CN103602711A - 一种治疗心肌炎的低分子硫酸软骨素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗心肌炎的低分子硫酸软骨素的制备方法，步骤包括：将原料经过食砜节杆菌发酵液发酵，原料中硫酸软骨素经过酶解得到低分子硫酸软骨素；所制备的低分子硫酸软骨素素中硫酸软骨素二糖含量在97%以上，其分子量在450-480之间，硫酸软骨素A含量在70-95%之间，硫酸软骨素C含量在5-25%之间。本发明制备方法操作方便、周期短，生产成本低，低分子硫酸软骨素治疗好，纯度高，可用于大规模工业化生产，经过大鼠试验，对心肌细胞损伤修复效果显著。
Description
技术领域
本发明涉及一种硫酸软骨素的制备方法，尤其涉及一种治疗心肌炎的低分子硫酸软骨素的制备方法。
背景技术
硫酸软骨素（Chondroitin Sulfate，CS）是存在于人和动物结缔组织中的酸性黏多糖，主要分布于软骨、骨、肌腱、肌膜和血管壁中，由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖以1,3苷键连接形成二糖，二糖之间以β-1,4苷键连接而成。CS的相对分子质量（Mr）一般在20×103以上，当Mr降低小于10×103时，常被称为低分子量硫酸软骨素(LMWCS)。
CS作为蛋白聚糖的组成部分，存在于细胞内颗粒、细胞膜、基底膜和细胞外基质中，通过糖链中特定的结构域与细胞因子、粘附因子或她们的受体特异性结合，发挥着重要的生理学功能，也与众多病理过程息息相关。CS作为临床药物使用也近半个世纪之久，在欧、美、日等发达国家，因其具有抗关节炎、降血脂、抗凝血、抗动脉粥样硬化、心脏病、抗病毒和抗肿瘤、减少铂类药物肾毒性等多种生物活性而得到广泛应用。但由于CS分子量较大，亲水集团多，脂溶性差，故体内吸收不完全，生物利用度低的不足也一直困扰着CS类药品的大规模应用。而LMWCS相对普通CS而言，因Mr降低而更有利于被机体吸收和利用，在药用、保健品和化妆品等方面有巨大的应用潜力。
LMWCS一般通过CS产品的降解来制备，主要有酸水解法和酶法。酸降解反应产物中杂质较多且不易除去，处理须耗费大量时间，反应过程中硫酸软骨素分子上的硫酸基团也会不同程度的脱落，且造成环境污染。相比较之下，酶解法反应条件温和，污染小且工艺简单易控，亦不会造成CS分子上硫酸基团的破坏，更适合于LMWCS的工业化生产。
但是酶解法对使用的酶有很高的要求，需要特异的软骨素酶，但目前国内尚未开发出有自主知识产权的软骨素酶产生菌，只能以高昂的价格从国外进口，从而大大增加了生产成本。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种治疗心肌炎的低分子硫酸软骨素的制备方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种治疗心肌炎的低分子硫酸软骨素的制备方法，步骤包括：将原料经过食砜节杆菌发酵液发酵，原料中硫酸软骨素经过酶解得到低分子硫酸软骨素；所制备的低分子硫酸软骨素素中硫酸软骨素二糖含量在97%以上，其分子量在450-480之间，硫酸软骨素A含量在70-95%之间，硫酸软骨素C含量在5-25%之间。
进一步的，所述原料指鸡软骨、猪软骨或牛软骨的一种或几种混合。
进一步的，所述硫酸软骨素二糖分子结构如下：
进一步的，所述硫酸软骨素二糖含量在98.5%以上，分子量在455-460之间。
进一步的，所述硫酸软骨素A含量在70-80%之间，硫酸软骨素C含量在10-15%之间。
进一步的，所述食砜节杆菌发酵液培养基组分为w/v：硫酸软骨素0.7-0.9%、KH2PO4 0.01-0.03%、酵母浸粉0.5-0.7%、MgSO4·7H20含量0.7-0.9%、pH值5-7；发酵条件为：按1.5%v/v接种量将种子菌液接入发酵罐中于20-35℃，100-300r/min振荡通气培养48-96h。
进一步的，所述发酵液酶解硫酸软骨素的条件为每升发酵液酶解硫酸软骨素0.1-0.6kg，酶解时间5-8h,酶解温度30-45℃，酶解pH为6-8。
进一步的，所述低分子硫酸软骨素促进H9c2心肌细胞的生长和增殖的作用浓度为200μgmL-1，对治疗心肌炎和心肌损伤修复具有重要的作用。
本发明的有益效果在于：操作方便、周期短，生产成本低，低分子硫酸软骨素治疗好，纯度高，可用于大规模工业化生产，经过大鼠试验，对心肌细胞损伤修复效果显著。
具体实施方式
一种治疗心肌炎的低分子硫酸软骨素的制备方法，将鸡软骨、猪软骨或牛软骨的一种或几种混合经过食砜节杆菌发酵液发酵，食砜节杆菌发酵液培养基组分为（w/v）：硫酸软骨素0.7-0.9%、KH2PO4 0.01-0.03%、酵母浸粉0.5-0.7%、MgSO4·7H20含量0.7-0.9%、pH值5-7；发酵条件为：按1.5%（v/v）接种量将种子菌液接入发酵罐中于20-35℃，100-300r/min振荡通气培养48-96h。原料中硫酸软骨素经过酶解得到低分子硫酸软骨素；所制备的低分子硫酸软骨素素中硫酸软骨素二糖含量在97%以上，其分子量在450-480之间，硫酸软骨素A含量在70-95%之间，硫酸软骨素C含量在5-25%之间。
所述发酵液酶解硫酸软骨素的条件为每升发酵液酶解硫酸软骨素0.1-0.6kg，酶解时间5-8h,酶解温度30-45℃，酶解pH为6-8。
