CN108441429B - 一种小核菌及其发酵生产硬葡聚糖的方法 - Google Patents
一种小核菌及其发酵生产硬葡聚糖的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108441429B CN108441429B CN201810238620.7A CN201810238620A CN108441429B CN 108441429 B CN108441429 B CN 108441429B CN 201810238620 A CN201810238620 A CN 201810238620A CN 108441429 B CN108441429 B CN 108441429B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- scleroglucan
- fermentation
- pyrenomycetes
- bacterial strain
- glucose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000221775 Hypocreales Species 0.000 title claims abstract description 16
- FEBUJFMRSBAMES-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-{[3,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-phosphanyloxan-4-yl]oxy}-3,5-dihydroxy-6-({[3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}methyl)oxan-4-yl)oxy]-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl phosphinite Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(OC2C(C(OP)C(O)C(CO)O2)O)C(O)C(OC2C(C(CO)OC(P)C2O)O)O1 FEBUJFMRSBAMES-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 35
- 229920002305 Schizophyllan Polymers 0.000 title abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 10
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 34
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 34
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 16
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 claims abstract description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 21
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 19
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 10
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 10
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 claims description 7
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 241001530056 Athelia rolfsii Species 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 4
- 230000003519 ventilatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 claims description 3
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000002700 tablet coating Substances 0.000 claims description 2
- 238000009492 tablet coating Methods 0.000 claims description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 claims 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 claims 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 claims 1
- 235000003132 food thickener Nutrition 0.000 claims 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 abstract description 11
