CN111518825A - 一种多基因组合表达制备蛹虫草多糖的方法 - Google Patents

一种多基因组合表达制备蛹虫草多糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多基因组合表达制备蛹虫草多糖的方法，所述方法是将组合基因导入蛹虫草细胞构建重组蛹虫草基因工程菌，再将重组蛹虫草基因工程菌接种在发酵培养基中，在22～25℃，100‑150rpm条件下发酵培养，获得含蛹虫草多糖的发酵液，将发酵液分离纯化，获得蛹虫草多糖；所述组合基因是指磷酸葡萄糖变位酶基因pgm，焦磷酸化酶基因ugp或UDP‑葡萄糖‑6‑脱氢酶基因ugdh中任意两种的组合。本发明通过基因组合表达技术构建得到了重组蛹虫草基因工程菌，该基因工程菌株与野生型菌株相比，其发酵液中的虫草胞外多糖产量为1.78倍，并且高于目前文献报道的发酵产生的最大虫草胞外多糖产量5.713g/L。

Description

一种多基因组合表达制备蛹虫草多糖的方法
(一)技术领域
本发明涉及基因工程和食品医药领域，具体涉及一种利用多基因组合表达技术制备虫草多糖的方法。
(二)背景技术
多糖是一种糖分子由糖苷键相连聚合而的一种高分子化合物，在动植物及微生物中广泛存在。因其在药理药效及生物活性方面有良好的作用而引来大量学者的关注和研究。蛹虫草合成的多糖包括细胞内多糖和细胞外多糖两种形式。虫草多糖纯品为白色粉末状，易溶于水，无法溶解于高浓度的有机溶剂中，是虫草中主要的有效成分之一，在天然虫草子实体、人工虫草子实体、人工虫草发酵液及发酵基质内均有存在。
蛹虫草多糖已被研究证明具有多种重要的生物学活性，例如抗氧化剂，抗肿瘤，抗糖尿病，辐射防护，抗病毒，降血脂，免疫调节、保护肾脏、肝脏、减轻机体疲劳等其他活性。虫草多糖对金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、四联球菌等革兰氏阳性菌有抑制作用，但是对大肠杆菌及丝状真菌无抑制效果。
现有虫草多糖的提取技术主要是从蛹虫草发酵产物中进行提取，它涉及到的蛹虫草是天然来源的蛹虫草，其多糖产量不高，使得多糖的生产成本高，效率低，无法满足市场对多糖类产品的需求。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种多基因组合表达制备蛹虫草多糖的方法，该方法高产量，低成本。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种多基因组合表达制备蛹虫草多糖的方法，所述方法是将组合基因导入蛹虫草细胞构建重组蛹虫草基因工程菌，再将重组蛹虫草基因工程菌接种在发酵培养基中，在22～25℃，100-150rpm(优选25℃、120rpm)条件下发酵培养，获得含蛹虫草多糖的发酵液，将发酵液分离纯化，获得蛹虫草多糖；所述组合基因是指磷酸葡萄糖变位酶基因pgm，焦磷酸化酶基因ugp或UDP-葡萄糖-6-脱氢酶基因ugdh中任意两种的组合。
进一步，所述磷酸葡萄糖变位酶基因pgm(Genbank，gene ID:18164305)来源于蛹虫草，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；焦磷酸化酶基因ugp(Genbank，gene ID:18168250)来源于蛹虫草，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述UDP-葡萄糖-6-脱氢酶基因ugdh(Genbank，gene ID:18163716)来源于蛹虫草，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步，所述发酵培养基质量组成：2％葡萄糖，0.70％(NH4)2SO4，0.05％K2HPO4·3H2O，0.05％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，0.10％L-甘氨酸，溶剂为蒸馏水，pH自然。
进一步，所述发酵液分离纯化方法为：向发酵液中加入四倍体积的无水乙醇，并在4℃保存过夜，离心得到沉淀(即为蛹虫草多糖)，然后将沉淀重悬于1M NaOH水溶液中，60℃水浴1h，离心，收集上清，即为蛹虫草多糖溶液。
进一步，所述重组蛹虫草基因工程菌按如下方法构建：将含组合基因的重组载体转入根瘤农杆菌细胞(优选Agrobacterium tumefaciens AGL-1)，再用根瘤农杆菌侵染野生型蛹虫草细胞(优选蛹虫草CM-001)，筛选得到重组蛹虫草基因工程菌。
本发明所述组合基因的重组载体是将含有相应基因的载体pCAMBIA-PgpdA-pgm-Tcbh1-hph-PtrpC、pCAMBIA-PgpdA-ugp-Tcbh1-hph-PtrpC和pCAMBIA-PgpdA-ugdh-Tcbh1-hph-PtrpC中任意两种，用引物Insert-CobF&R扩增得到插入片段，再用引物Plasmid-CobF&R将载体线性化，将插入片段与线性化载体连接，得到三种组合形式的重组载体。