所述硫酸软骨素二糖分子结构如下：
所述硫酸软骨素二糖含量在98.5%以上，分子量在455-460之间。
所述硫酸软骨素A含量在70-80%之间，硫酸软骨素C含量在10-15%之间。
所述低分子硫酸软骨素促进H9c2心肌细胞的生长和增殖的作用浓度为200μgmL-1，对治疗心肌炎和心肌损伤修复具有重要的作用。
实施例1
食砜节杆菌发酵条件为，发酵的最佳种子培养基组分为（w/v）：硫酸软骨素0.8%、KH2PO4 0.02%、酵母浸粉0.6%、MgSO4·7H20含量0.8%、pH=6。
最适发酵培养基条件为：将1.5升种子菌液接入100升发酵罐中于25℃，200r/min振荡通气培养72h。
发酵液酶解硫酸软骨素的最佳条件为将100升发酵液在酶解罐中酶解硫酸软骨素30公斤，酶解时间8h,酶解温度35℃，酶解pH=7。
酶解结束后喷雾干燥制备得到低分子量硫酸软骨素，硫酸软骨素二糖含量在99%，其分子量在458，硫酸软骨素A含量在85%，硫酸软骨素C含量在15%。
实施例2
食砜节杆菌发酵条件为，10升发酵的最佳种子培养基组分为（w/v）：硫酸软骨素80g、 KH2PO4 2g、酵母浸粉60g、MgSO4·7H20含量80g、pH=6。
最适发酵培养基条件为：将10升种子菌液接入1000升发酵罐中于30℃，250r/min振荡通气培养80h。
发酵液酶解硫酸软骨素的最佳条件为将1000升发酵液在酶解罐中酶解硫酸软骨素400公斤，酶解时间7h,酶解温度40℃，酶解pH=7。
酶解结束后喷雾干燥制备得到低分子量硫酸软骨素400公斤，硫酸软骨素二糖含量在98.5%，其分子量在461，硫酸软骨素A含量在83%，硫酸软骨素C含量在16%。
实施例3
采用显微观察法和MTT法，测定软骨素二糖对于正常H9c2心肌细胞的作用。结果表明软骨素二糖无细胞毒性，且一定程度地促进H9c2细胞的生长和增殖，其最佳作用浓度为200μgmL-1。
评价了不同分子量CS对受损心肌的保护作用。结果显示，低分子硫酸软骨素糖能够显著地促进受损心肌组织的生长和恢复。硫酸软骨素及其中分子硫酸软骨素对心脏的恢复有促进作用，但效果不如低分子硫酸软骨素明显。
灌胃7d后，CS组的心肌细胞损伤情况略有减轻，中分子硫酸软骨素和低分子硫酸软骨素的心肌细胞在心肌纤维排列情况、肌纤维萎缩程度、间隔宽度、心肌细胞胞浆及细胞核情况较ISO损伤对照组的心肌组织损伤情况均明显减轻。
灌胃14d后，损伤的心肌组织均见好转，嗜酸性粒细胞数量减少。较ISO损伤对照组，各组的恢复效果更明显，其中低分子硫酸软骨素效果更佳。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种治疗心肌炎的低分子硫酸软骨素的制备方法，其特征在于，步骤包括：将原料经过食砜节杆菌发酵液发酵，原料中硫酸软骨素经过酶解得到低分子硫酸软骨素；所制备的低分子硫酸软骨素素中硫酸软骨素二糖含量在97%以上，其分子量在450-480之间，硫酸软骨素A含量在70-95%之间，硫酸软骨素C含量在5-25%之间。
2.根据权利要求1所述的治疗心肌炎的低分子硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：所述原料指鸡软骨、猪软骨或牛软骨的一种或几种混合。
3.根据权利要求1所述的治疗心肌炎的低分子硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：所述硫酸软骨素二糖分子结构如下：
4.根据权利要求1或3所述的治疗心肌炎的低分子硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：所述硫酸软骨素二糖含量在98.5%以上，分子量在455-460之间。
5.根据权利要求1所述的治疗心肌炎的低分子硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：所述硫酸软骨素A含量在70-80%之间，硫酸软骨素C含量在10-15%之间。
6.根据权利要求1所述的治疗心肌炎的低分子硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：所述食砜节杆菌发酵液培养基组分为w/v：硫酸软骨素0.7-0.9%、KH2PO4 0.01-0.03%、酵母浸粉0.5-0.7%、MgSO4·7H20含量0.7-0.9%、pH值5-7；发酵条件为：按1.5% v/v接种量将种子菌液接入发酵罐中于20-35℃，100-300r/min振荡通气培养48-96h。
7.根据权利要求1所述的治疗心肌炎的低分子硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：所述发酵液酶解硫酸软骨素的条件为每升发酵液酶解硫酸软骨素0.1-0.6kg，酶解时间5-8h,酶解温度30-45℃，酶解pH为6-8。
8.根据权利要求1所述的治疗心肌炎的低分子硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：所述低分子硫酸软骨素促进H9c2心肌细胞的生长和增殖的作用浓度为200μg·mL-1，对治疗心肌炎和心肌损伤修复具有重要的作用。
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