CN110004157B - 一种增加根瘤数目和促进根瘤发育的转基因植物培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种增加根瘤数目和促进根瘤发育的转基因植物培育方法，在植物体内过表达序列表中的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的基因或其同源/等效基因，获得与正常植物相比根瘤数目增加和/或根瘤发育增强的转基因植物。利用本发明的方法构建转基因植物，能够显著提高植物的根瘤数目，促进根瘤的成熟，在理论研究和农林应用方面均具有重大的实用价值。

Description

一种增加根瘤数目和促进根瘤发育的转基因植物培育方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及与植物结瘤固氮相关的基因及其应用。

背景技术

大豆在国民经济中扮演重要角色，其特有的共生固氮能力可将空气中的氮气转化为可被植物吸收利用的氨态氮，不仅为自身生长发育提供了必需的氮素营养，而且还利于减少施肥过多带来的环境污染。充分利用大豆根瘤介导的共生固氮能力，挖掘和提高大豆共生固氮效率已成为农业可持续发展的重要途径之一。

根瘤是共生固氮的场所，根瘤的数目，尤其是有固氮功能的根瘤（功能根瘤）的数目决定着N₂的固定效率，然而根瘤固氮是个耗能的过程，过多的根瘤数目给植株的正常发育造成负担，导致植株发育迟缓，所以根瘤的数目以及功能根瘤数目受到豆科植物的严格控制。豆类植物自身演化出结瘤自调控信号通路（Autoregulation signaling pathway，AON），AON系统能够感知自身对氮素营养的需求，适度调节根瘤数目，确保既不影响植株自身生长发育情况，又保证氮素营养的生产和利用（Searle et al., 2003）。

AON信号通路最初在大豆中发现，包括两个长距离运输信号（根起源的多肽信号和叶起源的SDI（Shoot Derived Inhibitors）信号）。在大豆根瘤原基形成的同时（根瘤菌侵染根毛后的3-5天），在根部产生一些可移动的信号肽分子CLAVATA3/endospermsurrounding region (CLE)，称为RC1和RC2，含有12-13个氨基酸，通过木质部运输至叶薄壁组织，与质膜上的LRR-RLK（Lucine rich repeat-Receptor like kinase）受体类激酶受体GmNARK(nodule autoregulation receptor kinase)结合，开启结瘤自调控信号，并诱导SDI从地上部分运至根中，负调控根系结瘤（Searle et al., 2003; Okamoto et al.,2013）。在豆科模式植物百脉根中，也有类似的结瘤自调控机制，两个来自根中产生的CLE多肽CLE-RS1和CLE-RS2被质膜上的LRR-RLK受体类激酶HAR1 (Hypernodulation AberrantRoot formation1)识别，进而组成多肽-受体复合体发挥抑制根瘤数目的作用（Nishimuraet al., 2002）。此外，在百脉根中又鉴定一个在根部发挥作用的超结瘤突变体tml(TooMuch Love)，研究发现地上的HAR1和地下的TML共同调控根瘤数目（Magori et al.,2009）；在豆科模式植物苜蓿中也都发现了CLE受体MtSUNN（super numeric nodules），同样起着类似的调控机制(Schnabel et al., 2005)。大豆中GmNARK、百脉根的HAR1和苜蓿的MtSUNN都是拟南芥atCLV1（CLAVATA 1）的同源蛋白，但是在豆科植物中分化出调节根瘤数目的功能（Nishimura et al., 2002; Searle et al., 2003; Schnabel et al., 2005;Mirzaei et al., 2017）。

14-3-3蛋白最初是在动物的脑细胞中发现的酸性可溶性的同源或异源蛋白二聚体(Moore and Perez 1967)，根据其蛋白质在离子交换层析柱的第14管中洗脱以及后续淀粉凝胶中的3.3处分离，将其命名为14-3-3蛋白。目前，14-3-3蛋白已在20多种植物中发现，如拟南芥中鉴定到15个14-3-3家族蛋白水稻中有8个(DeLille et al., 2001;Rosenquist et al., 2001; Yao et al., 2007)，大豆有18个(Li and Dhaubhadel 2011)等。14-3-3家族蛋白质主要定位于细胞质中，也可定位于细胞核、质体、细胞膜和线粒体(Bunney et al 2001; Sehnke et al 2011; Taoka et al 2011; Swatek et al 2014)中。14-3-3蛋白通常以同源或异源二聚体蛋白形式发挥作用，与一个靶蛋白的两个结构域或两个靶蛋白相互作用(Yaffe et al., 1997)。

