皮层细胞响应细胞分裂素的能力，皮层细胞响应根瘤菌侵染的能力，NIN介导的植物自结瘤，皮层细胞分裂或根瘤形成。

在本发明的另一方面，提供一种定向性状正常的植物的方法，包括：分析植物的SCARECROW基因的启动子；其中，若同时存在顺式作用元件AT1 Box和Enhancer，则表明其正常表达SCARECROW基因，植物性状正常；其中，所述性状包括：侵染线形成，皮层细胞响应细胞分裂素的能力，皮层细胞响应根瘤菌侵染的能力，NIN介导的植物自结瘤，皮层细胞分裂或根瘤形成。

在本发明的另一方面，提供SCARECROW基因的启动子的用途，用于鉴定植物的性状；或，用于定向筛选性状正常的植物；其中，所述性状包括：侵染线形成，皮层细胞响应细胞分裂素的能力，皮层细胞响应根瘤菌侵染的能力，NIN介导的植物自结瘤，皮层细胞分裂或根瘤形成；较佳地，根据所述SCARECROW基因的启动子中的顺式作用元件AT1 Box和Enhancer的存在情况来进行鉴定。

在一个优选例中，AT1 Box和Enhancer均存在表明皮层细胞分裂能力或皮层生物量正常；若缺失任一则表明皮层细胞分裂能力或皮层生物量异常。

在一个优选例中，所述性状正常的植物，其为形成根瘤组织或类根瘤组织(如瘤状凸起)的植物。

在一个优选例中，所述的顺式作用元件AT1 Box具有SEQ ID NO:28(AATATTTTTATT)所示的核苷酸序列或与该核苷酸序列具有80％以上(如83％，85％，90％或95％以上)序列相同性的核苷酸序列；较佳地包括选自SEQ ID NO:15～24任一所示的核苷酸序列。

所述的顺式作用元件Enhancer的序列为GANTTNC，其中N表示A、T、C或G；较佳地，其具有SEQ ID NO:5～14任一所示的核苷酸序列。

在一个优选例中，所述的植物包括选自下组：表达SCARECROW基因的植物；根瘤植物；较佳地包括豆科植物；更佳地，包括(但不限于)：蒺藜苜蓿、大豆、百脉根、豌豆、鹰嘴豆、羽扇豆、菜豆、车轴草、山麻黄；禾本科植物；较佳地包括(但不限于)：水稻、大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、高粱；和/或，十字花科植物。

在本发明的另一方面，提供一种改良豆科植物或禾本科植物的性状的方法，包括提高植物中SCARECROW和SHORT ROOT的表达或活性，或促进SCARECROW和SHORT ROOT的相互作用；其中，改良的性状包括选自下组：促进侵染线的形成，改变皮层细胞命运，提高皮层细胞响应细胞分裂素的能力，提高皮层细胞响应根瘤菌侵染的能力，促进NIN介导的植物自结瘤，促进皮层细胞分裂，促进根瘤的形成。

在一个优选例中，所述的促进、提高表示显著性的促进、提高，如促进或提高20％、40％、60％、80％、90％或更高。

在一个优选例中，所述的促进根瘤的形成为在无根瘤菌接种的条件下形成根瘤或根瘤状结构。

在一个优选例中，使得SCARECROW和/或SHORT ROOT在皮层中进行异位表达(也即，定位于皮层中进行表达；较佳地，该异位表达为异位过表达)。

在一个优选例中，使用皮层细胞特异性表达启动子或遍在表达启动子进行表达。

在一个优选例中，所述的皮层细胞特异性表达启动子包括：NRT1.3启动子(pNRT1.3)。

在一个优选例中，所述的遍在表达启动子包括：LjUBQ启动子(pLjUBQ)。

在一个优选例中，所述促进植物中SCARECROW和SHORT ROOT的相互作用为：促进SHORT ROOT与SCARECROW基因的启动子的结合。

在一个优选例中，所述提高植物中SCARECROW和SHORT ROOT的表达或活性，或促进SCARECROW和SHORT ROOT的相互作用包括：利用SCARECROW和SHORT ROOT基因或含有该基因的表达构建物或载体转入植物中；以表达增强型启动子或组织特异性启动子，提高植物中SCARECROW和SHORT ROOT基因表达效率；以增强子提高植物中SCARECROW和SHORT ROOT基因表达效率；或对于植物SCARECROW基因启动子(pSCR)中缺失顺式作用元件AT1 Box或Enhancer的，在其启动子中外源增加所缺失的元件。

在本发明的另一方面，提供一种提高植物中SCARECROW和SHORT ROOT的表达或活性，或促进SCARECROW和SHORT ROOT的相互作用的物质的应用，用于改良豆科植物或禾本科植物的性状；其中，改良的性状包括选自下组：促进侵染线的形成，改变皮层细胞命运，提高皮层细胞响应细胞分裂素的能力，提高皮层细胞响应根瘤菌侵染的能力，促进NIN介导的植物自结瘤，促进皮层细胞分裂，促进根瘤的形成。

在本发明的另一方面，提供一种筛选改良豆科植物或禾本科植物的性状的物质的方法，所述方法包括：(1)将候选物质加入到含有SHORT ROOT蛋白与SCARECROW基因的体系中，其中所述SCARECROW基因由其启动子(pSCR)驱动表达；(2)检测所述体系中，观测(1)的体系中SHORT ROOT蛋白与SCARECROW基因启动子的相互结合；若所述候选物质促进两者的结合，或促进pSCR在皮层细胞的表达，则该候选物质为改良豆科植物或禾本科植物的性状的物质；其中，改良的性状包括选自下组：促进侵染线的形成，改变皮层细胞命运，提高皮层细胞响应细胞分裂素的能力，促进NIN介导的植物自结瘤，促进皮层细胞分裂，促进根瘤的形成。

在一个优选例中，所述的皮层细胞包括：根皮层细胞或表皮层细胞。

在另一优选例中，所述SCARECROW为来自蒺藜苜蓿的SCARECROW。

在另一优选例中，所述的SCARECROW的蛋白氨基酸序列包括选自下组：

(a)如SEQ ID NO:3氨基酸序列的蛋白；

(b)将SEQ ID NO:3氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或

(c)与(a)限定的蛋白序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；

(d)(a)限定的蛋白活性片段，或其两端添加标签序列、酶切序列、报告蛋白后形成的蛋白。

在另一优选例中，所述SHORT ROOT与为来自蒺藜苜蓿的SHORT ROOT。

在另一优选例中，所述的SHORT ROOT与的蛋白氨基酸序列包括选自下组：(a’)如SEQ ID NO:4氨基酸序列的蛋白；(b’)将SEQ ID NO:4氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；(c’)与(a’)限定的蛋白序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或(d’)(a’)限定的蛋白活性片段，或其两端添加标签序列、酶切序列、报告蛋白后形成的蛋白。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、AT1 box和Enhancer决定pMtSCR在蒺藜苜蓿及拟南芥皮层细胞的表达。(A)△En(缺失Enhancer元件)，△AT1(缺失AT1元件)，△AT1△En(同时缺失Enhancer和AT1元件)均能显著降低pMtSCR在蒺藜苜蓿毛根皮层细胞的表达。(B)△En，△AT1，△AT1△En均能显著降低pMtSCR在拟南芥根皮层细胞的表达。红色为PI染色；E：内皮层；C：皮层；QC：静止中心。比例尺：20微米。

图2、SCR在豆科植物中具有保守的表达模式。(A)启动子序列分析表明在豆科植物蒺藜苜蓿、百脉根、大豆、鹰嘴豆、菜豆、羽扇豆、豌豆、三叶草以及非豆科结瘤植物糙叶山黄麻SCR的启动子上同时拥有AT1 box和Enhancer，而在非豆科植物拟南芥、水稻SCR的启动子上则至少缺失一个元件。(B)原位杂交结果表明SCR在皮层细胞表达的属性在大豆、百脉根、鹰嘴豆、豌豆和羽扇豆中保守。比例尺：20微米。

