CN106086058A - 一种减少蛹虫草出菇时间及提高出菇产量的方法 - Google Patents

一种减少蛹虫草出菇时间及提高出菇产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种减少蛹虫草出菇时间及提高出菇产量的方法，包括：(1)收集蛹虫草菌丝，将目的基因CmSnf1利用引物进行PCR扩增，然后将PCR产物经XhoI/SalI双酶切，连接至改造的pKD1载体，得到pKD1‑CmSnf1载体；(2)将得到的pKD1‑CmSnf1载体转化根癌农杆菌，通过平板培养选出含有目的基因的农杆菌菌株；(3)将蛹虫草芽生孢子和步骤(2)得到的农杆菌菌株共培养，经诱导和筛选得到转基因菌株，最后进行出菇即可。本发明通过转基因技术得到蛹虫草转基因菌株，提高了菌株降解昆虫体壁、利用营养物质的能力，有效减少蛹虫草出菇时间及提高出菇产量，为进一步筛选蛹虫草的优良品种打下基础。

Description

一种减少蛹虫草出菇时间及提高出菇产量的方法
技术领域
本发明属于蛹虫草栽培领域，特别涉及一种减少蛹虫草出菇时间及提高出菇产量的方法。
背景技术
作为传统中药，虫草的研究和应用一直备受关注。虫草是由子囊菌门(Ascomycoa)，肉座菌目(Hypocreales)，麦角菌科(Clavicipitaceae)虫草属(Cordyceps)真菌的孢子寄生于昆虫幼虫身上并由夏季从虫体生出子实体所形成的菌虫复合体。其中最著名的是寄生于高山蝙蝠蛾(Hepialusarmoricanus)幼虫的冬虫夏草(Ophiocordycepssinensis)和寄生于鳞翅目蛹的蛹虫草(Cordycepsmilitaris)(Sung etal.,2007)。虫草具有多种药用功效，包括：抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抗炎症、杀虫、抗微生物、降血脂血糖、抗衰老、神经保护、肾保护等功能，在肿瘤治疗、器官移植、肝肾移植和心脏保护等方面具有重要作用。其主要成分包括四类：1)核苷酸、2)多糖、3)多肽和糖蛋白、4)甾醇和萜烯。其中多糖与抗炎症、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、脂类代谢等作用有关，虫草素有利于抗肿瘤、杀虫和抗微生物活性，甾醇则具有抗肿瘤和免疫调节活性(Lee et al.,2011，International Immunopharmacology 11,1226-1233)。
在生物技术上，我国的真菌学家王成树课题组率先对蛹虫草进行了全基因组测序(Zheng et al.,2011,Genome Biology 12,R116)。我国同时也是蛹虫草栽培大国。根据相关的调查研究，目前我国人工蛹虫草的主要产区在江门新会地区和辽宁地区。其中辽宁蛹虫草产量占到全国产量的七成以上，我国蛹虫草市场规模近15亿元。因此找到提高蛹虫草提高对能源利用的因子，缩短出菇时间在生产中具有非常重要的意义。
Snf1基因是Snf1蛋白激酶复合体的一个组分，是哺乳动物、植物、真菌等维持体内能源代谢所必需的(Hardieet al.,1998,Annual review of biochemistry67:821-855)，其在真核生物中高度保守。在酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，Snf1是酵母为适应葡萄糖有限的环境下利用其他碳源，如蔗糖、乙醇、乳糖等多必需的；在赤酶菌(Gibberellasaubinetii)中，GzSnf1基因的敲除影响了该菌的有性、无性生殖，改变了赤酶对碳源的应用(Leeet al.,2009,Eukaryot Cell8(1):116-127)；在青霉(Penicilliumdigitatum)中，PdSnf1基因在正常条件下并不参与CWDE基因的表达调控，然而在以果胶为碳源的生长条件下，PdSnf1基因参与CWDE基因的表达调控；PdSnf1基因缺失突变菌株在以不同碳源的条件下(如葡萄糖、蔗糖、果胶、果糖、甘油等)，突变体的生长速度变慢，菌丝生长受到不同程度的抑制(Zhang，et al.,2013,ApplMicrobiolBiotechnol.DOI10.1007/s00253-012-4593-z)。