CN106916776A - 过表达磷酸葡萄糖变位酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌及构建方法 - Google Patents

过表达磷酸葡萄糖变位酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌及构建方法 Download PDF

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Abstract

过表达磷酸葡萄糖变位酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌及构建方法，涉及基因工程及微生物发酵。公开了一株同时过表达磷酸葡萄糖变位酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的地衣芽孢杆菌及其构建方法，克隆了多糖絮凝剂合成途径的关键酶磷酸葡萄糖变位酶基因(pgcA)和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(gtaB1)，利用大肠杆菌－芽孢杆菌穿梭质粒构建重组表达载体。通过电转化的方法将重组质粒导入到地衣芽孢杆菌，构建了重组地衣芽孢杆菌HN301‑5，本发明构建的重组地衣芽孢杆菌比出发菌株的多糖絮凝剂产量提高了20.77％。可望用于多糖絮凝剂的工业化生产，提高产量，降低成本。

Description

过表达磷酸葡萄糖变位酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化 酶基因的工程菌及构建方法
技术领域
本发明涉及基因工程及微生物发酵，尤其是涉及一株过表达磷酸葡萄糖变位酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌及构建方法。
背景技术
磷酸葡萄糖变位酶(Phosphoglucomutase)和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucosepyrophosphorylase，UGPase)均是在植物、动物和细菌中广泛分布，与糖代谢密切相关的酶。磷酸葡萄糖变位酶的作用是将葡萄糖-6-磷酸转化为葡萄糖-1-磷酸，是糖代谢过程中的关键步骤。而尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶催化生成的尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)是葡萄糖的主要活化形式，可作为葡萄糖基的供体，在细胞内作为蔗糖、淀粉、纤维素、半纤维素、果胶质以及糖脂、糖蛋白、糖原、β-葡聚糖等多种碳水化合物的前体。已有研究表明，磷酸葡萄糖变位酶基因(pgcA)和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(gtaB1)是多糖生物合成的关键酶基因(Applied and Environmental Microbiology,2002.68(2):p.784-790.；Biotechnology letters,2002.24(12):p.1023-1026；Journal of Bacteriology,176(9):2611-2618；Biochemical Journal,370(1):995-1001)。
微生物絮凝剂(Microbial flocculant,MBF)是微生物分泌的能够使悬浮液中的固体颗粒、菌体、细胞和胶状物絮凝沉淀的大分子化合物，主要成分有多糖、糖蛋白、蛋白质、纤维素和DNA等。微生物絮凝剂具有安全、高效、可生物降解和对环境无污染等优势，且能产生絮凝剂的微生物种类多、生长快、易于采用工程手段而实现产业化。因此微生物絮凝剂的开发前景十分看好。目前，多糖生物絮凝剂已经应用于去除纺织印染废水中的色素(Colloids and Surfaces B-Biointerfaces,2005,44(4):179-186.)，还可以去除工业废水中的重金属离子和其它悬浮污染物(Bioresource Technology,2007,98(2):361-367.)。然而多糖絮凝剂产量低、成本较高，制约着它的大规模工业化应用。目前，对于培养基、培养条件、生长因子等外部因素影响多糖絮凝剂合成的报道已经很多(Process Biochemistry,2014,49(4:576-582；Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2014,116:257-264)。而从地衣芽孢杆菌的遗传及生理学角度对其多糖絮凝剂合成量影响的报道甚是少见。由于多糖絮凝剂结构复杂，且大多数针对多糖的研究并不关注絮凝活性，有关多糖絮凝剂代谢途径的研究还较少，而通过分子生物学技术改造菌株提高多糖絮凝剂产量的报道几乎没有，因此通过基因工程技术构建高产优良菌株，进一步提高多糖絮凝剂活性及产量，具有重要的经济价值及社会意义。
本申请人在中国专利200910111262.4提供了地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，该微生物已于2009年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.2876。
发明内容
本发明的第一目的在于针对现有技术中多糖絮凝剂絮凝活性不高、调控机理不明等问题，提供过表达磷酸葡萄糖变位酶基因pgcA和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB1。
本发明的第二目的在于提供一株同时过表达磷酸葡萄糖变位酶基因pgcA和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB1的地衣芽孢杆菌基因工程菌。
本发明的第三目的在于提供过表达磷酸葡萄糖变位酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌的构建方法。
