CN115261404B - 磷饥饿响应因子phr2在植物与丛枝菌根共生及提高磷营养中的应用 - Google Patents

磷饥饿响应因子phr2在植物与丛枝菌根共生及提高磷营养中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种磷饥饿响应因子PHR2在植物与丛枝菌根共生及提高磷营养中的应用。本发明揭示了磷饥饿响应因子PHR2在植物‑丛枝菌根共生中的应用，增加植物菌根共生率和磷元素吸收的方法，以期最终达到增加植物产量的目的。本发明还揭示了磷饥饿响应因子PHR2在植物体内的作用机制，其结合于下游靶基因的启动子的特定位置上，从而可基于此筛选藉由该作用机制发挥菌根共生或调控磷元素吸收作用的分子。

Description

磷饥饿响应因子PHR2在植物与丛枝菌根共生及提高磷营养中 的应用
技术领域
本发明属于生物技术和植物学领域，具体涉及磷饥饿响应因子PHR2在植物与丛枝菌根共生及提高磷营养中的应用。
背景技术
磷是植物生长发育必需的三大营养元素之一，是植物有机体的重要组成成分，以各种方式参与植物众多的生理生化过程，包括光合作用，呼吸作用，生物合成，膜结构，信号转导等，对于植物完成生命周期有着至关重要的作用。植物主要吸收以磷酸盐形式(PO4 3-、HPO4 2-和H2PO4 -)存在的无机磷，但是土壤中大部分的磷以有机磷以及与Fe、Al等阳离子形成难溶性盐的形式存在，降低了磷的可溶性和移动性，限制了植物对土壤磷的有效利用，使得磷元素成为限制植物生长的一个主要因素。在农业生产中，为保证作物的产量，会施加大量的含磷化肥。但是施加的磷肥大部分被固定在土壤中变成植物不可利用的有机磷，被植物直接吸收利用的只占约30％，土壤中大量的有机磷又造成了水体富营养化和有毒海藻泛滥等环境问题。
经过长期的演化，大多数植物主要通过两种途径从土壤中获取磷元素：一种是通过磷酸盐转运蛋白直接从土壤中吸收，另一种则是通过与菌根真菌建立共生关系，利用菌根真菌吸收磷元素。菌根共生是菌根真菌与大多数陆地植物，包括重要的农作物，形成的共生关系，是自然界中最古老，也是最普遍存在的一种共生关系。植物和菌根真菌都能从共生关系中获益：菌根真菌增加宿主植物对矿质营养元素的获取、水分的吸收、抗病性和抗逆性；宿主植物为菌根真菌提供碳源用于生长和繁殖。
近年来，菌根共生建立的分子机制获得重要进展，但是植物是如何平衡自身的磷吸收与丛枝菌根真菌共生这两种磷元素获取途径还是未知的。
因此，本领域需要对丛枝菌根共生中的磷元素获取调控进行深入研究，以明确植物在与丛枝菌根真菌共生时的磷元素获取途径。
发明内容
本发明的目的在于提供磷饥饿响应因子PHR2在植物与丛枝菌根共生及提高磷营养中的应用。
在本发明的第一方面，提供一种调节禾本科植物与丛枝菌根真菌共生或调节高磷对菌根共生的抑制作用的方法，所述方法包括：调节禾本科植物中磷饥饿响应因子PHR的表达或活性。
在一个优选例中，所述方法包括：上调禾本科植物中磷饥饿响应因子PHR的表达或活性，从而促进植物与丛枝菌根真菌共生，或拮抗高磷对菌根共生的抑制作用；较佳地，所述上调植物中磷饥饿响应因子PHR的表达或活性包括：将磷饥饿响应因子PHR的编码序列转入植物；或，改造PHR的下游靶标基因启动子区，增加P1BS元件(较佳地，使得启动子中存在至少1个P1BS元件，例如2、3、4、5、6个)；或，以与磷饥饿调控因子PHR相互作用的上调分子进行调控，从而提高磷饥饿调控因子PHR的表达或活性；较佳地，所述下游靶标基因包括：菌根共生特异的转录因子RAM1，菌根共生特异的转录因子WRI5A，菌根共生特异磷酸盐转运蛋白PT11或铵盐转运蛋白AMT3；1。
在另一优选例中，所述的将PHR的编码序列转入植物，可以转入植物细胞、组织或器官；较佳地如转入到根组织中。
在另一优选例中，所述的方法包括：下调禾本科植物中磷饥饿响应因子PHR的表达或活性，从而降低其与丛枝菌根真菌共生。
在另一优选例中，所述的方法包括：在植物中敲除或沉默磷饥饿调控因子PHR的编码基因，或抑制磷饥饿调控因子PHR的活性，或改造PHR的下游靶标基因启动子区，减少P1BS元件(如去除P1BS元件)；较佳地包括：以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除磷饥饿调控因子PHR的编码基因；以同源重组的方法敲除磷饥饿调控因子PHR的编码基因；以特异性干扰磷饥饿调控因子PHR编码基因表达的干扰分子来沉默；或将磷饥饿调控因子PHR进行功能丧失性突变；较佳地，所述下游靶标基因包括：菌根共生特异的转录因子RAM1，菌根共生特异的转录因子WRI5A，菌根共生特异磷酸盐转运蛋白PT11或铵盐转运蛋白AMT3；1。
在另一优选例中，所述的方法中，所述的调节禾本科植物与丛枝菌根真菌共生或调节高磷对菌根共生的抑制作用，包括促进植物对磷的高效吸收；较佳地，包括：在低磷条件下，上调PHR2，促进植物与丛枝菌根真菌共生，增加磷吸收；或，在高磷条件下，通过调节植物自身磷吸收途径及植物与丛枝菌根真菌共生，达到磷的高效吸收。
在另一优选例中，所述的低磷条件为磷供给量：0～50uM，较佳地0～20uM，如2、3、5、10、15uM。
在另一优选例中，所述的高磷条件为磷供给量：100～400uM；较佳地150～300；如180、200、250、300uM。
在另一优选例中，所述PHR来源于或所述禾本科植物包括(但不限于)：水稻、玉米、小麦、黍、粟、玉米、高粱、小米、大麦、黑麦、燕麦、二穗短柄草。
在另一优选例中，所述PHR调控下游靶标基因发挥调控作用，所述下游靶标基因包括：菌根共生特异的转录因子RAM1，菌根共生特异的转录因子WRI5A，菌根共生特异磷酸盐转运蛋白PT11或铵盐转运蛋白AMT3；1；较佳地，其通过结合于所述下游靶标基因启动子发挥调控作用；更佳地，其通过结合于所述下游靶标基因启动子的P1BS元件发挥调控作用；较佳地，所述调控作用为促进植物与丛枝菌根真菌共生，或拮抗高磷对菌根共生的抑制作用。
在另一优选例中，所述的PHR调控下游靶标基因为OsPT11，其启动子上有三个P1BS元件：-219/226bp、-515/522bp和-1203/1210bp。
在另一优选例中，所述的磷饥饿响应因子PHR是PHR1、PHR2、PHR3；较佳地，其是PHR2；更佳地，其包括：(a)SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-30或1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个、1-3个或1-2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；(c)氨基酸序列与(a)限定的氨基酸序列有50％以上(较佳地60％以上、65％以上、70％以上，75％以上，80％以上或85％以上；更佳地90％以上；更佳地95％以上；如98％以上或99％以上)相同性且具有(a)多肽功能的多肽；或(d)具有(a)多肽功能的SEQ ID NO:2的片段。
在本发明的另一方面，提供一种磷饥饿响应因子PHR或其编码基因或它们的调节剂用途，用于调节禾本科植物与丛枝菌根真菌共生或调节高磷对菌根共生的抑制作用。
在一个优选例中，所述的调节剂为上调剂，所述磷饥饿响应因子PHR或其上调剂促进植物与丛枝菌根真菌共生，或拮抗高磷对菌根共生的抑制作用；较佳地，所述上调剂包括(但不限于)：过表达所述磷饥饿调控因子PHR的表达盒或表达构建物(包括表达载体)；或，与所述磷饥饿调控因子PHR相互作用、从而提高其表达或活性的上调分子。
