CN117089566A - 一种水稻转录因子bZIP34及其编码基因在延迟植物抽穗期中的应用 - Google Patents
一种水稻转录因子bZIP34及其编码基因在延迟植物抽穗期中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了水稻转录因子bZIP34或其编码基因在延迟植物抽穗期中的应用，所述水稻转录因子bZIP34的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，水稻转录因子bZIP34的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了一种培育抽穗期延迟的转基因植物的方法。本发明首次发现转录因子bZIP34与水稻抽穗期相关，在正常的水稻和拟南芥中过表达转录因子bZIP34基因能够显著延迟两种植物的抽穗时期。本发明的过表达转录因子bZIP34影响水稻和拟南芥的抽穗时间。将所述蛋白的编码基因导入到普通植物中，可以得到抽穗期延迟的转基因植物。因此，所述蛋白及其编码基因可以应用于作物抽穗期性状的遗传改良。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种水稻转录因子bZIP34及其编码基因在延迟植物抽穗期中的应用。
背景技术
水稻是我国重要的粮食作物之一，超过一半的人口以稻米为口粮。我国地域辽阔，南北纬度跨度较广，导致不同地区的气候差异也较大，因此需要选择合适抽穗期的水稻品种种植。抽穗是从营养生长过渡到生殖生长的重要标志，通常将种子开始播种到主穗刚抽出这段时间称为抽穗期。抽穗期作为水稻重要的农艺性状，决定着稻米的种植范围和田间产量。抽穗过早导致营养生长时间太短，产量严重下降；抽穗过晚导致灌浆后期遭遇低温胁迫，严重影响稻米产量和品质。水稻抽穗时间受到多种因素的影响，例如光周期、干旱、赤霉素和温度等。光周期作为对水稻抽穗影响最大的外界环境因子，根据日照时间的长短分为短日照(Short-day，SD)和长日照(Long-day，LD)。水稻是一种典型的SD模式生物，SD处理能够加速水稻抽穗。目前在水稻中共发现两条较为保守的调控抽穗期的通路：OsGI-Hd1-Hd3a和Ghd7-Ehdl-Hd3a/RFT1。随着水稻功能基因组学的快速发展，越来越多的控制水稻抽穗期的基因被克隆，深入研究并解析这些基因参与调控水稻抽穗期的作用机制，将有助于我们通过基因工程的手段对水稻的抽穗期进行改良，扩大不同水稻品种的国内的种植面积。
真核生物的转录起始一般需要多个蛋白因子参与，其中转录因子能够结合RNA聚合酶II形成起始复合体，共同参与转录起始的过程。根据与DNA结合的结构域的特征不同，可以将转录因子分为bZIP、NAC、MYB、NF-Y和WRKY等几大类，其中bZIP转录因子广泛存在植物中。碱性亮氨酸拉链(Basic leucine zipper，bZIP)因含有高度保守的bZIP结构域而得名，bZIP结构域分为紧密结合的DNA基本区和亮氨酸拉链二聚区。bZIP结构由60～80个氨基酸组成，形成连续的α-螺旋结构，通过亮氨酸拉链形成二聚体。
水稻基因组中bZIP转录因子含有89个成员，目前为止已经克隆多个成员，并展开了功能研究。例如，OsbZIP47和OsbZIP58分别参与植物种子的生长发育和淀粉合成，OsbZIP1和OsbZIP52分别参与生物胁迫和非生物胁迫的响应过程，bZIP蛋白的OSBZ8和HY5分别参与水稻激素信号的传导和参与光信号传导和形态建成。
OsbZIP34基因属于水稻bZIP转录因子家族的一个成员，位于水稻第3染色体上。目前为止，已经有专利揭示bZIP34可以用于禾本科植物的产量性状或种子的淀粉特性，进而获得高产和种子淀粉含量升高的植物。有关bZIP34的研究报道主要与产量和稻米淀粉特性相关，未有其在植物抽穗期性状的研究报道。鉴于bZIP转录因子的功能多种多样，本专利主要揭示bZIP34在调控植物抽穗期中的功能和相关应用。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了水稻转录因子bZIP34或其编码基因在延迟植物植物抽穗期中的应用。本发明首次发现该转录因子与水稻抽穗期相关，在正常的水稻和拟南芥中过表达本发明蛋白bZIP34的编码序列能够显著延迟两种植物的抽穗时期。本发明将有助于进一步解析植物的抽穗期调控机制，并为通过基因工程技术改良植物抽穗期提供了基因资源和理论参考。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了水稻转录因子bZIP34或其编码基因在延迟植物植物抽穗期中的应用，所述水稻转录因子bZIP34的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，水稻转录因子bZIP34的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
该水稻转录因子bZIP34来自稻属水稻(Oryza sativa var.Zhonghua 11)。本发明序列表中的SEQ ID NO.2由340个氨基酸残基组成，中间的第232至296位氨基酸为bZIP(Basicleucine zipper domain)结构域。本发明序列表中的SEQ ID NO.1由1020个核苷酸组成。
本发明的水稻转录因子bZIP34还包括将SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抽穗期相关的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。
本发明的水稻转录因子bZIP34可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述的bZIP34的编码基因可通过将序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5’端和/或3’端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述的bZIP34的编码基因还包括在严格条件下与SEQ ID NO.1所示的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
进一步地，其与SEQ ID NO.1所示的DNA序列具有90％以上同源性，且编码抽穗期相关蛋白的DNA分子；
其中，所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
本发明内容还包括含有水稻转录因子bZIP34的编码基因的表达盒、重组表达载体、重组细胞或重组菌在延迟植物抽穗期中的应用，所述水稻转录因子bZIP34的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
为了便于转基因阳性植株的筛选，所述重组表达载体可为在pCAMBIA1305-Ubi-GFP载体(含有GFP绿色荧光蛋白标签)的多克隆位点Spe I和BamH I之间重组插入所述基因(bZIP34)得到的重组质粒。所述重组质粒具体可为pCAMBIA1305-Ubi-bZIP34-GFP；所述pCAMBIA1305-Ubi-bZIP34-GFP是将由bZIP34的CDS(由于后面连接GFP标签，所有是去掉终止密码子)片段通过同源重组技术插入到pCAMBIA1305-Ubi-GFP多克隆位点Spe I和BamH I之间得到的(南京诺唯赞公司，ClonExpress II One Step Cloning Kit)。
其中，所述植物包括但不仅限于水稻或拟南芥。
本发明内容还包括一种培育抽穗期延迟的转基因植物的方法，将含有水稻转录因子bZIP34的重组表达载体导入植物中，得到抽穗期延迟的转基因植物。
其中，所述含有水稻转录因子bZIP34的重组表达载体是将核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的水稻转录因子bZIP34的编码基因导入载体中得到。
其中，所述植物表达载体包括双元农杆菌载体或用于植物微弹轰击的载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。
其中，所述载体包括pCAMBIA1305-Ubi-GFP。
其中，所述水稻转录因子bZIP34的编码基因前还包括增强型启动子或组成型启动子。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优势：本发明首次发现转录因子bZIP34与水稻抽穗期相关，在正常的水稻和拟南芥中过表达转录因子bZIP34基因能够显著延迟两种植物的抽穗时期。本发明的过表达转录因子bZIP34影响水稻和拟南芥的抽穗时间。将所述蛋白的编码基因导入到普通植物中，可以得到抽穗期延迟的转基因植物。因此，所述蛋白及其编码基因可以应用于作物抽穗期性状的遗传改良。
附图说明
图1为qRT-PCR检测bZIP34基因在中花11不同组织中的表达水平。R表示根；S表示茎秆；L表示叶片；LS表示叶鞘；P表示穗子；PC表示果皮；EN表示胚乳；EM表示胚。
图2为bZIP34蛋白的基本功能特性，其中A图表示bZIP34蛋白含有340个氨基酸，其中第232至396位氨基酸为Basic leucine zipper结构域；B图表示利用酵母双杂交证明bZIP34可以与自身发生互作；C图表示利用GST pull down实验证明bZIP34可以与自身发生互作；D图表示在烟草中利用双分子荧光互补实验进一步证实bZIP34可以与自身发生互作；E图表示利用水稻原生质体系统证明bZIP34具有转录抑制作用。
图3为bZIP34过表达株系的构建和检测，其中A图表示过表达载体结构图；B图表示转基因水稻根尖中绿色荧光观察；C图表示过表达株系中bZIP34基因表达量检测；D图表示过表达株系中bZIP34-GFP的鉴定。
图4为bZIP34过表达株系植株和穗子的表型及抽穗期统计，其中A图表示bZIP34过表达植株的表型；B图表示bZIP34过表达植株穗子表型；C图表示过表达株系抽穗期的统计。
图5为bZIP34过表达株系中抽穗期相关基因的表达分析，其中图A，C，E，G和I表示短日照处理(10h白昼/14h黑夜)；图B，D，F，H和J表示长日照处理(为14h白昼/10h黑夜)。
图6为bZIP34过表达拟南芥植株的表型，其中图A表示生长5周的拟南芥野生型和过表达植株表型；图B表示成熟期拟南芥野生型和过表达植株的表型；图C表示拟南芥过表达植株中bZIP34-GFP蛋白的鉴定；图D表示拟南芥野生型和过表达植株的开花时间。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1植物抽穗期相关蛋白及其编码基因的克隆与表型分析
一、水稻bZIP34蛋白的基本功能特性研究
前期对实验室的转录组数据进行分析，发现bZIP34基因(国家水稻数据中心https://www.ricedata.cn/gene/gene_info.aspx？id＝LOC_Os03g59460)在胚和胚乳中表达量较高。以bZIP34基因为模板设计并合成荧光定量引物Primer 1：5′-ATGGCATCCTCGGCCGCCT-3′(SEQ ID NO.3)和Primer 2：5′-CTACCCTTTGCTGTCATCATTTGT-3′(SEQ ID NO.4)。利用植物RNA提取试剂盒提取水稻中花11品种(购买于杭州百格生物技术有限公司)各个组织和开花后不同时期的发育期胚乳的RNA，并反转录成单链的cDNA。将反转录获得的cDNA稀释5倍作为模板，利用近岸蛋白质科技有限公司试剂盒SYBRqPCR SuperMix Plus配制RT-qPCR反应体系，cDNA(100ng/μL)加1μL，2 x SupeMix Plus加10μL，Primer 1和Primer各0.4μL(浓度为10pmol)，加入8.2μL无菌水补齐到20μL体系。采用BIO-RAD CFX96 PCR仪进行定量分析。PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，变性、退化和延伸进行40个循环，最后添加溶解曲线。设置三次生物学重复，水稻肌动蛋白基因Actin作为内参基因，利用2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。结果显示bZIP34基因在根、茎、叶、叶鞘和穗中都有所表达，而在果皮、胚和胚乳中表达较高(图1)。利用生物信息学网站(http://smart.embl-heidelberg.de)对bZIP34进行结构域预测，发现靠近蛋白C端含有一个碱性亮氨酸拉链结构域(232位至296位氨基酸)(图2A)。利用WoLF PSORT网站(https://wolfpsort.hgc.jp)进行预测，bZIP34含有核定位信号(图2A)。
大多数转录因子会形成同源或者异源二聚体发挥作用，因此我们利用酵母双杂交、GST pull down和BiFC多个实验检测bZIP34是否是以同源二聚体的形式发挥功能。分别以pGBKT7和pGADT7(载体购买于美国Clontech公司)作为载体骨架，选用EcoR I和BamH I作为酶切位点，采用双切双连方法将bZIP34的CDS片段构建到pGBKT7和pGADT7载体上，获得重组载体BD-bZIP34和AD-bZIP34。配制酵母培养基所用到的试剂Trp Leu Minus Media、TrpLeu His Ade Minus Media和YPDA均为北京泛基诺科技有限公司的产品。SD/-Trp/-Leu酵母缺陷培养基配方为称取0.8g的Trp Leu Minus Media粉末，加入2g的无水葡萄糖，加水溶解后利用NaOH将pH调整到6.0，再加入2g琼脂粉，自来水定容到100mL，115℃高压灭菌15min。SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade酵母缺陷培养基配方为称取0.8g的Trp Leu His AdeMinus Media粉末，加入2g的无水葡萄糖，加水溶解后利用NaOH将pH调整到6.0，再加入2g琼脂粉，自来水定容到100mL，115℃高压灭菌15min。利用ZYMO RESEARCH公司的Frozen-EZYeast Transformation IITM试剂盒制备Y2H Gold酵母感受态并进行转化。酵母双杂交结果显示实验组和对照组都可以在SD/-Trp/-Leu酵母缺陷培养基上生长，说明载体转化成功，而只有转化AD-bZIP34和BD-bZIP34组合的实验组菌株在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade酵母缺陷培养基上生长(图2B)，表明bZIP34能够与自身在酵母中发生相互作用。
分别以pET-32a-His和pGEX-4T1-GST(Wang et al.，Plant Physiology，2020，184，1775-1791)为载体骨架，选用BamH I和Sal I作为酶切位点，采用同源重组法构建标签载体His-bZIP34和GST-bZIP34。将构建好的这两种原核表达载体转化至BL21(DE3)感受态细胞，涂布平板后在37℃恒温培养箱中倒置培养24h，挑取单克隆到含氨苄抗生素的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床中过夜培养种子液，随后进行种子液扩摇到菌液的OD 600为0.6，加入IPTG进行蛋白诱导和超声破碎。利用碧云天公司的蛋白纯化试剂盒分别纯化His-bZIP34和GST-bZIP34两个蛋白，并进行GST-pull down实验。结果显示对照组中没有His-bZIP34蛋白条带，而实验组GST-bZIP34和His-bZIP34两个蛋白经过混合孵育后，洗脱液中可以检测到His-bZIP34蛋白条带(图2C)。因此，bZIP34能够与自身在体外发生互作。
双分子荧光互补实验所用的载体为pSAT1-cYFP和pSAT1-nYFP(YFP表示黄色荧光蛋白，Citovsky et al.，Journal of Molecular Biology，2006，362，1120-1131)，选取SalI 和BamH I作为酶切位点，采用同源重组法构建载体nYFP-bZIP34和cYFP-bZIP34。双分子荧光互补实验流程为：将nYFP-bZIP34、cYFP-bZIP34和空载pSAT1-cYFP分别转化农杆菌GV3101，并进行摇菌，每个菌液的OD 600调整为0.2。将含有nEYFP-bZIP34和cEYFP的菌液等量混匀0.5mL作为阴性对照组合，将含有cEYFP-bZIP34和nEYFP-bZIP34的两个菌液等量混匀0.5mL作为实验组合进行烟草叶片背面的注射，室温培养48h后利用激光共聚焦显微镜观察黄色荧光蛋白信号。实验显示阴性对照组nYFP-bZIP34和cYFP没有黄色荧光信号，实验组nYFP-bZIP34和cYFP-bZIP34能够发出黄色荧光(图2D)。上述三个实验结果充分说明bZIP34能够同自身互作，可以以同源二聚体的形式在植物体内发挥功能。
转录因子通常具有激活或者抑制功能，我们利用GAL4/VP16-UAS和双荧光素酶报告基因系统(Zhuang et al.，The Plant Cell，2020，32，392-413)在水稻原生质体中检测bZIP34转录因子的功能。以载体GAL4BD(Zhuang et al.，The Plant Cell，2020，32，392-413)为骨架，选用酶切位点EcoR I和Sal I，采用同源重组法构建载体GAL4BD-bZIP34。以GAL4BD-VP16(Zhuang et al.，The Plant Cell，2020，32，392-413)载体为骨架，选用酶切位点Xba I和Sal I，采用同源重组法构建载体GAL4BD-VP16-bZIP34。将不同组合转化水稻原生质体，利用碧云天公司的双荧光素酶报告基因检测系统测定LUC(萤火虫荧光素酶)和REN(海肾荧光素酶)的数值，并计算LUC(萤火虫荧光素酶)/REN(海肾荧光素酶)的比值，该比值的大小就代表转化组合的转录活性。结果显示GAL4BD-VP16-bZIP34的LUC/REN值要显著低于阳性对照组GAL4BD-VP16，GAL4BD-bZIP34的LUC/REN值显著低于阴性对照组GAL4BD(图2E)。因此，bZIP34是一个具有转录抑制活性的转录因子。
二、水稻过表达株系的构建和抽穗期统计
为了进一步研究该基因的功能，设计扩增引物序列Primer 3：5′-ggacagcccagatcaactagtATGTCGTCGTCGTCCGCT-3′(SEQ ID NO.5)和Primer 4：5′-gcccttgctcaccatggatccACTGAAGGTGTTGTACAGAAATGGC-3′(SEQ ID NO.6)，以实施例1得到的cDNA为模板扩增出bZIP34 CDS(SEQ ID NO.1)。PCR扩增的体系为模板cDNA(100ng/μL)加1μL，Primer 3和Primer 4各1μL(浓度为10pmol)，dNTP(2mM)加10μL，2 x PCR Buffer加25μL，KOD酶(酶浓度1U/μL)加1μL(东洋纺(上海)生物科技有限公司)，加无菌水26μL配制成50μL混合液。设置PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，68℃延伸1.5min，68℃终延伸7min，变性、退火和延伸为30个循环。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后割胶，并利用天根公司的胶回收试剂盒回收片段。利用Spe I和BamH I对含有玉米UBIQUITIN1启动子的双元载体pCAMBIA1305-Ubi-GFP(Zhang et al.，Plant Molecular Biology(2022)，108，343-361)进行双酶切，并通过天根公司的DNA纯化试剂盒进行载体回收。利用诺唯赞公司的同源重组试剂盒将胶回收后的bZIP34 CDS插入到酶切后的载体获得pCAMBIA1305-Ubi-bZIP34-GFP重组载体，简称为pUbi-bZIP34-GFP(图3A)。重组连接体系为cDNA产物1μL，酶切后的线性化载体1.5μL，5 x CE II Buffer加2μL，重组酶Eznase II 1μL，加入4.5μL无菌水补齐到10μL。利用PCR仪进行控温，37℃连接30min。将连接产物转化大肠杆菌进行单克隆菌斑培养。利用农杆菌侵染的方法将构建好的载体转化中花11愈伤并获得bZIP34过表达阳性株系，选取其中的两个家系用于后续实验，分别命名为OE-1和OE-2。据载体上所带的GFP标签，首先利用激光共聚焦显微镜观察幼苗根尖分生区绿色荧光蛋白的表达情况进行初步鉴定(图3B)，随后利用Wstern blot和RT-qPCR实验从mRNA水平和蛋白水平进一步鉴定阳性。提取bZIP34过表达单株开花后9天发育胚乳的总RNA，并反转录成单链的cDNA进行RT-qPCR实验。RT-qPCR的反应体系与bZIP34组织表达分析中的RT-qPCR实验一致，只是将模板换成开花后9天的cDNA。具体操作如下：反转录获得的cDNA稀释5倍作为模板，利用近岸蛋白质科技有限公司试剂盒SYBR qPCR SuperMix Plus配制RT-qPCR反应体系，采用BIO-RAD CFX96 PCR仪进行定量分析。RT-qPCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，变性、退化和延伸进行40个循环，最后添加溶解曲线。设置三次生物学重复，水稻肌动蛋白基因Actin作为内参基因，利用2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。RT-qPCR实验结果显示OE-1和OE-2两个过表达株系中bZIP34表达水平分别是中花11的8倍和11倍(图3C)。提取RT-qPCR实验鉴定为阳性的OE-1和OE-2两个单株的叶片蛋白，以在各组织中和各时期都稳定表达的HSP82蛋白作为内参蛋白，利用Wstern blot实验检测GFP蛋白的表达情况，从显影结果可以观察到有清晰单一的GFP蛋白条带(图3D)。上述结果表明bZIP34过表达株系构建成功，后续的表型鉴定都是以OE-1和OE-2两个展开。
对bZIP34过表达株系进行抽穗期统计，发现过表达植株OE-1和OE-2与野生型相比株高和穗长都没有显著差异，只是抽穗期延迟(图4A，B)。对抽穗期进行调查统计结果显示，野生型中花11抽穗期平均在70天左右，过表达植株抽穗期平均在90天左右，过表达植株比野生型要晚抽穗20天左右(图4C)。
三、过表达株系中抽穗相关基因的表达量分析
为了查明bZIP34调控水稻抽穗期的作用机制，本发明重点检测了五个与水稻抽穗期相关的基因PHYB(Gene ID：LOC_Os03g19590)、Hd1(LOC_Os06g16370)、Ehd1(LOC_Os10g32600)、RFT1(LOC_Os06g06300)和Hd3a(LOC_Os06g06320)的表达量。荧光定量检测引物见表1。
表1用于检测抽穗期相关基因的表达量引物序列
| 标记 | 前引物 | 后引物 |
| PHYB | 5’CTCATCTTCAAGGAATCTGAGG 3’ | 5’CCTGCTAGAACAAGCATTCAC 3’ |
| Hd1 | 5’CGTTTCGCCAAGAGATCAG 3’ | 5’AGATAGAGCTGCAGTGGAGAAC 3’ |
| Ehd1 | 5’ATGGCTTCAAGTGGAGACAC 3’ | 5’ATATTGATGGAGGATGACCG 3’ |
| RFT1 | 5’TGACCTAGATTCAAAGTCTAATCCTT 3’ | 5’TGCCGGCCATGTCAAATTAATAAC 3′ |
| Hd3a | 5’GCTCACTATCATCATCCAGCATG 3’ | 5’CCTTGCTCAGCTATTTAATTGCATAA 3’ |
RT-qPCR的反应体系和反应程序参照前面的介绍。结果显示，在长日照(Long day，LD)和短日照(Short day，SD)条件下PHYB和Hd1的表达水平与野生型相比没有显著差异(图5A～D)。在短日照SD条件下，bZIP34过表达材料中Ehd1、RFT1和Hd3a的表达水平均显著降低(图5E，G，I)，在长日照LD条件下，Ehd1的表达水平在黑夜时低于野生型，在白昼时段高于野生型，而RFT1和Hd3a的表达水平均低于野生型(图5F，H，J)。综上所述，过表达bZIP34能够抑制水稻抽穗基因Ehd1、RFT1和Hd3a的表达从而延迟抽穗。
四、过表达bZIP34延迟拟南芥抽薹开花
为了进一步探究bZIP34对于植物开花时间的影响，将上述已经构建的pUbi-bZIP34-GFP过表达载体通过农杆菌介导的蘸花法转入拟南芥中，利用载体上含有的潮霉素磷酸转移酶基因HYG进行初步的阳性植株筛选。通过观察拟南芥的生长过程，发现拟南芥过表达株系OE-3和OE-4的抽薹开花时间显著晚于野生型(图6A，B)。提取过表达拟南芥的叶片蛋白进行Western blot检测，在OE-3和OE-4两个株系中可以看到单一的GFP蛋白条带，表明bZIP34-GFP融合蛋白可以在拟南芥植株中正常表达(图6C)。统计野生型和过表达植株的开花时间，发现过表达株系的开花时间相比于野生型要晚20天左右(图6D)。上述结果表明，过表达bZIP34也可以延迟拟南芥的开花。
Claims (9)
1.水稻转录因子bZIP34或其编码基因在延迟植物抽穗期中的应用，其特征在于，所述水稻转录因子bZIP34的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，水稻转录因子bZIP34的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.含有水稻转录因子bZIP34的编码基因的表达盒、重组表达载体、重组细胞或重组菌在延迟植物抽穗期中的应用，其特征在于，所述水稻转录因子bZIP34的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物包括水稻或拟南芥。
4.一种培育抽穗期延迟的转基因植物的方法，其特征在于，将含有水稻转录因子bZIP34的重组表达载体导入植物中，得到抽穗期延迟的转基因植物。
5.根据权利要求4所述的一种培育抽穗期延迟的转基因植物的方法，其特征在于，所述含有水稻转录因子bZIP34的重组表达载体是将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的水稻转录因子bZIP34的编码基因导入载体中得到。
6.根据权利要求5所述的一种培育抽穗期延迟的转基因植物的方法，其特征在于，所述载体包括双元农杆菌载体或用于植物微弹轰击的载体。
7.根据权利要求6所述的一种培育抽穗期延迟的转基因植物的方法，其特征在于，所述载体包括pCAMBIA1305-Ubi-GFP。
8.根据权利要求5所述的一种培育抽穗期延迟的转基因植物的方法，其特征在于，所述水稻转录因子bZIP34的编码基因前还包括增强型启动子或组成型启动子。
9.根据权利要求1~8任一项所述的培育抽穗期延迟的转基因植物的方法，其特征在于，所述植物包括水稻或拟南芥。
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