本发明的第四目的在于提供过表达磷酸葡萄糖变位酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌在制备多糖絮凝剂中的应用。
所述过表达磷酸葡萄糖变位酶基因pgcA和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB1利用PCR扩增克隆多糖絮凝剂合成途径获得，所述酶磷酸葡萄糖变位酶基因pgcA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示，所述尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：2所示。
所述一株同时过表达磷酸葡萄糖变位酶基因pgcA和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB1的地衣芽孢杆菌基因工程菌以得到的pgcA基因和gtaB1基因片段为模版，利用重叠延伸PCR扩增得到pgcA-gtaB1串联基因片段，利用重组酶(pEASY-Uni SeamlessCloning and Assembly Kit)将pgcA-gtaB1串联基因片段与表达载体连接，得到重组的串联基因表达载体，然后利用电转化的方法导入到地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中，通过抗性筛选获得一株同时过表达磷酸葡萄糖变位酶基因pgcA和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB1的地衣芽孢杆菌基因工程菌。所述表达载体为游离载体，优选表达载体PHY300PLK-PamyL-TTamyL；所述表达载体的启动子为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因的启动子PamyL。所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)已于2009年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.2876。
所述过表达磷酸葡萄糖变位酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌的构建方法包括以下步骤：
1)设计PCR引物扩增磷酸葡萄糖变位酶基因pgcA和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB1；
2)利用pgcA基因的上游引物和gtaB1基因的下游引物，以基因片段pgcA和gtaB1作为DNA模板，进行重叠延伸PCR得到pgcA-gtaB1串联基因片段；
3)表达载体PHY300PLK-PamyL-TTamyL分别用限制性内切酶Kpn I和Spe I双酶切，其后与pgcA-gtaB1串联基因片段混合，加入重组酶(pEASY-Uni Seamless Cloning andAssembly Kit)50℃反应15min，使基因片段与表达载体发生连接，得到PHY300-pgcA-gtaB1过表达质粒；
4)将PHY300-pgcA-gtaB1过表达质粒导入到E.coli DH5α中，以备扩增后电转化；
5)将经提取、浓缩后的PHY300-pgcA-gtaB1过表达质粒电转化地衣芽孢杆菌，37℃复苏5h后，涂布四环素抗性平板，再在37℃培养12h，筛选转化子；
6)转化子经质粒提取后，利用PCR进行验证并测序，从而获得过表达磷酸葡萄糖变位酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的地衣芽孢杆菌重组菌HN301-5。
所述过表达磷酸葡萄糖变位酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌可在制备多糖絮凝剂中应用。
所述过表达磷酸葡萄糖变位酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌制备多糖絮凝剂的具体方法包括以下步骤：
1)刮一环地衣芽孢杆菌重组菌HN301-5接种于液体种子培养基中，35～37℃，200r/min培养12～16h，制备种子培养液；
2)以4％(V/V)的接种量接种于多糖絮凝剂发酵培养基中，在30～40℃，150～300r/min条件下培养50～60h，进行发酵产多糖絮凝剂实验，优选在37℃，200r/min的条件下培养48～56h；
3)将所得发酵液离心收集上清液，将所得上清液用乙醇法沉淀，沉淀溶解于水后冷冻真空干燥即得。其中所述乙醇法沉淀是用三倍体积的乙醇提取，4℃静置12h，离心的速度为6000～8000rpm，离心时间可为10～15min，离心温度可为4℃。
pgcA基因是编码磷酸葡萄糖变位酶的基因，可以催化葡萄糖-6-磷酸与葡萄糖-1-磷酸之间的相互转化，是合成多糖絮凝剂过程中关键的中间步骤；gtaB1基因是编码尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶催化生成的尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)是葡萄糖的主要活化形式，也是合成多糖絮凝剂的必需前体，基于以上理论分析，过表达pgcA和gtaB1基因，能够增大多糖絮凝剂合成途径的代谢流量，有利于提高多糖絮凝剂的产量，降低成本。
本发明的技术效果在于：本发明提供了能提高多糖絮凝剂产量的的基因工程菌的构建方法。该方法包括以下过程：克隆多糖絮凝剂合成途径的关键酶磷酸葡萄糖变位酶基因pgcA和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB1，利用重组酶(pEASY-Uni SeamlessCloning and Assembly Kit)连接和PCR扩增构建串联基因表达载体，再利用大肠杆菌－芽孢杆菌穿梭质粒构建重组表达载体。通过电转化的方法将重组质粒导入到地衣芽孢杆菌，通过四环素筛选转化子，然后通过提取质粒对基因工程菌进行验证(如图1)，从而构建了地衣芽孢杆菌重组菌HN301-5，本发明构建的地衣芽孢杆菌重组菌HN301-5比出发菌株的多糖絮凝剂产量提高了20.77％(如图2)。可望用于多糖絮凝剂的工业化生产，提高产量，降低成本。