Insert-CobF：5’-TTGGAGACCAACTTGGCTTGTATCTCTACACACAGG-3’
Insert-CobR：5’-GGCAAAGGAATAGGTAAGTTGGTCTCCAACAGTGCTT-3’
Plasmid-CobF：5’-ACCTATTCCTTTGCCCTCGGACGA-3’
Plasmid-CobR：5’-CAAGTTGGTCTCCAACAGTGCTTT-3’。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明通过基因组合表达技术构建得到了重组蛹虫草基因工程菌，该基因工程菌株与野生型菌株相比，其发酵液中的虫草胞外多糖产量为1.78倍，并且高于目前文献报道的发酵产生的最大虫草胞外多糖产量5.713g/L(Wang CC,et al.Enhancedexopolysaccharide production by Cordyceps militaris using repeated batchcultivation.J Biosci Bioeng,2019.127(4):p.499-505.)，为进一步开发蛹虫草优良品种打下了基础，并应用此工程菌株生产蛹虫草多糖及其在功能食品等方面的应用。
(四)附图说明
图1为本发明虫草多糖合成相关基因的酶促反应过程。
图2为本发明虫草多糖多基因组和表达载体的构建图。
图3为本发明蛹虫草基因工程菌株的PCR鉴定图。
图4为本发明使用硫酸苯酚法绘制得到的葡萄糖标准曲线图。
图5为本发明基因工程菌株、野生菌株硫酸苯酚法检测的胞外多糖产量。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例1构建组合表达pgm和ugdh的蛹虫草菌株
表1材料来源
Figure BDA0002474955180000031
表2各培养基组分
Figure BDA0002474955180000032
Figure BDA0002474955180000041
所述LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.0。
所述LB固体培养基组成：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15～20g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.0。
所述IM培养基组成：0.145％KH2PO4，0.205％K2HPO4，0.06％MgSO4·7H2O，0.03％NaCl，0.01‰CaCl2，0.001‰FeSO4，0.05％NH4NO3，5mL/L甘油，0.2％葡萄糖，5mL/L微量元素储备液，40mL/L MES缓冲液(1mol/L、pH＝5.5)，溶剂为蒸馏水；所述每10ml微量元素储备液组成：ZnSO4·7H2O 0.001g，CuSO4·5H2O 0.001g，H3BO4 0.001g，(NH4)2SO4 0.5g，MnSO4·H2O0.001g，NaMoO4·H2O 0.001g，溶剂为蒸馏水。
PDB液体培养基组成：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，溶剂为蒸馏水。
1、构建组合表达重组载体
来源于蛹虫草的磷酸葡萄糖变位酶基因pgm(Genbank，gene ID:18164305)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；来源于蛹虫草的焦磷酸化酶基因ugp的(Genbank，gene ID:18168250)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；来源于蛹虫草的UDP-葡萄糖-6-脱氢酶基因ugdh的(Genbank，gene ID:18163716)核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
将目的基因序列pgm、ugp和ugdh分别扩增，然后用
Figure BDA0002474955180000042
Seamless Cloning and Assembly Kit将扩增片段分别与载体pCAMBIA-PgpdA-Tcbh1-hph-PtrpC连接，得到重组载体pCAMBIA-PgpdA-pgm-Tcbh1-hph-PtrpC、pCAMBIA-PgpdA-ugp-Tc bh1-hph-PtrpC和pCAMBIA-PgpdA-ugdh-Tcbh1-hph-PtrpC。
使用引物Insert-CobF和引物Insert-CobR，以重组载体pCAMBIA-PgpdA-pgm-Tcbh1-hph-PtrpC为模板，根据表3，经PCR扩增得到插入片段PgpdA-pgm-Tcbh1；
使用引物Plasmid-CobF和引物Plasmid-CobFR将重组载体pCAMBIA-PgpdA-ugdh-Tcbh1-hph-PtrpC根据表4条件进行线性化，获得线性化载体PCAMBIA-PgpdA-ugdh-Tcbh1-hph-PtrpC。
使用
