CN109735561A - 一种高结瘤固氮植物的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高结瘤固氮植物的培育方法，在植物体内分别过表达或者同时过表达序列表中的SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，获得与正常植物相比具有高结瘤固氮能力的转基因植物。利用本发明构建的过表达载体转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高大豆的根瘤数目，对减少氮肥施用和提高大豆产量具有重大的意义。

Description

一种高结瘤固氮植物的培育方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及到大豆钙调素蛋白家族GmCaM7编码基因促进大豆根瘤数目的应用方法。

背景技术

大豆是重要的粮油经济作物，其特有的共生固氮能力可将空气中的氮气转化为可被植物吸收利用的氨态氮，为自身生长发育提供了必需的氮素营养。充分利用大豆根瘤介导的共生固氮过程，不仅对维系大豆的正常生长和产量具有重要作用，并且还利于减少施肥过多带来的环境污染，因而，挖掘和提高大豆共生固氮效率已成为农业可持续发展的重要途径之一。

根瘤是共生固氮的场所，根瘤的数目决定着共生固氮的效率，较多的具有固氮功能的根瘤数目能够显著提高N₂的固定效率，然而过多的根瘤数目也会影响植株的正常发育，因而豆类植物演化出了调节根瘤数目的机制，它们能够感知自身对氮素营养的需求，在不影响自身生长发育情况下保证氮素营养的生产和利用。

目前对根瘤数目调控的分子机制的研究主要集中在受体激酶介导的结瘤自调控信号通路（Autoregulation signaling pathway，AON）上，AON信号通路包括两个长距离运输信号（根起源的信号和叶起源的信号）。在根瘤原基形成的同时（根瘤菌侵染根毛后的3-5天），在根部产生一些可移动的信号肽分子CLAVATA3/endosperm surrounding region（CLE），CLE含有12-13个氨基酸，通过木质部运输至叶薄壁组织，与质膜上的LRR-RLK（Lucine rich repeat-Receptor like kinase）受体类激酶受体结合，开启结瘤自调控信号，并诱导一类被称为SDI（Shoot Derived Inhibitors）的物质从地上部分运至根中，抑制根系结瘤（Okamoto et al., 2013）。在百脉根中，两个来自根中产生的CLE多肽CLE-RS1和CLE-RS2被质膜上的LRR-RLK受体类激酶HAR1 (Hypernodulation Aberrant Rootformation1)识别，进而组成多肽-受体复合体发挥抑制根瘤数目的作用（Nishimura etal., 2002）。此外，在百脉根中又鉴定一个在根部发挥作用的超结瘤突变体tml(Too MuchLove)，研究发现地上的HAR1和地下的TML共同调控根瘤数目（Magori et al., 2009）；在苜蓿和大豆中也都发现了CLE受体，苜蓿的MtSUNN、大豆中GmNARK和百脉根的HAR1都是拟南芥atCLV1（CLAVATA 1）的同源蛋白，但是在豆科植物中分化出调节根瘤数目的功能（Nishimura et al., 2002; Searle et al., 2003; Schnabel et al., 2005; Mirzaeiet al., 2017）。

植物中的Ca²⁺结合蛋白很多，通过EF-hand结构域与Ca²⁺结合，如拟南芥中有大约250 种蛋白质包含结合Ca2⁺的EF-h1nd结构域（Day et al 2002）；在大豆中也有至少262个基因编码含有EF-hand结构域的蛋白质(Zeng et al 2017)。钙调素（Calmodulin，CaM）是其中一种Ca²⁺结合蛋白，也称为Ca2⁺传感器，拟南芥中有7个基因编码CaMs类蛋白，这类蛋白通过4 个EF-hand构象结合4 个Ca2⁺，参与调控众多类似转录和酶活性的重要生理过程。在大豆基因组中包括6种钙调素(CaMs)，这些钙调素家组蛋白在大豆根瘤数目调控的研究并未报道。相关的参考文献如下。

Day, I.S., Reddy, V.S., Ali, G.S., Reddy, A.S.N. (2002). Analysis ofEF-hand-containing proteins in Arabidopsis. Genome Biol, 3, 1-24.