通过酵母Snf1的氨基酸同源性的比对，在已测序的蛹虫草CM01中找到其同源基因CCM_05552，该基因与酵母的蛋白序列相似性为60％，与食用真菌草菇的蛋白序列相似性为51％，香菇的蛋白序列相似性为38％。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种减少蛹虫草出菇时间及提高出菇产量的方法，该方法通过转基因技术得到蛹虫草转基因菌株，提高了菌株降解昆虫体壁、利用营养物质的能力，有效减少蛹虫草出菇时间及提高出菇产量，为进一步筛选蛹虫草的优良品种打下基础。
本发明的一种减少蛹虫草出菇时间及提高出菇产量的方法，包括：
(1)收集蛹虫草菌丝，将目的基因CmSnf1利用引物
F:CCCTCGAGTTCGTTAGATGATAAGGCTATGAGGTA、
R:CGGAATTCCGTGTTCTTTGGGATGATGATTTC进行PCR扩增，然后将PCR产物经XhoI/SalI双酶切，连接至pKD1载体，得到pKD1-CmSnf1载体；
(2)将得到的pKD1-CmSnf1载体转化根癌农杆菌，通过平板培养选出含有目的基因的农杆菌菌株；
(3)将蛹虫草芽生孢子和步骤(2)得到的农杆菌菌株共培养，经诱导和筛选得到转基因菌株，最后进行出菇即可。
所述步骤(1)中的目的基因CmSnf1的大小为2240bp，所述步骤(1)中的目的基因CmSnf1的大小为2240bp，具体序列如SEQ ID No.1所示。来源于蛹虫草，已经在GenBank注册，Gene ID:18167570。
所述步骤(1)中的pKD1载体具体序列如SEQ ID No.2所示。所用的克隆菌株为DH5a，所用的双元载体pKD1含有潮霉素抗性和蛹虫草Hsp70基因的启动子及绿色荧光蛋白，改造自pBlueScriptII(SK+)。
所述步骤(1)中的PCR反应体系和条件为
反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸3min，共30个循环；最后在72℃下补平10min，10℃保存。
所述步骤(2)中的平板培养采用50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基。
所述步骤(3)中的诱导和筛选采用含300μg/mL头孢霉素和450μg/mL潮霉素的M-100培养基。
所述步骤(3)中的出菇具体为虫体出菇或米饭培养基出菇。
有益效果
本发明通过转基因技术得到蛹虫草转基因菌株，提高了菌株降解昆虫体壁、利用营养物质的能力，有效减少蛹虫草出菇时间及提高出菇产量，为进一步筛选蛹虫草的优良品种打下基础。
附图说明
图1为过表达菌株的PCR验证图；
图2为过表达菌株的荧光定量PCR验证图；
图3为过表达菌株和野生型菌株的出菇比较照片；其中，A：野生型菌株蚕蛹出菇；B：过表达菌株蚕蛹出菇；C：野生型菌株米饭培养基出菇；D：过表达菌株米饭出菇。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
蛹虫草菌株所用培养基：
PDA培养基：购自碧迪医疗器械(上海)有限公司。配方：马铃薯淀粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂粉15.0g/L。
SDB培养基：购自碧迪医疗器械(上海)有限公司。配方：动物组织胃蛋白酶消化物5.0g/L，胰酶消化酪蛋白胨5.0g/L，葡萄糖20.0g/L。
M-100培养基：M-100Salt Solution 62.5mL/L，葡萄糖10g/L，KNO3 3g/L，琼脂粉15g/L。做覆盖用时，琼脂粉减为0.75g/L。M-100Salt Solution：KH2PO4 16g/L，Na2SO4 4g/L，KCl8g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，CaCl2 1g/L，M-100Trace Element Solution 8mL/L。M-100Trace Element Solution：H3BO3 0.06g/L，MnCl2·4H2O 0.14g/L，ZnCl2 0.40g/L，Na2MoO4·2H2O 0.04g/L，FeCl3·6H2O 0.10g/L，CuSO4·5H2O 0.40g/L。