Figure BDA0002474955180000043
Seamless Cloning and Assembly Kit将插入片段PgpdA-pgm-Tcbh1与线性化载体PCAMBIA-PgpdA-ugdh-Tcbh1-hph-PtrpC连接，得到组合表达重组载体PCAMBIA-PgpdA-pgm-ugdh-Tcbh1-hph-PtrpC(记为pgm-ugdh)，如图2。
Insert-CobF：5’-TTGGAGACCAACTTGGCTTGTATCTCTACACACAGG-3’
Insert-CobR：5’-GGCAAAGGAATAGGTAAGTTGGTCTCCAACAGTGCTT-3’
Plasmid-CobF：5’-ACCTATTCCTTTGCCCTCGGACGA-3’
Plasmid-CobR：5’-CAAGTTGGTCTCCAACAGTGCTTT-3’
表3插入片段PCR反应体系
试剂 体积(μL)
DNA模板 2
Insert-CobF 1
Insert-CobR 1
Primer-STARMix 25
ddH<sub>2</sub>O 21
Total 50
反应程序：98℃预变性3min，98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s，3个循环，98℃变性10s，65℃退火10s，72℃延伸30s，27个循环，72℃补缺10min，4℃低温保存。
表4载体线性化PCR反应体系
试剂 体积(μL)
DNA模板 3
Plasmid-CobF 2
Plasmid-CobR 2
Primer-STARMix 25
ddH<sub>2</sub>O 18
Total 50
反应程序：98℃预变性3min，98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸180s，20个循环，72℃补缺10min，4℃低温保存。
2、转化根瘤农杆菌
将6μL构建好的组合表达重组载体PCAMBIA-PgpdA-pgm-ugdh-Tcbh1-hph-PtrpC加入到100μL大肠杆菌DH5α感受态中，冰上放置30min；42℃水浴中热激30s，转冰上冷却2min；向感受态中加入800μL LB液体培养基，37℃，180rpm，震荡培养1h；3500rpm离心10min，保留100μL菌液；重悬菌液涂布于大肠杆菌培养基，37℃培养24h。筛选大肠杆菌阳性克隆，用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒抽提质粒DNA，并将质粒载体加入到100μL根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL-1感受态中，转化得到农杆菌阳性克隆。
3、农杆菌转化蛹虫草
重组载体中T-DNA片段通过农杆菌介导转化导入蛹虫草细胞后，使蛹虫草产生潮霉素B抗性，通过潮霉素B抗性筛选得到潜在的基因工程菌株。
将农杆菌阳性克隆接种到农杆菌预培养液体培养基中，180rpm、28℃恒温培养6～8h，菌体浓度OD600＝0.80，得到农杆菌菌液。将蛹虫草CM-001接种至PDB液体培养基中，22～25℃，120rpm培养7d，过滤，菌体用无菌水调整为106/mL的蛹虫草CM-001孢子悬浮液。将200μL农杆菌菌液与蛹虫草CM-001孢子悬浮液等体积混合，并涂布至贴有无菌玻璃纸的共培养固体培养基表面，24℃恒温避光共培养48h后，将玻璃纸转接至选择培养基，并25℃恒温避光培养4天传代筛选得到潮霉素B抗性菌株，即为含有组合基因的重组蛹虫草基因工程菌。
提取蛹虫草潮霉素B抗性菌株基因组DNA，采用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司，产品编号：B518229)以及相关操作说明提取基因组DNA：①取50-100mg新鲜真菌或20mg干燥子实体或菌丝，液氮中充分研磨成粉末后放入到1.5mL离心管中，依次加入400μL Buffer Digestion和4μlβ-巯基乙醇，震荡混匀。65℃水浴1h至细胞完全裂解。②加入200μl Buffer PF，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min。③室温10000rpm离心5min，将上清液(500～550μl)转移到新的1.5ml离心管中。④加入等体积的异丙醇，颠倒5～8次使之充分混匀，室温放置2～3min。室温10000rpm离心5min，弃上清。⑤加入1ml 75％乙醇，颠倒漂洗1～3min，10,000rpm离心2min，弃上清。⑥重复步骤⑤一次。⑦开盖室温倒置5～10min至残留的乙醇完全挥发，得到的DNA用50～100用正向引物F：5’-CTATTCCTTTGCCCTCGGACGA-3’和反向引物R：5’-ATGCCTGAACTCACCGCGACGT-3’进行PCR验证，检验是否转化成功，结果如图3所示。
配制葡萄糖水溶液浓度梯度为16、24、32、40、48、56、64和72μg/mL，用硫酸苯酚法测定490nm吸光度，根据测定结果，绘制标准曲线，如图4所示，标准曲线方程为y＝0.00752x-0.01393(R2＝0.99722)。
分别收集蛹虫草CM-001(即图5中WT)和蛹虫草潮霉素抗性菌株(图5中pgm-ugdh、ugp-ugdh、pgm-ugp)的新鲜孢子悬浮液，浓度106/mL，取500μL，接种到发酵培养基，25℃，120rpm，摇床培养9d。
取发酵液样品，加入四倍体积的无水乙醇，并4℃保存过夜，离心得到沉淀，然后将沉淀重悬于1M NaOH水溶液中，60℃水浴1h，离心收集上清，用硫酸苯酚法(浓硫酸5mL，5％苯酚1mL，样品1mL)测定上清中总糖含量，重复测定三次。根据图4，得到发酵液中虫草胞外多糖含量结果如表5和图5所示。
实施例2构建组合表达ugp和ugdh的蛹虫草菌株
同实施例1方法，使用引物Insert-CobF&Insert-CobFR经PCR扩增重组载体pCAMBIA-PgpdA-ugp-Tcbh1-hph-PtrpC得到插入片段PgpdA-ugp-Tcbh1；使用引物Plasmid-CobF&Plasmid-CobR将重组载体pCAMBIA-PgpdA-ugdh-Tcbh1-hph-PtrpC线性化。
使用
Figure BDA0002474955180000071
Seamless Cloning and Assembly Kit将插入片段与线性化载体连接得到组合表达重组载体PCAMBIA-PgpdA-ugp-ugdh-Tcbh1-hph-PtrpC(记为ugp-ugdh)，如图2。
其他操作同实施例1，获得组合表达ugp和ugdh的蛹虫草基因工程菌株菌株，用正向引物F：5’-CTATTCCTTTGCCCTCGGACGA-3’和反向引物R：5’-ATGCCTGAACTCACCGCGACGT-3’进行PCR验证，检验是否转化成功，结果如图3所示；测定转基因菌株总糖含量，即得到发酵液中胞外多糖产量，如表5和图5所示。
实施例3构建组合表达pgm和ugp的蛹虫草菌株
同实施例1方法，使用引物Insert-CobF&Insert-CobR经PCR扩增重组载体pCAMBIA-PgpdA-ugp-Tcbh1-hph-PtrpC得到插入片段PgpdA-ugp-Tcbh1；使用引物Plasmid-CobF&Plasmid-CobR将重组载体pCAMBIA-PgpdA-pgm-Tcbh1-hph-PtrpC线性化。
使用
Figure BDA0002474955180000072
Seamless Cloning and Assembly Kit将插入片段与线性化载体连接得到组合表达重组载体PCAMBIA-PgpdA-pgm-ugp-Tcbh1-hph-PtrpC(记为pgm-ugp)，如图2。
其他操作同实施例1，获得组合表达pgm和ugp的蛹虫草基因工程菌株菌株，用正向引物F：5’-CTATTCCTTTGCCCTCGGACGA-3’和反向引物R：5’-ATGCCTGAACTCACCGCGACGT-3’进行PCR验证，检验是否转化成功，结果如图3所示；测定转基因菌株总糖含量，即得到发酵液中胞外多糖产量，如表5和图5所示。
表5重组蛹虫草基因工程菌株与蛹虫草原始菌株的虫草多糖产量
pgm-ugdh(g·L<sup>-1</sup>) ugp-ugdh(g·L<sup>-1</sup>) pgm-ugp(g·L<sup>-1</sup>) C.militaris WT(g·L<sup>-1</sup>)
5.97 4.28 4.74 3.51
6.33 3.86 4.55 3.64
6.05 4.02 4.46 3.29
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种多基因组合表达制备蛹虫草多糖的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1662
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
atggacgtca agactgttga gtttaagcct ttccaggacc aaaaggctgg cacctccggt 60
cttcgcaaga aggtcaccac cttccagcag gcccactaca gcgagtcttt cgttgccagc 120
cttctcctct ccatccccga aggtgtcgag ggatcctttc tcgtcatcgg tggtgatggc 180
cgctactgga accccgaggt gatccagctg attgccaaga ttggtgccgc gtacggcgtc 240
aagaagctcc tcatcggcca aaatggcatc ctgtcaaccc cggctgcgag ccatgtcatc 300
cgccttcgca aggctaccgg tggtatcctt ctgactgcca gtcacaaccc cggcggcccc 360
aaggaagact ttggcatcaa atacaacctg gccaacggtg gccccgcccc cgagtccgtg 420
