CN108546705B

CN108546705B - 一种拟南芥开花时间调节基因ssf及其应用

Info

Publication number: CN108546705B
Application number: CN201810611440.9A
Authority: CN
Inventors: 李培金; 王云鹤; 王传宏; 陶珍
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2018-06-14
Filing date: 2018-06-14
Publication date: 2020-08-14
Anticipated expiration: 2038-06-14
Also published as: CN108546705A

Abstract

本发明提供了一种拟南芥开花时间调节基因SSF及其应用，属于基因工程技术领域，该SSF基因属于FCA家族蛋白中的一员，FCA在拟南芥中通过对FLC前体mRNA的调控来促进FLC的表达，抑制营养生长向生殖生长的转变。拟南芥中的另一个重要的自主途径中的开花时间调控基因FY能够通过该家族的WW蛋白相互作用结构域形成蛋白复合体，调节FLC前体mRNA 3'端剪接，从而影响FLC的表达，进而调节拟南芥开花。

Description

一种拟南芥开花时间调节基因SSF及其应用

技术领域

本发明涉及的是基因工程技术领域，尤其涉及的是一种拟南芥开花时间调节基因SSF及其应用。

背景技术

植物开花是高等植物由营养生长向生殖生长的转变，是个体发育和后代繁衍的中心环节。这一发育的转变是植物体自身的发育条件和外部环境因素共同决定的。在拟南芥开花调控网络中，开花抑制基因FLC处于关键枢纽地位。FLC的表达受许多来自环境和生长发育的信号调控，主要包括：FRI依赖途径、自主途径和春化作用途径基因。那么如何找出这些调控途径中的关键基因，更进一步了解植物开花的遗传调控机理，为基因工程指导遗传育种奠定理论依据，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种拟南芥开花时间调节基因SSF及其应用，以提供一种新的、可调节植物开花时间的基因。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种拟南芥开花时间调节基因SSF，该基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或具有与SEQ ID NO.1所示序列互补的核苷酸序列，该基因是从拟南芥植物中克隆获得的，也可通过人工合成方法获得，全长1539bp。

本发明还提供了上述拟南芥开花时间调节基因SSF在延迟植物开花时间中的应用。

本发明还提供了上述拟南芥开花时间调节基因SSF的编码蛋白，该编码蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，共编码512个氨基酸。

本发明还提供了一种植物表达载体，该植物表达载体含有上述拟南芥开花时间调节基因，优选地，所述植物表达载体为pGreenII0179载体。

本发明还提供了一种遗传工程化的宿主细胞，该宿主细胞含有上述拟南芥开花时间调节基因SSF，或含有上述植物表达载体，优选地，所述宿主细胞为农杆菌GV3101。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种拟南芥开花时间调节基因SSF及其应用，该基因属于FCA家族蛋白中的一员，在拟南芥中起到抑制营养生长向生殖生长的转变，通过对FLC前体mRNA的调控促进FLC的表达。拟南芥中的另一个重要的自主途径中的开花时间调控基因FY能够通过该家族的WW蛋白相互作用结构域形成蛋白复合体，调节FLC前体mRNA 3'端剪接，从而影响FLC的表达，进而调节拟南芥开花。能够与自主途径中的重要基因FY相互作用。该基因也可以参与FLC上的染色质组蛋白去甲基化修饰，促进FLC表达从而调控植物开花。

附图说明

图1为SSF全长扩增电泳图，图中，泳道1-2为SSF基因片段，M为Marker(Trans2K)；

图2为未转基因的SSF-1和SSF-2突变体株系花期统计；

图3为转基因阳性植株花期统计；

图4为转基因株系主根中SSF亚细胞定位；

图5为酵母双杂交实验四缺培养基筛选鉴定验证SSF基因与YF的蛋白相互作用结果图。

具体实施方式

实施例1

1、材料

本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。

2、方法

2.1拟南芥SSF基因的克隆

2.1.1以拟南芥野生型Col-0品种为材料，提取RNA，并将提取的总RNA进行反转录合成cDNA第一链，作为PCR扩增的模板。

2.1.2用设计的特异性引物：

SSF-F：(5'>ATGGAGAGACGCGCCCCAA<3')