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 abstract description 11
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 4
- OHVGNSMTLSKTGN-BTVCFUMJSA-N [C].OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O Chemical compound [C].OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O OHVGNSMTLSKTGN-BTVCFUMJSA-N 0.000 abstract description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 12
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 5
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 229910052564 epsomite Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001558929 Sclerotium <basidiomycota> Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 3
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 2
- 229940099112 cornstarch Drugs 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 125000005640 glucopyranosyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000009229 glucose formation Effects 0.000 description 2
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 2-(4-chloro-2-methylphenoxy)acetic acid;n-methylmethanamine Chemical compound CNC.CC1=CC(Cl)=CC=C1OCC(O)=O PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 239000007832 Na2SO4 Substances 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 1
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
- A23L29/20—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents
- A23L29/269—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents of microbial origin, e.g. xanthan or dextran
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
- C12P19/08—Dextran
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Botany (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种小核菌及其发酵生产硬葡聚糖的方法，属于微生物技术领域。本发明提供的菌株CCTCC NO:M2017646可以在葡萄糖碳源浓度为75g/L的条件下发酵56h达到硬葡聚糖产量近20g/L的效果，明显优于目前国际上硬葡聚糖在150g/L蔗糖的培养条件下72h产量26g/L的效果，底物利用率提高58％，成本降低明显。优于现有的葡聚糖生产工艺，具有重要的工业化应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种小核菌及其发酵生产硬葡聚糖的方法，属于微生物技术领域。
背景技术
硬葡聚糖又称为小核菌多糖，是高分子量，非离子型的支链葡聚糖。它是以β-D-(1-3)吡喃葡萄糖基为主链，每三个葡萄糖由β-D-(1-6)吡喃葡萄糖基为侧链的葡聚糖。硬葡聚糖可由小核菌属丝状真菌纯培养发酵得到。
硬葡聚糖具有耐高温、各种电解质(5％NaCl、5％Na2SO4、20％CaCl2等)以及广范的pH等特性。在食品行业作为增稠剂、凝胶剂或稳定剂广泛应用，在制药行业作为药片涂层、眼用滴液等。
目前已有微生物生产硬葡聚糖，然而，由于硬葡聚糖通常由真菌发酵生产，发酵产率不高，从而导致其价格居高不下，这严重限制了其市场(特别是石油工业领域)的开发拓展。已有报道的关于硬葡聚糖发酵生产的研究多集中于发酵培养基的优化，但其仍然存在发酵时间长(96h以上)，生产工艺复杂，生产成本较高等缺陷。因此，一种工艺简单、生产效率日升的硬葡聚糖发酵方法对于实现硬葡聚糖的大规模工业化生产具有重要的意义。
生产硬葡聚糖最广泛应用的是齐整小核菌，在PDA培养基上，菌丝体白色，有绢丝光泽，从中央向四周辐射状扩展，菌丝易纠结，纠结的菌丝会不断紧缩，最后发育成菌核。菌核初期为白色小圆点，中期藏黄色，油菜籽状，后期菌核呈褐色。