acgaacaaga tctttgagac ttccaagact ttgacctcct ataagatcac ctctatcccc 480
gacattgaca ttgtcactat tggcacccag acctacggtg ctctcgaggt ggagattatt 540
gacagcacgg ccgactacgt cgctatgctc aaggacattt tcgactttgg caccatcaag 600
aagtttttcg cttcgcaccc cgacttcaag gttctctttg acggtcttca cggcgtcact 660
ggcccttatg gaaccgccat tttcgaaaag gagcttggtc ttactggcgc cacccagaac 720
tgcgtgccta gccccgactt caacggcggt caccccgatc ccaacctggt ctacgcccac 780
tctctcgtcg aagttgtcga caagcacaac attccctttg gcgccgcctc ggacggcgac 840
ggcgaccgca acatgattta cggtgccaat gcctttgtct cgcccggcga ctccctcgcc 900
atcatcgctc accacgccaa gctcattccc tacttccaga agcacggtgt taacggcctg 960
gcccgctcca tgcccacctc gggcgctgtt gacctcgtcg ccaaggcgca gggtctcgac 1020
tgctacgagg tccccaccgg ctggaagttc ttctgcgccc tctttgacgc caagaagctg 1080
tccatctgcg gcgaggagag cttcggcacg ggcagcgacc acattcgtga aaaggacggt 1140
ctctgggccg ttgtcgcctg gctcaacatc attgccgccc tcggtgtgca gaaccccgag 1200
tctacccctt ccatcaagca gatccaaaag gacttttgga cgcaatacgg acgcacattc 1260
ttcacccgct acgactacga gaatgttgac tccgacggtg ccaacaaggt tgttggcgag 1320
ctgcaggcgc tggtggctaa ccccaacact gtcggcagca agattggcga gcgcaccgtc 1380
actgccgctg gcaacttctc ctacaccgac ctcgacggct ccgtctcgtc taaccagggt 1440
ctctacgcca ccttttcctc tggcagccgc atcgtcgttc gtctctccgg caccggctcc 1500
tccggcgcga ccatccgtct ctacctcgag cagcacagca gcgaccccgc cacatacgac 1560
ctggatgccc aggacttcct caaggccgag gtcaagtttg ccacggagct tctcaagttc 1620
aaggagcatg tcggccgcga cgagcctaat gtccgcactt ga 1662
<210> 2
<211> 1659
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
atggttgtgg caggggggag gagggttaca gtgcagaaga gaatcacggc taccgatatc 60
tccaaacctc ccaaggtatt agttaggtac tccaagagtg ctcttccctc tcacctccgt 120
cctaccgcca ctggcaagga cgaggagaac aatggtttcg agaagcgtca tcacggcaag 180
acgcgcagcc acatggcctt tgagaacacc tctaccaatg ttgccgcggc ccagatgcgc 240
aatgccctca caaacctcgc cgagacggtc gaggacccca agcagaagaa gctcttcgaa 300
accgaaatgg acaacttctt cgctctcttc cgccgctact tgaacgacaa ggccaaggga 360
aacgtcgttg actgggaacg catccgcccc cctgctgccg gccaggtcgt cgactatgag 420
gacctcgcca actccgagtc agttcagttt ctcaacaagc ttgccgtcct caagctcaat 480
ggtggtctcg gtacctccat gggctgcgtt ggccccaagt ccgtcattga ggtccgcgac 540