SSF-R：(5'>TTATGAACATGTTGTTTCAACAGCTA<3')

进行扩增，得到1539bp的基因片段(图1)，连接到T克隆载体PEASY-T5simplevector上，获得T-SSF转化进入大肠杆菌，挑取阳性克隆并测序，测序结果与预测结果一致，获得如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.1.3对上述扩增获得的SSF基因及其编码蛋白进行生物信息学分析，发现该SSF是调控拟南芥开花时间关键基因FLC的重要基因，属于FCA家族蛋白中的一员，在拟南芥中起到抑制营养生长向生殖生长的转变。该家族具有两个保守的RNA结合结构域和一个WW蛋白相互作用结构域，编码RNA结合蛋白，通过对FLC前体mRNA的调控促进FLC的表达。

2.2拟南芥突变体和转基因鉴定该基因的功能

2.2.1根据SSF基因序列，从英国诺丁汉拟南芥种子中心(NottinghamArabidopsis Stock Center)订购两个独立的T-DNA插入突变体Salk_023927(SSF-1)和Salk_025857C(SSF-2)，根据TAIR网站提供的T-DNA引物鉴定方法合成鉴定引物：

Salk_023927(SSF-1)：

LP:5'>TTATTCCCATTGGGACAAGTG<3'

RP:5'>AGATTTGTCGTGGTATGTCCG<3'

LBb1.3:5'>ATTTTGCCGATTTCGGAAC<3'

Salk_028875(SSF-2)：

LP:5'>TAACCGCTGTGGATAAGGATG<3'

RP:5'>TTTGTTGTATCCCAATGGCTC<3'

LBb1.3:5'>ATTTTGCCGATTTCGGAAC<3'

通过旁侧序列测序结果分析，该T-DNA插入突变体Salk_023927(SSF-1)和Salk_025857C(SSF-2)分别插入SSF基因内含子8和外显子10号上导致功能缺失。两个独立的突变体植株在长日照和短日照条件下都表现出早花和低FLC表达表型。说明该基因功能是通过影响FLC表达从而使植物晚花。

2.2.2构建亚细胞定位及互补载体

根据获得的上述拟南芥品种的SSF基因的基因组DNA序列，设计特异引物构建亚细胞定位及互补载体(横线为酶切位点，斜体小写字母为mini-linker)：

SSF-F1：5'>GGTACCATAGAAAGTTTAGTGGGAATTTGGA<3'

SSF-R1：5'>GTCGACTGAACATGTTGTTTCAACAGCTA<3'

SSF-F2：5'>GGATCCAAGGTTTCTTCAGGTAATGAAGTG<3'

SSF-R2：5'>GCGGCCGCCTGAAGACAATGAACAGTTAAGAAG<3'

GFP-F:5'>AGTCGACtctgctgccgcatccgcggcagcttcagccAGCAAGGGCGAGGAGCTG TTCA<3'

GFP-R:5'>GGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC<3'

获得带有酶切位点的SSF及GFP片段。

2.2.3将测序正确的带有酶切位点SSF及GFP片段分别经Kpn I和Sal I、BamHⅠ和Spe I双酶切，相应地，将构建载体pGreenII0179(http://www.pgreen.ac.uk/JIT/pG0179.htm)双酶切，回收目的片段与载体。利用T4连接酶，16℃过夜连接，经热激法转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，采用菌液PCR方法筛选阳性克隆并进行测序分析，最终构建成植物表达载体pGreen-SSF-GFP。

将pGreen-SSF-GFP和pSoup(http://www.pgreen.ac.uk/a_pls_fr.htm)质粒转入感受态农杆菌GV3101中，采用PCR法鉴定阳性克隆。