Magori, S., Oka-Kira, E., Shibata, S., Umehara, Y., Kouchi, H., Hase, Y.,Tanaka, A., Sato, S., Tabata, S. & Kawaguchi, M. (2009). Too much love, aroot regulator associated with the long-distance control of nodulation inLotus japonicus. Mol Plant Microbe Interact, 22, 259-268.

Mirzaei, S., Batley, J., El-Mellouki, T., Liu, S., Meksem, K., Ferguson,B.J. & Gresshoff. P. M. (2017). Neodiversification of homeologous CLAVATA1-like receptor kinase genes in soybean leads to distinct developmentaloutcomes. Sci Rep, 7, 8878.

Nishimura, R., Hayashi, M., Wu, G.J., Kouchi, H., Imaizumi-Anraku, H.,Murakami, Y., Kawasaki, S., Akao, S., Ohmori, M., Nagasawa, M., Harada, K. &Kawaguchi, M. (2002). HAR1 mediates systemic regulation of symbiotic organdevelopment. Nature, 420, 426-429.

Okamoto, S., Shinohara, H., Mori, T., Matsubayashi, Y. & Kawaguchi, M.(2013). Root-derived CLE glycopeptides control nodulation by direct bindingto HAR1 receptor kinase. Nat Commun, 4, 2191.

Schnabel, E., Journet, E.P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G. & Frugoli,J. (2005). The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-richrepeat receptor kinase that regulates nodule number and root length. Plant Mol Biol, 58, 809-822.

Searle, I.R., Men, A.E., Laniya, T.S., Buzas, D.M., Iturbe-Ormaetxe, I.,Carroll, B.J. & Gresshoff, P.M. (2003). Long-distance signaling in nodulationdirected by a CLAVATA1-like receptor kinase. Science, 299, 109-112.

Zeng, H.Q., Zhang, Y.X., Zhang, X.J., Pi, E.X., Zhu, Y.Y. (2017).Analysis of EF-Hand proteins in soybean genome suggests their potential rolesin environmental and nutritional stress signaling. Front Plant Sci, 8, 877. 。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高结瘤固氮植物的培育方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种高结瘤固氮植物的培育方法，在植物体内分别过表达或者同时过表达序列表中的SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，获得与正常植物相比具有高结瘤固氮能力的转基因植物。

作为本发明的一种优选技术方案，首先构建含有SEQ ID NO：1所述基因和/或含有SEQ ID NO：2所述基因和/或含有SEQ ID NO：3所述基因和/或含有SEQ ID NO：4所述基因和/或含有SEQ ID NO：5所述基因的重组表达载体，然后利用此重组表达载体构建转化体，再利用此转化体侵染目的植物，筛选阳性植株，获得与正常植物相比根瘤数目增多的转基因大豆。

作为本发明的一种优选技术方案，所述重组过表达载体以pTF101为骨架载体。

作为本发明的一种优选技术方案，所述重组过表达载体上含连接有35S强启动子。

作为本发明的一种优选技术方案，利用所述过表达载体转化农杆菌K599获得转化体，然后再利用农杆菌K599介导的毛状根转化法获得转基因植物，筛选阳性植株得到与正常植物相比具有高结瘤固氮能力的转基因植物。

作为本发明的一种优选技术方案，所述目的植物为蝶形花科植物。

作为本发明的一种优选技术方案，所述目的植物为大豆。

作为本发明的一种优选技术方案，SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：5所示核苷酸的扩增引物对，其正向引物依次如序列表中SEQ ID NO：16～SEQ ID NO：20所示；其反向引物依次如序列表中SEQ ID NO：21～SEQ ID NO：25所示。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：参看下述实施例，利用本发明构建的过表达载体转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高大豆的根瘤数目，对减少氮肥施用和提高大豆产量具有重大的意义。

