CN103305496A

CN103305496A - 一种微生物发酵提取硫酸软骨素酶的方法

Info

Publication number: CN103305496A
Application number: CN2013102622118A
Authority: CN
Inventors: 曹荣军; 刘万顺; 孙杰; 杨庆利; 任宪君; 张秋艳; 武鑫; 刘少芳; 金海明; 姚秀芬; 台文静; 鲁涛
Original assignee: BETTER (QINGDAO) BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BETTER (QINGDAO) BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-06-27
Filing date: 2013-06-27
Publication date: 2013-09-18

Abstract

本发明公开了一种微生物发酵提取硫酸软骨素酶的方法，其步骤包括：一、产硫酸软骨素酶的微生物初筛；二、产硫酸软骨素酶的微生物复筛；三、菌种鉴定；四、产硫酸软骨素酶的微生物发酵；五、发酵后硫酸软骨素酶提取。本发明操作方便、周期短，发酵产生的硫酸软骨素酶活力高达3981U/L，可用于大规模工业化生产，解决了目前由于硫酸软骨素酶产量低，价格昂贵，严重制约小分子硫酸软骨素行业发展的问题。

Description

一种微生物发酵提取硫酸软骨素酶的方法

技术领域

本发明涉及一种微生物发酵提取硫酸软骨素酶的方法，属于生物工程领域。

背景技术

硫酸软骨素是糖胺聚糖的一种，由D-葡糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖以β-1,4-糖苷键连接而成的重复二糖单位组成的多糖，并在N-乙酰氨基半乳糖的C-4位或C-6位羟基上发生硫酸酯化。根据硫酸基在半乳糖上位置不同主要分为硫酸软骨素A (CSA)硫酸软骨素C (CSC)。硫酸软骨素对角膜胶原纤维具有保护作用，能促进基质中纤维的增长，增强通透性，改善血液循环，加速新陈代谢，促进渗透液的吸收及炎症的消除；其聚阴离子具有强的保水性，能改善眼角膜组织的水分代谢，对角膜有较强的亲和力，促进角膜创伤的愈合及改善眼部干燥症状。近年来研究发现，硫酸软骨素（CS）的相对分子量较大，它的大体积往往妨碍其顺利的穿越细胞膜，因而不能在机体内良好发挥其多种药理功能，而低分子量的硫酸软骨素（LMWCHS）具有粘度小、溶解性好、易吸收及生物利用度高等特点。

近年来，小分子硫酸软骨素在防治冠心病、关节炎以及抗肿瘤等方面正日益受到广泛重视，小分子硫酸软骨素的制备主要通过硫酸软骨素酶酶解获得。硫酸软骨素酶是一类主要存在于微生物体内，能将多种酸性粘多糖如硫酸皮肤素、硫酸软骨素、透明质酸等降解为寡糖及不饱和二糖的裂解酶。

目前由于硫酸软骨素酶产量低，价格昂贵，严重制约了小分子硫酸软骨素行业的发展，急需一种高效、操作方便、生产周期短、适合大规模工艺化生产的方法。

发明内容

本发明为了克服现有技术中存在的上述缺点，提供一种操作方便、周期短，发酵产生的硫酸软骨素酶活力高达3981U/L，可用于大规模工业化生产的微生物发酵提取硫酸软骨素酶的方法。

为达到上述目的，本发明所采用的技术解决方案是：一种微生物发酵提取硫酸软骨素酶的方法，其步骤包括：

一、产硫酸软骨素酶的微生物初筛：用无菌水将土样悬浮制成10%的土壤溶液，两层滤纸抽滤后得澄清液体，将液体梯度稀释至10^-5，取稀释液0.2ml涂布分离培养基平板培养，将单菌落用平板划线分离方法在分离培养基平板上纯化1～2次，得到纯菌落，挑取纯化后的单菌落点种于初筛培养基平板，30℃温箱中培养4-7天后，向平板中倒入5ml 2mol/L的冰醋酸，浸泡5min，观察透明圈的有无，将产生透明圈的菌株利用划线法保存于试管固体斜面培养基上并于4℃保存待用；