ggcatgtcct tcctcgacct ttccgtccgt cagatcgagt tcctcaaccg cacatacgac 600
gtcaatgtcc ctttcctcct catgaactcg ttcaacacca acgacgatac cgctgccatc 660
atcaagaagt acgagggcca caacgtcgat atcctcacct tcaaccagtc ccgctacccc 720
agaatcttca aggactctca gctccctgtt cccagcaact acaactcggc cattagcgag 780
tggtaccctc ctggtcacgg tgacgtcttc gagtctctct acaactctgg tgttctagac 840
cagctcctcg agcgcggcat cgagatcatc ttcctctcca acgttgataa cctgggtgcc 900
gtagttgacc tgcgcatcct acagcacatg atggagacca aggccgagta cattatggaa 960
ctcaccaaca agaccaaggc cgacgttaag ggtggtacta ttatcgacta tgatggctcc 1020
gtccgcctgc tcgaaatcgc ccaggttccc aaggagcacg tgaatgactt caagtcgatt 1080
aagaagttca agtacttcaa caccaacaac atctggctca acctccgtgc tatcaagcgc 1140
gttgtcgaga acgacgagct tgagatggag attattccca atgccaagac catccctggc 1200
gacaagaagg gcgagtctga catttccatt atgcagctcg agactgctgt cggcgccgct 1260
attcgccact tcaaaaatgc ccacggtgtc aacgtccccc gtcgccgctt ccttcccgtc 1320
aagacatgct cggacctcat gctggtcaag tccgatctct acactctcaa gcacggtcag 1380
ctccagatga gcgccaaccg cttcggtgat gctcccctta tcaagcttgg tagcgacttc 1440
aagaaggtct ccgacttcca gaagcacatt ccttctatcc ccaaggttct cgagctggac 1500
cacctgacca tcaccggtgc tgtgaacctg ggccgtggtg tcacgctcaa gggcactgtt 1560
attattgtcg ccaccgaggg aagcaccatt gatatccccc ccggctctat tctcgaaaac 1620
gtcgtcgttc agggctcgct acgcctgctt gagcattaa 1659
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<211> 1875
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atgtcttcat ccatcgtcga caccgtcaag gcccttagcc tcaacagctc agcaaacgcc 60
tccaatggct ccgaaaaccc agaatttacc atccgcaaca tctgctgcgt tggtgctggc 120
tatgtcggcg gccctaccgc ggcggtcctc gccttccaaa accctcacat cagagtcacc 180
gttgtcgatc gtgaccagac ccgaattcgt cgctggaact cgagacaccc ccccatctat 240
gagcccggcc tgcaagacat tgtccgcata gcccgcgacg gcagccgtga gaccttcttc 300
tccaacgagg ccaccagcga cgccgacacc ttcaactcgg actttggcga ggtcagcgtg 360
gctccccgcc agagcaacct attctttacc acagatgtgg ccggcagcat cgccgaggcc 420
gacgttgtcc tcatctcggt caacacaccc acaaaggaac gcggtatcgg tgccggcagc 480
gctaccgaca tgaccgcctt tgaggccgtc actgctgtcg tagcacaaaa cgcccgcgaa 540
ggtgccatta tcgtcgagaa gagcactgtt ccttgccgca ctgctcagct cgttgccgag 600
actatttcaa tgcaccgccc cggcgtccat tttgagattc tctccaaccc cgaattcctc 660
gctgctggta ccgccgtcaa cgatctcctc tacccggacc gtattctcat cggttccgcc 720
cccaccccga ctggcaagct tgccgccgag gccctcgcca acgtctacgg ggcctgggtg 780
ccccgcgaac gcatcctaac aaccaacgtc tggtcttccg agcttgccaa gctcgttgcc 840
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actggcgctg atgttgacga ggtagcccgc gccgttggtg tggacccccg tattggcaac 960
aagttccttg tcgctggtat cggtttcggt ggtagctgct tcaagaagga tgttctcaac 1020
ctcgtctacc tcgccgacac aatgggtctc cctgaagtcg gcgagtactg gcgccaggtc 1080
gtcaagatga acgagtacgc acgcgaccgc ttcaccaacc gcgttatcaa gtgtctgaac 1140
aacacgctgg tcggcaaaaa ggtctgcatc ctcggttacg ccttcaagaa gaacacctcc 1200
gatacccgtg aagccccagc tttggagatg atcaagaccc tcctcgagga gcgcccgcgt 1260
gagattgcca tcttcgaccc gtgctgcaac ccgctagtca tcaagaacga aattcgatcc 1320
ctccttgggc ctctggccga gggcaacaac atctccgtct atggaaacgc gtacgacgcc 1380
tgcgacgatg ccacagccgt cgtcattgcg accgaattcg acgagttccg caatcagccc 1440
gtgccgaagc ccactgctcc ctcagctgcg gctgtgccca agacgattgg tggcaagccc 1500
aaccccaaat gcgatccccg ccccttcaag accaccattc cttctgagaa tgatctccta 1560
gctcttcaca agcacctggc tcagcgcgaa aacgggcagg ggcccgatcc gctcaaccgc 1620
ttcaacactg agccgtcgtg tgacagctct tgtcccgact gccagcaaga gcaggaaagt 1680
caggcgactg gccatgctac gggcatgggc aatgccgagg agtacaagtc caaggggcgc 1740
ctcaactggg agcgcatcgc cgattcaatg gcaattcctc gctgggtttt tgacggccgt 1800
ggtgttattg actcgcgcga aatggtcaag ctgggcgttc gcgttgagag cgttggtcgt 1860
caacaccgct tctaa 1875

Claims (6)

1.一种多基因组合表达制备蛹虫草多糖的方法，其特征在于所述方法是将组合基因导入蛹虫草细胞构建重组蛹虫草基因工程菌，再将重组蛹虫草基因工程菌接种至发酵培养基中，在22～25℃，100-150rpm条件下发酵培养，获得含蛹虫草多糖的发酵液，将发酵液分离纯化，获得蛹虫草多糖；所述组合基因是指磷酸葡萄糖变位酶基因pgm，焦磷酸化酶基因ugp或UDP-葡萄糖-6-脱氢酶基因ugdh中任意两种的组合。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述磷酸葡萄糖变位酶基因pgm核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述焦磷酸化酶基因ugp核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述UDP-葡萄糖-6-脱氢酶基因ugdh核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养基质量组成：2％葡萄糖，0.70％(NH4)2SO4，0.05％K2HPO4·3H2O，0.05％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，0.10％L-甘氨酸，溶剂为蒸馏水，pH自然。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵液分离纯化方法为：向发酵液中加入四倍体积的无水乙醇，并在4℃保存过夜，离心得到沉淀即为蛹虫草多糖，然后将沉淀重悬于1M NaOH水溶液中，60℃水浴1h，离心，收集上清，即为蛹虫草多糖溶液。
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