附图说明

图1为实施例2中，大豆GmCam7家族基因GmCam7La，GmCam7Lb，GmCam7Lc，GmCam7Ld和GmCam7Le5个基因（简写为GmCam7La-GmCam7Le）响应根瘤菌处理的表达分析，相对于不接种根瘤菌的处理的大豆根而言，在根瘤菌侵染后的28天的大豆根中，GmCam7La-GmCam7Le基因的表达均受到显著诱导，该结果说明GmCam7L家族基因参与了大豆根系结瘤固氮的过程。

图2为实施例3中，毛状根中过表达GmCam7La对大豆结瘤的表型分析，在完全相同的实验环境下，上调表达GmCam7La的转基因毛状根与空载体转化的转基因根系（EV）相比，根瘤数量显著增多（图2A和2B），图2C为对转基因根系中GmCam7La的表达水平分析，结果显示在转基因根系中GmCam7La的表达是显著上调。

图3为实施例3中，毛状根中过表达GmCam7Lb对大豆结瘤的表型分析，在完全相同的实验环境下，上调表达GmCam7Lb的转基因毛状根与空载体转化的转基因根系（EV）相比，根瘤数量显著增多（图3A和3B），图3C为对转基因根系中GmCam7Lb的表达水平分析，结果显示在转基因根系中GmCam7Lb的表达是显著上调的。

图4为实施例3中，毛状根中过表达GmCam7Lc对大豆结瘤的表型分析，在完全相同的实验环境下，上调表达GmCam7Lc的转基因毛状根与空载体转化的转基因根系（EV）相比，根瘤数量显著增多（图4A和4B），图4C为对转基因根系中GmCam7Lc的表达水平分析，结果显示在转基因根系中GmCam7Lc的表达显著上调。

图5为实施例3中，毛状根中过表达GmCam7Ld对大豆结瘤的表型分析，在完全相同的实验环境下，上调表达GmCam7Ld的转基因毛状根与空载体转化的转基因根系（EV）相比，根瘤数量显著增多（图5A和5B），图5C为对转基因根系中GmCam7Ld的表达水平分析，结果显示在转基因根系中GmCam7Ld的表达显著上调。

图6为实施例3中，毛状根中过表达GmCam7Le对大豆结瘤的表型分析，在完全相同的实验环境下，上调表达GmCam7Le的转基因毛状根与空载体转化的转基因根系（EV）相比，根瘤数量显著增多（图6A和6B），图6C为对转基因根系中GmCam7Le的表达水平分析，结果显示在转基因根系中GmCam7Le的表达显著上调。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。下述实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置两次重复实验，结果取平均值。

实施例1、基因的命名和序列。

本发明构建的过表达载体能够特异的过表达大豆中的GmCam7Ls家族5个基因。该基因分别定位在大豆第2、3、5、14、19号染色体上，分别命名如下，GmCam7La（基因号：Glyma.02G275600），具有SEQ ID NO：1所示的编码序列；GmCam7Lb（基因号：Glyma.03G004100），具有SEQ ID NO：2所示的编码序列；GmCam7Lc（基因号：Glyma.05G079700），具有SEQ ID NO：3所示的编码序列；GmCam7Ld（基因号：Glyma.14G040600），具有SEQ ID NO：4所示的编码序列；GmCam7Le（基因号：Glyma.19G068300），具有SEQ ID NO：5所示的编码序列。

实施例2、GmCam7Ls家族基因响应根瘤菌侵染的表达分析。

1）材料获取：实验所用材料为威廉姆斯82（简称W82）；材料按照以下流程进行：大豆种子用70%的洒精灭菌30 sec，播种于低氮营养液浸泡的蛭石基质中，于培养室中培养，16 h光/8 h 暗，光强7000 LUX，温度26 ℃，相对湿度为70%。播种后15天，做接种根瘤菌处理，每株接种慢生型根瘤菌USDA110菌液（OD600=0.08）30 mL，在接菌后第28天取大豆的根。