国内关于硬葡聚糖生产的报道主要有，中国科学院微生物研究所任永娥等以葡萄糖和酵母膏为基础培养基进行16L自控罐发酵，产量达到14.14g/L，多糖对底物的转化率为47.52％；吉林农业大学李鸿梅等以玉米淀粉和玉米黄浆为基础培养基进行摇瓶发酵，产量达到16.1g/L，多糖对底物的转化率为24％。国外对硬葡聚糖的主要介绍有，Shrikant A等利用蔗糖和酵母浸粉进行摇瓶发酵，产量高达16.58g/L，底物对多糖的转化率为20.7％；J.I.Farina等利用蔗糖和酵母浸粉进行10L自控罐发酵，产量高达26.0g/L，多糖对底物的转化率为17％。目前，硬葡聚糖生产碳源主要为蔗糖，虽然产量达到26g/L，但是底物利用率偏低，生产成本较高，资源浪费严重。运用玉米淀粉和玉米黄浆生产硬葡聚糖并不适用与所有地区，而且产物的后续处理比较麻烦。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种小核菌(Sclerotium rolfsii)WSH-G01，已于2017年11月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017646，保藏地址为中国武汉大学。
本发明的第二个目的是提供所述菌株在发酵领域制备食品中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种硬葡聚糖生产方法，所述方法是将所述小核菌接种于发酵培养基中，培养24～96h。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分为：葡萄糖45～75g/L，硝酸钠2.0～3.0g/L，酵母膏0.2～1.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸1.5g/L，KCl 0.5g/L，pH 4.5。
在本发明的一种实施方式中，控制发酵过程通气量为1～3vvm。
有益效果：本发明提供了一种葡聚糖生产效率高的菌株，该菌株可以在葡萄糖碳源浓度为75g/L的条件下发酵56h达到硬葡聚糖产量近20g/L的效果，明显优于目前国际上硬葡聚糖在150g/L蔗糖的培养条件下72h产量26g/L的效果，底物利用率提高58％，成本降低明显。优于现有的葡聚糖生产工艺，具有重要的工业化应用前景。
生物材料保藏
一种小核菌(Sclerotium rolfsii)WSH-G01，已于2017年11月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017646，保藏地址为中国武汉大学。
附图说明
图1为不同碳源浓度下的发酵效果；其中，A为葡萄糖浓度55g/L的发酵结果；B为葡萄糖浓度75g/L的发酵结果；C为葡萄糖浓度95g/L的发酵结果；▲生物量；■草酸；●硬葡聚糖；pH；◆残糖。
图2为不同通气量下的发酵效果；其中A为通风比1vvm；B为通风比2vvm；C为通风比3vvm；▲生物量；■草酸；●硬葡聚糖；pH；◆残糖。
具体实施方式
种子培养基(g/L)：葡萄糖30；KH2PO4 1.0；NaNO3 3.0；酵母浸粉1.0；KCl 0.5；MgSO4·7H2O 0.5；pH 4.0
PDA培养基(g/L)：马铃薯200(切块、经水煮烂后过滤)，葡萄糖20。
生物质的测定方法：向发酵液中加入3倍体积蒸馏水后，混匀。5mol/L NaOH调节pH7.0。将混合液置于80℃水浴中保温30min。冷却，10 000rpm/min离心15min，除去上清，水洗2～3次，置于105℃烘干至恒重。
草酸的测定方法：采用Agilent 1260高效液相色谱(HPLC)进行测定。HPLC检测条件：色谱柱：Aminex HPX-87H(Bio-Rad)；流动相：5mmol/L H2SO4；流速：0.4mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；检测器：紫外检测器。
硬葡聚糖的检测方法：向发酵液中加入3倍体积蒸馏水后，混匀。5mol/LNaOH调节pH7.0。将混合液置于80℃水浴中保温30min。冷却，10 000rpm/min离心15min，取澄清的多糖水溶液等除蛋白，加入等体积无水乙醇醇沉16h。挑取醇沉多糖，105℃烘干至恒重。
残糖测定方法：取发酵液1mL于1.5mL离心管中，10 000rpm/min离心3min，稀释50倍，用残糖仪进行测定葡萄糖剩余量。
实施例1菌株的分离与鉴定
将前期分离出的菌株接种于PDA培养基，提取菌株基因组DNA，扩增18S rDNA的基因序列(PCR扩增的通用引物为NS1F和NS8R)。将PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果良好。将PCR扩增产物寄送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果在NCBI网站上进行BLAST序列比对，确定为小核菌(Sclerotium rolfsii)。
本发明提供的小核菌与现有小核菌的重点实质性区别：本发明提供的小核菌相比于现有的小核菌更易利用葡萄糖生产硬葡聚糖，在含有同等浓度的蔗糖和葡萄糖的培养基中，在葡萄糖培养基中产量明显优于蔗糖培养基。在摇瓶培养条件下，初始葡萄糖浓度为55g/L，产量达到11.96g/L，明显优于同等条件下初始蔗糖浓度55g/L时产量为7.5g/L。在3L发酵罐初始葡萄糖浓度为75g/L时，产量达到20g/L，而在10L发酵罐初始蔗糖浓度为150g/L时，产量达到26g/L，利用葡萄糖生产硬葡聚糖，生产成本更低，产物利用率更高。
实施例2小核菌的培养及硬葡聚糖的发酵
发酵培养基(g/L)：KH2PO4 1.0；KCL 0.5；柠檬酸1.5；MgSO4·7H2O 0.5g/L；pH4.0；添加不同量的葡萄糖(45、50、55)、NaNO3(2、2.25、2.5)、酵母浸粉(0.2、0.37、0.5)。