2.2.4挑选阳性菌液，加入5mL含有卡那霉素Kan、利福平Rif抗性的LB液体培养基，28℃培养过夜，然后按体积比1∶100接种于250mL的含有卡那霉素Kan、利福平Rif抗性的LB液体培养基，28℃培养至OD₆₀₀值在0.6～0.8之间。

2.2.5收集菌体，通过花粉介导法转入SSF-2突变体拟南芥，待种子成熟后(T0)，对种子进行潮霉素抗性筛选，阳性苗(T1)培养于人工气候室至种子成熟。

2.2.6筛选T3代纯合转基因种子，播种后鉴定表型，结果如图2-3所示：

图2可以看出，未转基因的SSF-1和SSF-2突变体株系表现出明显的早花表型；图3可以看出，转基因互补株系与野生型Col-0开花时间无明显差异，回补了突变体的早花表型；图4对转基因植株幼根主根进行亚细胞定位观察，结果表明SSF定位在细胞核中。

2.3酵母双杂交验证该基因与YF的蛋白相互作用

2.3.1根据上述获得的拟南芥品种的SSF基因和NCBI网站公布的FY基因(AT5G13480)的CDS序列，设计特异引物(横线为酶切位点)：

SSF-F3：5'>GAATTCATGGAGAGACGCGCCCCAA<3'

SSF-R3：5'>GGATCCTTATGAACATGTTGTTTCAACAGCTA<3'，添加酶切位点。

2.3.2将测序正确的带有酶切位点SSF和FY片段及酵母双杂交系统(

Gold Yeast Two-Hybrid System)构建载体pGBK-T7、pGAD-T7分别经EcoRI、BamHⅠ双酶切，回收目的片段与载体。并与T4连接酶混合后，16℃过夜连接，经热激法转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，采用菌液PCR方法筛选阳性克隆并进行测序分析，最终构建成酵母双杂交实验表达载体pGBK-T7-SSF和pGAD-T7-FY。

2.3.3在5ml YPDA培养基中30℃，250rpm培养酵母细胞(AH109)，18个小时后扩大为30mlYPDA培养基培养，初始浓度为0.2-0.4。四个小时后菌液浓度达到0.4-0.6，使用低温离心的方法，制作酵母感受态细胞，热激转化表达载体pGBK-T7-SSF和pGAD-T7-FY，并涂布在二缺固体培养基中(SD-Leu/-Trp)。两天后待酵母长出使用5-7ml二缺液体培养基(SD-Leu/-Trp)30℃，250rpm培养酵母细胞，过夜培养。第二天通过离心清洗重悬酵母细胞，并进行等比例稀释涂布在四缺固体培养基(SD-Leu/-Trp/-His/-Ade)上。

2.3.4通过在四缺固体培养基(SD-Leu/-Trp/-His/-Ade)上筛选鉴定，获得图5，图5中可以看出，SSF能够在酵母中与FY相互作用。

3、结论

SSF是调控拟南芥开花时间关键基因FLC的重要基因，SSF基因能与拟南芥中自主途径中的另一个重要开花时间调控基因FY相互作用，从而促进FLC的表达，进而调节拟南芥开花，起到抑制营养生长向生殖生长的转变。