二、产硫酸软骨素酶的微生物复筛：将产生透明圈的菌体接种于复筛培养基中，30℃，130r/min振荡通气培养48h，将菌液梯度稀释至10^-9，取0.2ml 10^-7、10^-8、10^-9的菌液，涂布于初筛培养基中，并使每个平板中培养基的厚度相同，30℃温箱中培养4-7天后，通过测量挑选透明圈相对于菌落较大的菌株，接种于复筛培养基中，30℃、130r/min振荡通气培养24h，经平板菌落计数得菌体密度为2×10⁷～3×10⁷个/ml作为种子菌液，用于菌种鉴定和发酵培养；

三、菌种鉴定：运用形态特征鉴定和16SrDNA扩增与比对方法对步骤二得到的微生物菌种进行鉴定；

四、产硫酸软骨素酶的微生物发酵：按1.5-2.5% v/v接种量将种子菌液接入5L发酵罐中通过发酵培养基发酵，25-30℃，发酵60-72h；

五、发酵后硫酸软骨素酶提取：将步骤四所得发酵液置于离心机中，4℃、4000r/min离心30min,弃去菌体沉淀，冰浴，在磁力搅拌器的搅拌下，缓缓向发酵上清液中加入硫酸铵至90%的饱和度，4℃层析柜中静置24h,然后4℃、4000r/min再次离心发酵液，收集蛋白沉淀，将蛋白沉淀利用三蒸水溶解并置于透析袋中，于4℃层析柜中利用三蒸水对蛋白沉淀透析脱盐，在(NH₄)₂SO₄溶液检测透析袋外液体不含SO₄ ^2-的情况下，将透析液冷冻干燥即得硫酸软骨素酶粉。

进一步的，所述步骤一中使用的培养基包括硫酸软骨素 0.5%、(NH₄)₂SO₄ 1%、KH₂PO₄ 0.03%、NaCl 0.5%、Albumin bovine V 1%、琼脂2%，pH=7.0。

进一步的，所述步骤二中使用的培养基包括硫酸软骨素0.5%、MgSO₄·7H₂0 0.5%、KH₂PO₄ 0.03%、NaCl 0.5%、冰醋酸0.5-1%、酵母浸粉1%，pH=7.0。

进一步的，所述步骤四中选用的发酵培养基包括硫酸软骨素0.8%、MgSO₄·7H₂0 0.8%、酵母浸粉0.6%、KH₂PO₄ 0.02%、起始pH=6.0。

进一步的，所述步骤三中形态特征鉴定是指将目标菌株在固体平板培养基上培养3～4d后，用肉眼观察菌落的形态特征；16SrDNA扩增与比对是指用煮沸法提取基因组DNA，扩增16S rRNA 基因序列及比对，电泳检测，基因测序，NCBI比对序列。

本发明的有益效果是：操作方便、周期短，发酵产生的硫酸软骨素酶活力高达3981U/L，可用于大规模工业化生产。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以助于理解本发明的内容。

实施例1

产硫酸软骨素酶的微生物初筛：

用无菌水将土样悬浮制成10%的土壤溶液，两层滤纸抽滤后得澄清液体，将液体梯度稀释至10^-5，取稀释液0.2ml涂布分离培养基平板培养，将单菌落用平板划线分离方法在分离培养基平板上纯化1～2次，得到纯菌落。挑取纯化后的单菌落点种于初筛培养基平板，30℃温箱中培养4-7天后，向平板中倒入5ml 2mol/L的冰醋酸，浸泡5min，观察透明圈的有无。将产生透明圈的菌株利用划线法保存于试管固体斜面培养基上并于4℃保存待用。

产硫酸软骨素酶的微生物复筛：

将产生透明圈的菌体接种于复筛培养基中，30℃，130r/min振荡通气培养48h,将菌液梯度稀释至10-9,取0.2ml 10^-7、10^-8、10^-9的菌液，涂布于初筛培养基中，并使每个平板中培养基的厚度相同，30℃温箱中培养4-7天后，。通过测量挑选透明圈相对于菌落较大的菌株，接种于复筛培养基中，30℃,130r/min振荡通气培养24h,经平板菌落计数得菌体密度为（2～3）×10⁷个/ml作为种子菌液，用于发酵培养。

产硫酸软骨素酶的微生物发酵：

按1.5%（v/v）接种量将种子菌液接入5L发酵罐中发酵，使用的培养基为硫酸软骨素0.8%、MgSO₄·7H₂0 0.8%、酵母浸粉0.6%、KH₂PO₄ 0.02%、起始pH 6.0， 25℃，发酵72h。