细菌菌株所用培养基：
LB培养基：购自MDBio(青岛生工生物科技有限公司)。配方：Tryptone 10g/L，NaCl10g/L，Yeast extract 5g/L。若要配制固体培养基，则再添加15g/L琼脂粉。
农杆菌诱导培养基IM(液体)：2.5×MM Salt Solution 400mL/L，葡萄糖1.8g/L，甘油5mL/L，加水定容至940mL。高压灭菌并冷却至50℃后，每升加入40mL 1M MES(PH 5.5，过滤除菌)，20mL 10mM AS(乙酰丁香酮，DMSO(二甲基亚砜)配制，过滤除菌)。若配置固体培养基，葡萄糖减为0.9g/L，并加入琼脂粉15.0g/L。2.5×MM Salt Solution：KH2PO4 3.625g/L，K2HPO4 5.125g/L，MgSO4·7H2O 1.250g/L，NaCl 0.375g/L，CaCl2·2H2O 0.165g/L，FeSO4·7H2O 0.0062g/L(先配制6.2g/L的溶液，用时移取1mL)，(NH4)2SO4 1.250g/L。
过表达载体的构建
1)目的基因的制备：收集蛹虫草菌丝，提取基因组DNA，利用引物
F:CCCTCGAGTTCGTTAGATGATAAGGCTATGAGGTA；
R:CGGAATTCCGTGTTCTTTGGGATGATGATTTC；
反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸3min，共30个循环；最后在72℃下补平10min，10℃保存。过产物回收柱。
2)过表达载体的构建：回收产物经XhoI/SalI双酶切消化用1％的琼脂糖凝胶回收纯化，与pKD1质粒的融合载体转化大肠杆菌菌株DH5a；用含有卡那霉素50mg/L的LB培养基37℃200rpm过夜培养。菌落PCR验证，提取质粒，得到pKD1-CmSnf1载体。
3)转化根癌农杆菌：将1μL构建好的载体加入到100μL农杆菌AGL-1感受态中，液氮中放置5min，使感受态彻底冻住；37℃温育5min，使感受态彻底融化；向感受态中加入800μLLB液体培养基，28℃，220rmp振荡培养2h；在超净台中将菌液均匀涂于LB固体培养基上(含50μg/mL卡那霉素)，28℃培养30h。选取3个长出的单菌落分别用GFP的验证引物和CmSnf1的验证引物进行PCR验证，检验转化是否成功。
实施例2
目的基因在蛹虫草中的转化
(根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化)
1)从LB平板(含50μg/mL卡那霉素)上挑选一新鲜培养的含目的质粒的农杆菌AGL-1单菌落，接种于5mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，220rpm，28℃过夜培养。
2)次日离心收集菌体，用等体积的液体诱导培养基IM重悬，移取适量的重悬液至5mL液体诱导培养基IM使OD660＝0.14-0.2。
3)28℃、220rpm振荡培养4-6h，菌液浓度至OD660＝0.5-0.8之间即可。
4)蛹虫草芽生孢子的培养和收集：在超净工作中，将在PDA培养基上活化好(25℃，20d)的新鲜菌丝转移至均质仪中，加入50mL SDB液体培养基，均质30s(低速10s，高速10s，低速10s)后，移取10mL至100mL SDB液体培养基中，25℃，150rmp，摇床培养7d至芽生孢子量达到108-109。无纺布过滤收集芽生孢子，储存在4℃待用，一个月内可用。
5)取上述农杆菌菌液和用0.05％Tween 20稀释至1×106个/mL的孢子悬液各100μL充分混匀后涂布于IM平板，28℃共培养2d。
6)加入1mL 0.05％Tween 20溶液至上述平板，用涂布器充分洗涤(刮取)混匀共培养物。将洗涤下来的培养物按每板200μL均匀涂布在含300μg/mL头孢霉素和250μg/mL潮霉素的M-100培养基上，25℃培养3～5d至转化子出现，即得过表达菌株。