以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 一种拟南芥开花时间调节基因SSF及其应用

<141> 2018-06-14

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1539

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

atggagagac gcgccccaaa cgcattccct ggtgctccac caccagttcc ctactatcat 60

aacaactaca acaaccctcc tcatcatcag attcatccgc cgccgccgcc gcaccaccat 120

atcgctgccg ttggattcca caaatacccc caaaacgaca acagggatca gcgtttcaat 180

caaccgcatt actccggcca acagcagaac atgatcgttg atcagagtaa taacgctcct 240

ccgccgtttc cgccgagtcc ttgcggtggc agcagcttaa ggaagagacg gtctcaatca 300

gctacagata atgctgatgg tagtattgcc aagttatatg ttgcgcccat ctcaaagaca 360

gctactgaat atgatatccg tcaggtcttt gaaaaatatg gtaatgtcac tgagatcatt 420

ctacccaaag ataagatgac cggtgaaagg gcagcttact gttttattaa gtacaaaaag 480

gtagaagagg gtaatgcggc tattgcagct ttaactgaac agtttacctt tcctggggaa 540

atgcttccag tcaaggtccg atttgctgaa gctgaacgag aacggattgg ttttgcccca 600

gtgcaacttc ctgataaccc taaactatat gttagatgcc tcaacaaaca aactacaaaa 660

atggaagtca atgaggtctt ctctaggtac ggaatcattg aagatattta tatggcactt 720

gacgacatga agatttgtcg tgggtatgca tttgttcagt tttcttgtaa agagatggca 780

ctagcggcaa tcaaagcttt aaatggactc tttaccatac ggggttctga tcagcctctg 840

attgttagat ttgctgatcc taaaaaaccc cgtctagggg aacaaaggtc tacctttaac 900

actccacctg caatgcaaca cttcgaccca aattggcatt cacaaccata tccccagtgg 960

gaaaacaagg aacctgcacc ccctagagtc gttcagcatc atgatttctc ttcacagcca 1020

aatcacttcc cgcaccaaaa tactcaagca gtatccgagg ttcataaacc actgcatcaa 1080

gatattccac ctgctaattt tgagaagcat cagaaatctg agactgccag cgtggagact 1140

agaagtgatg gtcagaagat ttctagtcat tcaaatgcat tccatgaaga tcaaaataca 1200

gtgagctcag agtgtgactg gagtgaacac acttgtccca atgggaataa atattacttc 1260

cattgcatca cttgcgaaag cacgtgggag aaaccggacg aatactccat gtatgaaaga 1320

tggttgaaag agcaaacaag gctacaggat gaaaaaatta aatctccccc gttaaacaat 1380

gagagccaag aagcaatcga aaacagcgag caagttgagt ctgatgtatt acaacagaat 1440

ggtgaactcc aacaaccatc cttatccaca gcggatcagg agaacaatgt agtagtatat 1500

ccagtaacaa cactagctgt tgaaacaaca tgttcataa 1539

<210> 2

<211> 512

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 2

Met Glu Arg Arg Ala Pro Asn Ala Phe Pro Gly Ala Pro Pro Pro Val

1 5 10 15

Pro Tyr Tyr His Asn Asn Tyr Asn Asn Pro Pro His His Gln Ile His

20 25 30

Pro Pro Pro Pro Pro His His His Ile Ala Ala Val Gly Phe His Lys

35 40 45

Tyr Pro Gln Asn Asp Asn Arg Asp Gln Arg Phe Asn Gln Pro His Tyr

50 55 60

Ser Gly Gln Gln Gln Asn Met Ile Val Asp Gln Ser Asn Asn Ala Pro

65 70 75 80

Pro Pro Phe Pro Pro Ser Pro Cys Gly Gly Ser Ser Leu Arg Lys Arg

85 90 95

Arg Ser Gln Ser Ala Thr Asp Asn Ala Asp Gly Ser Ile Ala Lys Leu

100 105 110

Tyr Val Ala Pro Ile Ser Lys Thr Ala Thr Glu Tyr Asp Ile Arg Gln

115 120 125

Val Phe Glu Lys Tyr Gly Asn Val Thr Glu Ile Ile Leu Pro Lys Asp

130 135 140

Lys Met Thr Gly Glu Arg Ala Ala Tyr Cys Phe Ile Lys Tyr Lys Lys

145 150 155 160

Val Glu Glu Gly Asn Ala Ala Ile Ala Ala Leu Thr Glu Gln Phe Thr

165 170 175

Phe Pro Gly Glu Met Leu Pro Val Lys Val Arg Phe Ala Glu Ala Glu

180 185 190

Arg Glu Arg Ile Gly Phe Ala Pro Val Gln Leu Pro Asp Asn Pro Lys

195 200 205

Leu Tyr Val Arg Cys Leu Asn Lys Gln Thr Thr Lys Met Glu Val Asn

210 215 220

Glu Val Phe Ser Arg Tyr Gly Ile Ile Glu Asp Ile Tyr Met Ala Leu

225 230 235 240

Asp Asp Met Lys Ile Cys Arg Gly Tyr Ala Phe Val Gln Phe Ser Cys

245 250 255

Lys Glu Met Ala Leu Ala Ala Ile Lys Ala Leu Asn Gly Leu Phe Thr

260 265 270

Ile Arg Gly Ser Asp Gln Pro Leu Ile Val Arg Phe Ala Asp Pro Lys

275 280 285

Lys Pro Arg Leu Gly Glu Gln Arg Ser Thr Phe Asn Thr Pro Pro Ala

290 295 300

Met Gln His Phe Asp Pro Asn Trp His Ser Gln Pro Tyr Pro Gln Trp

305 310 315 320

Glu Asn Lys Glu Pro Ala Pro Pro Arg Val Val Gln His His Asp Phe

325 330 335

Ser Ser Gln Pro Asn His Phe Pro His Gln Asn Thr Gln Ala Val Ser

340 345 350

Glu Val His Lys Pro Leu His Gln Asp Ile Pro Pro Ala Asn Phe Glu

355 360 365

Lys His Gln Lys Ser Glu Thr Ala Ser Val Glu Thr Arg Ser Asp Gly

370 375 380

Gln Lys Ile Ser Ser His Ser Asn Ala Phe His Glu Asp Gln Asn Thr

385 390 395 400

Val Ser Ser Glu Cys Asp Trp Ser Glu His Thr Cys Pro Asn Gly Asn

405 410 415

Lys Tyr Tyr Phe His Cys Ile Thr Cys Glu Ser Thr Trp Glu Lys Pro

420 425 430

Asp Glu Tyr Ser Met Tyr Glu Arg Trp Leu Lys Glu Gln Thr Arg Leu

435 440 445

Gln Asp Glu Lys Ile Lys Ser Pro Pro Leu Asn Asn Glu Ser Gln Glu

450 455 460

Ala Ile Glu Asn Ser Glu Gln Val Glu Ser Asp Val Leu Gln Gln Asn

465 470 475 480

Gly Glu Leu Gln Gln Pro Ser Leu Ser Thr Ala Asp Gln Glu Asn Asn

485 490 495

Val Val Val Tyr Pro Val Thr Thr Leu Ala Val Glu Thr Thr Cys Ser

500 505 510

Claims

1.一种拟南芥开花时间调节基因SSF在延迟植物开花时间中的应用，其特征在于，所述拟南芥开花调节基因SSF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或为与SEQ ID NO.1所示序列互补的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的拟南芥开花调节基因SSF在延迟植物开花时间中的应用，其特征在于，所述拟南芥开花调节基因SSF的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共编码513个氨基酸。

3.根据权利要求1所述的拟南芥开花调节基因SSF在延迟植物开花时间中的应用，其特征在于，构建植物表达载体，该植物表达载体含有所述拟南芥开花调节基因SSF。

4.根据权利要求3所述的拟南芥开花调节基因SSF在延迟植物开花时间中的应用，其特征在于，所述植物表达载体为pGreenII0179载体。

5.根据权利要求1-4任一所述的拟南芥开花调节基因SSF在延迟植物开花时间中的应用，其特征在于，构建遗传工程化的宿主细胞，该宿主细胞含有如权利要求1所述的拟南芥开花时间调节基因SSF，或含有如权利要求3、4任一所述的植物表达载体。

6.根据权利要求5所述的拟南芥开花调节基因SSF在延迟植物开花时间中的应用，其特征在于，所述宿主细胞为农杆菌GV3101。