发酵后硫酸软骨素酶提取：

将所得发酵液于离心机中4℃、4000r/min离心30min,弃去菌体沉淀，冰浴，在磁力搅拌器的搅拌下，缓缓向发酵上清液中加入硫酸铵至90%的饱和度，4℃层析柜中静置24h,然后4℃、4000r/min再次离心发酵液，收集蛋白沉淀，将蛋白沉淀利用三蒸水溶解并置于透析袋中，于4℃层析柜中利用三蒸水对蛋白沉淀透析脱盐，在(NH4)₂SO₄溶液检测透析袋外液体不含SO₄ ^2-的情况下，将透析液冷冻干燥即得硫酸软骨素酶粉。

实施例2

硫酸软骨素酶活力测定：以37℃条件下，每分钟降解硫酸软骨素形成1μmol不饱和双糖的酶量为一酶活力单位。

将发酵液经6000r/min离心10min,吸取0.1 ml上清液加入到3.9mL 0.2%硫酸软骨素溶液（0.02 mol/L Tris-HCL配制，pH7.5）中，37℃水浴中反应20 min,立即将混合液置于沸水浴中煮沸10min,在相同的条件下加入煮沸10min的发酵上清液作为空白对照，在232nm处测定反应液的光吸收值。

主要计算公式：

Figure 2013102622118100002DEST_PATH_IMAGE002

式中：ε指不饱和二糖产物的毫摩尔消光系数(5.1)；A 指不饱和二糖产物在232nm 处的吸光度；t指反应的时间(min)；d指比色杯的厚度(1cm)；Vs指样本的体积（ml）；Vt指反应的总体积（ml）。

经测定本方法发酵获得的硫酸软骨素酶活力为3981U/L。

实施例3

产硫酸软骨素酶的微生物大规模发酵和硫酸软骨素酶提取

按1.5%（v/v）接种量将种子菌液接入50L发酵罐中发酵，使用的培养基为硫酸软骨素0.8%、MgSO₄·7H₂0 0.7%、酵母浸粉0.6%、KH₂PO₄ 0.02%、起始pH 6.0， 25℃，发酵60h。

将所得发酵液于离心机中4℃、4000r/min离心25min,弃去菌体沉淀，冰浴，缓缓向发酵上清液中加入硫酸铵至90%的饱和度，边加边搅拌，4℃静置24h,然后4℃、4000r/min再次离心发酵液，收集蛋白沉淀，将蛋白沉淀透析脱盐，在(NH4)₂SO₄溶液检测透析袋外液体不含SO₄ ^2-的情况下，将透析液喷雾干燥即得硫酸软骨素酶粉。

以本方法发酵并提取的硫酸软骨素酶活力可达3981U/L。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本专利揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种微生物发酵提取硫酸软骨素酶的方法，其特征在于，步骤包括：

2.根据权利要求1所述的微生物发酵提取硫酸软骨素酶的方法，其特征在于：所述步骤一中使用的培养基包括硫酸软骨素 0.5%、(NH₄)₂SO₄ 1%、KH₂PO₄ 0.03%、NaCl 0.5%、Albumin bovine V 1%、琼脂2%，pH=7.0。

3.根据权利要求1所述的微生物发酵提取硫酸软骨素酶的方法，其特征在于：所述步骤二中使用的培养基包括硫酸软骨素0.5%、MgSO₄·7H₂0 0.5%、KH₂PO₄ 0.03%、NaCl 0.5%、冰醋酸0.5-1%、酵母浸粉1%，pH=7.0。

4.根据权利要求1所述的微生物发酵提取硫酸软骨素酶的方法，其特征在于，所述步骤四中选用的发酵培养基包括硫酸软骨素0.8%、MgSO₄·7H₂0 0.8%、酵母浸粉0.6%、KH₂PO₄ 0.02%、起始pH=6.0。

5.根据权利要求1所述的微生物发酵提取硫酸软骨素酶的方法，其特征在于：所述步骤三中形态特征鉴定是指将目标菌株在固体平板培养基上培养3～4d后，用肉眼观察菌落的形态特征；16SrDNA扩增与比对是指用煮沸法提取基因组DNA，扩增16S rRNA 基因序列及比对，电泳检测，基因测序，NCBI比对序列。