14-3-3蛋白在植物中发挥着多种作用，参与植物的生物和非生物的应激反应、代谢、调控叶片气孔的运动、调节植物的生长发育的各个方面(DeLille et al 2001; Chenet al., 2006)，大豆中的18个14-3-3家族蛋白，其中的GmSGF14c和GmSGF14l参与根瘤数目的调控作用，Radwan等发现同时降低GmSGF14c和GmSGF14l基因能够增加根瘤数目，抑制根瘤成熟，并且导致宿主早期结瘤过程中的细胞膜的降解(Radwan et al 2012)。本发明涉及的大豆14-3-3家族蛋白GmSGF14H和GmSGF14I在根瘤数目的调控作用与GmSGF14c和GmSGF14l的作用截然相反，说明大豆中的14-3-3家族蛋白质成员在根瘤数目调控中的作用各不相同。此外GmSGF14H和GmSGF14I在大豆根瘤数目和根瘤发育调控中的研究并未报道。相关的技术参考文献如下。

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Taoka K, Ohki I, Tsuji H, Furuita K, Hayashi K, Yanase T, YamaguchiM, Nakashima C, Purwestri YA, Tamaki S, Ogaki Y, Shimada C, Nakagawa A,Kojima C, Shimamoto K. 14-3-3 proteins act as intracellular receptors forrice Hd3a florigen. Nature, 2011, 476: 332–335.

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发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种增加根瘤数目和促进根瘤发育的转基因植物培育方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种增加根瘤数目和促进根瘤发育的转基因植物培育方法，在植物体内过表达序列表中的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的基因或其同源/等效基因，获得与正常植物相比根瘤数目增加和/或根瘤发育增强的转基因植物。

作为本发明的一种优选技术方案，首先构建含有SEQ ID NO：1/或SEQ ID NO：2所示基因的重组表达载体，然后利用此重组表达载体构建转化体，再利用此转化体侵染目的植物，筛选阳性植株，获得与正常植物相比根瘤数目增加和/或根瘤发育增强的转基因植物。

作为本发明的一种优选技术方案，所述重组过表达载体以PTF101载体为骨架载体，并连接有35S强启动子。

作为本发明的一种优选技术方案，利用所述重组表达载体转化农杆菌K599获得转化体。

作为本发明的一种优选技术方案，利用转化体介导的毛状根转化法获得转基因植物，筛选阳性植株，得到与正常植物相比根瘤数目增加和/或根瘤发育增强的转基因植物。

作为本发明的一种优选技术方案，所述植物为蝶形花科植物，尤其为大豆。

本发明还包含SEQ ID NO：1的正、反向引物，分别如序列表中SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：9所示。

本发明还包含SEQ ID NO：2的正、反向引物，分别如序列表中SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10所示。

本发明还包括含有SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：2的重组表达载体和转化体，以及含有SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：2的转基因植物。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：发明人课题组的研究首次揭示了相关基因在植物结瘤固氮方面的作用，基于这一研究成果构建了本发明的转基因植物培育方法。参看下述实施例，利用本发明构建的过表达载体转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高大豆的根瘤数目，促进根瘤的成熟，后者对减少氮肥施用和提高大豆产量具有重大的意义，在理论研究和农林应用方面均具有重大的实用价值。

附图说明

图1为实施例2中，大豆GmSGF14H和GmSGF14I基因响应根瘤菌处理的表达分析，图中：(A) 大豆幼苗接菌12 h后GmSGF14H基因在根中的表达量；(B) 大豆幼苗接菌14 D后GmSGF14H基因在根中的表达量；(C)大豆幼苗接菌12 h后GmSGF14I基因在根中的表达量；(D)大豆幼苗接菌14 D后GmSGF14I基因在根中的表达量。可见，相对于不接种根瘤菌的处理的大豆根而言，在根瘤菌侵染后14h和28d的大豆根中，GmSGF14H和GmSGF14I基因的表达均受到显著诱导，该结果说明GmSGF14H和GmSGF14I基因参与了大豆根系结瘤固氮的过程。