摇瓶培养：取适量菌丝接种于装有50ml种子培养基的250ml摇瓶中，于28℃，220r/min条件下培养72h，以5％的接种量转移至加有25ml葡萄糖发酵培养基的250ml摇瓶中，于30℃、220r/min条件下培养96h。
分别调整发酵培养基的部分组分(如表1所示)，其余成分保持不变：
表1发酵培养基的成分调整及对应产量
| 编号 | 葡萄糖(g/L) | NaNO<sub>3</sub>(g/L) | 酵母浸粉(g/L) | 葡聚糖产量(g/L) |
| 1 | 45 | 2.0 | 0.5 | 9.18 |
| 2 | 50 | 2.0 | 0.5 | 9.45 |
| 3 | 55 | 2.0 | 0.5 | 11.72 |
| 4 | 55 | 2.25 | 0.5 | 11.96 |
| 5 | 55 | 2.5 | 0.5 | 10.98 |
| 6 | 55 | 2.0 | 0.2 | 11.71 |
| 7 | 55 | 2.0 | 0.37 | 11.82 |
结果显示，采用培养基配方(g/L)：葡萄糖55；NaNO3 2.25；酵母浸粉0.5；KH2PO41.0；KCL 0.5；柠檬酸1.5；MgSO4·7H2O 0.5时效果最好，葡聚糖产量达11.96g/L。目前国际上硬葡聚糖的生产大多采用蔗糖作为碳源，我们利用葡萄糖作为碳源，在相同碳源浓度的条件下硬葡聚糖产量明显提高(蔗糖55g/L时产量在7.5g/L)。
实施例3不同碳源浓度对硬葡聚糖生产的影响
具体实施方式同实施例2，区别在于，发酵培养基配方为：硝酸钠2.2g/L，酵母膏0.5g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸1.5g/L，KCl 0.5g/L，pH 4.5；分别采用不同葡萄糖添加量(55、75、95g/L)探究碳源对硬葡聚糖产量的影响。
3L发酵罐分批培养：将28℃、220r/min条件下培养72h的上述种子液，按5％的接种量转接至加有100ml种子液的500ml摇瓶中，于28℃、220r/min条件下培养48h，然后以5％的接种量接种于装有1.5L发酵培养基的3L发酵罐中培养96h，温度设置为30℃,搅拌转速350r/min。
发酵结果如图2所示，其中在碳源控制在75g/L时效果最为显著，在此条件下56hScleroglucan产量达到19.69g/L，比碳源55g/L和95g/L，分别提高了13％和7％。生产强度为0.35，比碳源55g/L和95g/L，分别提高了10％和22％。可见发酵罐上最适碳源为75g/L。
实施例4不同通气对硬葡聚糖产量影响
发酵过程中的溶氧情况是影响菌体生长与产物合成的重要因素，而改变溶氧状态的最直接方式就是改变通气量。文献报道低通气更适合Scleroglucan的生产。本发明在碳源优化的基础上进行了通气优化在3L罐上采用不通通气(1、2、3vvm)对小核菌合成硬葡聚糖的影响。其中通气在1vvm时效果最为显著。发酵56h产量为20.86g/L，比通气2vvm和3vvm分别提高了19％和31％。生产强度为0.37，比通气2vvm和3vvm分别提高了19％和32％。可见Scleroglucan发酵控制最适通气为1vvm。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (9)
1.一种小核菌(Sclerotium rolfsii)WSH-G01，已于2017年11月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017646，保藏地址为中国武汉大学。
2.权利要求1所述菌株在发酵制备葡聚糖中的应用。
3.一种生产葡聚糖的方法，其特征在于，将权利要求1所述小核菌接种于发酵培养基中，培养24～96h；所述发酵培养基的成分为：葡萄糖45～75g/L，硝酸钠2.0～3.0g/L，酵母膏0.2～1.0g/L，KH2PO4 0.5～1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5～1.0g/L，柠檬酸1.0～1.5g/L，KCl0.5～1.0g/L，pH4.0～4.5。
4.根据权利要求3所述的一种生产葡聚糖的方法，其特征在于，控制发酵过程通气量为1～3vvm。
5.根据权利要求3所述的一种生产葡聚糖的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分为：葡萄糖55～60g/L，硝酸钠2.0～3.0g/L，酵母膏0.5～1.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸1.5g/L，KCl 0.5g/L，pH4.0～4.5。
6.权利要求1所述菌株在制备食品增稠剂中的应用。
7.权利要求1所述菌株在制备食品凝胶剂中的应用。
8.权利要求1所述菌株在制备药片涂层中的应用。
9.权利要求1所述菌株在制备眼用滴液中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810238620.7A CN108441429B (zh) | 2018-03-22 | 2018-03-22 | 一种小核菌及其发酵生产硬葡聚糖的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810238620.7A CN108441429B (zh) | 2018-03-22 | 2018-03-22 | 一种小核菌及其发酵生产硬葡聚糖的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108441429A CN108441429A (zh) | 2018-08-24 |
| CN108441429B true CN108441429B (zh) | 2019-11-08 |
Family