2）mRNA的分离：采用Trizol法提取大豆总RNA，①先将组织放入研磨中用液氮研磨3次，将研磨好的组织0.1-0.2 g加入1 mL离心管中然后加入1 mL TRI pure试剂，充分震荡，裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体，室温放置5 min；②加200 μl氯仿，振荡混匀，室温静置5 min，4 ℃，12000 r/min，离心15 min；③将上清移入另外一个离心管中，加入等体积异丙醇，振荡混匀，-20 ℃沉淀30 min，4 ℃，12000 r/min，离心10 min；④弃上清，用75%的乙醇（DEPC处理过的无菌水配制）洗，4 ℃，12000 r/min，离心10 min，重复两次，室温风干10 min左右，加20 μl左右 DEPC处理过的RNase Free水（DEPC水）溶解沉淀。

3）反转录为cDNA：将提取的mRNA用TaKaRa反转录试剂盒，反转录为cDNA。

4）实时荧光定量PCR分析：采用TIANGEN公司的 SuperReal PreMix Plus（SYBRGreen）试剂盒，具体实验方法如下：在10 μl体系中加入上步所得cDNA模板0.2 μl、正反向引物各0.2 μl、2 x SuperReal PreMix Plus 5 μl、ddH2O 4.4 μl；扩增程序为：95 ℃，15min；95 ℃，10 sec；60 ℃，34 sec，40 cycles；65 ℃，5 sec，95 ℃，5 sec；其中，与GmCam7La-GmCam7Le对应的正向引物依次为：

AGAACCCAACTGAGGCAGA（SEQ ID NO：6）；

AAGGAGCTTGGGACTGTTATG（SEQ ID NO：7）；

AAACCCAACTGAGGCAGA（SEQ ID NO：8）；

AGAACCCAACTGAGGCTGAG（SEQ ID NO：9）；

ACTGAGGCAGAACTCCAGGA（SEQ ID NO：10）。

对应的的反向引物依次为：

TCTTTCATCTTGCGAGCC（（SEQ ID NO：11）；

GCCATTCCCATCAGCATCTA（SEQ ID NO：12）；

AGCAGAGATGAACCCATTCT（SEQ ID NO：13）；

TGTCAAACACACGGAAAGC（SEQ ID NO：14）；

AGCAGCAGAGATGAACCCA（SEQ ID NO：15）。

结果分析：参见附图1，显示在根瘤菌侵染长期的大豆根中，GmCam7La-GmCam7Le 5个基因的表达受到显著诱导，该结果说明GmCam7La-GmCam7Le 5个基因参与了大豆根系结瘤固氮过程。

实施例3、高结瘤固氮能力转基因大豆的培育。

1）Wilimas82大豆根组织中总RNA的提取。

研钵经 180 ℃高温处理8 h或经燃烧处理以消除RNA酶污染；氯仿、异丙醇，乙醇等试剂使用新开封未被污染的；其它器材如枪头、离心管和试剂如超纯水、NaAc，均经1 ‰DEPC水处理过夜后121 ℃高温湿热灭菌30 min，枪头，离心管65 ℃烘干备用；采用Trizol法提取大豆总RNA。

（1）取100 mg大豆根材料用液氮研磨材料，加入1 mL TRI pure试剂，充分匀浆后，将匀浆液吸入1.5 mL 离心管，室温放置5 min。

（2）加入200 μl 氯仿，震荡混匀，静置5 min，4 ℃，12000 r/min，离心10 min。

（3）取上清于另一离心管，加等体积异丙醇，振荡混匀，-20 ℃沉淀30 min，4 ℃，12000 r/min，离心10 min。

（4）弃上清，用1 mL 75%的乙醇（DEPC处理过的无菌水配制）洗涤，4 ℃，12000 r/min，离心10 min，重复两次，室温风干10 min左右，加20 μl左右 DEPC处理过的RNase Free水（DEPC水）溶解沉淀。