图2为实施例3中，接根瘤菌14天后毛状根中过表达GmSGF14H对大豆结瘤的表型分析，图中：(A) 空载体和过表达GmSGF14H 的大豆单条毛状根的根瘤数目情况；(B) 空载体和过表达GmSGF14H的单条毛状根上的根瘤数目统计，**， t-tes，0.001< p< 0.01；(C)GmSGF14H 基因在毛状根中的表达检测，*，t-test，0.01< p< 0.05；(D)空载体和过表达GmSGF14H基因的根瘤的横切面。可见，在完全相同的实验环境下，上调表达GmSGF14H的转基因毛状根与空载体转化的转基因根系（EV）相比，根瘤数量显著增多（图2A和2B），图2C为对转基因根系中GmSGF14H的表达水平分析，结果显示在转基因根系中GmSGF14H的平均表达显著高于对照。根瘤切片可以看出过表达GmSGF14H基因的根瘤的固氮区与对照颜相比颜色明显偏红(图2 D)。因此过表达GmSGF14H基因能使得大豆根瘤数目增多，根瘤发育加快。

图3为实施例3中，接根瘤菌14天后毛状根中过表达GmSGF14I对大豆结瘤的表型分析，图中，（A）空载体和过表达GmSGF14I 的大豆单条毛状根的根瘤数目情况；(B) 空载体和过表达GmSGF14I的单条毛状根上的根瘤数目统计，**，t-test，0.001<p<0.01；(C)GmSGF14I 基因在毛状根中的表达检测，**，t-test，0.001<p<0.01；(D) 空载体和过表达GmSGF14I基因的根瘤的横切面。可见，在完全相同的实验环境下，上调表达GmSGF14H的转基因毛状根与空载体转化的转基因根系（EV）相比，根瘤数量显著增多（图3A和3B），图3C为对转基因根系中GmSGF14I的表达水平分析，结果显示在转基因根系中GmSGF14I的平均表达显著高于对照。根瘤切片可以看出过表达GmSGF14I基因的根瘤的固氮区与对照颜相比颜色明显偏红(图3 D)。因此过表达GmSGF14I基因能使得大豆根瘤数目增多，根瘤发育加快。

图4为实施例3中，接根瘤菌28天后毛状根中过表达GmSGF14H对大豆结瘤的表型分析，图中：（A）空载体和过表达GmSGF14H 的大豆单条毛状根的根瘤数目情况；(B) 空载体和过表达GmSGF14H的单条毛状根上的根瘤数目统计，*，t-test，0.01< p< 0.05；(C)GmSGF14H 基因在毛状根中的表达检测，*，t-test，0.01< p< 0.05；(D)空载体和过表达GmSGF14H基因的根瘤的横切面。可见，在完全相同的实验环境下，上调表达GmSGF14H的转基因毛状根与空载体转化的转基因根系（EV）相比，根瘤数量显著增多（图4A和4B），图4C为对转基因根系中GmSGF14H的表达水平分析，结果显示在转基因根系中GmSGF14H的平均表达显著高于对照。根瘤切片可以看出过表达GmSGF14H基因的根瘤的固氮区与对照颜相比颜色明显偏红(图4 D)。因此过表达GmSGF14H基因能使得大豆根瘤数目增多，根瘤发育加快。

图5为实施例3中，接根瘤菌28天后毛状根中过表达GmSGF14I对大豆结瘤的表型分析，图中：（A）空载体和过表达GmSGF14I 的大豆单条毛状根的根瘤数目情况；(B) 空载体和过表达GmSGF14I的单条毛状根上的根瘤数目统计，*，t-test，0.01< p< 0.05；(C)GmSGF14I 基因在毛状根中的表达检测，*，t-test，0.01< p< 0.05；(D) 空载体和过表达GmSGF14I基因的根瘤的横切面。可见，在完全相同的实验环境下，上调表达GmSGF14H的转基因毛状根与空载体转化的转基因根系（EV）相比，根瘤数量显著增多（图5A和5B），图5C为对转基因根系中GmSGF14I的表达水平分析，结果显示在转基因根系中GmSGF14I的平均表达显著高于对照。根瘤切片可以看出过表达GmSGF14I基因的根瘤的固氮区与对照颜相比颜色明显偏红(图5 D)。因此过表达GmSGF14I基因能使得大豆根瘤数目增多，根瘤发育加快。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购买自常规生化试剂公司。下述实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置两次重复实验，结果取平均值。