图3、皮层细胞表达的SCR对根瘤共生至关重要。(A)Mtscr-1、Mtscr-2突变体以及野生型在接种根瘤菌7天、14天、21天、28天后根瘤数目统计。(B)野生型及Mtscr-1突变体分别转化空载(EV)、pMtSCR:MtSCR、pMtSCR△En△AT1:MtSCR和pAtSCR:MtSCR的毛根接种根瘤菌21天的根瘤数目。(C)pAtSCR:MtSCR稳定转化Mtscr-1植株不能回复突变体的根瘤缺陷表型。(D)百脉根中分别转化空载和pMtNRT1.3:LjSCR-SRDX的毛根接种根瘤菌21天的根瘤数目。(n≥12)。(E)代表性图片显示百脉根毛根中转化LjSCR-SRDX显著降低根瘤的数目。白色箭头指示为根瘤。(F)大豆中分别转化空载和pMtNRT1.3:GmSCR-SRDX的毛根接种根瘤菌21天的根瘤数目。(n≥15)。(G)代表性图片显示大豆毛根中转化GmSCR-SRDX显著降低根瘤的数目。白色箭头指示为根瘤。在图(A)、(D)、(F)中，星号表示t检验有显著性差异(*P<0.05；**P<0.01；ns表示无显著性差异)；在图(B)，(C)中，不同的字母(a/b)表示样品间有显著性差异(ANOVA，Duncan多重比较；P<0.01)。箱型图中央为中值；黑点代表数据样本点；n代表独立的生物学样品数目；实验重复两次，结果一致。比例尺：1毫米(E,G)

图4、MtSCR与MtSCL23具有的一定的功能冗余。(A)Maximum likelihood进化树中SCR来源于拟南芥、水稻(Q2RB59,A2ZAX5)、玉米(NP_001168484)、蒺藜苜蓿(Medtr7g074650)、江南卷柏(85562，84762)、小立碗藓(Pp1s882_1V6.1，Pp1s85_139V6.1，Pp1s324_56V6.1)和SCR在拟南芥(AtSCL23,AtRGA1,AtSCL3,AtLAS/SCL18)以及蒺藜苜蓿中的同源蛋白(Medtr4g076020,Medtr1g069725,Medtr3g065980,Medtr7g027190,Medtr8g442410)。树枝上的数字从1000次bootstrap重复中获得，进化分析采用MEGA7。(B)野生型、Mtscr-1和Mtscr-1/Mtscl23在接种Sm1021后7天、14天、21天和28天的根瘤数目统计。(n≥19)。星号表示t检验有显著性差异(**P<0.01)；箱型图中央为中值；黑点代表数据样本点；n代表独立的生物学样品数目。

图5、MtSCR与MtSHR1/2互作。(A)酵母双杂交证明MtSCR和MtSHR1/2互作。BD，结合结构域；AD，激活结构域；SD2，缺少亮氨酸和色氨酸的SD培养基；SD4，缺少亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤的SD培养基。(B)荧光素酶互补证明MtSCR和MtSHR1/2在烟草叶片中互作。荧光信号强度如图所示；实验所用载体为JW771和JW772，分别是将Pro35S:nLUC和Pro35S:cLUC模块插入到pCAMBIA2300中衍生而来(Gou等，2011)。(C)免疫共沉淀证明MtSCR和MtSHR1/2在烟草叶片中互作。WB，Western Blot；IP，免疫沉淀；CoIP，免疫共沉淀；MtSCR-HA与MtSHR1-FLAG或MtSHR2-FLAG分别在烟草叶片中共表达。

图6、MtSHR1/2定位在中柱、内皮层、皮层及表皮层细胞中并且皮层细胞中的MtSHR参与根瘤共生。(A)pMtSHR1/2:EGFP-GUS转基因毛根GUS染色60分钟的切片图示，表明MtSHR1和MtSHR2表达在蒺藜苜蓿根的中柱。(B)GUS染色60分钟证明MtSHR1/2-GUS蛋白定位在中柱、内皮层、皮层和表皮层中。值得注意的是同样的启动子起始MtSCR-GUS和AtSHR-GUS的表达时，GUS染色只定位在中柱里(图B下左)。(C)免疫组织Cy3染色证明MtSHR1蛋白定位在中柱、内皮层、皮层和表皮层中。(D)Mtshr2突变体分别转化空载、pLjUBQ:MtSHR1-SRDX、pMtSHR1:MtSHR1-SRDX或者pMtNRT1.3:MtSHR1-SRDX的毛根接种根瘤菌21天的根瘤数目。(n≥10)。比例尺：100微米(A，B)和50微米(C)。

图7、MtSHR-MtSCR决定了皮层细胞的分裂能力。(A)野生型分别转化空载、pLjUBQ:MtSHR1-SRDX的毛根定点接种根瘤菌4天的根瘤原基数目统计。(n≥20)。(B-C)统计数据(B)及代表性切片(C)表明野生型，Mtscr-1，Mtscr-1/Mtscl23和Mtscr-1/pAtSCR:MtSCR稳定转化植株定点接种根瘤菌3天的根瘤原基。(n≥16)。(D-E)野生型，Mtscr-1，Mtscr-1/Mtscl23和Mtscr-1/pAtSCR:MtSCR稳定转化植株用10μM的6-BA处理3天后皮层细胞分裂的统计数据(D)及代表性切片(E)(n≥26)。(F-G)野生型和Mtshr2中分别转化空载、pLjUBQ:MtSHR1-SRDX的毛根用50μM的6-BA处理4天后的皮层细胞分裂统计数据(F)以及代表性图片(G)。(n≥20)。(H-J)代表性图片(H)、切片(I)和统计数据(J)表明NIN过量表达产生的自结瘤在Mtscr突变体中显著降低。在图(J)中，星号表示t检验有显著性差异(**P<0.01)；箱型图中央为中值；黑点代表数据样本点。在图(A)、(B)、(D)和(F)中，星号表示与对照相比卡方检测有显著性差异(*P<0.05；**P<0.01；ns，差异不显著)。在图(C)、(E)和(G)中，黑色箭头代表皮层细胞分裂；n代表独立的生物学样品数目。比例尺：50微米(C，E，G，I)和1毫米(H)。

图8、过量表达MtSHR1诱导蒺藜苜蓿皮层细胞分裂形成假瘤并且拟南芥和水稻中过量表达SHR促进皮层细胞分裂。(A-B)在没有根瘤菌接种的条件下，蒺藜苜蓿毛根中过量表达MtSHR1诱导根皮层细胞分裂并产生类似根瘤的结构(A)及其切片(B)。(C)MtSHR1过量表达材料与定点接种根瘤菌120小时材料中的所有差异表达基因韦恩图分析。图(C)表明MtSHR1过量表达引起的皮层细胞分裂类似于接种根瘤菌120小时的根瘤。定点接种根瘤菌120小时的RNAseq数据来源于Schiessl et al,2019。(D)皮层细胞中特异的过量表达MtSHR1诱导皮层细胞分裂。(E)10μM雌激素处理pG1090-XVE:AtSHR稳转植株24小时诱导拟南芥皮层细胞的分裂。箭头表示皮层细胞分裂。En：内皮层；Co：皮层；Ep：表皮层。(F)EV或MtSHR1-MtSCR转基因水稻根的横切片。(G)MtSHR1、MtSCR相对于内参基因Cyclophilin2的表达量。(n＝6)。星号表示与对照相比，t检验差异显著(**p<0.01)。误差线代表三次技术重复的标准差。n代表独立的生物学样品数目。黑点代表数据样本点。比例尺：1毫米(A)，100微米(B，D，F)和20微米(E)。

图9、MtSHR-MtSCR参与侵染线形成。(A)MtSHR1过量表达与定点接种根瘤菌24小时、120小时材料中部分差异基因的热图。箭头标注的基因参与侵染线形成。定点接种根瘤菌24小时，120小时的RNAseq数据来源于Schiessl et al,2019。(B)WT,Mtscr-1和Mtscr-1/Mtscl23接种LacZ-根瘤菌7天的侵染线及侵染点数目统计。(n≥12)。不同的字母(a/b)表示样品间有显著性差异(ANOVA，Duncan多重比较；P<0.05)。(C)Mtshr2突变体分别转化空载、pLjUBQ:MtSHR1-SRDX的毛根接种LacZ-根瘤菌7天的侵染线及侵染点数目统计。(n≥14)。星号表示与对照相比，t检验差异显著(**p<0.01)。

