CN107502624A - 一种利用电击法进行羊肚菌遗传转化的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用电击法进行羊肚菌遗传转化的方法，该方法包括：测定羊肚菌菌丝对潮霉素的最低耐受浓度；在PDA培养基培养羊肚菌菌丝，利用复合酶液降解羊肚菌菌丝细胞的细胞壁，收集羊肚菌的原生质体制成菌丝液；将构建完成的外源质粒与羊肚菌菌丝液置于电极杯中，在外加电场的作用下完成电击过程，电击后的羊肚菌菌丝体涂布于再生培养基中，在含有潮霉素的培养基上进行抗性筛选，分子检测正常生长的转化子是否为阳性转化子。本发明针对羊肚菌的结构特征和生长特性而建立的适用于羊肚菌的遗传转化体系，为羊肚菌的基因功能研究提供基础的技术保障，同时为开发羊肚菌的食药用价值提供重要的分子基础。

Description

一种利用电击法进行羊肚菌遗传转化的方法

技术领域

本发明属于羊肚菌生物工程领域，具体涉及一种利用电击法进行羊肚菌遗传转化的方法。

背景技术

羊肚菌(Morchella)是子囊菌纲(Ascomycetes)，盘菌目(Pezizales)，羊肚菌科(Morohellaceae)，羊肚菌属(Morchella)的珍稀的食、药两用的真菌，又称草笠竹、羊肚菜、羊蘑、羊肚蘑。目前中国已知的羊肚菌种类已经有很多，比较常见的有羊肚菌、小顶羊肚菌、尖顶羊肚菌、粗柄羊肚菌、小羊肚菌等。羊肚菌是著名的珍稀食用菌，其营养丰富，食药用价值极高，据《食疗本草》记载：其甘寒无毒，化痰理气，益肠胃。现在医学研究表明，具有提高免疫能力、抗疲劳、降血脂、抗肿瘤等功效。近年来，羊肚菌的人工栽培，生理生化特点以及生活史的研究都具有突飞猛进的发展，研究发现羊肚菌多糖是羊肚菌食药用价值的重要体现者。

虽然关于羊肚菌生理功能研究较多，但是分子水平的研究少之又少，其中主要的原因就是缺乏成熟的遗传转化方法，导致基因的功能分析受到阻碍。建立成熟稳定的遗传转化方法是解析羊肚菌药用价值的关键技术，目前食用菌的遗传转化方法很多，如PEG法、基因枪法、农杆菌介导转化法等，PEG法的主要特点是操作简便，结果稳定，重复性好，无需昂贵的设备，对原生质体的损伤相对较小，但变异率高，而且转化率也比较低。基因枪法转化特点是可不受原生质体制备及再生问题的限制，并可直接用于转化菌丝体、夏孢子、子实体。但该方法也存在一些问题，如转化频率低、费用高、外源DNA整合机理不清楚等。

电击法遗传转化方法具有操作方便，流程简单且投入成本低的优点。但目前研究中未见关于建立羊肚菌遗传转化方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用电击法进行羊肚菌遗传转化的方法，该方法克服基因枪转化方法过程复杂、成本高的缺点，以及农杆菌转化不稳定的缺点，为羊肚菌的基因功能研究提供重要的技术保障，同时为建立羊肚菌生物反应器开辟了方便而经济的途径，为根本解析羊肚菌药用机理提供基础。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：

一种利用电击法进行羊肚菌遗传转化的方法，其包括：

(1)测定羊肚菌菌丝对潮霉素的最低耐受浓度；

(2)制备菌丝液：将羊肚菌菌种接种于液体PDA培养基中，23～28℃静置培养3～5天，得到羊肚菌菌丝；将菌丝过滤，复合酶解液酶解，酶解时间为1.5～3.5h；酶解后离心，再加入电击缓冲液制成菌丝液；

其中，所述复合酶解液包含溶壁酶0.005～0.02g/mL，蜗牛酶 0.001～0.01g/mL，纤维素酶0.005～0.02g/mL；

(3)电击转化：向电极杯中加入电击缓冲液和步骤(2)制得的菌丝液，再加入外源质粒吹打混匀，放入冰中静置；用高压脉冲电击转化仪电击，电压为1000～2000V，冰上静置10～20min；加入液体再生PDA培养基，摇床培养1～2d；

(4)筛选：取经过步骤(3)转化处理后的菌丝液涂布于无潮霉素的再生PDA平板上，23～28℃培养，切取新生长的菌丝，转入含有最低耐受浓度的潮霉素的再生PDA平板上，筛选出能正常生长的菌丝体，即转化子；提取转化子基因组DNA基因组，进行PCR分子检测，成功扩增出外源基因则为阳性转化子。

优选的，步骤(1)、步骤(4)中的所述最低耐受浓度选择范围为 5～7μg/mL。

更优选的，步骤(1)、步骤(4)中的所述最低耐受浓度为6μg/mL。

优选的，步骤(2)中，所述复合酶解液的制备方法为：依据上述复合酶解液各组分的浓度取料，用0.55～0.6M甘露醇溶液溶解，定容至2mL，粗酶液在2500～3500r/min离心10～30min，取上清液经微孔滤膜过滤除菌后使用。

优选的，步骤(2)中，酶解后离心条件为在2000～4000rpm下离心5～10min，然后用渗透压稳定剂离心洗涤2次。

更优选的，所述渗透压稳定剂为0.55mol/L甘露醇溶液。

优选的，步骤(2)、(3)中，所述电击缓冲液的组成为甘露醇0.55mol/L， HEPES1mmol/L。

优选的，步骤(3)中，所述液体再生PDA培养基的组成为马铃薯 200g/L，葡萄糖20g/L，酵母提取物5g/L，甘露醇0.55mol/L。

优选的，步骤(4)中，所述再生PDA平板的组成为马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，酵母提取物5g/L，甘露醇0.55mol/L，琼脂1.5％。

本发明步骤(2)所提供的复合酶解液是针对羊肚菌的细胞壁结构特点，利用羊肚菌原生质体的制备，使羊肚菌的细胞壁消化更加充分且消化时间较短(仅1.5～3.5h)，不影响原生质体活性。

本发明首次利用电击法进行羊肚菌的遗传转化，克服了基因枪转化过程复杂、成本高的缺点，以及农杆菌转化不稳定的特点。电击法遗传转化体系的建立为羊肚菌分子生物学的研究开辟新的途径，为根本解析羊肚菌的药用价值提供技术支持和保障。

本发明的有益效果：

1.本发明首次将潮霉素作为筛选标记用于羊肚菌遗传转化，并测定出羊肚菌菌丝对潮霉素的筛选浓度为5-7μg/mL，最佳筛选浓度为6μg/mL；同时制备了适用于羊肚菌菌丝细胞的复合酶解液，通过酶解成功地收集羊肚菌的原生质体且不影响原生质体活性，进而在电压为1000～2000V的外加电场作用下完成电击转化，从而通过电击法实现了羊肚菌的遗传转化。

2.现有普通电击法进行食用菌遗传转化中，食用菌的再生培养需要 2～4d，本发明所提供的电击法中电击后再生培养时间短，仅为1-2d，使得遗传转化的整体操作时间缩短至少50％，显著提高遗传转化效率。

3.本发明提供的用于羊肚菌遗传转化的电击法操作流程简单，可操作性强，不要求操作者拥有丰富的分子生物学实验的操作经验，克服了基因枪转化过程复杂、成本高的缺点。

4.本发明所提供的电击法在转化过程中所需试剂都是常规性生物化学试剂，成本低廉，不需要使用商业试剂盒或委托业务，完成一个样品的遗传转化成本仅需要8元左右，远低于目前羊肚菌中的常用遗传转化方法-基因枪转化法的成本(60元/样品)。

附图说明

图1为本发明实施例1中羊肚菌菌株在不含潮霉素(A)和含有1、2、 4、6、8、10、20μg/mL(B-H)潮霉素的PDA平板上的生长情况，其中，B-H 培养基的潮霉素浓度分别为1、2、4、6、8、10、20μg/mL，A为不含潮霉素对照。

图2为本发明实施例1中产生的8个羊肚菌遗传转化子基因组中外源质粒pCAMBIA1301中卡那基因的PCR扩增结果。

图3为本发明实施例2中羊肚菌遗传转化子在含潮霉素平板上的生长情况。

图4为本发明实施例2中产生的24个羊肚菌遗传转化子基因组中外源质粒pCAMBIA1300中卡那基因的PCR扩增结果。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1)羊肚菌菌株对潮霉素的敏感性测定

配制含有1、2、4、6、8、10、20μg/mL潮霉素的PDA平板，每个浓度处理3次重复。之后在超净台上，在每个平板上接入边长为5mm的正方形状的菌种，以不加潮霉素的PDA平板作为对照。接种后置于25℃、相对湿度45％的恒温培养箱中培养，每天观察并记录。培养3天后，羊肚菌菌丝在 PDA平板上的生长情况如图1所示。

由图1及羊肚菌菌丝每天生长情况可知，潮霉素对羊肚菌的生长速度影响很大，在潮霉素浓度为4μg/mL时，菌丝生长极慢；浓度为6μg/mL时，即停止生长，并且浓度为8μg/mL时菌丝也不生长。故选择潮霉素作为羊肚菌的抗性筛选试剂，并且确定羊肚菌菌株在PDA平板上的筛选浓度为5～7μg/mL，最佳筛选浓度为6μg/mL。

2)菌丝培养

切取带培养基的少量供试羊肚菌菌株接入PDA培养基，贴上封口膜后放入恒温恒湿培养箱中进行培养。培养条件恒定为：温度25℃，相对湿度40％，且无光照。接入的菌丝1天左右长出气生菌丝，且生长速度加快，3天时菌丝一般长满平板，菌丝颜色为白色，5天左右菌丝褐化，变为褐色，培养基中间长出颗粒状的褐色物质。由于菌丝提取DNA的用量比较大，刮取接种4天左右的白色菌丝作为后续试验材料。

3)制备酶解菌丝

复合酶解液的配制：称取0.02g溶壁酶，0.01g蜗牛酶和0.015g纤维素酶，用0.6M甘露醇溶液溶解，定容到2mL得到粗酶液，粗酶液在 3000r/min离心15min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后使用(现配现用)。

取培养好的菌丝，用二层灭菌的纱布过滤，然后用无菌水冲洗三次。用无菌纸吸干水分后悬浮于适量已配制好的酶液中，25℃，100rpm振荡酶解；酶解3小时后，4000rpm离心5min。用渗透压稳定剂(0.55mol/L 甘露醇溶液)离心洗涤2次，加入500μL电击缓冲液(甘露醇0.55mol/L， HEPES 1mmol/L)制成菌丝液，最后用血球计数板计数。每个处理设5个重复。

4)转化

纯水冲洗电极杯，用无水乙醇浸泡1～2h，超净工作台中放置1h吹干。向电极杯中加入100μL的电击缓冲液(甘露醇0.55mol/L，HEPES 1mmol/L) 和150μL步骤3)制备的菌丝液，再加入20μL的双元载体pCAMBIA1301 质粒吹打混匀，放入冰中10min。用高压脉冲电击转化仪电击，电压为 1200V，冰上放置10min。恢复培养，加入液体再生培养基(马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，酵母提取物5g/L，甘露醇0.55mol/L)1mL，摇床上培养 1h(25℃，170rpm)。

5)电击法转化子的筛选

取100μl电击后的羊肚菌原生质体悬浮液涂布于无潮霉素的再生PDA 平板(马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，酵母提取物5g/L，甘露醇0.55mol/L，琼脂1.5％)上，25℃培养2d，切取新生长的菌丝，转入6μg/mL潮霉素的再生PDA平板上，继续筛选，能在培养基中正常生长的菌块认为是转化子。

6)阳性转化子的分子鉴定

对能够在含有6μg/ml潮霉素的抗性平板上正常生长的菌丝体进行培养结果显示有菌丝体可正常生长，分别提取8个正常生长菌丝体DNA基因组，对其进行PCR分子检测，检测引物：

F：5`-TGCAGGAATCGGCACGAGGAA-3`；

R：5`-GACTTTCATGGCTTAATTAGC-3`；

PCR扩增体系为20μl，10×Taq Buffer 2μL，dNTPs Mixture(各 10mmol/L)0.3μL，上下游引物(10μmol/L)各0.6μL，Taq(5U/μL)0.2μL，模板DNA 2μL，ddH₂O补至20μL；PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min， 4℃forever。

成功扩增出外源基因卡那基因则为阳性转化子，扩增结果参见图2。由图2可知，泳道1-8都扩增出750bp左右的条带，说明转化子1-8基因组中含有卡那基因，即这些转化子中已经成功转入外源质粒 pCAMBIA1301。

实施例2

1)培养

切取带培养基的少量供试菌株接入PDA培养基，贴上封口膜后放入恒温恒湿培养箱中进行培养。培养条件恒定为：温度25℃，相对湿度40％，且无光照。接入的菌丝1天左右长出气生菌丝，且生长速度加快，3天时菌丝一般长满平板，菌丝颜色为白色，5天左右菌丝褐化，变为褐色，培养基中间长出颗粒状的褐色物质。由于菌丝提取DNA的用量比较大，刮取接种4天左右的白色菌丝作为后续试验材料。

2)制备酶解菌丝

酶解液的配制：称取0.02g溶壁酶和0.01g蜗牛酶，用0.55M甘露醇溶液溶解2h，定容到2mL，粗酶液在3000r/min离心15min，取上清液经 0.22μm微孔滤膜过滤除菌后使用(现配现用)。

取培养好的菌丝，用二层灭菌的纱布过滤，然后用无菌水冲洗三次。用无菌纸吸干水分后悬浮于适量已配制好的复合酶解液中，25℃，100rpm 振荡酶解；酶解3小时后，4000rpm离心5min。用渗透压稳定剂(0.55mol/L 甘露醇溶液)离心洗涤2次，加入500μL电击缓冲液(甘露醇0.55mol/L， HEPES 1mmol/L)制成菌丝液，最后用血球计数板计数。每个处理设5个重复。

3)转化

纯水冲洗电极杯，用无水乙醇浸泡1～2h，超净工作台中放置1h吹干。向电极杯中加入100μL的电击缓冲液(甘露醇0.55mol/L，HEPES 1mmol/L) 和150μL的菌丝液，再加入20μL的双元载体pCAMBIA1300质粒吹打混匀，放入冰中10min。用高压脉冲电击转化仪电击，电压为1200V，冰上放置10min。恢复培养，加入液体再生培养基(马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，酵母提取物5g/L，甘露醇0.55mol/L)1ml，摇床上培养1h(25℃，170rpm)。

4)电击法转化子的筛选

取100μL转化处理后的羊肚菌菌液涂布于无潮霉素的再生PDA平板 (马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，酵母提取物5g/L，甘露醇0.55mol/L，琼脂1.5％)上，放入25℃培养1～2d，切取新生长的菌丝，转入6μg/ml潮霉素的再生PDA平板上，继续筛选，能在培养基中正常生长的菌块认为是转化子。

电击转化后的转化子在含有潮霉素的抗性平板上进行培养，能够正常生长出菌丝体的转化子则表示菌丝体具有潮霉素抗性，体内可能已经转入含有潮霉素抗性基因的外源质粒pCAMBIA1300。图3为羊肚菌遗传转化子在含潮霉素平板上的生长情况，图3中三个菌块均能在抗性平板上正常生长，表明其体内可能已转入pCAMBIA1300。

5)阳性转化子的分子鉴定

对能够在含有潮霉素的抗性平板上正常生长的菌丝体进行培养，抗性筛选结果发现有菌丝体可在含潮霉素抗性平板上正常生长，分别提取24个 DNA基因组，对其进行PCR分子检测：

检测引物F：5`-TGCAGGAATCGGCACGAGGAA-3`，R： 5`-GACTTTCATGGCTTAATTAGC-3`和PCR扩增体系为20μL，10×Taq Buffer 2μL，dNTPs Mixture(各10mmol/L)0.3μL，上下游引物(10μmol/L)各 0.6μL，Taq(5U/μL)0.2μL，模板DNA 2μL，ddH₂O补至20μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35 个循环；72℃延伸10min，4℃forever。

成功扩增出外源基因卡那基因则为阳性转化子，扩增结果参见图4。

由图4可知，泳道1-22都扩增出750bp左右的条带，说明转化子1-22 基因组中含有卡那基因，即这些转化子中已经成功转入外源质粒 pCAMBIA1300。

Claims (9)

1.一种利用电击法进行羊肚菌遗传转化的方法，其包括如下步骤：

1)测定羊肚菌菌丝对潮霉素的最低耐受浓度；

2)制备菌丝液

将羊肚菌菌种接种于液体PDA培养基中，23～28℃静置培养3～5天，得到羊肚菌菌丝；将羊肚菌菌丝过滤，复合酶解液酶解，酶解时间为1.5～3.5h；酶解后离心，再加入电击缓冲液制成羊肚菌菌丝液；

其中，所述复合酶解液包含溶壁酶0.005～0.02g/mL、蜗牛酶0.001～0.01g/mL、纤维素酶0.005～0.02g/mL；

3)电击转化

向电极杯中加入电击缓冲液和步骤2)制得的羊肚菌菌丝液，再加入外源质粒吹打混匀，放入冰中静置；用高压脉冲电击转化仪电击，电压为1000～2000V，冰上静置10～20min；再加入液体再生PDA培养基，摇床培养1～2d；

4)筛选

取经过步骤3)转化处理后的菌丝液涂布于无潮霉素的再生PDA平板上，23～28℃培养，切取新生长的菌丝，转入含有最低耐受浓度的潮霉素的再生PDA平板上，筛选出能正常生长的菌丝体，即转化子；提取转化子基因组DNA，进行PCR分子检测，成功扩增出外源基因则为阳性转化子。

2.根据权利要求1所述的利用电击法进行羊肚菌遗传转化的方法，其特征在于，步骤1)、步骤4)中，所述的最低耐受浓度为5-7μg/mL。

3.根据权利要求1或2所述的利用电击法进行羊肚菌遗传转化的方法，其特征在于，步骤1)、步骤4)中，所述的最低耐受浓度为6μg/mL。

4.根据权利要求1所述的利用电击法进行羊肚菌遗传转化的方法，其特征在于，步骤2)中，所述复合酶解液的制备方法为：依据权利要求1所述复合酶解液各组分的浓度取料，用0.55～0.6M甘露醇溶液溶解，定容至2mL，粗酶液在2500～3500r/min离心10～30min，取上清液经微孔滤膜过滤除菌后使用。

5.根据权利要求1所述的利用电击法进行羊肚菌遗传转化的方法，其特征在于，步骤2)中，酶解后离心条件为2000～4000rpm下离心5～10min，然后用渗透压稳定剂离心洗涤2次。

6.根据权利要求5所述的利用电击法进行羊肚菌遗传转化的方法，其特征在于，所述渗透压稳定剂为0.55mol/L甘露醇溶液。

7.根据权利要求1所述的利用电击法进行羊肚菌遗传转化的方法，其特征在于，步骤2)、3)中，所述电击缓冲液的组成为甘露醇0.55mol/L，HEPES 1mmol/L。

8.根据权利要求1所述的利用电击法进行羊肚菌遗传转化的方法，其特征在于，步骤3)中，所述液体再生PDA培养基的组成为马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，酵母提取物5g/L，甘露醇0.55mol/L。

9.根据权利要求1所述的利用电击法进行羊肚菌遗传转化的方法，其特征在于，步骤4)中，所述再生PDA平板的组成为马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，酵母提取物5g/L，甘露醇0.55mol/L，琼脂1.5％。