实施例1、基因的命名和序列。

本发明涉及到大豆14-3-3家族蛋白GmSGF14H和GmSGF14I的编码基因及其应用。本发明构建的过表达载体能够特异的过表达大豆中的GmSGF14H和GmSGF14I基因。该基因分别定位在大豆第4和6号染色体上，分别命名如下，GmSGF14H（基因号：Glyma.04G099900），具有SEQ ID NO：1所示的编码序列；GmSGF14I（基因号：Glyma.06G101500），具有SEQ ID NO：2所示的编码序列。

实施例2、GmSGF14H和GmSGF14I基因响应根瘤菌侵染的表达分析。

1）材料获取：实验所用材料为威廉姆斯82（简称W82）；材料按照以下流程进行：大豆种子用70%的洒精灭菌30 sec，播种于低氮营养液浸泡的蛭石基质中，于培养室中培养，16 h光/8 h 暗，光强7000 LUX，温度26 ℃，相对湿度为70%。播种后15天，做接种根瘤菌处理，每株接种慢生型根瘤菌USDA110菌液（OD600=0.08）30 mL，在接菌后第28天取大豆的根。

2）mRNA的分离：采用Trizol法提取大豆总RNA，①先将组织放入研磨中用液氮研磨3次，将研磨好的组织0.1-0.2 g加入1 mL离心管中然后加入1 mL TRI pure试剂，充分震荡，裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体，室温放置5 min；②加200 μl氯仿，振荡混匀，室温静置5 min，4 ℃，12000 r/min，离心15 min；③将上清移入另外一个离心管中，加入等体积异丙醇，振荡混匀，-20 ℃沉淀30 min，4 ℃，12000 r/min，离心10 min；④弃上清，用75%的乙醇（DEPC处理过的无菌水配制）洗，4 ℃，12000 r/min，离心10 min，重复两次，室温风干10 min左右，加20 μl左右 DEPC处理过的RNase Free水（DEPC水）溶解沉淀。

3）反转录为cDNA：将提取的mRNA用TaKaRa反转录试剂盒，反转录为cDNA。

4）实时荧光定量PCR分析：采用TIANGEN公司的 SuperReal PreMix Plus（SYBRGreen）试剂盒，具体实验方法如下：在10 μl体系中加入上步所得cDNA模板0.2 μl、正反向引物各0.2 μl、2 x SuperReal PreMix Plus 5 μl、ddH2O 4.4 μl；扩增程序为：95 ℃，15min；95 ℃，10 sec；60 ℃，34 sec，40 cycles；65 ℃，5 sec，95 ℃，5 sec；其中，与GmSGF14H和GmSGF14I基因对应的正向引物依次为：

AACATCTGCGACGGTATTCTC（SEQ ID NO：3）；

GCTTGGCCTTGCTCTTAACT（SEQ ID NO：4）；

对应的的反向引物依次为：

CCTGTGGTAATCTCCCTTCATC（SEQ ID NO：5）；

ATGACTCCTCTCCCAGTGTATC （SEQ ID NO：6）；

结果分析：参见附图1，显示在根瘤菌侵染长期的大豆根中，GmSGF14H和GmSGF14I基因的表达受到显著诱导，该结果说明GmSGF14H和GmSGF14I基因参与了大豆根系结瘤固氮过程。

实施例3、高结瘤固氮能力转基因大豆的培育。

1）Wilimas82大豆根组织中总RNA的提取。

研钵经 180 ℃高温处理8 h或经燃烧处理以消除RNA酶污染；氯仿、异丙醇，乙醇等试剂使用新开封未被污染的；其它器材如枪头、离心管和试剂如超纯水、NaAc，均经1 ‰DEPC水处理过夜后121 ℃高温湿热灭菌30 min，枪头，离心管65 ℃烘干备用；采用Trizol法提取大豆总RNA。