图10、共生信号激活MtSHR-MtSCR模块。(A)野生型植株接种7天的材料定量结果表明MtSCR在根瘤共生中受诱导，而MtSHR1/2不受诱导。(n＝5)。(B)MtSCR在野生型、nsp1-1、nsp2-1和nin-1突变体处理结瘤因子24小时后的相对表达量。(C)定量结果表明抑制MtSHR1/2的功能显著降低MtSCR的表达量(接种根瘤菌7天)。(D-E)GUS染色(D)及切片(E)表明MtSCR启动子及MtSHR1-GUS在根瘤原基表达，而MtSHR1的启动子在根瘤原基不表达。在图(A)，(B)和(C)中，表达量为相对于内参基因EF-1的表达量；星号表示与对照相比，t检验差异显著(*P<0.05；**p<0.01)。误差线代表三次技术重复的标准差。n代表独立的生物学样品数目。黑点代表数据样本点。比例尺：100微米。

图11、共生信号促进MtSHR蛋白在皮层细胞中的积累并进而激活MtSCR的表达。(A)免疫杂交结果显示MtSHR1-GUS(≈130KD)在接种根瘤菌3天的pMtSHR1:MtSHR1-GUS转基因野生型毛根中积累增加，而在nin-1中积累消失。(n≥10)。(B)GUS蛋白在接种根瘤菌3天的p35S:GUS转基因毛根中没有修饰和增加蛋白量的积累。(C)pMtSHR1:MtSHR1-GUS转基因毛根的GUS染色(10min)结果表明根瘤菌促进MtSHR1-GUS在皮层和表皮层细胞的积累。这些实验重复两次，结果一致。(D)染色质免疫共沉淀-PCR结果显示MtSHR1结合在MtSCR的启动子上，并且该区域与AT1 box(-1604bp to-1615bp)和增强子(-1632bp to-1638bp)不重合。GFP-3xFLAG转基因毛根为对照。(E)定量PCR结果表明MtSHR1过量表达上调MtSCR表达。(n＝5)；表达量为相对于内参基因EF-1的表达量；实验重复两次，结果一致。星号表示与对照相比，t检验差异显著(**p<0.01)。误差线代表三次技术重复的标准差。n代表独立的生物学样品数目。黑点代表数据样本点。比例尺：1毫米(管子和根尖)和100微米(切片)。

具体实施方式

本发明人通过遗传学，细胞生物学和分子生物学等方法发现，豆科植物中SHR-SCR富集于皮层细胞，在皮层中过量表达SHR-SCR引起皮层细胞分裂，在无根瘤菌接种的条件下形成根瘤状结构，诱导根瘤发育与侵染线形成相关基因表达。本发明人还发现，SHR蛋白可以移动到根皮层和表皮层细胞，控制根瘤发育中早期皮层细胞分裂，皮层细胞的SHR-SCR决定皮层细胞分裂潜能。本发明的新发现，为植物根瘤性状的改良提供了新的途径。

基因及植物

如本文所用，所述的“SCARECROW(SCR)基因”或“SCR多肽”是指来自蒺藜苜蓿的SCR基因或多肽，与蒺藜苜蓿来源的基因或多肽同源的、含有基本相同的结构域、具有基本相同的功能的基因或多肽。

如本文所用，所述的“SHORT ROOT(SHR)基因”或“SHR多肽”是指来自蒺藜苜蓿的SHR基因或多肽，与蒺藜苜蓿来源的基因或多肽同源的、含有基本相同的结构域、具有基本相同的功能的基因或多肽。

本发明中，所述的SCR多肽、SHR多肽，还包括它们的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述的多肽相同的生物学功能或活性的蛋白片段，可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白等。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。所述的SCR多肽、SHR多肽的生物活性片段都可以应用到本发明中。

在本发明中，术语“SCR多肽”指具有SCR多肽活性的SEQ ID NO:3序列的蛋白。该术语还包括具有与SCR多肽蛋白相同功能的、SEQ ID NO:3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。

在本发明中，术语“SHR多肽”指具有SHR多肽活性的SEQ ID NO:4序列的蛋白。该术语还包括具有与SHR多肽蛋白相同功能的、SEQ ID NO:4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。

本发明还包括编码所述多肽的多核苷酸(基因)，例如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸或其简并的序列，可以编码SEQ ID NO:3的SCR多肽；SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的多核苷酸或其简并的序列，可以编码SEQ ID NO:4的SHR多肽。

应理解，虽然本发明的SCR基因、SHR基因优选获自豆科植物特别是蒺藜苜蓿，但是获自其它植物的与蒺藜苜蓿SCR基因、SHR基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因或与所述基因具有简并性的基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

包含所述编码序列的载体，以及用所述的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞也包括在本发明中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含合适的表达载体。

宿主细胞通常是植物细胞。转化植物一般可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等；优选的是农杆菌法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得相对于野生型而言性状发生改变的植物。

如本文所用，所述的植物包括但不限于选自下组的植物：表达SCARECROW基因的植物；根瘤植物；禾本科植物和/或十字花科植物。

如本文所用，所述“根瘤植物”，主要指能由根瘤菌侵入、被刺激而在根部形成瘤状物的植物。所述“根瘤植物”可包括豆科根瘤植物和非豆科根瘤植物。佳地，所述的“根瘤植物”是“豆科植物”。

如本文所用，所述的“类根瘤植物”是指具有根瘤样或根瘤状结构的植物。

所述的根瘤植物较佳地包括豆科植物；更佳地，包括(但不限于)：食用类如大豆、蚕豆、豌豆、绿豆、赤豆、豇豆、菜豆、藊豆、木豆、落花生等；饲料类如苜蓿、紫云英、蚕豆、翘摇等；材用类如合欢、黄檀、皂角、格木、红豆、槐等；染料类如马棘、槐花、木蓝、苏木等；树胶等；树脂类如阿拉伯胶、木黄芪胶、柯伯胶等；纤维类如印度麻、葛藤等；油料类如大豆、落花生等。应理解，在本发明的技术方案的提示下，本领域人员易于想到变换各种豆科作物的种类而实现相同或相似的技术效果，这些变换形式也包含于本发明。

所述的禾本科植物较佳地包括(但不限于)：水稻、大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、高粱。

顺式作用元件及其应用

在对SCR基因的精细分析过程中，本发明人意外地发现，当启动子中AT1Box(简称AT1)和Enhancer(简称En)缺失时，SCR启动子在皮层细胞的表达活性显著降低或丧失活性。表明顺式元件AT1和Enhancer控制着MtSCR启动子在根皮层细胞的表达能力。

所述顺式元件在豆科植物的不同物种中，位于SCR启动子上游的位置存在不同，但是它们发挥着同样的功能，可见它们在豆科植物中应是具有高度的保守性的。

基于本发明人的这一新发现，可以以所述顺式元件为分子标记物，来进行植物的定向筛选，或鉴定植物的皮层细胞分裂能力或皮层生物量。

因此，本发明提供了一种定向筛选皮层细胞分裂能力或皮层生物量正常的植物的方法，包括：分析植物的SCARECROW基因的启动子(pSCR)；其中，若同时存在顺式作用元件AT1 Box和Enhancer，则表明其正常表达SCARECROW基因，植物的侵染线形成，皮层细胞响应细胞分裂素的能力，皮层细胞响应根瘤菌侵染的能力，NIN介导的植物自结瘤，皮层细胞分裂或根瘤形成正常。

本发明也提供了一种鉴定植物的皮层细胞分裂能力或皮层生物量(包括皮层厚度)的方法，包括：分析植物的SCARECROW基因的启动子(pSCR)；其中，若同时存在顺式作用元件AT1 Box和Enhancer，则表明其侵染线形成，皮层细胞响应细胞分裂素的能力，皮层细胞响应根瘤菌侵染的能力，NIN介导的植物自结瘤，皮层细胞分裂或根瘤形成正常；缺少AT1Box和Enhancer中任一个，则表明植物的侵染线形成，皮层细胞响应细胞分裂素的能力，皮层细胞响应根瘤菌侵染的能力，NIN介导的植物自结瘤，皮层细胞分裂或根瘤形成异常。

本发明提供了一种筛选改良豆科植物或禾本科植物的性状的物质的方法，包括：(1)将候选物质加入到含有SHR与SCR基因的体系中，其中所述SCR基因由其启动子(pSCR)驱动表达；(2)检测所述体系中，观测(1)的体系中SHR与SCR基因启动子的相互结合；若所述候选物质促进两者的结合，则该候选物质为改良豆科植物或禾本科植物的性状的物质；其中，改良的性状包括选自下组：促进侵染线的形成，提高皮层细胞响应细胞分裂素的能力，促进NIN介导的植物自结瘤，促进皮层细胞分裂，促进根瘤的形成。

以蛋白或基因或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。

经过大规模的筛选，可以获得一类特异性作用于SHR与SCR基因启动子相互结合的复合体的、调控作用的潜在物质。

上述定向筛选、鉴定可以运用本领域已知的一些技术手段。获取待测样品的DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。聚合酶链反应(PCR)技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异DNA片段的方法。本发明的方法可采用常规的PCR技术进行。

植物改良应用

基于本发明人的新发现，提供了一种改良植物的方法，所述方法包括：提高植物中SCR和SHR的表达或活性，或促进SCR和SHR的相互作用；其中，改良的性状包括选自下组：促进侵染线的形成，提高皮层细胞响应细胞分裂素的能力，提高皮层细胞响应根瘤菌侵染的能力，促进NIN介导的植物自结瘤，促进皮层细胞分裂，促进根瘤的形成。

豆科植物与根瘤菌的共生过程起始于根瘤菌对根毛的侵染，并受侵染的根毛中会形成一个被称为侵染线的特殊管状通道，根瘤菌在侵染线内扩增并进一步侵染其它细胞。本发明人研究过程中发现，一些影响侵染线的基因在过量表达植物材料中的表达量都被激活，从而意识到SHR-SCR参与侵染线形成，并通过进一步的实验和观测得以确证。在没有根瘤菌侵染的条件下，豆科植物的皮层细胞可以特异性的响应细胞分裂素(cytokinin)，分裂形成假瘤(pseudonodule)。本发明人发现，SHR-SCR决定了皮层细胞响应细胞分裂素的分裂能力。本发明的这些发现在本领域中没有在先被研究。

应理解，根据本发明提供的实验数据及调控机制后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的SCR和SHR的表达，这些方法均被包含在本发明中。

本发明中，提高植物中SCR和SHR的表达或活性，或促进SCR和SHR的相互作用的物质包括了促进剂、激动剂、激活剂。所述的“上调”、“提高”、“促进”包括了蛋白活性的“上调”、“促进”或蛋白表达的“上调”、“提高”、“促进”。任何可提高SCR和/或SHR蛋白的活性、提高SCR和/或SHR基因或其编码的蛋白的稳定性、上调SCR和/或SHR基因的表达、增加SCR和/或SHR蛋白有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调SCR和/或SHR基因或其编码的蛋白有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。

作为本发明的另一种实施方式，还提供了一种上调植物中SCR和/或SHR基因或其编码的蛋白的表达的方法，所述的方法包括：将SCR和/或SHR基因或其编码的蛋白的表达构建物或载体转入植物中。

本发明的主要优点在于：

本发明人深入研究了豆科植物中SHR-SCR在根瘤共生中皮层细胞分裂中的作用机制，发现SHR-SCR控制着根瘤共生中皮层细胞的分裂潜能，同时也为非豆科植物根皮层细胞属性改造，最终实现非豆科植物结瘤有重要应用价值。

本发明提供了新型的用于鉴定植物的性状的途径，从而为植物的有效鉴定提供了可行的方法，为植物的育种筛选提供了有力的工具。

本发明能在种植早期就能够鉴定出植物的感兴趣的性状，为植物育种工作带来极大的便利。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

I.材料和方法

1.实验材料

1.1.植物材料

根据实验要求的不同，本发明人分别选择蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)野生型Jemalong A17和R108进行相应的毛根转化。在本发明中所用到的蒺藜苜蓿Tnt1插入突变体Mtscr-1(NF11026)，Mtscr-2(NF20550)，Mtshr2(NF13823)均来自于Noble FoundationTnt1 database(http://medicago-mutant.noble.org/mutant/database.php)且均为R108背景。

MtSCL23与MtSCR功能冗余性地控制根和根瘤的发育，由此本发明人建立了Mtscr-1/Mtscl23双突变体。Mtscr-1/Mtscl23双突变的植物材料：以Mtscl23(NF9220)突变体为父本，Mtscr-1突变体为母本进行杂交获得Mtscr-1/Mtscl23双突变体。

所有材料的生长条件均为24℃，16h光照/22℃，8h黑暗。

1.2.菌株和克隆载体

克隆用大肠杆菌：DH5α，CCDB3.1；

农杆菌：Arqul(AR)；

根瘤菌：Sm1021；

入门载体：pENTR/SD/D-Topo(Invitrogen)；

载体pG1090：获自福建农林大学吴双教授。

植物表达载体：pK7WG2R从英国剑桥大学的Giles Oldroyd博士实验室获得。

pK7WG2R-pMtNRT1.3(根皮层细胞特异性表达启动子)：从英国剑桥大学的GilesOldroyd博士实验室获得。

pK7WG2R-pLjUBQ(植物遍在表达启动子)：将启动子pLjUBQ(GenBnak登录号AP009383.1中第37766～38887bp位)插入到pK7WG2R的6242/7309bp位点中获得。

pK7WG2R-pMtSHR1(中柱特异性表达的启动子)：将启动子pMtSHR1(Medtr5g015490，ATG前2939bp的启动子片段)插入到pK7WG2R的6242/7309bp位点中间获得。

pK7WG2R-pMtSHR2(中柱特异性表达的启动子)：将启动子pMtSHR2(Medtr4g097080，ATG前3161bp的启动子片段)插入到pK7WG2R的6242/7309bp位点中间获得。

pK7WG2R-pAtSCR(内皮层细胞特异性表达的启动子)：将pAtSCR启动子(At3g54220，ATG前1686bp的启动子片段)插入到pK7WG2R的6242/7309bp位点中间获得。

pG1090-XVE:AtSHR来自福建农林大学吴双教授。

水稻表达载体：将pZmUBI:SHR-TNOS连接到pYL322-d1载体上，p35S：SCR-PolyA连接到pYL322-d2载体上，然后先通过将pYL322-d1-pZmUBI:SHR-TNOS与终载体pYLTAC380H重组获得pYLTAC380H-pZmUBI:SHR-TNOS构建；然后再通过将pYL322-d2-p35S：SCR-PolyA与pYLTAC380H-pZmUBI:SHR-TNOS重组获得pYLTAC380H-pZmUBI:SHR-TNOS--p35S：SCR-PolyA(即同时过量表达SHR、SCR的构建)。

鉴定AT1 Box和Enhancer的表达载体为pBGWFS7：将pMtSCR(2899bp)或缺失AT1(ΔAT1)、缺失En(ΔEn)或者同时缺失AT1 En(ΔAT1ΔEn)先连接至中间载体pENTR/SD/D-Topo上，然后重组到pBGWFS7，该载体上带有EGFP-GUS报告基因。并在启动子后插入EGFP-GUS报告基因。其中，该pMtSCR(2899bp)启动子突变体包括：缺失AT1 Box(ΔAT1)和、Enhancer(ΔEn)和同时缺失AT1 En(ΔAT1ΔEn)。

2.实验方法

2.1.重组质粒的构建

首先利用引物MtSHR-F/MtSHR-R和KOD酶(为高保真DNA聚合酶，购自Toyobo)、以蒺藜苜蓿gDNA进行扩增，PCR产物回收后经过BamHI，EcoRI酶切连接到pENTR载体，转化大肠杆菌鉴定阳性克隆，抽提质粒DNA，经过测序验证后，获得携带有MtSHR1基因的重组质粒。

引物序列如下：

MtSHR-F：CGGGATCCTATGGATACATTGTTTAGACTTG(SEQ ID NO:25)；

MtSHR-R：CCGGAATTCCTCAAGGCCTCCATGCACTGGC(SEQ ID NO:26)。

建立MtSHR1-SRDX抑制体：利用显性抑制元件SRDX构建，将SRDX序列连接于MtSHR1基因的3’端。

SRDX序列为：5’>ctagatctggatctagaactccgtttgggtttcgcttaa>3’(SEQ ID NO:27)。

利用LR酶(购自Invitrogen)，将MtSHR1-SRDX重组到pK7WG2R-pMtNRT1.3、pK7WG2R-pMtSHR1或pK7WG2R-pLjUBQ的启动子下游。将获得的重组质粒分别转化大肠杆菌鉴定阳性克隆，抽提质粒DNA备用。

利用携带AtSCR启动子(At3g54220，ATG前1686bp的启动子片段)的pK7WG2R-pAtSCR质粒，在启动子的下游插入MtSCR CDS，获得表达MtSCR的重组质粒。

2.2.发根农杆菌转化

发根农杆菌感受态细胞的制备

1)培养基和溶液

超纯水，LB培养基，10％甘油(v/v)。

2)感受态制备

步骤1：取保存的菌种，在含相应抗生素的LB平板上划线，28℃培养24-48hrs。

步骤2：挑单克隆于3mL LB液体培养基中，28℃小摇过夜，按1:100接种至无抗LB培养基中，28℃，200rpm培养，直至OD600＝0.5～1.0。

步骤3：冰浴10min，然后4℃，2,500g离心10min。

步骤4：去除上清，先用5mL冰冷的超纯水轻悬细胞，再加入200mL冰冷的超纯水，4℃，2,500g离心10min。

步骤5：重复步骤4一次。

步骤6：去除上清，先用5mL冰冷的10％甘油轻悬细胞，再加入200mL冰冷的10％甘油，4℃，2,500g离心10min。

步骤7：重复步骤6一次。

步骤8：彻底去除上清，加入50mL 10％的甘油，重悬细胞，200μL/管分装。

步骤9：液氮速冻后存于-80℃冰箱备用。

表达载体转入发根农杆菌AR中

步骤1：将电击杯洗净、吹干备用，同时取保存的感受态，冰上融化。

步骤2：吸取0.5-1μL的质粒到感受态中，轻轻吸打混匀。

步骤3：把含有质粒的感受态溶液转移到电击杯中，1.6-1.8千伏电击。

步骤4：电击完成后迅速用600μL无抗液体LB将转化物洗出至EP管中，28℃，220rpm复苏1hrs。

步骤5：4,000rpm离心2min，吸出多余的上清，保留50μL以重悬菌体并涂在含有相应抗生素的LB板子上。

步骤6：28℃倒置培养24-48hrs，挑取单克隆进行鉴定。

获得蒺藜苜蓿转基因组合苗

a)蒺藜苜蓿种子萌发

步骤1：选取大小一致、无破损的蒺藜苜蓿种子置于2mL EP管(每管约100粒)。

步骤2：加入1mL浓硫酸，充分混匀直至大多数种皮上出现小黑点后，立即吸除浓硫酸并用清水冲洗5次。

步骤3：吸除多余的清水，每管加入1ml 10％的NaClO，颠倒混匀2-3min。

步骤4：吸除NaClO，用无菌水冲洗种子，重复5次。

步骤5：将种子平铺在1％Agar平板上，4℃避光倒置2天。

步骤6：切根转化前一天将种子放在24℃，避光倒置培养约16hrs种子即可萌发。

b)菌液准备及侵染转化

步骤1：提前将保存的Arqual进行平板划线以活化菌种。

步骤2：挑取单克隆于3mL抗性TY培养基中，30℃，220rpm过夜培养至OD₆₀₀>1.5。

步骤3：切根的前一天晚上，按1:1000接种至新的30mL抗性TY培养基中，30℃，220rpm过夜培养至OD₆₀₀＝0.6-1.0。

步骤4：4,000rpm离心10min收集菌体，然后用5mL无抗的TY重悬细胞并转移至小平皿中备用。

步骤5：取出萌发的蒺藜苜蓿种子，加入适量的无菌水以使种子保持湿润。

步骤6：用无菌的镊子将种子放在平板盖子上，切除根尖(距离子叶结大概3-5mm处)后放入含有菌液的小皿中。

步骤7：待转化的蒺藜苜蓿苗切完后，把伤口含有菌液的种子转到FP培养基上。

步骤8：培养箱中培养7-10天后，将长出来的根紧贴茎部全部切除，其中，胚根底部的膨大部分不可切掉。

步骤9：将切好的蒺藜苜蓿苗转入MFP培养基中，培养箱中培养3-4周。

c)筛选鉴定和表型统计

步骤1：上述转化苗培养3-4周后，将苗从培养基中取出并清理掉培养基。

步骤2：根据载体上的荧光标记在体视镜下切除非阳性根，然后把阳性根进行振荡切片。

振荡切片

1)3％低熔点琼脂糖

低熔点琼脂糖：0.6g

ddH₂O：20mL

注意：低熔点琼脂糖的浓度应介于2％-3％。在微波炉中加热溶解时，初次加热30sec，待其沸腾后再间隔加热，每次加热不能超过7sec，否则容易喷出。

2)包埋及切片

步骤1：选取新鲜的相对幼嫩的根切成大约3-4mm的小段，取材过程中避免牵拉、挤压和损伤组织。

步骤2：将溶解好的低琼脂糖溶液加到小容器中(如电击杯盖子)，然后用卫生纸将材料上粘附的多余的水分吸干并平放于含有低熔点琼脂糖的容器底部(对于电击杯盖，可将5条根平行排列在一起，样品之间留一点间隔即可，包埋完成后这5个材料一起进行切片)，常温待其凝固。

步骤3：凝固好的材料直接用于切片或者用保鲜膜包裹放于4℃暂时保存。切片时用的是莱卡VT1200S振荡切片机，前进速度为1mm/sec，振幅为1mm，切片厚度为50μm，如果材料比较硬则可适当增加振幅，降低前进速度，反之如果材料比较幼嫩则可适当减小振幅，增加前进速度。

步骤4：切好的片子可直接放在载玻片上观察或者放到2mL EP管中4℃暂时存放。

2.3.数据分析平台与软件

序列BLAST分析：NCBI在线分析平台。

序列Alignment分析：SerialCloner 2.6.1软件。

引物设计：Primer Premier 5.0软件。

显微观察：Zeiss Axio Scope A1。

II.实施例

实施例1、SCR保守地表达在豆科植物皮层细胞

1、MtSCR扩展表达在根皮层和表皮层细胞

发明人发现，蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)SCARECROW(MtSCR)基因，除了在蒺藜苜蓿根的静止中心和内皮层，还在根的皮层以及表皮层细胞中表达，与拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtSCR特异性表达在蒺藜苜蓿根的静止中心和内皮层截然不同(图1A～图1B)。

2、AT1和Enhancer控制MtSCR启动子在根皮层细胞的表达

发明人对MtSCR启动子(MtSCR的ATG上游2899；称为pMtSCR(2899bp))做了一系列截短实验，并结合顺式元件预测分析(http://plantpan2.itps.ncku.edu.tw/)，发现当启动子中AT1 Box(简称AT1)和Enhancer(简称En)缺失时，MtSCR启动子在蒺藜苜蓿皮层细胞的表达活性显著降低(图1A)，而在拟南芥中则完全丧失了在皮层细胞的表达(图1B)。表明顺式元件AT1和Enhancer控制着MtSCR启动子在根皮层细胞的表达能力。

3、AT1和Enhancer在豆科植物中可能具有保守的作用

发明人进一步研究发现，AT1和Enhancer在其他豆科植物及唯一的非豆科结瘤植物糙叶山黄麻SCR的启动子上也保守的邻近成对存在，而在非豆科植物如拟南芥和蒺藜苜蓿中则至少缺失一个(图2A)。对于其中的多种豆科植物进行测定，蒺藜苜蓿、百脉根、大豆、鹰嘴豆、豌豆、羽扇豆等的内皮层以及皮层中，均检测到SCR的稳定表达。

为了探究其他豆科植物中SCR是否存在于皮层细胞，发明人进行了原位杂交实验，发现在豆科植物百脉根(LjSCR)、大豆(GmSCR)、鹰嘴豆(CaSCR)豌豆(PsSCR)和羽扇豆(LaSCR)中，SCR表达在根皮层细胞中(图2B)。

豆科植物及非豆科结瘤植物糙叶山黄麻SCR的启动子上的和位置如表1。

表1*

*表中，“+”表示顺式元件位于正义链(5’→3’)；“-”表示顺式元件位于反义链(3’→5’)。

上述结果提示，SCR启动子中顺式元件AT1和Enhancer在豆科植物中保守地控制SCR在根皮层细胞的表达。

实施例2、MtSCR参与根瘤共生

1、MtSCR参与根瘤共生

本发明人获取了蒺藜苜蓿Tnt1插入突变体Mtscr-1(NF11026)，Mtscr-2(NF20550)的植物材料，在24℃、16h光照/22℃、8h黑暗的环境下生长；以野生型蒺藜苜蓿(WT)作为对照。