2）反转录PCR。

（1）在用DEPC 处理过的的200 μl PCR管中顺序加入5μL RNA 和3μL oligo (dt)18；4 μl dNTPs，65 ℃温育5 min 后迅速置于冰上冷却。

（3）按以下顺序加入以下溶液：5X M-MLV buffer（invitrogen公司出品）4μl，RNase inhibitor 1μl，M-MLV 1μl，0.1M DTT 2μl。

（4）将上述反应液混匀，37 ℃反应30 min。

（5）反应结束后，70 ℃处理10 min灭活逆转录酶活性；反应合成的cDNA 第一条链可用作PCR反应模板。

3）构建重组表达载体。

（1）GmCam7La-GmCam7Le5个基因片段的克隆。

根据GmCam7La-GmCam7Le 5个基因的编码序列（SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：5）设计引物对用于过表达载体构建，根据pTF101载体上的多克隆位点，引物末端分别引入HindⅢ和BamHIⅠ酶切识别位点；以大豆测序品种W82的cDNA为模板进行PCR，扩增GmCam7La-GmCam7Le5个基因长度分别为450 bp的基因片段。

与5组基因片段对应的正向引物序列依次为：

TCTAGAATGGCCGATCAGCTCACCG（SEQ ID NO: 16）；

TCTAGAATGGCAGATCAACTCACCG（SEQ ID NO: 17）；

GGATCCATGGCCGATCAACTTACCG（SEQ ID NO: 18）；

TCTAGAATGGCCGATCAGCTCACCG（SEQ ID NO: 19）；

TCTAGAATGGCGGATCAACTCACCG（SEQ ID NO: 20）。

与5组基因片段对应的反向引物序列依次为：

GGATCCCTTGGCCATCATGACTTTGAC（SEQ ID NO: 21）；

GGATCCCTTGGCCATCATGACCTTAAC（SEQ ID NO: 22）；

GAATTCCTTGGCCATCATCACCTTAAC（SEQ ID NO: 23）；

GGATCCCTTGGCCATCATGACTTTGAC（SEQ ID NO: 24）；

GGATCCCTTGGCCATCATCACCTTAAC（SEQ ID NO: 25）。

扩增程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 sec，56 ℃ 30 sec，68 ℃ 30sec，30个循环；72 ℃ 5min。

PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化450bp左右的条带。

回收的 DNA 片段与Blant3-T载体 (Takara 公司) 连接，10 μl体系中加入Tvector 1 μl，回收片段4 μl，混匀混合液，16 ℃连接过夜，热击法转入E.coli 大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑阳性克隆，送交上海生工测序。

(2) 重组表达载体的构建。

a. 提取含有正确测序的GmCam7La-GmCam7Le5个基因列的Blunt 3载体质粒，用HindⅢ和BamHIⅠ酶切获得核苷酸序列。

b.用HindⅢ和BamHIⅠ酶切Blunt 3质粒，获得线状的GmCam7La-GmCam7Le5个基因核苷酸序列。

c. 将GmCam7La-GmCam7Le5个基因核苷酸序列片段先克隆到pTF101载体中。

d. 将步骤3的连接产物热激转化感受态大肠杆菌DH5α菌株，37 ℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒GmCam7Ls -pTF101。

4）农杆菌K599介导的毛状根转化。

（1）农杆菌的转化，采用液氮冻溶法转化农杆菌。

a. 取出冻存的200 μl感受态细胞，融化后加入5-10 μl质粒DNA，轻弹管壁混匀，冰上放20-30 min。

b. 放入液氮中5 min后取出，将管转入37 ℃（5 min）融化后，加入800 μl LB（无抗性）液体培养基，28 ℃低速振荡 (150 r/min) 4-5 h。