（1）取100 mg大豆根材料用液氮研磨材料，加入1 mL TRI pure试剂，充分匀浆后，将匀浆液吸入1.5 mL 离心管，室温放置5 min。

（2）加入200 μl 氯仿，震荡混匀，静置5 min，4 ℃，12000 r/min，离心10 min。

（3）取上清于另一离心管，加等体积异丙醇，振荡混匀，-20 ℃沉淀30 min，4 ℃，12000 r/min，离心10 min。

（4）弃上清，用1 mL 75%的乙醇（DEPC处理过的无菌水配制）洗涤，4 ℃，12000 r/min，离心10 min，重复两次，室温风干10 min左右，加20 μl左右 DEPC处理过的RNase Free水（DEPC水）溶解沉淀。

2）反转录PCR。

（1）在用DEPC 处理过的的200 μl PCR管中顺序加入5μL RNA 和3μL oligo (dt)18；4 μl dNTPs，65 ℃温育5 min 后迅速置于冰上冷却。

（3）按以下顺序加入以下溶液：5X M-MLV buffer（invitrogen公司出品）4μl，RNase inhibitor 1μl，M-MLV 1μl，0.1M DTT 2μl。

（4）将上述反应液混匀，37 ℃反应30 min。

（5）反应结束后，70 ℃处理10 min灭活逆转录酶活性；反应合成的cDNA 第一条链可用作PCR反应模板。

3）构建重组表达载体。

（1）GmSGF14H和GmSGF14I基因片段的克隆。

根据GmSGF14H和GmSGF14I基因的编码序列（SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2）设计引物对用于过表达载体构建，根据pTF101载体上的多克隆位点，引物末端分别引入Sma I和BamH I酶切识别位点；以大豆测序品种W82的cDNA为模板进行PCR，扩增GmSGF14H和GmSGF14I基因，获得基因长度分别为867 bp和 840bp的基因片段。

与2组基因片段对应的正向引物序列依次为：

TCCCCCGGGATGGCGGCCGCTCCC（SEQ ID NO:7）；

TCCCCCGGGATGGCGGCCGCTCC（SEQ ID NO: 8）；

与2组基因片段对应的反向引物序列依次为：

GGATCCCTGGTCATCCTGTTTCGGTG（SEQ ID NO: 9）；

CGCGGATCCGCAACAAACACCTTCTCCCTTC（SEQ ID NO: 10）；

扩增程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 sec，56 ℃ 30 sec，68 ℃ 1 min，30个循环；68℃ 10min。

PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化867bp和840bp左右的条带。

回收的 DNA 片段与Blant3-T载体 (Takara 公司) 连接，10 μl体系中加入Tvector 1 μl，回收片段4 μl，混匀混合液，16 ℃连接过夜，热击法转入E.coli 大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑阳性克隆，送交上海生工测序。

(2) 重组表达载体的构建。

a. 提取含有正确测序的GmSGF14H和GmSGF14I基因列的Blunt 3载体质粒，用Sma I和BamH I酶切获得核苷酸序列。

b.用Sma I和BamH I酶切Blunt 3质粒，获得线状的GmSGF14H和GmSGF14I基因核苷酸序列。

c. 将GmSGF14H和GmSGF14I基因核苷酸序列片段克隆到pTF101载体中。

d. 将连接产物热激转化感受态大肠杆菌DH5α菌株，37 ℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒GmSGF14H-pTF101和GmSGF14I-pTF101。

4）农杆菌K599介导的毛状根转化。

（1）农杆菌的转化，采用液氮冻溶法转化农杆菌。

a. 取出冻存的200 μl感受态细胞，融化后加入5-10 μl质粒DNA，轻弹管壁混匀，冰上放20-30 min。

b. 放入液氮中5 min后取出，将管转入37 ℃（5 min）融化后，加入800 μl LB（无抗性）液体培养基，28 ℃低速振荡 (150 r/min) 4-5 h。