植物生长至3天时接种Sm1021根瘤菌。之后，分别在接种后第7天、第14天、第21天、第28天测定植物的根瘤生长。

结果如图3A所示，野生型蒺藜苜蓿能够正常产生根瘤，而蒺藜苜蓿Tnt1插入突变体Mtscr-1(NF11026)，Mtscr-2(NF20550)在接种根瘤菌后第7天产生的根瘤数非常低，在接种后第14天、第21天、第28天所产生的根瘤数也大大低于野生型。

上述结果说明，蒺藜苜蓿中MtSCR基因参与根瘤共生，其表达或活性下降将使得根瘤的产生发生缺陷。

2、蒺藜苜蓿皮层细胞中SCR参与蒺藜苜蓿根瘤共生

为了探究蒺藜苜蓿皮层细胞中的SCR是否参与根瘤共生，首先，发明人利用AtSCR启动子、MtSCR启动子及MtSCR(△En△AT1)启动子在蒺藜苜蓿皮层细胞表达活性的差异(如图1A所示)进行Mtscr-1毛根转化互补实验。发明人发现只有当用MtSCR启动子时可以恢复Mtscr-1的结瘤表型(图3B)，且同时缺失两个顺式元件后不能恢复，表明皮层细胞是否表达MtSCR是结瘤表型能否互补的关键。

为了对该结果进行验证，本发明人又通过组织培养获得了pAtSCR:MtSCR(拟南芥AtSCR启动子驱动MtSCR表达)稳定转化的互补植株，表型分析发现，其不能恢复突变体的结瘤表型(图3C)，进一步表明蒺藜苜蓿皮层细胞中SCR对蒺藜苜蓿根瘤共生至关重要。

3、豆科植物皮层细胞中SCR参与根瘤共生

发明人利用根皮层细胞特异性启动子(pMtNRT1.3)，在大豆(Glycine max，Gm)和百脉根(Lotus japonicus；Lj)中分别皮层细胞特异性显性抑制SCR的功能(pMtNRT1.3:SCR-SRDX)，发现当皮层细胞SCR功能缺陷时，大豆和百脉根的根瘤数目显著降低(图3D-G)，暗示皮层细胞中SCR参与根瘤共生在豆科植物是保守的。

4、MtSCL23与MtSCR冗余性地控制根瘤形成

本发明进化分析发现，MtSCL23与MtSCR可能存在冗余性(图4A)。发明人将Mtscl23(NF9220)与Mtscr-1进行杂交获得Mtscr-1/Mtscl23双突变体。表型分析发现Mtscr-1/Mtscl23根瘤形成严重缺陷，绝大多数Mtscr-1/Mtscl23都不能形成根瘤(图4B)，表明MtSCL23与MtSCR具有一定相互冗余性地控制根瘤形成。

实施例3、MtSHR1/2定位于蒺藜苜蓿根皮层细胞并参与根瘤共生

1、MtSHR-MtSCR相互作用

拟南芥中的研究结果表明，MtSHR-MtSCR通常作为一个复合体发挥作用。所以发明人首先发现蒺藜苜蓿基因组编码两个SHR蛋白，Medtr5g015490和Medtr4g097080，分别命名为MtSHR1和MtSHR2。

然后发明人通过常规的酵母双杂交、双分子荧光互补及免疫共沉淀进行验证，证明MtSHR1/2-MtSCR相互作用(图5A-C)。

2、MtSHR1/2定位于蒺藜苜蓿皮层及表皮层细胞

发明人发现，MtSHR1和MtSHR2启动子在蒺藜苜蓿毛根中特异性表达在根的中柱(图6A)，但是MtSHR1和MtSHR2蛋白则可以定位在蒺藜苜蓿毛根的皮层及表皮层细胞中(图6B-C)，而对应的拟南芥AtSHR蛋白及MtSCR蛋白虽然用同样的MtSHR1启动子起始表达，却只能定位在中柱(图6B)。

以上结果表明，相对于拟南芥AtSHR蛋白，蒺藜苜蓿MtSHR1和MtSHR2蛋白具有更强的移动能力，可以定位于蒺藜苜蓿根皮层及表皮层细胞。

3、皮层细胞中的MtSHR参与根瘤共生

本发明人获取了蒺藜苜蓿Tnt1插入突变体Mtshr2(NF13823)，以该植物材料为背景，在其中进一步抑制MtSHR1的功能。具体地，将MtSHR1-SRDX连接到pK7WG2R-pMtNRT1.3、pK7WG2R-pMtSHR1或pK7WG2R-pLjUBQ的启动子下游。本发明人构建了在缺失SHR2基因功能的基础上不同程度显性抑制(包括遍在抑制、根皮层特异性抑制)SHR1基因功能的蒺藜苜蓿材料，以表达空质粒(EV)的转基因蒺藜苜蓿材料作为对照。

转基因植物在蛭石中生长3天时接种Sm1021根瘤菌。之后，在接种后第21天观测植物的根瘤生长情况。

结果如图6D所示，与表达空质粒(EV)的转基因蒺藜苜蓿材料相比，在缺失SHR2基因功能的基础上皮层特异性显性抑制(pMtNRT1.3:SHR1-SRDX)SHR1基因功能的蒺藜苜蓿材料的根瘤数显著降低(图6D)。

遍在抑制SHR1(pLjUBQ:SHR1-SRDX)或根皮层特异抑制SHR1(pMtNRT1.3:SHR1-SRDX)功能均导致了根瘤数的大大降低，说明根皮层SHR基因参与根瘤的形成，对于根瘤的产生和生长发挥了重要的作用。

实施例4、MtSHR-MtSCR决定蒺藜苜蓿皮层细胞的分裂能力

1、MtSHR-MtSCR决定根瘤菌处理后蒺藜苜蓿皮层细胞的分裂能力

根皮层细胞的分裂形成根瘤原基。本实施例中，通过分析植株定点(在无菌条件下，用沾取菌液的牙签在根上轻点一下，做好标记)接种根瘤菌的根瘤原基，来分析根瘤菌处理后皮层细胞的分裂能力。

本发明人分析了蒺藜苜蓿Tnt1插入突变体Mtscr-1、Mtscr-1/Mtscl23双突变体以及以Mtscr-1为背景的pAtSCR:MtSCR稳定转化植株的根皮层细胞的分裂能力。如图7B～C，在进行根瘤菌定点接种后，野生型植株的根皮层细胞分裂能力强，而突变体Mtscr-1、Mtscr-1/Mtscl23双突变体则发生极为显著的分裂能力下降，根瘤不能正常形成。稳转pAtSCR:MtSCR后的植株的根皮层细胞分裂能力尽管与野生型植株相比也显著下降，但有一定的恢复。因此，皮层表达的SCR对于根瘤发育中根皮层细胞的分裂至关重要。

同时，本发明人分析了野生型蒺藜苜蓿分别转化空载(EV)、pLjUBQ:MtSHR1-SRDX的毛根定点接种根瘤菌4天的根瘤原基。结果如图7A，在进行根瘤菌接种后，转化空载的植株的根皮层细胞分裂能力强，而pLjUBQ启动子驱动表达MtSHR1-SRDX的显性抑制植株，则由于MtSHR1的功能受到抑制元件SRDX的抑制，其根皮层细胞分裂能力显著降低。

因此，蒺藜苜蓿MtSHR-MtSCR决定了根皮层细胞响应(根瘤菌)的分裂能力。

2、MtSHR-MtSCR决定细胞分裂素处理后蒺藜苜蓿皮层细胞的分裂能力

在没有根瘤菌侵染的条件下，豆科植物的皮层细胞可以特异性的响应细胞分裂素(cytokinin)，分裂形成假瘤(pseudonodule)。为了进一步验证MtSHR-MtSCR是控制皮层细胞的分裂潜能的决定因子，发明人对野生型、Mtscr-1、Mtscr-1/Mtscl23以及Mtscr-1/pAtSCR:MtSCR稳定互补植株处理细胞分裂素(10μM 6-BA)，并于处理后4天通过振荡切片统计皮层细胞分裂状况，结果表明与野生型相比，Mtscr-1、Mtscr-1/Mtscl23以及Mtscr-1/pAtSCR:MtSCR稳定互补植株的皮层细胞分裂比例均显著降低(图7D-E)。同时，发明人分别对EV及pLjUBQ:MtSHR1-SRDX转化的毛根处理50μM的6-BA，并于处理后4天通过振荡切片统计转基因毛根皮层细胞分裂状况，结果表明，MtSHR1-SRDX显性抑制的毛根皮层细胞的分裂比例显著降低(图7F-G)。