附图说明
图1为重组表达质粒PHY300-pgcA-gtaB1的PCR验证结果图，其中泳道1,2,3:重组质粒PHY300-pgcA-gtaB1。
图2为地衣芽孢杆菌CGMCC 2876及其重组菌HN301-5多糖絮凝剂絮凝活性和产量比较图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好理解本发明。然而本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅限于说明本发明。
实施例1:重组表达载体PHY300-pgcA-gtaB1的构建
设计PCR引物，用于扩增pgcA基因片段。
上下游引物分别为：
上游引物1：GAGGAAAATCGGTACATGAGCTGGAGAACGAG
下游引物2：GACTGCTTTTTTTACTTTCATTCAATTTGAAGTCGCTTTTA
设计PCR引物，用于扩增gtaB1基因片段。
上下游引物分别为：
上游引物3：TAAAAGCGACTTCAAATTGAATGAAAGTAAAAAAAGCAGTC
下游引物4：CTTTTCTTCTCGAGATCATTGCCATGCTCCTT
以Bacillus licheniformis CGMCC 2876基因组DNA为模板，进行如下PCR程序:(1)94℃,5min；(2)94℃,30s；(3)55℃,30s；(4)72℃,1min，步骤(2)～(4)重复35个循环；(5)72℃,10min，4℃保存。
PCR反应体系如表1所示。
表1
以引物1和引物4分别作为上游引物和下游引物，以pgcA和gtaB1基因片段作为DNA模板进行重叠延伸PCR，扩增得到pgcA-gtaB1串联基因片段。PCR程序同上。PCR反应体系如表2所示。
表2
将表达载体PHY300PLK-PamyL-TTamyL用限制性内切酶Kpn I和Spe I双酶切，回收后，与pgcA-gtaB1串联基因片段以及重组酶Assembly Mix(pEASY-Uni Seamless Cloningand Assembly Kit)混合，50℃反应15min。反应体系如表3所示。
表3
实施例2:地衣芽孢杆菌基因工程菌HN301-5的构建
将PHY300-pgcA-gtaB1过表达质粒经提取及浓缩后，电击转化地衣芽孢杆菌，37℃复苏5h后，涂布四环素抗性平板，再在37℃培养12h，筛选转化子。转化子经质粒提取后，利用PCR进行验证(如图1)。从而获得过表达磷酸葡萄糖变位酶基因pgcA和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB1的地衣芽孢杆菌工程菌HN301-5。
电转化具体步骤如下：
地衣芽孢杆菌感受态的制备：
(1)在50mL LB培养基中接种一环B.licheniformis,37℃，200r/min过夜培养12h；
(2)取过夜培养液1mL接入50mL生长培养基中，于37℃，200r/min培养至对数中后期，直到细胞OD600达到0.85～0.95；
(3)细胞冰浴30min，停止生长后，(取预先预冷的50mL干净离心管，加入40mL停止生长的培养液)再于4℃以6 000r/min离心收获细胞；
(4)用冰冷(0℃冰水浴)的EP缓冲液40mL悬浮细胞四次(每次都在0℃冰水浴中晃动，使沉淀悬浮，可用枪轻轻吹吸)，并最终将细胞悬浮于1mL EP缓冲液中,使细胞浓度达到(1～1.3)×1010CFU/mL；
(5)将感受态细胞分装于1.5mL离心管(预冷过的)中，每管100μL，再直接进行下一步实验或-70℃保存感受态；
地衣芽孢杆菌的电转：
(1)将感受态细胞和1～5μg质粒混合物转移到冰冷的0.1cm间隙的电击池中；
(2)以1800V、5ms脉冲转化；
(3)迅速往电击池中加入1mL复苏培养基，将菌悬液回收到5mL离心管中,于37℃，200r/min培养5h；
(4)将菌液涂布在抗性平板上，于37℃培养直到平板上出现菌落。
实施例3:利用地衣芽孢杆菌及其基因工程菌发酵制备多糖絮凝剂
将地衣芽孢杆菌CGMCC 2876出发菌株和实施例2所述基因工程菌接种于液体种子培养基中，37℃，200r/min培养16h，制备种子培养液，以4％(V/V)的接种量接种于多糖絮凝剂发酵培养基中，37℃，200r/min培养，进行发酵产多糖絮凝剂实验。56h后分别测定发酵液絮凝活性及多糖絮凝剂产量(如图2)。pgcA-gtaB1串联基因过表达重组工程菌多糖絮凝剂的粗提产量为9.07g/L，较原菌株粗提产量7.51g/L提高了20.77％。
生物絮凝剂的絮凝活性可采用以下方法测定:
称取高岭土粉末0.2g与50mL刻度试管中，依次加入2.5mLCaCl2溶液(10g/L)和1mL待测液，蒸馏水加至与刻度线平齐。充分混合后，迅速置于比色皿中，静置5min后，用紫外可见分光光度计在波长550nm下测定吸光度。以蒸馏水做空白测定。计算公式如下:
絮凝活性(U mL-1)＝(B-A)/B×100×D
式中，A：待测样品的OD550值，B：空白培养基的OD550值，D：发酵液稀释倍数。
生物絮凝剂的提取纯化方法：
(1)取10mL发酵液8000rpm离心5min，除菌体，收集上清液，重复操作两次。
(2)上清液中加入3倍体积的无水乙醇，4℃条件下静置12h。
(3)8000rpm离心10min，弃上清液，加10mL去离子水溶解。上清液中加入3倍体积的无水乙醇，4℃条件下静置12h后，离心弃上清液。
(4)冷冻真空干燥。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 过表达磷酸葡萄糖变位酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌及构建方法
<130> 2016
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1746
<212> DNA
<213> Bacillus Licheniformis
<400> 1
atgagctgga gaacgagcta tgaacgctgg aaaaacaaag aaaacttaga ttccgaatta 60
aaatcgcttc ttttggaagc tgaaggaaat gaaaaagaac tagaggattg cttttataaa 120
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gtatatcaaa ttgacgatct tgtggaaaag ccgtctgtca aagaagcccc ttcaaatatc 600
gcggttatgg gccgctatgt gctgaggcct tcgattttcc ctgtgctcga acaaacgaag 660
cgcggtgcgg gaaatgaaat tcagctgact gacgcactaa gggaaatctg ccgggaacaa 720
agcatgtatg cgcgcaaatt ggaaggaagc cgctttgata tcggcgacaa gctgggcagt 780
ttaaaagcga gtacggaaat cgctcttatg cgggacgaga tgcggccaaa actgctcgcc 840
tacctggaaa gcgtcctaaa aaaagaggcg cagaaaggag catggcaatg a 891
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 上游引物1
<400> 3
gaggaaaatc ggtacatgag ctggagaacg ag 32
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 下游引物2
<400> 4
gactgctttt tttactttca ttcaatttga agtcgctttt a 41
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 上游引物3
<400> 5
taaaagcgac ttcaaattga atgaaagtaa aaaaagcagt c 41
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 下游引物4
<400> 6
cttttcttct cgagatcatt gccatgctcc tt 32

Claims (10)

1.过表达磷酸葡萄糖变位酶基因pgcA，其特征在于利用PCR扩增克隆多糖絮凝剂合成途径获得，所述酶磷酸葡萄糖变位酶基因pgcA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。
2.过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB1，其特征在于利用PCR扩增克隆多糖絮凝剂合成途径获得，所述尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：2所示。
3.一株同时过表达磷酸葡萄糖变位酶基因pgcA和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB1的地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于以得到的pgcA基因和gtaB1基因片段为模版，利用重叠延伸PCR扩增得到pgcA-gtaB1串联基因片段，利用重组酶(pEASY-UniSeamless Cloning and Assembly Kit)将pgcA-gtaB1串联基因片段与表达载体连接，得到重组的串联基因表达载体，然后利用电转化的方法导入到地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)中，通过抗性筛选获得一株同时过表达磷酸葡萄糖变位酶基因pgcA和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB1的地衣芽孢杆菌基因工程菌；所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)已于2009年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.2876。
4.如权利要求3所述一株同时过表达磷酸葡萄糖变位酶基因pgcA和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB1的地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于所述表达载体为游离载体，表达载体为PHY300PLK-PamyL-TTamyL。
5.如权利要求4所述一株同时过表达磷酸葡萄糖变位酶基因pgcA和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB1的地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于所述表达载体的启动子为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因的启动子PamyL。
6.如权利要求3所述过表达磷酸葡萄糖变位酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
1)设计PCR引物扩增磷酸葡萄糖变位酶基因pgcA和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB1；
2)利用pgcA基因的上游引物和gtaB1基因的下游引物，以基因片段pgcA和gtaB1作为DNA模板，进行重叠延伸PCR得到pgcA-gtaB1串联基因片段；
3)表达载体PHY300PLK-PamyL-TTamyL分别用限制性内切酶Kpn I和Spe I双酶切，其后与pgcA-gtaB1串联基因片段混合，加入重组酶(pEASY-Uni Seamless Cloning andAssembly Kit)50℃反应15min，使基因片段与表达载体发生连接，得到PHY300-pgcA-gtaB1过表达质粒；
4)将PHY300-pgcA-gtaB1过表达质粒导入到E.coli DH5α中，以备扩增后电转化；
5)将经提取、浓缩后的PHY300-pgcA-gtaB1过表达质粒电转化地衣芽孢杆菌，37℃复苏5h后，涂布四环素抗性平板，再在37℃培养12h，筛选转化子；
6)转化子经质粒提取后，利用PCR进行验证并测序，从而获得过表达磷酸葡萄糖变位酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的地衣芽孢杆菌重组菌HN301-5。
7.如权利要求3所述过表达磷酸葡萄糖变位酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌在制备多糖絮凝剂中应用。
8.如权利要求7所述应用，其特征在于所述过表达磷酸葡萄糖变位酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌制备多糖絮凝剂的具体方法包括以下步骤：
1)刮一环地衣芽孢杆菌重组菌HN301-5接种于液体种子培养基中，35～37℃，200r/min培养12～16h，制备种子培养液；
2)按体积比，以4％的接种量接种于多糖絮凝剂发酵培养基中，在30～40℃，150～300r/min条件下培养50～60h，进行发酵产多糖絮凝剂实验；
3)将所得发酵液离心收集上清液，将所得上清液用乙醇法沉淀，沉淀溶解于水后冷冻真空干燥即得。
9.如权利要求8所述应用，其特征在于在步骤2)中，按体积比，以4％的接种量接种于多糖絮凝剂发酵培养基中，在37℃，200r/min的条件下培养48～56h。
10.如权利要求8所述应用，其特征在于在步骤3)中，所述乙醇法沉淀是用三倍体积的乙醇提取，4℃静置12h，离心的速度为6000～8000rpm，离心时间为10～15min，离心温度为4℃。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108374002A (zh) * 2018-02-11 2018-08-07 中国海洋大学 一种脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白及其编码基因和用途
CN111518825A (zh) * 2020-04-30 2020-08-11 浙江工业大学 一种多基因组合表达制备蛹虫草多糖的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101503709A (zh) * 2009-03-13 2009-08-12 厦门大学 利用地衣芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法
CN105087454A (zh) * 2014-05-05 2015-11-25 中国医学科学院药物研究所 用于生物催化黄酮类化合物葡萄糖苷化的基因工程菌
CN105624176A (zh) * 2016-01-15 2016-06-01 厦门大学 过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌及构建
CN105624080A (zh) * 2016-01-15 2016-06-01 厦门大学 高产多糖絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101503709A (zh) * 2009-03-13 2009-08-12 厦门大学 利用地衣芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法
CN105087454A (zh) * 2014-05-05 2015-11-25 中国医学科学院药物研究所 用于生物催化黄酮类化合物葡萄糖苷化的基因工程菌
CN105624176A (zh) * 2016-01-15 2016-06-01 厦门大学 过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌及构建
CN105624080A (zh) * 2016-01-15 2016-06-01 厦门大学 高产多糖絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN Z ET AL: "Identification of key genes involved in polysaccharide bioflocculant synthesis in Bacillus licheniformis", 《BIOTECHNOL BIOENG》 *
XU JW ET AL: "Increased polysaccharide production and biosynthetic gene expression in a submerged culture of Ganoerma lucidum by the overexpression of the homologous α-phosphoglucomutase gene", 《BIOPROCESS BIOSYST ENG》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108374002A (zh) * 2018-02-11 2018-08-07 中国海洋大学 一种脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白及其编码基因和用途
CN108374002B (zh) * 2018-02-11 2020-05-12 中国海洋大学 一种脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白及其编码基因和用途
CN111518825A (zh) * 2020-04-30 2020-08-11 浙江工业大学 一种多基因组合表达制备蛹虫草多糖的方法

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