在另一优选例中，所述的调节剂为下调剂，其降低植物与丛枝菌根真菌共生；较佳地，所述下调剂包括(但不限于)：敲除或沉默磷饥饿调控因子PHR的编码基因的试剂，抑制磷饥饿调控因子PHR活性的试剂；较佳地，所述下调分子包括：针对所述磷饥饿调控因子PHR的编码基因的基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述试剂将磷饥饿调控因子PHR进行功能丧失性突变；或，特异性干扰磷饥饿调控因子PHR的编码基因表达的干扰分子。
在本发明的另一方面，提供一种磷饥饿响应因子PHR或其编码基因用途，用于作为鉴定禾本科植物与丛枝菌根真菌共生的分子标记。
在一个优选例中，若经检测禾本科植物组织中磷饥饿响应因子PHR表达高于一个特定值，则相对而言，所述禾本科植物与丛枝菌根真菌的共生能力强；若经检测禾本科植物组织中磷饥饿响应因子PHR表达低于一个特定值，则相对而言，所述禾本科植物与丛枝菌根真菌的共生能力弱。其中，除非另外说明，所述的“特定值”是指禾本科植物中相应磷饥饿响应因子PHR表达量的平均值。
在另一优选例中，所述高表达(或表达高)或高活性(或活性高)，是指与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的提高，如提高10％、20％、40％、60％、80％、90％或更高。
在另一优选例中，所述低表达(或表达低)或低活性(或活性低)，是指与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的降低，如降低10％、20％、40％、60％、80％、90％或更低。
在另一优选例中，所述“共生能力强”是指与同类或同种植物与所述菌的共生能力相比，有统计学意义地提高，如高10％、20％、40％、60％、80％、90％或更高。
在另一优选例中，所述“共生能力弱”是指与同类或同种植物与所述菌的共生能力相比，有统计学意义地降低，如低10％、20％、40％、60％、80％、90％或更低。
在本发明的另一方面，提供一种筛选调节禾本科植物与丛枝菌根真菌共生或调节高磷对菌根共生的抑制作用的物质(潜在物质)的方法，包括：(1)将候选物质加入到表达磷饥饿调控因子PHR的体系中；(2)检测所述体系，观测其中磷饥饿调控因子PHR的表达或活性，若其表达或活性提高(显著提高，如提高10％、20％、40％、60％、80％、90％或更高)，则表明该候选物质为可用于促进禾本科植物与丛枝菌根真菌共生，或拮抗(或逆转)高磷对菌根共生的抑制作用的物质；若其表达或活性降低(显著降低，如降低10％、20％、40％、60％、80％、90％或更低)，则表明该候选物质可用于降低禾本科植物与丛枝菌根真菌共生的物质。
在一个优选例中，所述体系中还表达PHR下游靶标基因，所述下游靶标基因包括：菌根共生特异的转录因子RAM1，菌根共生特异的转录因子WRI5A，菌根共生特异磷酸盐转运蛋白PT11或铵盐转运蛋白AMT3；1。
在另一优选例中，所述方法还包括：观测磷饥饿调控因子PHR与所述下游靶标基因的结合情况，较佳地观测其与所述下游靶标基因的启动子的结合情况，更佳地观测其与所述下游靶标基因的启动子P1BS元件的结合情况；若所述候选物质能够增强该结合，则表明其为可用于促进禾本科植物与丛枝菌根真菌共生，若所述候选物质能够减弱该结合，则表明其为可用于降低禾本科植物与丛枝菌根真菌共生的物质。
在另一优选例中，所述方法还包括：设置不添加所述候选物质的对照组，从而明确分辨测试组中所述磷饥饿调控因子PHR表达或活性与对照组的差异。
在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对所述磷饥饿调控因子PHR或其编码基因或其上游或下游蛋白或基因设计的调控分子(如上调剂、小分子化合物基因编辑构建物等。
在本发明的另一方面，提供一种鉴定受PHR2调控的菌根相关基因的方法，包括分析菌根共生相关基因的启动子；其中，若存在顺式作用元件P1BS，则表明该基因能(或潜在地能)在菌根共生中受到PHR2的直接调控。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、(A)OsPHR1/2/3在接种菌根真菌(+AM)和不接种菌根真菌(-AM)的野生型根中相对于内参基因Cyclophilin2的表达量。误差线代表三次技术重复的标准差。(B)osphr2-1和osphr2-2突变体中T-DNA和碱基“T”在OsPHR2基因组插入位点示意图。黑色实线表示内含子和5’/3’转录非翻译区，黑色方块表示外显子，OsPHR2基因组上方三角表示T-DNA插入位置，箭头表示突变体鉴定引物位置。OsPHR2基因组下方是osphr2-2突变体编辑方式，红色“T”是插入碱基，“TGA”是翻译提前终止位点。(C)PCR鉴定osphr2-1纯合突变体。(D)OsPHR2在osphr2-1和osphr2-2突变体根中相对于内参基因Cyclophilin2的表达量。误差线代表三次技术重复的标准差。星号表示与野生型相比，t检验有显著差异(*P<0.05；**P<0.01)。
图2、(A)野生型、osphr2-1和osphr2-2植株中丛枝菌根真菌侵染率。(B)野生型和osphr2-1植株中的丛枝结构大小统计。在显微镜下对osphr2-1突变体和野生型的丛枝结构拍照，用Image J测量丛枝结构的长度，通过不同大小丛枝结构所占的比例来衡量丛枝结构的发育情况。(C)接种菌根真菌六周之后的野生型、Osphr2-1和Osphr2-2植株地上部分的磷元素浓度。DW,Dry Weight。(D)图片显示野生型、osphr2-1和osphr2-2突变体中丛枝结构形态。图中黑色长方形为被墨水着色的丛枝结构。在图(A)和(C)中，星号表示与野生型相比，t检验有显著性差异(*P<0.05；**P<0.01)。
图3、(A)Western Blot检测OsPHR2-FLAG蛋白在OsPHR2 OE2植株中的表达。(B)OsPHR2在OsPHR2 OE1和OE2中相对于内参基因Cyclophilin2的表达量，误差线代表三次技术重复的标准差。(C)野生型，PHR2 OE1和OE2的丛枝菌根侵染率统计。在图(B)和(C)中，星号表示与野生型相比，t检验差异显著(*P<0.05；**P<0.01)。
图4、(A)野生型、osphr2-1和osphr1/2-1/3突变体中的菌根侵染率。不同的字母(a/b/c)表示样品间有显著性差异(ANOVA，Duncan多重比较；P<0.05)。(B)野生型、OsPHR1OE和OsPHR3 OE植株中的菌根侵染率。星号表示与野生型相比，t检验差异显著(*P<0.05)。
图5、启动子分析显示OsPHR1/2/3靶标基因的启动子上有P1BS元件。在OsRAM1、OsWRI5A、OsPT11和OsAMT3；1的启动子上分别有2、3、3和2个P1BS元件(短柱体标示为P1BS元件)。
图6、体外EMSA实验证明OsPHR2蛋白能够结合在OsRAM1(A)、OsWRI5A(B)、OsAMT3；1(C)和OsPT11(D)的启动子上。靶基因启动子上P1BS元件的前100bp和后100bp，加上P1BS元件共208bp片段作为EMSA探针，通过PCR扩增在探针的两端带上CY5标记，进行EMSA实验。没有被CY5标记的片段作为冷探针以10倍，50倍，100倍的量加入反应体系进行竞争实验。箭头表示蛋白-DNA复合物。
图7、烟草转录激活实验表明OsPHR2可以激活下游靶标基因驱动的报告基因的表达，荧光信号强度如图所示。
图8、(A)不同P1BS缺失的ProPT11:GUS构建示意图。黄绿色长方形表示2,600bp的OsPT11启动子，深绿色方块表示P1BS元件。(B)PT11-1、PT11-2、PT11-3、PT11-4和PT11-5植株根侵染菌根真菌后GUS染色的切片图示，PT11-5同时也用WGA对丛枝菌根真菌染色。虚线内的细胞为有丛枝结构的细胞。
图9、野生型(NIP)和OsPHR2 OE株系在高磷和低磷条件下的菌根侵染率统计。植株在接种丛枝菌根真菌3周后分别施加含0uM(低磷)或200uM(高磷)KH2PO4的水稻营养液，接种6周后取样统计菌根共生情况。不同的字母(a/b/c/d)表示样品间有显著性差异(ANOVA，Duncan多重比较；P<0.05)。
图10、(A)不同物种中PHR基因的进化分析。进化树在MEGA7中用最大似然法完成，bootstrap重复1000次。(B)玉米Zmphr1/2双突变体与野生型B73相比的生长表型。
具体实施方式
本发明中，经过深入分析，揭示了磷饥饿响应因子PHR2在植物-丛枝菌根共生中的应用，增加植物菌根共生率和磷元素吸收的方法，以期最终达到增加植物产量的目的。本发明人还发现了磷饥饿响应因子PHR2在植物体内的作用机制，其结合于下游靶基因的启动子的特定位置上，从而可基于此筛选藉由该作用机制发挥菌根共生或调控磷元素吸收作用的分子。
在本发明的一个方面中，提供一种提高植物丛枝菌根侵染的方法，包括增强PHR的基因表达或蛋白活性；本发明中，所述的PHR包括其同源基因。
在本发明的另一个方面中，提供一种鉴定受PHR调控的菌根相关基因的方法，包括分析菌根共生相关基因的启动子；其中，若存在顺式作用元件P1BS，则表明该基因可能在菌根共生中受到PHR2的直接调控。
本发明也提供一种促进植物磷高效吸收的方法，包括在低磷条件下过量表达PHR2提高菌根共生增加磷吸收、在高磷条件下通过协调植物自身磷吸收途径和菌根共生达到磷的高效吸收。
本发明人通过遗传学和分子生物学等方法发现，磷饥饿响应因子PHR2通过直接调控植物中菌根共生特异转录因子和营养交换相关转运蛋白的表达，正向的调控植物与丛枝菌根真菌共生。本发明人还发现，PHR的结合元件P1BS对于菌根共生相关基因受诱导表达是必需的。
术语
如本文所用，所述的磷饥饿响应因子(Phosphate starvation response；PHR)基因或多肽包括来自水稻的PHR基因或多肽，与水稻来源的基因或多肽同源的、含有基本相同的结构域、具有基本相同的功能的基因或多肽。
如本文所用，所述的“禾本科植物与丛枝菌根真菌共生”在本发明中也简称为“菌根共生”。
如本文所用，所述的“植物”包括表达PHR或其同源蛋白的植物或基因组存在PHR或其同源基因的植物。根据本领域的知识，表达PHR或其同源物(同源基因或同源蛋白)的植物，其内在存在如本发明所主张的作用机制，可以实现如本发明所主张的技术效果。所述的植物可以是单子叶植物或双子叶植物。在一些优选方式中，所述的植物为作物，较佳地为禾谷类作物，所述禾谷类作物为具有籽粒(穗粒)的作物。在一些优选方式中，所述的“禾谷类作物”可以是禾本科植物；较佳地，所述的禾本科植物包括但不限于：水稻、小麦、黍、粟、玉米、高粱、小米、大麦、黑麦、燕麦、二穗短柄草等。所述的植物也可以是豆科植物等。
如本文所用，所述的“地上部”也称为“地上部分”是指植物植株的部分组织，当植株种植于土地中或培养于培养液中时，该部分组织位于植株的地面或培养液面以上的部分。
如本文所用，所述的“地下部”也称为“地下部分”是指植物植株的部分组织，当植株种植于土地中或培养于培养液中时，该部分组织位于植株的地面或培养液面以下的部分。
如本文所用，术语“上调”、“增大”、“提高”、“增加”、“促进”、“强化”等是相互可以交换的并且在应用含义上应当意指与本文中定义的“对照植物”或“对照基因”或“对照蛋白”等对照物相比较，至少有2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选的至少15％或20％、更优选25％、30％、50％、80％、100％或更显著的提高。
如本文所用，术语“下调”、“减少”、“降低”、“抑制”、“弱化”、“阻滞”等是相互可以交换的并且在应用含义上应当意指与本文中定义的“对照植物”或“对照基因”或“对照蛋白”等对照物相比较，至少有2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选的至少15％或20％、更优选25％、30％、50％、80％、100％或更显著的下降。
关于“对照植物”，选择合适的对照植物是实验设计的例行部分，可以包括对应的野生型植物或无目的基因的相应转基因植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同或属于同一类的品种。对照植物也可以是因分离而丢失转基因植物的个体。如本文所用的对照植物不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。
如本发明所用，所述的高表达或高活性，是指与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的提高，如提高10％、20％、40％、60％、80％、90％或更高。
如本发明所用，所述的低表达或低活性，是指与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的降低，如降低10％、20％、40％、60％、80％、90％或更低。
如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体，其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。
基因及植物
本发明中，除非特别说明，所述的PHR2指具有SEQ ID NO:2序列的多肽或其编码基因，还包括具有与PHR2多肽相同功能的序列变异形式。所述的编码基因可以是gDNA或cDNA，也可以包含启动子。例如，所述的cDNA具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。所述编码基因的序列也包括与本发明所提供的序列相简并的序列。
本发明中，所述的PHR多肽，还包括它们的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述的多肽相同的生物学功能或活性的蛋白片段，可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白等。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。所述的PHR多肽的生物活性片段都可以应用到本发明中。
在本发明中，术语“PHR多肽”指具有PHR多肽活性的SEQ ID NO:2序列的蛋白。该术语还包括具有与PHR多肽蛋白相同功能的、SEQ ID NO:1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。
应理解，虽然本发明的PHR基因优选获自禾本科植物水稻，但是获自其它植物的与水稻PHR基因高度同源(如50％以上、60％以上，更特别如70％以上，80％以上，85％以上、90％以上、95％以上、甚至98％以上序列相同性)的其它基因或与所述基因具有简并性的基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。作为一种举例，所述PHR基因的同源物为小麦来源的PHR2(TaPHR2)，或者是玉米来源的Zmphr1/2，但不限于此。
包含所述编码序列的载体，以及用所述的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞也包括在本发明中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含合适的表达载体。
宿主细胞通常是植物细胞。转化植物一般可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法等；优选的是农杆菌法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得相对于野生型而言性状发生改变的植物。
顺式作用元件及其应用
在对PHR的下游靶标基因的启动子的精细分析过程中，本发明人发现PHR下游靶标基因(包括菌根特异启动子和营养交换相关转运蛋白)的启动子上的P1BS缺失时，会严重减弱该基因在菌根共生中的表达，表明P1BS元件对于菌根共生基因的诱导表达至关重要。
基于本发明人的这一发现，可以以所述顺式元件作为分子标记，来鉴定在菌根共生中PHR的下游靶标基因。
此外，可基于此筛选调节禾本科植物与丛枝菌根真菌共生或调节高磷对菌根共生的抑制作用的物质(潜在物质)，包括：(1)将候选物质加入到表达磷饥饿调控因子PHR的体系中；(2)检测所述体系，观测其中磷饥饿调控因子PHR的表达或活性，若其表达或活性提高，则表明该候选物质为可用于促进禾本科植物与丛枝菌根真菌共生，或拮抗(或逆转)高磷对菌根共生的抑制作用的物质；若其表达或活性降低，则表明该候选物质可用于降低禾本科植物与丛枝菌根真菌共生的物质。
在优选的实施方式中，所述体系中还表达PHR下游靶标基因，所述下游靶标基因包括：菌根共生特异的转录因子RAM1，菌根共生特异的转录因子WRI5A，菌根共生特异磷酸盐转运蛋白PT11或铵盐转运蛋白AMT3；1；所述方法还包括：观测磷饥饿调控因子PHR与所述下游靶标基因的结合情况，较佳地观测其与所述下游靶标基因的启动子的结合情况，更佳地观测其与所述下游靶标基因的启动子P1BS元件的结合情况；若所述候选物质能够增强该结合，则表明其为可用于促进禾本科植物与丛枝菌根真菌共生，若所述候选物质能够减弱该结合，则表明其为可用于降低禾本科植物与丛枝菌根真菌共生的物质。
上述方法，有利于本领域人员进一步获得一些有应用价值的调节禾本科植物与丛枝菌根真菌共生的调节分子。
以蛋白或基因或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。
植物改良应用
基于本发明人的新发现，提供一种提高植物磷元素吸收的方法，所述方法包括：提高植物中PHR的表达或活性。其中，改良的形状包括选自下组：增加菌根共生基因的表达、提高丛枝菌根共生率。
植物与丛枝菌根共生过程在转录水平受到严格的调控，植物中许多的转录因子参与其中，包括菌根特异的转录因子RAM1和WRI5A，分别参与调控菌根共生中的脂肪酸合成和营养交换。菌根共生特异诱导的磷酸盐转运蛋白PT11和铵盐转运蛋白AMT3；1在菌根共生营养交换发挥了重要作用。本发明人在研究过程中发现，在RAM1、WRI5A、PT11和AMT3；1的启动子上有P1BS元件的存在，进而通过进一步的实验表明PHR2确实参与调控RAM1、WRI5A、PT11和AMT3；1的表达。本发明的这些发现在本领域先前的研究中没有报道。
应理解，根据本发明提供的实验数据及调控机制后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节PHR或调节其下游靶基因RAM1、WRI5A、PT11和AMT3；1的表达，这些方法均被包含在本发明中。
本发明中，提高植物中PHR的表达或活性物质包括了促进剂、激动剂、激活剂。所述的“上调”、“提高”、“促进”包括了蛋白活性的“上调”、“促进”或蛋白表达的“上调”、“提高”、“促进”。任何可提高PHR蛋白的活性、提高PHR基因或其编码的蛋白的稳定性、上调PHR基因的表达、增加PHR蛋白有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于PHR基因或其编码的蛋白有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。
作为本发明的另一种实施方式，还提供了一种上调植物中PHR基因或其编码的蛋白的表达的方法，所述的方法包括：将PHR基因或其编码的蛋白的表达构建物或载体转入植物中。
在另外的一些调控方式中，也包括进行PHR的表达或活性的下调。本发明中，所述的PHR蛋白或其编码基因的下调剂是指任何可降低PHR的活性、降低PHR或其编码基因的稳定性、下调PHR蛋白的表达、减少PHR蛋白有效作用时间、抑制PHR基因的转录和翻译的物质、或降低蛋白的磷酸化/激活水平，这些物质均可用于本发明，作为对于下调PHR蛋白有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。例如，所述的下调剂是：特异性干扰PHR蛋白或其它信号通路基因表达的干扰RNA分子或反义核苷酸；或是特异性编辑PHR基因的基因编辑试剂，等等。
作为本发明的一种优选方式，提供一种下调植物中PHR蛋白的方法，包括对PHR蛋白进行靶向性地突变、基因编辑或基因重组，从而实现下调。作为一种更为具体的实施例方式，藉由上述任一的方法，使PHR蛋白转变为其突变体，从而使其不再发挥作用。作为一种更为具体的实施例方式，采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑。合适的sgRNA靶位点，会带来更高的基因编辑效率，所以在着手进行基因编辑前，可以设计并找到合适的靶位点。在设计特异性靶位点后，还需要进行体外细胞活性筛选，以获得有效的靶位点用于后续实验。本发明的实施例中提供了优选的基因编辑试剂。
本发明的主要优点在于：
本发明人深入研究了PHR在丛枝菌根共生中的作用机制，发现植物磷饥饿响应关键转录因子通过直接调控菌根共生相关基因包括转录因子的表达来直接调控菌根共生，对于植物磷高效吸收有非常重要的参考意义。
本发明人提供了一种增加植物-丛枝菌根共生的方法，为提高植物磷元素的吸收提供了可行的方法，为植物育种筛选提供了有力的工具。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
I.材料和方法
1.实验材料
1.1.植物材料
本发明中用到的作为对照的水稻野生型均为日本晴(oryza sativassp.Japonica cv.Nipponbare)。本发明中所用到的突变体osphr2-1为日本晴背景的T-DNA插入突变体，突变体osphr2-2和oswri5a/b是通过CRISPR/CAS9基因编辑系统在日本晴中对OsPHR2和OsWRI5A、OsWRI5B的基因组DNA进行编辑。
本发明中所用烟草为本氏烟(Nicotiana benthamiana)。
1.2.菌株和克隆载体
构建载体用大肠杆菌(Escherichia coli)：DH5α，CCDB3.1。
农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)：GV3101，EHA105。
入门载体：pCR-Blunt、pDONR207和pENTR。
CRISPR/CAS9基因载体：将OsPHR2的靶序列CAGTCCAGTACCGGGTCTGTTGG合成并连接到中间载体pOs-sgRNA，通过LR重组反应将proOsU3-OsPHR2靶序列-gRNA表达盒连到载体pH-Ubi-cas9-7上。其中proOsU3是OsU3(X79685.1)的启动子。
pCAMBIA1301-OsPHR2：将OsPHR2的编码区(LOC_Os07g25710)插入到pCAMBIA1301载体多克隆位点中获得。
pCAMBIA1300-pOsPT11-GUS:将OsPT11启动子(LOC_Os01g46860，ATG前2600bp)插入到改造后(在多克隆位点BamHI和EcorI中间插入了编码GUS的基因序列)的pCAMBIA1301载体的多克隆位点中获得。
pMAL-C2x-OsPHR2：将OsPHR2的编码区(LOC_Os07g25710)插入到pMAL-C2x载体的多克隆位点中获得。
烟草转录激活载体：将OsRAM1(LOC_Os11g31100)、WRI5A(LOC_Os06g05340)、OsPT11(LOC_Os01g46860)和OsAMT3；1(LOC_Os01g65000)的启动子插入到荧光素酶报告基因载体pLL00R的多克隆位点中获得。
2.实验方法
2.1农杆菌介导的水稻转化
首先准备水稻幼胚愈伤组织，之后制备农杆菌感受态及转化。进行农杆菌(工程菌)培养后，进行感菌和共培养。获得共培养后的愈伤组织，进行抗性筛选。之后，进行抗性愈伤组织的诱导分化和生根。以上操作步骤皆在无菌条件下进行。
2.2接种丛枝菌根真菌及不同浓度磷处理
将取出颖壳的水稻种子用75％的乙醇表面消毒1min，再用次氯酸钠溶液(次氯酸钠：水＝1:2.5)表面消毒30min，最后用灭菌的ddH2O次五次。将表面消毒后的种子放在装有固体1/2MS培养基的玻璃管中，在培养箱中发芽生长2周，培养箱的条件为12小时光照/12小时黑暗，28℃/22℃，70％湿度。
将含有丛枝菌根真菌孢子的沙子与蛭石按照1:4的比例混匀，装在5×10的黑色穴盘中。将生长两周的水稻苗移入穴盘中，放在人工气候室培养。在水稻苗接种丛枝菌根真菌的前两周，每天浇少量的自来水。第三周开始，浇营养液(见附录表2)，每两天浇一次。6周后挖苗，染根，统计侵染率。
对于磷酸盐处理的，在营养液中加入0uM，100uM和200uM的KH2PO4，在接种后第三周开始浇营养液，6周后取样，检测菌根侵染情况。
2.3菌根染色及统计
(1)取与丛枝菌根真菌共培养的水稻根，洗净擦干，置于底部有孔的2ml EP管中。
(2)10％KOH和墨水染液(100ml中加5ml的墨水，5ml的冰醋酸和90ml的水)分别倒入染色盒中，在95℃预热。
(3)将水稻根置于10％KOH中12min，取出。
(4)用水冲洗三次。
(5)置于墨水染液中6min，取出，置于72孔的蓝色盒子里，脱色，勤换水。
(6)在体式显微镜下观察统计。
将用墨水染色的根放在带有格子(0.5cm×0.5cm)的培养皿中，置于体式显微镜下统计。
将墨水染过的水稻根在显微镜下观察并在同一个倍数下对丛枝结构拍照，将在显微镜下拍照的丛枝结构放在软件MacBiophotonics ImageJ中测量丛枝结构的长度，根据图片上比例尺的大小换算为丛枝结构的长度，然后对落在每一个长度去见的丛枝结构进行统计，做图。
2.4凝胶迁移实验(EMSA)
a.所需试剂：
5XTBE溶液(1L)：Tris：54g，硼酸：27.5g，Na2EDTA.2H2O：3.72g，配好后PH自动为8.3。
5×EMSA buffer：Tris-HCl(PH8.0):100mM，甘油：25％，BSA:0.2mg/ml；配好后过滤除菌，冻存在-20℃备用。
b.实验步骤
(1)制备探针：设计引物，在正向引物和反向引物的前面加上通用接头：CY5-AGCCAGTGGCGATAAG。合成引物后将探针片段从模板上扩增，回收后的片段1用5’端用CY5标记的通用引物CY5-AGCCAGTGGCGATAAG进行二次扩增，回收，得到片段2(因为CY5见光分解，所以在制备荧光探针尽量避光操作)。将片段1和片段2测量浓度，然后稀释到0.08pmol的浓度。没有被CY5标记的片段1即为冷探针，用于竞争实验，用CY5标记的片段2即为探针。
(2)制备非变性PAGE胶：制胶前必须把制胶所用的模具冲洗干净，保证没有SDS残留，制备4％的胶。制备一块4％的非变性PAGE胶需要700uL的5XTBE溶液，700uL 40％丙烯酰胺(29：1)，350uL的50％的甘油，7uL的四甲基乙二胺(TEMED)，5.3ml的ddH2O，35uL的10％过硫酸铵(AP)。凝胶一到两小时。
(3)准备反应体系
先配制5×结合缓冲液，体系如下：试剂(80uL中加入的量)：5×EMSA buffer：70.8uL，1M MgCl2：4uL，0.5M DTT：0.8uL，H2O：4.4uL；
然后根据下表配制20uL的反应体系：
5×binding buffer：4uL
0.1M KCl：3uL
鲑鱼精DNA(50ng/uL)：0.2uL
纯化的蛋白：1uL(约50ng)
Cy5标记的探针：1uL
H2O：10.8uL
(4)在准备好反应体系后，在室温反应30min。
(5)在蛋白-探针反应的半小时中，进行预电泳：使用干净点的电泳槽(没有SDS残留)进行预电泳。等非变性胶完全凝固后，放入电泳槽中(电泳槽放在冰水混合物中)，加入提前充分预冷好的1XTBE，小心拔去梳子，在冰上120V预电泳半小时。
(6)电泳：反应结束后，每管加入2.3uL 10×loading buffer(250mM Tris-HCl[PH7.5]，40％甘油，0.2％溴酚蓝)，用枪轻轻地吹吸几次混匀。停止预电泳。将12uL的样品加入到孔中，在冰上避光120V电泳90min，停止电泳。
(7)扫胶：将跑好的PAGE胶用FUJIFILM FLA 9000plus DAGE扫胶，选择CY5通道扫描信号，保存图片。
2.5烟草蛋白瞬时表达
a.所需试剂
注射缓冲液：MgCl2：10mM，乙磺酸溶液(pH 5.6)：10mM，乙酰丁香酮：150uM。
b.实验步骤
(1)将保存在-80℃的转化的GV3101菌在相应抗性的平板上划线以活化菌种，28℃培养。
(2)从培养好的平板上提取单克隆于8ml对应抗性LB培养基中，28℃，200rpm过夜摇菌。
(3)离心，8000rpm 8min，弃上清。
(4)用注射缓冲液洗涤菌体两次，然后用注射缓冲液将所有的菌重悬菌体至OD600为1.0。
(5)按照试验要求把相应组合的菌液以及P19等体积混合(1:1:1)，颠倒混匀后于28℃静置2小时。
(6)从生长良好的烟草中挑取完全伸展的叶片，用1ml无针头的注射器将菌液从叶片背面注射到叶片组织中，做好标记以区分不同的组合。
(7)剪取注射48小时后的烟草叶片，在叶片正面均匀涂抹荧光素酶底物，然后用冷的CCD相机黑暗中收集荧光信号5min。
2.6GUS染色
(1)剪取新鲜的植物组织于10ml离心管中，加入GUS染液没过植物组织。
(2)抽真空，20min。
(3)置于37℃，避光，每隔一小时观察染色情况。
(4)倒掉GUS染液，加入50％的乙醇终止染色。
(5)在显微镜下拍照。
II.实施例
实施例1、OsPHR1/2/3不受菌根共生诱导
本发明人测定了OsPHR1/2/3在接种菌根真菌(+AM)和不接种菌根真菌(-AM)的野生型根中相对于内参基因Cyclophilin2的表达量。结果发现，OsPHR2及其同源基因OsPHR1和OsPHR3的表达不受菌根共生诱导(图1A)。
其中，OsPHR2的核苷酸序列如下(SEQ ID NO:1)：
atggagagaataagcaccaatcagctctacaattctggaattccggtgactgtgccatcgcctctgcctgctataccagctaccctggatgaaaacattcccaggattccagatgggcagaatgttccgcgggagagagaattgagaagcacacctatgccacctcatcagaatcagagtactgttgctcctcttcatgggcattttcagtccagtaccgggtctgttgggcctctgcgttcgtcccaggcgataaggttctcttcagtttcaagcaatgagcaatatacaaatgccaatccttacaattctcaaccgccgagtagtgggagttcttcaacgctcaattatggatcacaatatggaggctttgaaccttccttgactgattttccaagagatgctgggccgacgtggtgtcctgatccagttgatggcttgcttggatatacagatgatgtccctgctgggaacaatttgactgaaaacagttctattgcagctggtgatgaacttgccaagcaaagtgaatggtggaatgattttatgaattatgactggaaagatattgataacacagcttgtactgaaactcaaccacaggttggaccagctgcgcaatcatctgtcgcagttcaccaatcagctgcccaacaatcagtttcatctcaatcaggagaaccttctgcagttgctataccctcgccctctggtgcctccaatacctccaactccaagacacgaatgagatggactcctgaacttcatgagcgctttgtagatgctgtcaatctacttggtggcagtgaaaaagctactcccaagggtgtgttaaagctaatgaaggcagacaatttgaccatttatcatgttaaaagtcaccttcagaaatacagaacagctcgatacagaccagaattgtctgaaggttcttcagaaaagaaggcagcctcaaaagaggacataccatcaatagatctgaaaggagggaactttgatctcactgaggcattgcgtctccagttagaactccaaaagaggcttcatgaacagcttgagatccaaagaagtttgcagctgagaattgaggagcaagggaagtgccttcagatgatgctcgagcagcagtgcatacctgggacagacaaggcggtggatgcttcaacctcagcagaaggaacaaagccatcttctgatcttccagaatcttctgccgtgaaggatgttccagagaacagtcagaacggaatagccaaacaaacagaatcaggtgacagataa
OsPHR2的核苷酸序列如下(SEQ ID NO:2)
MERISTNQLYNSGIPVTVPSPLPAIPATLDENIPRIPDGQNVPRERELRSTPMPPHQNQSTVAPLHGHFQSSTGSVGPLRSSQAIRFSSVSSNEQYTNANPYNSQPPSSGSSSTLNYGSQYGGFEPSLTDFPRDAGPTWCPDPVDGLLGYTDDVPAGNNLTENSSIAAGDELAKQSEWWNDFMNYDWKDIDNTACTETQPQVGPAAQSSVAVHQSAAQQSVSSQSGEPSAVAIPSPSGASNTSNSKTRMRWTPELHERFVDAVNLLGGSEKATPKGVLKLMKADNLTIYHVKSHLQKYRTARYRPELSEGSSEKKAASKEDIPSIDLKGGNFDLTEALRLQLELQKRLHEQLEIQRSLQLRIEEQGKCLQMMLEQQCIPGTDKAVDASTSAEGTKPSSDLPESSAVKDVPENSQNGIAKQTGMRIH
发明人获得了两个OsPHR2的突变体：Osphr2-1和Osphr2-2。其中Osphr2-1是Chen等报道(Chen,J.et al.(2011).Plant Physiology 157,269-278)的一个参与磷饥饿响应的T-DNA插入突变体(图1C)，Osphr2-2是在本发明中通过CRIPSR/CAS9技术得到的一个稳定转化的新突变体，其在223和224bp之间插入一个碱基“T”，造成OsPHR2蛋白翻译提前终止(图1B)。
实时荧光定量PCR结果表明，在Osphr2-1和Osphr2-2突变体中，OsPHR2的表达量均显著低于野生型(图1D)。
实施例2、Osphr2突变体中菌根侵染率降低
本发明人分析了野生型、osphr2-1和osphr2-2植株中丛枝菌根真菌侵染率。结果发现，Osphr2两个突变体株系的菌根侵染率均显著低于野生型(图2A)，说明OsPHR2功能缺失严重影响了水稻-丛枝菌根真菌共生。为更好地反映菌根真菌共生情况，发明人对NIP和Osphr2-1突变体中形成的从枝结构的大小进行测量并对结果进行作图。
结果显示，在Osphr2-1突变体中，丛枝结构大小的分布比野生型稍小，但能够形成正常的丛枝结构(图2B)。osphr2-1和osphr2-2突变体中丛枝结构形态如图2D。
接种菌根真菌六周之后的野生型、Osphr2-1和Osphr2-2植株地上部分的磷元素浓度测定中，Osphr2-2植株比野生型有所下降，Osphr2-1植株磷元素浓度的降低更显著(图2C)。
实施例3、过量表达OsPHR2增加菌根侵染率
发明人进一步获得了OsPHR2过表达植株。其中，OsPHR2 OE1由35S启动子驱动，OsPHR2 OE2由Ubiquitin启动子驱动。
定量结果表明，OsPHR2表达量在OsPHR2 OE植株中显著高于野生型(图3B)。Western实验表明，OsPHR2蛋白在OsPHR2 OE2中积累(图3A)。
发明人对NIP和OsPHR2 OE植株进行菌根侵染实验，发现在接种丛枝菌根真菌六周后，OsPHR2 OE1和OsPHR2 OE2的菌根侵染率显著高于野生型(图3C)，进一步表明OsPHR2调控水稻-丛枝菌根真菌共生。
实施例4、OsPHR2与OsPHR1和OsPHR3在菌根共生中功能冗余
发明人对OsPHR1和OsPHR3的过量表达植株也进行了菌根侵染，发现OsPHR1过量表达植株菌根侵染率也显著高于野生型，与OsPHR2过量表达植株表型一致，而OsPHR3过量表达植株菌根侵染率也有一定升高(图4B)。
发明人通过杂交获得了Osphr1/2-1/3三突变体，对NIP、Osphr2-1和Osphr1/2-1/3三突变体的菌根表型进行统计发现，接种丛枝菌根真菌六周后，Osphr1/2-1/3三突变体的菌根侵染率进一步降低，显著低于Osphr2-1突变体，几乎不能侵染(图4A)。
上述结果表明，OsPHR1/2/3对菌根共生至关重要，并且这三个基因在调控菌根共生中功能冗余。
实施例5、OsPHR1/2/3下游靶标基因启动子顺式元件分析
本发明人对水稻中菌根特异的基因进行了分析，发现菌根特异的转录因子OsRAM1、OsWRI5A和菌根共生特异转运蛋白OsPT11、OsAMT3；1等4个基因的启动子都至少存在两个P1BS元件(在OsRAM1、OsWRI5A、OsPT11和OsAMT3；1的启动子上分别有2、3、3和2个P1BS元件)(图5)。
上述结果暗示，OsPHR1/2/3直接结合这些菌根共生特异基因的启动子并调控其表达。
实施例6、OsPHR2直接结合下游靶标基因的启动子
发明人进行了体外凝胶迁移实验(EMSA)，结果显示，MBP-PHR2可以与OsRAM1(图6A)、OsWRI5A(图6B)、OsAMT3；1(图6C)和OsPT11(图6D)启动子探针结合，对应的冷探针能够与探针竞争性的结合MBP-PHR2，表明MBP-PHR2对探针的结合是特异的。并且MBP-PHR2对同一个基因启动子上不同位置探针的结合强度具有明显差异(图6)。
以上结果表明，在体外条件下OsPHR2蛋白能够结合到下游靶标基因的启动子上。
实施例7、OsPHR2可以激活下游靶标基因
为了研究OsPHR2与OsRAM1、OsWRI5A、OsPT11和OsAMT3；1启动子的结合是否可以激活它们的表达，发明人在烟草叶片中进行了转录激活实验，发现在烟草叶片中一起表达OsPHR2蛋白和靶标基因启动子驱动荧光素酶(Promoter:Luciferase)36小时后，OsPHR2显著激活报告基因荧光素酶的表达(图7)。
该结果表明，OsPHR2可以与下游菌根共生靶标基因启动子上的P1BS元件结合并激活它们的表达。
实施例8、P1BS对于OsPT11受菌根诱导是必需的
为了验证P1BS元件对于菌根共生诱导基因表达是否重要，发明人选取菌根共生磷转运的磷酸盐转运蛋白基因OsPT11的启动子做进一步分析。
发明人发现，OsPT11的启动子上有三个P1BS元件：-219/226bp、-515/522bp和-1203/1210bp(图8A)。
为了研究P1BS对OsPT11在菌根共生中表达的影响，发明人在2,600bp OsPT11启动子的基础上分别构建了三个P1BS元件分别缺失和三个P1BS元件同时缺失的启动子表达分析载体(ProPT11:GUS)：P1BS无缺失的全长启动子(PT11-1)、缺失-219/226bp P1BS(PT11-2)、缺失-515/522bp P1BS(PT11-3)、缺失-1203/1210bp P1BS(PT11-4)和同时缺失-219/226bp、-515/522bp和-1203/1210bp P1BS(PT11-5)等不同形式的OsPT11启动子(图8A)，并稳定遗传转化水稻。对稳定转化的ProPT11:GUS转基因水稻进行菌根侵染实验，并于侵染六周后进行GUS染色。GUS染色分析发现在PT11-1、PT11-2、PT11-3和PT11-4转基因根中，GUS特异性表达在有丛枝结构的细胞中，说明去掉OsPT11启动子上单个P1BS元件不影响其在菌根共生中的表达。有意思的是，在PT11-5转基因根中，水稻根部虽然有丛枝结构形成，但没有GUS染色(图8B)，表明三个P1BS元件对于菌根诱导OsPT11在丛枝细胞里面表达至关重要，表明OsPHR2通过P1BS元件调控菌根共生相关基因表达。
实施例9、OsPHR2过量表达可以拮抗高磷对菌根共生的抑制作用
发明人发现，过量表达OsPHR2提高菌根共生，进而推测OsPHR2可能在高磷抑制菌根共生中起重要作用。发明人分别检测了野生型NIP和OsPHR2 OE株系在高磷和低磷条件(不额外添加磷酸盐的营养液浇水稻苗)下的菌根共生情况，发现OsPHR2 OE株系在高磷条件下的菌根侵染率显著高于野生型(图9)。
更有意思的是，OsPHR2 OE株系在高磷条件下的菌根侵染率与野生型在低磷条件下的菌根侵染率相当，表现出对高磷营养的不敏感(图9)，表明OsPHR2过量表达可以拮抗高磷对菌根共生的抑制作用。
实施例10、OsPHR2在玉米和小麦中功能保守
1、玉米
本发明人通过进化分析找到了OsPHR2在玉米中的同源基因，将之称为ZmPHR1(GRMZM2G006477)、ZmPHR2(GRMZM2G162409)。ZmPHR1与OsPHR2在氨基酸序列上的同源性为38.97％；ZmPHR2与OsPHR2在氨基酸序列上的同源性为65.4％。
通过Crispr/Cas9技术同时敲除玉米ZmPHR1/2(ZmPHR1的第406和407bp的碱基缺失，使得蛋白翻译提前终止(137aa)；ZmPHR2的第95-99bp的碱基缺失，使得蛋白翻译提前终止(89aa))得到Zmphr1/2纯合突变体。
结果发现，相比于野生型，Zmphr1/2突变体植株发育迟缓，株高显著低于野生型(图10B)。
2、小麦
本发明人通过进化分析找到了OsPHR2在小麦中的同源基因，将之称为TaPHR2(TraesCS3D02G107800)。本发明人将其编码其的多核苷酸引入到过表达载体pCAMBIA1301中，转化至Osphr2-1突变体中。结果发现，过量表达小麦TaPHR2能够部分恢复Osphr2-1突变体的菌根共生的表型，表明OsPHR2在单子叶植物小麦和玉米中的功能是保守的。
讨论
综上，本发明人通过遗传学和分子生物学等方法发现，磷饥饿响应因子PHR2通过直接调控菌根共生相关基因的表达，正向的调控了水稻-丛枝菌根共生。
过量表达OsPHR1和OsPHR2能够显著增加菌根共生的效率，OsPHR3过量表达后也有一定的促进作用，但相对而言比OsPHR1和OsPHR2低，可能是因为OsPHR3对P1BS元件的结合能力弱于OsPHR1和OsPHR2，或OsPHR3存在其它的反馈调节。
本发明人发现，OsPHR2是菌根共生中核心的正向调控因子，OsPHR2在菌根共生中直接调控共生相关转录因子等基因的表达。OsPHR2的表达量不受菌根共生诱导，表明其在菌根共生中主要受到蛋白水平的调控。目前，本发明人的酵母双杂交结果没有发现OsPHR2与OsCCAMK、OsCYCLOP互作。提示OsPHR2参与菌根共生的解释是：(1)通过磷酸化OsPHR2或者OsPHR2与其它共有共生信号组分互作，被共生信号激活，调控共生基因的表达；(2)OsPHR2作为菌根共生和磷营养胁迫信号网络的核心监控土壤营养环境比如磷营养浓度，在低磷土壤中使菌根共生网络处于开放状态，在菌根因子等信号刺激下，建立高效菌根共生；在高磷条件下使网络处于处于非活跃状态，抑制菌根共生。
发明人通过去除OsPT11启动子上的P1BS元件证明P1BS对于菌根共生基因的诱导是必需的(图8)。EMSA实验表明，OsPHR2对启动子上不同位置P1BS元件结合能力不同(图6)，暗示OsPHR2与P1BS元件的结合受P1BS旁邻序列的影响，启动子不同位置的P1BS元件可能具有一定的功能互补。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心
<120> 磷饥饿响应因子PHR2在植物与丛枝菌根共生及提高磷营养中的应用
<130> 211615
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1281
<212> DNA
<213> Oryza sativa L.
<400> 1
atggagagaa taagcaccaa tcagctctac aattctggaa ttccggtgac tgtgccatcg 60
cctctgcctg ctataccagc taccctggat gaaaacattc ccaggattcc agatgggcag 120
aatgttccgc gggagagaga attgagaagc acacctatgc cacctcatca gaatcagagt 180
actgttgctc ctcttcatgg gcattttcag tccagtaccg ggtctgttgg gcctctgcgt 240
tcgtcccagg cgataaggtt ctcttcagtt tcaagcaatg agcaatatac aaatgccaat 300
ccttacaatt ctcaaccgcc gagtagtggg agttcttcaa cgctcaatta tggatcacaa 360
tatggaggct ttgaaccttc cttgactgat tttccaagag atgctgggcc gacgtggtgt 420
cctgatccag ttgatggctt gcttggatat acagatgatg tccctgctgg gaacaatttg 480
actgaaaaca gttctattgc agctggtgat gaacttgcca agcaaagtga atggtggaat 540
gattttatga attatgactg gaaagatatt gataacacag cttgtactga aactcaacca 600
caggttggac cagctgcgca atcatctgtc gcagttcacc aatcagctgc ccaacaatca 660
gtttcatctc aatcaggaga accttctgca gttgctatac cctcgccctc tggtgcctcc 720
aatacctcca actccaagac acgaatgaga tggactcctg aacttcatga gcgctttgta 780
gatgctgtca atctacttgg tggcagtgaa aaagctactc ccaagggtgt gttaaagcta 840
atgaaggcag acaatttgac catttatcat gttaaaagtc accttcagaa atacagaaca 900
gctcgataca gaccagaatt gtctgaaggt tcttcagaaa agaaggcagc ctcaaaagag 960
gacataccat caatagatct gaaaggaggg aactttgatc tcactgaggc attgcgtctc1020
cagttagaac tccaaaagag gcttcatgaa cagcttgaga tccaaagaag tttgcagctg1080
agaattgagg agcaagggaa gtgccttcag atgatgctcg agcagcagtg catacctggg1140
acagacaagg cggtggatgc ttcaacctca gcagaaggaa caaagccatc ttctgatctt1200
ccagaatctt ctgccgtgaa ggatgttcca gagaacagtc agaacggaat agccaaacaa1260
acagaatcag gtgacagata a 1281
<210> 2
<211> 426
<212> PRT
<213> Oryza sativa L.
<400> 2
Met Glu Arg Ile Ser Thr Asn Gln Leu Tyr Asn Ser Gly Ile Pro Val
1 5 10 15
Thr Val Pro Ser Pro Leu Pro Ala Ile Pro Ala Thr Leu Asp Glu Asn
20 25 30
Ile Pro Arg Ile Pro Asp Gly Gln Asn Val Pro Arg Glu Arg Glu Leu
35 40 45
Arg Ser Thr Pro Met Pro Pro His Gln Asn Gln Ser Thr Val Ala Pro
50 55 60
Leu His Gly His Phe Gln Ser Ser Thr Gly Ser Val Gly Pro Leu Arg
65 70 75 80
Ser Ser Gln Ala Ile Arg Phe Ser Ser Val Ser Ser Asn Glu Gln Tyr
85 90 95
Thr Asn Ala Asn Pro Tyr Asn Ser Gln Pro Pro Ser Ser Gly Ser Ser
100 105 110
Ser Thr Leu Asn Tyr Gly Ser Gln Tyr Gly Gly Phe Glu Pro Ser Leu
115 120 125
Thr Asp Phe Pro Arg Asp Ala Gly Pro Thr Trp Cys Pro Asp Pro Val
130 135 140
Asp Gly Leu Leu Gly Tyr Thr Asp Asp Val Pro Ala Gly Asn Asn Leu
145 150 155 160
Thr Glu Asn Ser Ser Ile Ala Ala Gly Asp Glu Leu Ala Lys Gln Ser
165 170 175
Glu Trp Trp Asn Asp Phe Met Asn Tyr Asp Trp Lys Asp Ile Asp Asn
180 185 190
Thr Ala Cys Thr Glu Thr Gln Pro Gln Val Gly Pro Ala Ala Gln Ser
195 200 205
Ser Val Ala Val His Gln Ser Ala Ala Gln Gln Ser Val Ser Ser Gln
210 215 220
Ser Gly Glu Pro Ser Ala Val Ala Ile Pro Ser Pro Ser Gly Ala Ser
225 230 235 240
Asn Thr Ser Asn Ser Lys Thr Arg Met Arg Trp Thr Pro Glu Leu His
245 250 255
Glu Arg Phe Val Asp Ala Val Asn Leu Leu Gly Gly Ser Glu Lys Ala
260 265 270
Thr Pro Lys Gly Val Leu Lys Leu Met Lys Ala Asp Asn Leu Thr Ile
275 280 285
Tyr His Val Lys Ser His Leu Gln Lys Tyr Arg Thr Ala Arg Tyr Arg
290 295 300
Pro Glu Leu Ser Glu Gly Ser Ser Glu Lys Lys Ala Ala Ser Lys Glu
305 310 315 320
Asp Ile Pro Ser Ile Asp Leu Lys Gly Gly Asn Phe Asp Leu Thr Glu
325 330 335
Ala Leu Arg Leu Gln Leu Glu Leu Gln Lys Arg Leu His Glu Gln Leu
340 345 350
Glu Ile Gln Arg Ser Leu Gln Leu Arg Ile Glu Glu Gln Gly Lys Cys
355 360 365
Leu Gln Met Met Leu Glu Gln Gln Cys Ile Pro Gly Thr Asp Lys Ala
370 375 380
Val Asp Ala Ser Thr Ser Ala Glu Gly Thr Lys Pro Ser Ser Asp Leu
385 390 395 400
Pro Glu Ser Ser Ala Val Lys Asp Val Pro Glu Asn Ser Gln Asn Gly
405 410 415
Ile Ala Lys Gln Thr Gly Met Arg Ile His
420 425

Claims (4)

1.一种调节禾本科植物与丛枝菌根真菌共生或调节高磷对丛枝菌根真菌共生的抑制作用的方法，其特征在于，上调禾本科植物中磷饥饿响应因子PHR的基因表达或蛋白活性，从而促进植物与丛枝菌根真菌共生，或拮抗高磷对丛枝菌根真菌共生的抑制作用；所述上调植物中磷饥饿响应因子PHR的基因表达或蛋白活性包括：将磷饥饿响应因子PHR的编码序列转入植物；所述磷饥饿响应因子PHR为PHR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；所述禾本科植物为水稻。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的调节禾本科植物与丛枝菌根真菌共生或调节高磷对丛枝菌根真菌共生的抑制作用，包括：在低磷条件下，上调PHR2的基因表达或蛋白活性，促进植物与丛枝菌根真菌共生，增加磷吸收。
3. 一种磷饥饿响应因子PHR或其编码基因或它们的调节剂用途，其特征在于，所述的调节剂为上调剂，所述磷饥饿响应因子PHR或其上调剂促进植物与丛枝菌根真菌共生，或拮抗高磷对丛枝菌根真菌共生的抑制作用；所述上调剂包括：过表达所述磷饥饿调控因子PHR的表达盒或表达构建物；所述磷饥饿响应因子PHR为PHR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；所述禾本科植物为水稻。
4. 一种筛选调节禾本科植物与丛枝菌根真菌共生或调节高磷对丛枝菌根真菌共生的抑制作用的物质的方法，包括：(1)将候选物质加入到表达磷饥饿调控因子PHR的体系中；(2)检测所述体系，观测其中磷饥饿调控因子PHR的基因表达或蛋白活性，若其基因表达或蛋白活性提高，则表明该候选物质为可用于促进禾本科植物与丛枝菌根真菌共生，或拮抗高磷对丛枝菌根真菌共生的抑制作用的物质；所述磷饥饿响应因子PHR为PHR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；所述禾本科植物为水稻。
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