因此，蒺藜苜蓿MtSHR-MtSCR决定了皮层细胞响应细胞分裂素的分裂能力。

3、MtSCR参与NIN过量表达引起的自结瘤形成

NIN是根瘤共生过程中至关重要的一个转录因子(Medtr5g099060，NIN过量表达可以在无根瘤菌侵染的条件下引起根皮层细胞分裂形成瘤状凸起。在本实施例中，发明人分别在野生型和Mtscr-1中过量表达NIN，发现在Mtscr-1中NIN过量表达所产生的自结瘤的数目及比例均显著低于野生型(图7H-J)，表明MtSCR参与NIN过量表达引起的自结瘤形成。

实施例5、过量表达SHR诱导皮层细胞分裂

MtSHR-MtSCR控制蒺藜苜蓿皮层细胞分裂潜能，为了研究过量表达MtSHR-MtSCR是否可以引起蒺藜苜蓿皮层细胞分裂，本发明人用LjUBQ启动子在蒺藜苜蓿毛根(毛根转化方法Hairy root transformation)中过量表达MtSHR1。pLjUBQ:MtSHR1转基因毛根具有更多的皮层细胞，在没有根瘤菌接种的条件下，形成棒状结构的假瘤(图8A-B)。

发明人进一步收集EV和pLjUBQ:MtSHR1的转基因毛根进行RNAseq测序，通过差异基因富集分析发现过量表达MtSHR1引起7466个基因发生变化(1.5倍；p<0.05)。将这些差异基因与定点接种根瘤菌120小时根瘤组织的差异基因进行对比【定点接种根瘤菌的数据来源于(Schiessl等，2019)】，发现与定点接种根瘤菌120小时的根瘤中基因重合的比例为40％(图8C)，表明MtSHR1过量表达引起的皮层细胞分裂在转录组水平上与接种根瘤菌120小时的根瘤有很大的相似性，暗示这些细胞分裂具有根瘤的部分特征。

另外，利用根皮层细胞特异性启动子pMtNRT1.3驱动表达MtSHR时，可以诱导皮层细胞分裂(图8D)。

最后，发明人还发现SHR和SCR过量表达促进皮层细胞分裂的现象在非豆科植物拟南芥(图8E)和水稻(图8F-G)中也是保守的。

实施例6、SHR-SCR参与侵染线形成

在SHR过量表达的测序结果中，本发明人注意到一些影响侵染线的基因如FLOT4、FLOT2、EFD、GH3.1和DMI3在MtSHR1过量表达材料中的表达量都被激活(图9A，黑色箭头所示)，暗示MtSHR-MtSCR参与侵染线的形成。与这一推测一致的是，本发明人发现Mtscr-1、Mtscr-1/Mtscl23以及LjUBQ:SHR1-SRDX/Mtshr2显性抑制的根中，侵染线形成严重缺陷(图9B-C)。

综合实施例5和本实施的结果，表明MtSHR-MtSCR既参与控制皮层细胞的分裂，也参与侵染线的形成。

实施例7、共生信号激活皮层细胞中SHR-SCR

发明人发现，在野生型接种根瘤菌(Sm1021)7天的根中，MtSCR的表达量显著升高(图10A)。MtSCR表达受到结瘤因子的诱导，并且依赖共生信号组分NSP1/NSP2/NIN(图10B)。MtSHR过量表达激活MtSCR(图10D)，和AtSHR激活AtSCR的表达一致。另外发明人也发现，SHR-SRDX显性抑制植株中MtSCR的表达量显著降低(图10C)，表明MtSCR的诱导表达也依赖MtSHR。

通过对MtSCR和MtSHR1的启动子进行GUS染色分析，本发明人发现MtSCR的启动子在根瘤原基中具有很高的表达(图10D-E)，而MtSHR1的启动子则在根瘤原基中只有微弱的表达或不表达(图10D-E)。但是，pMtSHR1:MtSHR1-GUS转基因毛根的根瘤原基中有很强的GUS信号(图10D-E)，暗示MtSHR1在根瘤起始时从中柱和皮层细胞移动到根瘤原基细胞中。

发明人进一步对pMtSHR1:MtSHR1-GUS转基因毛根处理根瘤菌，并于3天后进行GUS染色切片及Western杂交检测，结果表明根瘤菌处理促进MtSHR1-GUS蛋白量的积累并且依赖于共生信号组分NIN(图11A)，但是本发明人发现根瘤菌处理并不影响GUS蛋白本身(图11B)，表明共生信号改变的是MtSHR1的蛋白积累状况。切片结果显示积累的MtSHR1-GUS蛋白主要集中在皮层和表皮层细胞(图11C)。

发明人还发现，MtSHR1可以结合在MtSCR的启动子上(图11D)，其中S1为蒺藜苜蓿SCR启动子上游的2074bp-2252bp；S2为蒺藜苜蓿SCR启动子上游的565bp-862bp。并且，MtSHR1过量表达(OE)可以激活MtSCR的表达(图11E)。

讨论

综上，本发明人通过遗传学，细胞生物学和分子生物学等方法发现，接种根瘤菌可以使MtSHR-MtSCR富集于皮层细胞及根瘤原基中(图10D-E，图11C)。在皮层中过量表达MtSHR-MtSCR引起皮层细胞分裂(图8D)，在无根瘤菌接种的条件下形成根瘤状结构(图8A-B)。过量表达MtSHR能够诱导根瘤发育与侵染线形成相关基因表达(图9A)，其中40％的变化基因与接种5天的根瘤的转录组重叠(图8C)。

蒺藜苜蓿MtSHR与MtSCR互作(图5)。尽管MtSHR与AtSHR一样只在根的中柱特异性表达(图6A)，但是MtSHR蛋白可以移动到蒺藜苜蓿根皮层和表皮层细胞(图6B)。通过皮层特异干扰MtSHR的功能，证明皮层积累的MtSHR控制根瘤发育中早期皮层细胞分裂(图6D)。发明人通过根瘤菌定点接种和细胞分裂素处理实验，证明皮层细胞的MtSHR-MtSCR决定蒺藜苜蓿皮层细胞分裂潜能(图7)。

在非豆科植物拟南芥和水稻中激活MtSHR-MtSCR模块也能分别诱导拟南芥和水稻根系皮层细胞的分裂(如图8E-G)。图8E表明在拟南芥皮层细胞中诱导表达MtSHR可以诱导根系皮层细胞分裂。图8F-G表明在水稻中过表达MtSHR-MtSCR也可以诱导根系皮层细胞分裂。以上数据表明MtSHR-MtSCR模块是根系皮层细胞活化分裂的充分必要条件，提示MtSHR-MtSCR在皮层细胞中的异位表达是豆科植物根系皮层细胞分裂潜能的决定性因素。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心

<120> SHR-SCR在豆科植物皮层细胞命运决定和改造非豆科植物皮层细胞分裂潜能中的应用

<130> 203061

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2418

<212> DNA

<213> 蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)

<400> 1

atggctgctt gtgctttgtt caatggtgct actactgatg aaaccaacaa caatagtgct 60

tcaaactcca gcaatatcag tagtgaagat ttacacactc tacacaacag caacaccaac 120

atgccacaac aacaacaacc tcattctgat agaaaagtgc ttagaaaaag aatggcttct 180

gaaatggaac ttcaacttca agtccacaac aacaacaata gattttctcg tagaaacaac 240

aacaacattt cctcattgaa ttgttcttta ccttcttcca cagaaaaagg tgttacaaca 300

acaacaacaa caacactagc cgcaggtaca aataataatg ctaataataa taactttcat 360

tataatacta ataatataaa caatagtagt catcatagta atgttgcttt gtcacgagat 420

aacgttgctg ttcaaaatta ccccactgtg accgtcacaa ccaactactc cactatgttg 480

ctaccttctt cttccaacaa tctcaacaat tcctcaacct caaactacgc tcattttcaa 540

caaccacttg ttgaggaaca aaaccatgtt cctaatattt gtggtttttc tggtttacca 600

ctttttccat ctcaaaacca acccaacaga accagcaaca gaaacagtaa cagtaacata 660

agttctgcta ctaatattgt tgatgttgtt aactcttcta caccttctat gatggacgaa 720

acatcagcta caacaaactg gattgatggt attttgaagg atcttattca tacttcaaac 780

agtgtttcta ttcctcaact tatcaacaat gttagagaga ttatatatcc ttgtaatcca 840

aaccttgctc ttgttcttga acataggtta cgtcttctta cagaaactgc tccaagtgtt 900

gttcctgaga gaaaaagaaa caacactgaa caacaaagtg tttctaatgt taatgtttta 960

cctgcttcta atgttaattc ctcagtcaaa ctcatgaacc gtgttgatga cattgttcca 1020

catttttctg attcatcaac tcttttgaat caaaatcaaa acatgtttcc taattggggt 1080

gtgccacaaa tcaataacaa caataaccct ttggttactt taccttcaca accacaatca 1140

acacaacaag atcaacatca acatcaacaa catcaagagc atcaagaaga tcttgtacct 1200

gcaacaacac caccaccacc aacttctgct gagttagcaa taacaagaaa aaagaaagag 1260

gagattaaag aacagaagaa gaaagatgaa gaaggtttac accttctaac attacttctt 1320

caatgtgcag aagcagtatc agcagagaat cttgaacaag caaataagat gttactcgaa 1380

atttcgcagc tttctacgcc tttcgggacc tcggcacaaa gagtagcagc ttatttctca 1440

gaagcaattt cagcaagact agtgagttca tgtttaggaa tctatgcaac acttccacca 1500

cacacactac ataatcaaaa agttgcttca gcttttcaag tcttcaatgg tattagtcca 1560

tttgtgaaat tctctcattt cactgctaac caagctatac aagaagcttt tgatagagaa 1620

gaaagagttc acatcataga tcttgatatc atgcaaggtt tacaatggcc tggtcttttt 1680

catatccttg cttcaagacc aggtggacct ccttatgtga gactcactgg attaggtact 1740

tccatggaaa cccttgaagc tactggtaaa cgtttgtctg attttgcatc taaacttggt 1800

cttccttttg agttctttcc tgttgctgag aaagttggaa atattgatgt tgagaagctt 1860

aatgttagta aatcagaagc tgttgctgtt cattggttgc aacattctct atatgatgtt 1920

actggttcag atacaaacac tttatggctc ttgcaaaggt tggcacctaa agtggtaaca 1980

gtagtggaac aagacttgag caatgcaggc tcattcttgg gaaggtttgt ggaagcaata 2040

cattactact cagcattatt tgattctctt ggttcaagct atggagaaga gagtgaagag 2100

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<212> PRT

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Ser Asp Arg Lys Val Leu Arg Lys Arg Met Ala Ser Glu Met Glu Leu

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Asn Ala Asn Asn Asn Asn Phe His Tyr Asn Thr Asn Asn Ile Asn Asn

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Gln Asn Tyr Pro Thr Val Thr Val Thr Thr Asn Tyr Ser Thr Met Leu

145 150 155 160

Leu Pro Ser Ser Ser Asn Asn Leu Asn Asn Ser Ser Thr Ser Asn Tyr

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Ile Cys Gly Phe Ser Gly Leu Pro Leu Phe Pro Ser Gln Asn Gln Pro

195 200 205

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210 215 220

Asn Ile Val Asp Val Val Asn Ser Ser Thr Pro Ser Met Met Asp Glu

225 230 235 240

Thr Ser Ala Thr Thr Asn Trp Ile Asp Gly Ile Leu Lys Asp Leu Ile

245 250 255

His Thr Ser Asn Ser Val Ser Ile Pro Gln Leu Ile Asn Asn Val Arg

260 265 270

Glu Ile Ile Tyr Pro Cys Asn Pro Asn Leu Ala Leu Val Leu Glu His

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Arg Leu Arg Leu Leu Thr Glu Thr Ala Pro Ser Val Val Pro Glu Arg

290 295 300

Lys Arg Asn Asn Thr Glu Gln Gln Ser Val Ser Asn Val Asn Val Leu

305 310 315 320

Pro Ala Ser Asn Val Asn Ser Ser Val Lys Leu Met Asn Arg Val Asp

325 330 335

Asp Ile Val Pro His Phe Ser Asp Ser Ser Thr Leu Leu Asn Gln Asn

340 345 350

Gln Asn Met Phe Pro Asn Trp Gly Val Pro Gln Ile Asn Asn Asn Asn

355 360 365

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Gln His Gln His Gln Gln His Gln Glu His Gln Glu Asp Leu Val Pro

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Glu Ala Ile Ser Ala Arg Leu Val Ser Ser Cys Leu Gly Ile Tyr Ala

485 490 495

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<212> DNA

<213> 顺式作用元件(cis-acting element)

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gattttc 7

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aatatttttt tt 12

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aatatatttt tt 12

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<210> 25

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 25

cgggatccta tggatacatt gtttagactt g 31

<210> 26

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 26

ccggaattcc tcaaggcctc catgcactgg c 31

<210> 27

<211> 39

<212> DNA

<213> SRDX序列(SRDX)

<400> 27

ctagatctgg atctagaact ccgtttgggt ttcgcttaa 39

<210> 28

<211> 12

<212> DNA

<213> 顺式作用元件(cis-acting element)

<400> 28

aatattttta tt 12

Claims

1.一种鉴定植物的性状的方法，包括：分析植物的SCARECROW基因的启动子；若同时存在顺式作用元件AT1 Box和Enhancer，则其正常表达SCARECROW基因，其性状正常；若缺少AT1 Box和Enhancer中任一个，则其SCARECROW基因表达异常，其性状异常；

其中，所述性状包括：侵染线形成，皮层细胞响应细胞分裂素的能力，皮层细胞响应根瘤菌侵染的能力，NIN介导的植物自结瘤，皮层细胞分裂或根瘤形成。

2. 一种定向性状正常的植物的方法，包括：分析植物的SCARECROW基因的启动子；其中，若同时存在顺式作用元件AT1 Box和Enhancer，则表明其正常表达SCARECROW基因，植物性状正常；

3.SCARECROW基因的启动子的用途，用于鉴定植物的性状；或，用于定向筛选性状正常的植物；其中，所述性状包括：侵染线形成，皮层细胞响应细胞分裂素的能力，皮层细胞响应根瘤菌侵染的能力，NIN介导的植物自结瘤，皮层细胞分裂或根瘤形成；其中，根据所述SCARECROW基因的启动子中的顺式作用元件AT1 Box和Enhancer的存在情况来进行鉴定。

4. 如权利要求1～3任一所述，其特征在于，所述性状正常的植物，其为形成根瘤组织或类根瘤组织的植物。

5. 如权利要求1～3任一所述，其特征在于，所述的顺式作用元件AT1 Box具有SEQ IDNO: 28所示的核苷酸序列或与该核苷酸序列具有80%以上序列相同性的核苷酸序列；和/或

所述的顺式作用元件Enhancer的序列为GANTTNC，其中N表示A、T、C或G。

6. 如权利要求5所述，其特征在于，所述的顺式作用元件AT1 Box包括选自SEQ ID NO:15～24任一所示的核苷酸序列；和/或

所述的顺式作用元件Enhancer具有SEQ ID NO: 5～14任一所示的核苷酸序列。

7.如权利要求1～3任一所述，其特征在于，所述的植物包括选自下组：

表达SCARECROW基因的植物；

根瘤植物，其中包括豆科植物；

禾本科植物；和/或

十字花科植物。

8.如权利要求7所述，其特征在于，所述的根瘤植物包括：蒺藜苜蓿、大豆、百脉根、豌豆、鹰嘴豆、羽扇豆、菜豆、车轴草、山麻黄；和/或

所述的禾本科植物包括：水稻、大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、高粱。

9.如权利要求1所述，其特征在于，所述的皮层细胞包括：根皮层细胞或表皮层细胞。

10. 一种改良豆科植物或禾本科植物的性状的方法，所述植物SCARECROW基因启动子中缺失顺式作用元件AT1 Box或Enhancer；所述方法包括在其启动子中外源增加所缺失的元件，提高植物中SCARECROW和SHORTROOT的表达或活性，或促进SCARECROW和SHORT ROOT的相互作用。