c. 4000 r/min，30 sec, 去上清，加100 μl LB 液体培养基，悬浮菌体后涂板含50 mg/ml 卡那霉素）。

d. 置28 ℃培养至白色转化子长出，用于毛状根的转化。

（2）农杆菌K599介导的毛状根转化。

以大豆品种W82为材料，取种子材料用氯气消毒10 h后，在B5培养基（培养基配方：2％蔗糖，0.8 g琼脂粉（sigma），1×GAMBORG B-5 BASAL（Phyto TechnologyLaboratories，货号：G398），pH调至5.7）上萌发5天，待子叶刚要张开时切下子叶，在子叶下端十字交叉切割，浸在活化的农杆菌K599中侵染30 min（OD600=0.6）后，将外植体转至1/2MS培养基（培养基配方：2％蔗糖，0.8 琼脂粉（sigma），0.5×MURA SHIGE & SKOOG BASALMEDIOM w/VITAMINS （Phyto Technology Laboratories，货号：G519），pH调至5.7；上共培生长3天后，再转至1/2 MS培养基上诱导毛状根，7天后，毛状根长出，待大豆真叶长出，毛状根达到7-8 cm后，选择发育阶段接近的毛状根复合苗移入蛭石中，培养1周后接种根瘤菌USDA110（OD600=0.08）30 mL/株，培养28天后统计根瘤数量。

5） 结果观察。

参见附图2-5，可见在完全相同的实验环境下，分别上调表达GmCam7La-GmCam7Le 5个基因的转基因根同空载体转化的转基因根系（EV）相比：

A：根瘤数量显著增多（图2 A和2B，图3A和3B，图4A和4B，图5A和5B，图6A和6B）；

B：图2C，图3C，图4C，图5C和图6C分别为对转基因根系中GmCam7La-GmCam7Le5个基因的表达水平分析，结果显示在转基因根系中GmCam7La-GmCam7Le 5个基因的表达均是显著上调的。

综上，实施例1中的实时荧光定量PCR检测结果表明，GmCam7La-GmCam7Le 5个基因在大豆根中的表达受到根瘤菌侵染的诱导。实施例2进一步通过毛状根转化嵌合苗的结瘤分析显示，上调表达GmCam7La-GmCam7Le 5个基因可以显著促进大豆根系结瘤数目的增加，表明GmCam7Ls基因在大豆根瘤发育中具有重要的作用，在高产大豆培育方面具有重要的潜在和实际应用前景。

上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种高结瘤固氮植物的培育方法

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 450

<212> DNA

<213> 大豆属大豆(glycine max)

<400> 1

atggccgatc agctcaccga cgaacagatc tccgagttca aggaagcctt cagcctcttc 60

gacaaggacg gggatggttg tattaccacc aaggaacttg ggaccgtgat gcggtcactt 120

ggccagaacc caactgaggc agagctgcag gacatgataa atgaggttga tgctgatggg 180

aatggtacca ttgatttccc agaattcctg aatctcatgg ctcgcaagat gaaagacact 240

gattcagagg aggagctgaa ggaggctttc cgcgtgtttg acaaggatca gaatggcttc 300

atctctgcag cggagctccg ccatgtgatg accaatctcg gtgagaagct gaccgacgag 360

gaagtcgatg agatgattcg cgaggctgac gttgatggtg atggtcagat caactatgag 420

gagtttgtca aagtcatgat ggccaagtga 450

<210> 2

<211> 450

<212> DNA

<213> 大豆属大豆(glycine max)

<400> 2

atggcagatc aactcaccga tgaacagatc tcggagttca aggaagcctt cagtttgttc 60

gataaggatg gcgatggttg catcacaaca aaggagcttg ggactgttat gcgttcgttg 120

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gattctgagg aggagctgaa agaggcgttc cgagtgtttg acaaggacca gaatgggttc 300

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gaggttgatg agatgattcg agaggctgat gtcgatggcg acggccaaat aaactacgag 420

gagtttgtta aggtcatgat ggccaagtga 450

<210> 3

<211> 453

<212> DNA

<213> 大豆属大豆(glycine max)