7)挑取转化子至含300μg/mL头孢霉素的M-100培养基上，待其长至直径为1-2cm时小量提取基因组进行PCR验证(图1)，同时提取野生出发菌株和过表达菌株的RNA，进行反转录为cDNA，进行表达量的验证，实验证明CmSnf1的基因转录水平得到提高(图2)。
实施例3
过表达菌株出菇实验
1)蚕蛹出菇
分别收集野生型菌株和过表达菌株的新鲜芽生孢子悬浮液，浓度调至108，用无菌注射器吸取300μL注射进蚕蛹体内(选用鲜活的蚕蛹，并用75％酒精浸泡1min杀菌)。然后将蚕蛹放置于底层铺有吸水纸(无菌水浸湿，无明水)的一次性方盒中(紫外照射1h杀菌)，25℃避光培养25d后转移至生态培养箱中，23℃光周期12:12(光：暗)培养1月。观察子实体生长情况。
2)米饭出菇
将野生型菌株和过表达菌株在PDA培养基上25℃避光培养三周后，用直径1cm的打孔器打孔后，每瓶米饭培养基中接入4块菌块，25℃避光培养至菌丝完全覆盖米饭培养基后转移至生态培养箱中，23℃光周期12:12(光：暗)培养1月。观察子实体生长情况。米饭培养基配方如下：30g大米，45mL蒸馏水(含0.3％KH2PO4，0.15％MgSO4，2％葡萄糖)，121℃，1h高温灭菌。
结果显示，蚕蛹出菇实验，过表达菌株出菇数明显多于野生型(见图3)，出菇时间提前7-10天；米饭培养基出菇也有提前，但相较于蚕蛹没有那么明显，出菇时间提前3-5天。

Claims (7)

1.一种减少蛹虫草出菇时间及提高出菇产量的方法，包括：
(1)收集蛹虫草菌丝，将目的基因CmSnf1利用引物F:CCCTCGAGTTCGTTAGATGATAAGGCTATGAGGTA、R:CGGAATTCCGTGTTCTTTGGGATGATGATTTC进行PCR扩增，然后将PCR产物经XhoI/SalI双酶切，连接至改造后的pKD1载体，得到pKD1-CmSnf1载体；
(2)将得到的pKD1-CmSnf1载体转化根癌农杆菌，通过平板培养选出含有目的基因的农杆菌菌株；
(3)将蛹虫草芽生孢子和步骤(2)得到的农杆菌菌株共培养，经诱导和筛选得到转基因菌株，最后进行出菇即可。
2.根据权利要求1所述的一种减少蛹虫草出菇时间及提高出菇产量的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的目的基因CmSnf1的大小为2240bp，具体序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述的一种减少蛹虫草出菇时间及提高出菇产量的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的pKD1载体具体序列如SEQ ID No.2所示。
4.根据权利要求1所述的一种减少蛹虫草出菇时间及提高出菇产量的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的PCR反应体系为：PCR MagicMix 2.0 25μL，引物各2μL，模板3μL，ddH2O18μL；PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸3min，共30个循环；最后在72℃下补平10min，10℃保存。
5.根据权利要求1所述的一种减少蛹虫草出菇时间及提高出菇产量的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的平板培养采用50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基。
6.根据权利要求1所述的一种减少蛹虫草出菇时间及提高出菇产量的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的诱导和筛选采用含300μg/mL头孢霉素和450μg/mL潮霉素的M-100培养基。
7.根据权利要求1所述的一种减少蛹虫草出菇时间及提高出菇产量的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的出菇具体为虫体出菇或米饭培养基出菇。
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