ID=63196529
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810238620.7A Active CN108441429B (zh) | 2018-03-22 | 2018-03-22 | 一种小核菌及其发酵生产硬葡聚糖的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108441429B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112266907B (zh) * | 2020-10-28 | 2022-03-15 | 江南大学 | 齐整小核菌内源小核菌胶水解酶及应用 |
| CN112662649B (zh) * | 2021-01-29 | 2022-10-11 | 江南大学 | 小核菌胶水解酶突变体的制备及应用 |
| CN113201563B (zh) * | 2021-04-14 | 2022-11-29 | 天津科技大学 | 一种提高小核菌多糖产量的营养盐及其应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102154408B (zh) * | 2011-01-13 | 2013-06-05 | 天津市工业微生物研究所 | 小核菌硬葡聚糖在线发酵提取方法及系统 |
| CN102796205B (zh) * | 2012-08-24 | 2014-12-17 | 黄河三角洲京博化工研究院有限公司 | 一种高透明度小核菌葡聚糖的制备方法 |
| CN104371933B (zh) * | 2014-10-23 | 2017-05-03 | 山东省食品发酵工业研究设计院 | 一株齐整小核菌及其在发酵生产硬葡聚糖中的应用 |
| CN106337071A (zh) * | 2016-01-28 | 2017-01-18 | 通辽市黄河龙生物工程有限公司 | 小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺 |
| CN106832044B (zh) * | 2017-03-16 | 2019-05-24 | 山东省食品发酵工业研究设计院 | 一种小核菌多糖高效提取纯化方法及其应用 |
-
2018
- 2018-03-22 CN CN201810238620.7A patent/CN108441429B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108441429A (zh) | 2018-08-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107354188B (zh) | 大肠埃希氏菌JL-GlcN发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖的工艺 | |
| CN108441429B (zh) | 一种小核菌及其发酵生产硬葡聚糖的方法 | |
| CN108441528B (zh) | 一种高效产细菌纤维素的培养基 | |
| CN101870739B (zh) | 多粘类芽孢杆菌胞外多糖及其应用 | |
| Sun et al. | High-efficiency production of Tremella aurantialba polysaccharide through basidiospore fermentation | |
| CN105695543B (zh) | 一种生物表面活性素的生产方法 | |
| CN102229920B (zh) | 一种提高里氏木霉纤维素酶液体深层发酵水平的方法 | |
| CN103805650A (zh) | 一种无色素普鲁兰多糖的发酵生产方法 | |
| CN108546660B (zh) | 甲壳素脱乙酰基酶高产菌株及其应用 | |
| CN107674841B (zh) | 一种高产聚苹果酸的出芽短梗霉及其用途 | |
| CN103602591B (zh) | 一种裂殖壶菌及用于生产二十二碳六烯酸油脂的方法 | |
| CN110218676A (zh) | 一种丁酸梭菌及其应用 | |
| CN102850410A (zh) | 一种从啤酒废酵母中提取海藻多糖的方法 | |
| CN104845893B (zh) | 一株胶红酵母及其在发酵生产海红虾青素中的应用 | |
| CN105695340A (zh) | 一种米曲霉及其应用 | |
| CN105801675B (zh) | 一种高活性壳聚糖酶控制基因csn及利用该基因生产高活性壳聚糖酶的方法 | |
| CN103305496A (zh) | 一种微生物发酵提取硫酸软骨素酶的方法 | |
| CN107586810A (zh) | 一种透明质酸的生物发酵生产工艺 | |
| CN103865850B (zh) | 一株蝙蝠弧菌及制备琼胶酶的方法 | |
| CN105567779A (zh) | 一种高产低分子量热凝胶的发酵方法 | |
| CN103898012A (zh) | 一株海旋菌及制备琼胶酶的方法 | |
| CN114292763B (zh) | 一株高产γ-氨基丁酸和可溶性β-葡聚糖的酿酒酵母及其应用 | |
| CN103589758A (zh) | 一种以五倍子单宁为原料利用发酵分离耦合技术制备没食子酸的方法 | |
| TW201816117A (zh) | 一種用於生產葡萄糖胺的培養基及其應用 | |
| CN103923853B (zh) | 一株类芽孢杆菌及其用于κ-卡拉胶酶的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |