CN105039183B - 一种埃德菌fs110原生质体及其制备方法和转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种埃德菌FS110原生质体及其制备方法和转化方法。采用含有溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶的混合酶体系对埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110的菌丝体进行酶解而得到埃德菌FS110原生质体。本发明以潮霉素B为筛选标记，采用原生质体转化法将能带有外源基因的载体pAN7‑1导入到埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110原生质体中，从而构建埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110原生质体的遗传操作体系，为建立埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110的遗传转化体系并促进其代谢工程改造奠定前期基础，从而最终通过基因工程手段提高埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110中高活性代谢产物的产量和种类。
Description
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种埃德菌FS110原生质体及其制备方法和转化方法。
背景技术：
埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110是从3739米的深海中分离得到的真菌。从中分离得到了具有很强抗肿瘤活性的化合物Clavatol，Clavatol对于肿瘤细胞SF-268、MCF-7、NCI-H460和HepG-2的IC50为6-11nM。从该真菌中还分离得到了15种胶霉毒素及其衍生物，其中4种胶霉毒素为新结构化合物，分离得到胶霉毒素对于肿瘤细胞SF-268、MCF-7、NCI-H460和HepG-2的IC50为0.22-34.02μM。胶霉毒素具有抗肿瘤、抗真菌活性、抗病毒和免疫调节活性，因此在抗肿瘤、抗肝纤维化、抗病毒及免疫抑制剂药物开发方面具有良好的开发前景。而且Dichotomomyces cejpii FS110粗提物对于病原真菌胶孢炭疽菌、链格孢霉、新月弯孢霉和柱枝双胞霉的生长抑制率均大于90％(杨小岚，陈玉婵，李浩华，章卫民，23株海洋真菌的分子鉴定及其抗植物病原真菌和细胞毒活性研究。生物技术通报，2014,8:132-137)。以上结果预示该真菌具有较新颖的功能基因，存在独特的生物合成机制。因此，十分有必要建立该埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110的遗传转化体系，以便于后期对该真菌进行遗传操作改造，以提高高活性次级代谢产物的产量并获得更多结构新颖的有活性的衍生物，最终获得更多的药物先导化合物，促进我国生物医药事业的发展。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种埃德菌FS110原生质体及其制备方法。
本发明的埃德菌FS110原生质体是通过以下方法制备的，采用含有溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶的混合酶体系对埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110的菌丝体进行酶解而得到埃德菌FS110原生质体。
所述的混合酶体系优选是溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶按照质量比1：1：1混合而成，混合酶体系中酶的总浓度为10mg/L。
优选，具体步骤为：冰浴条件下200rpm搅拌埃德菌FS110菌丝体3h，然后5000rpm，4℃条件下收集菌丝体，用0.02M PB缓冲液洗涤，加入0.5％β-巯基乙醇室温放置0.5h，再用0.02M PB缓冲液洗涤，收集菌丝体，按1g菌丝体/10mL的比例加入混合酶体系进行酶解，充分振荡，30℃，100rpm酶解3.5h，将酶解液过滤，取滤液，即为埃德菌FS110原生质体，所述的混合酶体系是溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶按照质量比1：1：1混合而成，混合酶体系中酶的总浓度为10mg/L。
本发明的第二个目的是提供一种埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110的转化方法，其特征在于，将质粒pAN7-1通过PEG介导转化至上述埃德菌FS110原生质体中，以潮霉素B作为筛选标记，在再生培养基上对埃德菌FS110原生质体进行筛选恢复培养，经过筛选得到含有质粒pAN7-1的埃德菌FS110。
优选，具体步骤为：用STC液洗涤埃德菌FS110原生质体，离心取埃德菌FS110原生质体沉淀，用STC液稀释至108个/ml，每100μL埃德菌FS110原生质体悬浮液与含2μg pAN7-1质粒的100μL STC缓冲液以及50μL体积分数30％PEG-6000混合，在30℃下温育30min后，与2ml体积分数30％PEG 6000液充分混匀，继续培养5min后，再与5ml融化的再生培养基(50℃)混合，涂布于含有100μg/ml潮霉素B的再生培养基上，然后覆盖一层含有100μg/ml潮霉素B的再生培养基，于30℃培养，得到抗性菌落，然后提取抗性菌落的基因组，以潮霉素B作为筛选标记基因，筛选阳性克隆，得到含有质粒pAN7-1的埃德菌FS110。
所述的质粒pAN7-1为带有潮霉素B抗性基因hph和真菌启动子gpdA的广宿主载体pAN7-1，为现有技术中的已知产品。
所述的再生培养基的配方为：酵母粉1g酶水解干酪素1g琼脂16g蔗糖274g蒸馏水1L，灭菌备用。
本专利所涉及的埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110分离自3739米的深海，本发明以溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶混合酶体系作用制备埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110原生质体。鉴于目前关于埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110的遗传转化体系的构建方法尚未见报道，因此本发明以潮霉素B为筛选标记，采用原生质体转化法将能带有外源基因的载体pAN7-1导入到埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110原生质体中，从而构建埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110原生质体的遗传操作体系，为建立埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110的遗传转化体系并促进其代谢工程改造奠定前期基础，从而最终通过基因工程手段提高埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110中高活性代谢产物的产量和种类。
本发明的埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110，其公开于文献：杨小岚，陈玉婵，李浩华，章卫民，23株海洋真菌的分子鉴定及其抗植物病原真菌和细胞毒活性研究。生物技术通报，2014,8:132-137。该菌种本申请人也持有，保证自发明的申请日起20年内向公众提供。
附图说明
图1为深海真菌Dichotomomyces cejpi FS110的原生质体油镜镜检图；
图2为质粒pAN7-1载体图谱；
图3为深海真菌Dichotomomyces cejpi FS110原生质体在不导入外源质粒pAN7-1(A)和导入外源质粒pAN7-1(B)在含有100μg/ml潮霉素B的YPD培养基平板上的生长状况；
图4为以Dichotomomyces cejpi FS110重组菌为模板扩增hph基因的PCR产物鉴定图，其中1、2、3、4、5、6泳道分别为DL 2000DNA Marker和以菌落1#-5#基因组为模板扩增得到的PCR产物。
图5为hph引物扩增得到PCR产物的测序结果在NCBI数据库中的比对结果。
具体实施方式
以下将参照附图，结合具体实施例对本发明进行进一步解释。但实施例本身对本发明不做任何形式的限定。
实施例1:PEG介导的埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110原生质体转化，包含如下步骤：
原生质体的制备：将埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110于斜面上刮取少量菌落，接种于30ml YPD液体培养基中(YPD液体培养基属于现有技术中的常规培养基)，同时接种于含有20μg/mL、50μg/mL、75μg/mL和100μg/mL潮霉素B的YPD液体培养基中，30℃，160rpm培养72h后，结果表明100μg/mL潮霉素B可以完全抑制埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110的生长。不含潮霉素B培养基中生长的埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110菌株用无菌磁力搅拌棒在200rpm，冰浴条件下搅拌菌丝体3.0h，5000rpm，4℃条件下收集菌丝体，0.02M PB缓冲液洗涤2次，加入150μLβ-巯基乙醇室温放置0.5h，再用0.02M PB缓冲液洗涤2次，收集菌丝体，按1g菌丝体/10mL的比例加入按质量比蜗牛酶：纤维素酶：溶壁酶＝1:1:1的混合而成的混合酶体系，混合酶体系中酶的总浓度为10mg/ml，充分振荡，30℃，100rpm酶解3.5h，将酶解液用无菌擦镜纸过滤，取滤液共计5.0ml，即得埃德菌(Dichotomomycescejpii)FS110原生质体(其实质为含有埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110原生质体的溶液，可以通过离心收集去上清液，收集沉淀，该沉淀即为埃德菌(Dichotomomycescejpii)FS110原生质体)。采用血球计数板对所得原生质体进行计数，埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110原生质体的形态如图1所示。计数结果表明，埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110原生质体的浓度为1×108个/mL，原生质体总量为5.0×108个。
用15ml STC缓冲液(1.2mol/L山梨糖,0.01mol/L CaCl 2,0.01mol/L Tris2HCl缓冲液,pH7.5)洗涤埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110原生质体2次，离心取原生质体沉淀，用STC缓冲液稀释至1×108个/ml。100μL埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110原生质体悬浮液与含2μg pAN7-1质粒的100μL STC缓冲液以及50μL体积分数30％PEG-6000小心混合，以不加pAN7-1质粒的100μL STC缓冲液作为空白对照，在30℃下温育30min后，与2ml体积分数30％PEG 6000液充分混匀，继续培养5min后与5ml融化的再生培养基混合，涂布于含有100μg/ml潮霉素B的再生培养基上，再覆盖一层含100μg/ml潮霉素B的再生培养基，于30℃培养。所采用再生培养基的配方为：酵母粉1g酶水解干酪素1g琼脂16g蔗糖274g蒸馏水1L。其中质粒pAN7-1的载体图谱如图2所示。
如图3所示，不加pAN7-1质粒的埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110原生质体在100μg/ml的潮霉素B的再生培养基平板上不能生长，未见白色丝状真菌菌落；而导入pAN7-1质粒的Dichotomomyces cejpi FS110原生质体在100μg/ml的潮霉素B的再生培养基平板上能正常生长，可见白色丝状真菌菌落，由此得到转化pAN7-1质粒的埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110。
实施例2：阳性克隆的鉴定：
将转化pAN7-1质粒的埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110于含有100μg/ml潮霉素B的YPD液体培养基中扩大培养，30℃培养48h，采取真菌基因组提取试剂盒提取其基因组。以所得基因组为模板，以SEQ ID NO.1(5’-CCTCGAGATG CCTGAACTCA CCGCGAC-3’)和2(5’-GACTAGTCTA TTCCTTTGCC CTCGG-3’)所示上下游引物进行PCR扩增，验证质粒pAN7-1的导入。
其反应体系如下：
PCR扩增程序如下：
所得PCR产物于4℃保存待用，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，如图4所示，以其中4个菌落的基因组为模板可以得到与阳性对照一致的大小为1020bp的hph基因片段，其中1#菌落的目的产物条带最亮，对阳性重组菌保存甘油菌。对此片段切胶回收，送至华大进行测序。测序结果于NCBI数据库中比对，比对结果见图5。由此转化pAN7-1质粒的埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110。
Claims (6)
1.一种埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110原生质体的制备方法，其特征在于，采用含有溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶的混合酶体系对埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110的菌丝体进行酶解而得到埃德菌FS110原生质体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的混合酶体系是溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶按照质量比1：1：1混合而成，混合酶体系中酶的总浓度为10mg/L。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体步骤为：冰浴条件下200rpm搅拌埃德菌FS110菌丝体3h，然后5000rpm，4℃条件下收集菌丝体，用0.02M PB缓冲液洗涤，加入0.5％(v/v)β-巯基乙醇室温放置0.5h，再用0.02M PB缓冲液洗涤，收集菌丝体，按1g菌丝体/10mL的比例加入混合酶体系进行酶解，充分振荡，30℃，100rpm酶解3.5h，将酶解液过滤，取滤液，即为埃德菌FS110原生质体，所述的混合酶体系是溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶按照质量比1：1：1混合而成，混合酶体系中酶的总浓度为10mg/L。
4.一种按照权利要求1所述的制备方法制备得到的埃德菌FS110原生质体。
5.一种埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110的转化方法，其特征在于，将质粒pAN7-1通过PEG介导转化至权利要求4所述的埃德菌FS110原生质体中，以潮霉素B作为筛选标记，在再生培养基上对埃德菌FS110原生质体进行筛选恢复培养，经过筛选得到含有质粒pAN7-1的埃德菌FS110。
6.根据权利要求5所述的转化方法，其特征在于，具体步骤为：用STC液洗涤埃德菌FS110原生质体，离心取埃德菌FS110原生质体沉淀，用STC液稀释至108个/ml，每100μL埃德菌FS110原生质体悬浮液与含2μg pAN7-1质粒的100μL STC缓冲液以及50μL体积分数30％PEG-6000混合，在30℃下温育30min后，与2ml体积分数30％PEG 6000液充分混匀，继续培养5min后，再与5ml融化的再生培养基混合，涂布于含有100μg/ml潮霉素B的再生培养基上，然后覆盖一层含有100μg/ml潮霉素B的再生培养基，于30℃培养，得到抗性菌落，然后提取抗性菌落的基因组，以潮霉素B作为筛选标记基因，筛选阳性克隆，得到含有质粒pAN7-1的埃德菌FS110。
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