c. 4000 r/min，30 sec, 去上清，加100 μl LB 液体培养基，悬浮菌体后涂板含50 mg/ml 卡那霉素）。

d. 置28 ℃培养至白色转化子长出，用于毛状根的转化。

（2）农杆菌K599介导的毛状根转化。

以大豆品种W82为材料，取种子材料用氯气消毒10 h后，在B5培养基（培养基配方：2％蔗糖，0.8 g琼脂粉（sigma），1×GAMBORG B-5 BASAL（Phyto TechnologyLaboratories，货号：G398），pH调至5.7）上萌发5天，待子叶刚要张开时切下子叶，在子叶下端十字交叉切割，浸在活化的农杆菌K599中侵染30 min（OD600=0.6）后，将外植体转至1/2MS培养基（培养基配方：2％蔗糖，0.8 琼脂粉（sigma），0.5×MURA SHIGE & SKOOG BASALMEDIOM w/VITAMINS （Phyto Technology Laboratories，货号：G519），pH调至5.7；上共培生长3天后，再转至1/2 MS培养基上诱导毛状根，7天后，毛状根长出，待大豆真叶长出，毛状根达到7-8 cm后，选择发育阶段接近的毛状根复合苗移入蛭石中，培养1周后接种根瘤菌USDA110（OD600=0.08）30 mL/株，培养28天后统计根瘤数量。

5） 结果观察。

参见附图2-附图5，可见在完全相同的实验环境下，分别上调表达GmSGF14H和GmSGF14I的转基因根同空载体转化的转基因根系（EV）相比：

A：根瘤数量显著增多（图2 A和2B，图3A和3B,图4 A和4B，图5A和5B）；

B：图2C、图3C、图4C和图5C，分别为对转基因根系中GmSGF14H和GmSGF14I基因的表达水平分析，结果显示在转基因根系中GmSGF14H和GmSGF14I基因的表达均是显著上调的。

C： 图2D、图3D、图4D和图5D分别为对过表达GmSGF14H和GmSGF14I基因根瘤横切图，结果显示过表达GmSGF14H和GmSGF14I基因能够促使根瘤发育。

综上，实施例2中的实时荧光定量PCR检测结果表明，GmSGF14H和GmSGF14I基因在大豆根中的表达受到根瘤菌侵染的诱导。实施例3进一步通过毛状根转化嵌合苗的结瘤分析显示，上调表达GmSGF14H和GmSGF14I基因可以显著促进大豆根系结瘤数目的增加，表明GmSGF14H和GmSGF14I基因在大豆根瘤发育中具有重要的作用，在高产大豆培育方面具有重要的潜在和实际应用前景。

已有的研究显示，14-3-3蛋白在植物中发挥着多种作用，参与植物的生物和非生物的应激反应、代谢、调控叶片气孔的运动、调节植物的生长发育的各个方面(DeLille etal 2001; Chen et al., 2006)，大豆中的18个14-3-3家族蛋白，其中的GmSGF14c和GmSGF14l参与根瘤数目的调控作用，Radwan等发现同时降低GmSGF14c和GmSGF14l基因能够增加根瘤数目，抑制根瘤成熟，并且导致宿主早期结瘤过程中的细胞膜的降解(Radwan etal 2012)。

本发明涉及的大豆14-3-3家族蛋白GmSGF14H和GmSGF14I在根瘤数目的调控作用与GmSGF14c和GmSGF14l的作用截然相反，说明大豆中的14-3-3家族蛋白质成员在根瘤数目调控中的作用各不相同。

上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种增加根瘤数目和促进根瘤发育的转基因植物培育方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 867

<212> DNA

<213> 大豆属大豆(glycine max)