<400> 3

cdsatggccg atcaacttac cgatgaacag atctccgagt tcaaggaagc cttcagcttg 60

ttcgacaagg acggcgatgg ttgcatcaca accaaggagc ttggaactgt tatgcgttca 120

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gaggagttcg ttaaggtgat gatggccaag tga 453

<210> 4

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<212> DNA

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ttcgacaagg acggcgatgg ttgtattacc accaaggaac ttgggactgt gatgcggtcg 120

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<210> 5

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<212> DNA

<213> 大豆属大豆(glycine max)

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cdsatggcgg atcaactcac cgatgaacag atctccgagt tcaaggaagc cttcagcttg 60

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ttcatctctg ctgctgagct ccgtcatgtg atgaccaacc tcggggagaa actcaccgat 360

gaagaggtcg atgagatgat tcgtgaggct gatgttgatg gagatggcca aataaactac 420

gaggagttcg ttaaggtgat gatggccaag tga 453

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

agaacccaac tgaggcaga 19

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

aaggagcttg ggactgttat g 21

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

aaacccaact gaggcaga 18

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

agaacccaac tgaggctgag 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

actgaggcag aactccagga 20

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

tctttcatct tgcgagcc 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

gccattccca tcagcatc 18

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

agcagagatg aacccattct 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

tgtcaaacac acggaaagc 19

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

agcagcagag atgaaccca 19

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

tctagaatgg ccgatcagct caccg 25

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 17

tctagaatgg cagatcaact caccg 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 18

ggatccatgg ccgatcaact taccg 25

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 19

tctagaatgg ccgatcagct caccg 25

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 20

tctagaatgg cggatcaact caccg 25

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 21

ggatcccttg gccatcatga ctttgac 27

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 22

ggatcccttg gccatcatga ccttaac 27

<210> 23

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 23

gaattccttg gccatcatca ccttaac 27

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 24

ggatcccttg gccatcatga ctttgac 27

<210> 25

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 25

ggatcccttg gccatcatca ccttaac 27

Claims (8)

1.一种高结瘤固氮植物的培育方法，其特征在于：在植物体内分别过表达或者同时过表达序列表中的SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，获得与正常植物相比具有高结瘤固氮能力的转基因植物。

2.根据权利要求1所述的一种高结瘤固氮植物的培育方法，其特征在于：首先构建含有SEQ ID NO：1所述基因和/或含有SEQ ID NO：2所述基因和/或含有SEQ ID NO：3所述基因和/或含有SEQ ID NO：4所述基因和/或含有SEQ ID NO：5所述基因的重组表达载体，然后利用此重组表达载体构建转化体，再利用此转化体侵染目的植物，筛选阳性植株，获得与正常植物相比根瘤数目增多的转基因大豆。

3.根据权利要求2所述的一种高结瘤固氮植物的培育方法，其特征在于：所述重组过表达载体以pTF101为骨架载体。

4.根据权利要求2所述的一种高结瘤固氮植物的培育方法，其特征在于：所述重组过表达载体上含连接有35S强启动子。

5.根据权利要求2所述的一种高结瘤固氮植物的培育方法，其特征在于：利用所述过表达载体转化农杆菌K599获得转化体，然后再利用农杆菌K599介导的毛状根转化法获得转基因植物，筛选阳性植株得到与正常植物相比具有高结瘤固氮能力的转基因植物。

6.根据权利要求1-5任一项所述的一种高结瘤固氮植物的培育方法，其特征在于：所述目的植物为蝶形花科植物。

7.根据权利要求1-5任一项所述的一种高结瘤固氮植物的培育方法，其特征在于：所述目的植物为大豆。

8.根据权利要求1所述的一种高结瘤固氮植物的培育方法，其特征在于：SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：5所示核苷酸的扩增引物对，其正向引物依次如序列表中SEQ ID NO：16～SEQID NO：20所示；其反向引物依次如序列表中SEQ ID NO：21～SEQ ID NO：25所示。