<400> 1

atggcggccg ctccctcgcc tcgcgaagag aacgtgtaca tggcgaagct cgccgagcag 60

gccgagcgct acgaagagat ggtggagttc atggagaagg tctccgccgc cgccgacaac 120

gaggagctca ccgtcgagga gaggaacctc ctctccgtcg cgtacaagaa cgtgatcgga 180

gcgcgccgcg cctcgtggcg catcatctcc tcgatcgagc agaaggagga gagccgcggc 240

aacgaggacc acgtctccgt catccgcgac taccgatcca agatcgagtc cgagctctcc 300

aacatctgcg acggtattct caagctcctc gactctcgcc tcattccctc cgcttcctcc 360

ggcgattcca aggtcttcta cctcaagatg aagggagatt accacaggta cctcgccgag 420

ttcaagaccg gcgccgagcg taaggaggct gccgagagca ctctctctgc atacaaagcc 480

gctcaggaca ttgcaaatgc cgaactgcct ccaactcatc caattaggct tggccttgca 540

cttaacttct ctgtatttta ctacgaaatc cttaactctc ccgatcgtgc ctgcaacctt 600

gcaaaacagg cttttgatga agctattgct gaattggata cactgggaga ggagtcatac 660

aaggatagca ctctgatcat gcaactcctt cgtgataacc tcaccctttg gacctctgac 720

atgcaggtat tgattttagg ttgccatagc tcatccatca cttctttttt tatttccctt 780

ttttgtgttg tcgacttatt attgtggttt caggatgatg gagcagatga aattaaagaa 840

gcagcaccga aacaggatga ccagtaa 867

<210> 2

<211> 840

<212> DNA

<213> 大豆属大豆(glycine max)

<400> 2

atggcggccg ctccctcgcc tcgcgaagag aacgtctaca tggcgaagct cgccgagcag 60

gccgagcgct acgaagagat ggtggagttc atggagaagg tctccgccgc cgccgacaac 120

gaggaactta ccgtggagga gaggaacctc ctctccgtcg cctacaagaa cgtgatcgga 180

gcgcgccgcg cctcgtggcg catcatctcc tcgatcgagc agaaggagga gagccgcggc 240

aacgaggatc acgtctccgt catccgcgac taccgatcca agatcgagtc cgagctctcc 300

aacatctgcg acggtatcct caagctcctc gactctcgcc tcattccatc cgcttcctcc 360

ggcgattcca aggtcttcta cctcaagatg aagggagatt accacagata ccttgccgag 420

ttcaagaccg gcgccgagcg taaggaggct gccgagagca ctctctctgc atacaaagcc 480

gcacaggaca ttgcgaatgc cgaactgcct cctactcatc caattaggct tggccttgct 540

cttaactttt ctgtatttta ctacgaaatc cttaattctc cggatcgtgc ctgcaacctt 600

gcaaaacagg cttttgatga agctattgct gaattggata cactgggaga ggagtcatac 660

aaggatagca ctttgatcat gcaactcctt cgtgataacc tcacactttg gacctctgac 720

atgcagatga aattaaagaa gcagcaccga aaccggatga ccagtaaaaa tattttactg 780

ctaattagaa ttgaacttct cctccatatc tttttgaagg gagaaggtgt ttgttgctaa 840

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

aacatctgcg acggtattct c 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

gcttggcctt gctcttaact 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

cctgtggtaa tctcccttca tc 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

atgactcctc tcccagtgta tc 22

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

tcccccggga tggcggccgc tccc 24

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

tcccccggga tggcggccgc tcc 23

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

ggatccctgg tcatcctgtt tcggtg 26

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

cgcggatccg caacaaacac cttctccctt c 31

Claims (5)

1.一种增加根瘤数目和促进根瘤发育的转基因植物培育方法，其特征在于：在植物体内过表达序列表中的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的基因，获得与正常植物相比根瘤数目增加和/或根瘤发育增强的转基因植物；所述植物为大豆。

2.根据权利要求1所述的一种增加根瘤数目和促进根瘤发育的转基因植物培育方法，其特征在于：首先构建含有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示基因的重组表达载体，然后利用此重组表达载体构建转化体，再利用此转化体侵染目的植物，筛选阳性植株，获得与正常植物相比根瘤数目增加和/或根瘤发育增强的转基因植物。

3.根据权利要求2所述的一种增加根瘤数目和促进根瘤发育的转基因植物培育方法，其特征在于：所述重组表达载体以PTF101载体为骨架载体，并连接有35S强启动子。

4.根据权利要求2所述的一种增加根瘤数目和促进根瘤发育的转基因植物培育方法，其特征在于：利用所述重组表达载体转化农杆菌K599获得转化体。

5.根据权利要求2所述的一种增加根瘤数目和促进根瘤发育的转基因植物培育方法，其特征在于：利用转化体介导的毛状根转化法获得转基因植物，筛选阳性植株，得到与正常植物相比根瘤数目增加和/或根瘤发育增强的转基因植物。

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