CN104845958A - 一种软骨素酶的大规模生产方法 - Google Patents

一种软骨素酶的大规模生产方法 Download PDF

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曹荣军
黄婧
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Abstract

本发明公开了一种软骨素酶的大规模生产方法，主要是根据发酵过程中不同时期生长情况和产酶情况对于理化环境和营养条件的不同，对发酵系统进行细节的分段控制，大大提高了硫酸软骨素酶的生产效率。本发明得到的软骨素酶比传统粗放的方法酶活提高大于1000％，发酵周期大大缩短。本发明的生产方法很提高了纤维素酶的生产水平，大大降低了成本，非常适合大规模的生产。

Description

一种软骨素酶的大规模生产方法
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种软骨素酶的大规模生产方法。
背景技术
硫酸软骨素酶(chondroitinase,ChSase),是一类能将多种糖胺聚糖如硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸等降解为不饱和二糖及寡糖的裂解酶。该酶在研究机体内硫酸软骨素等糖胺多糖的功能和代谢方面、在治疗动脉粥样硬化、溶解椎间盘突出中破裂的纤维环或髓核、抗肿瘤、促进神经组织和神经轴的再生和增强软骨细胞与软骨的黏附力等方面有着广泛的应用前景。此外，低分子的硫酸软骨素具有粘度小、溶解性好、易吸收及生物利用度高等特点，又由于硫酸软骨素在治疗风湿病、关节炎、骨质疏松症、腰椎间盘突出、治疗高血脂症、防治动脉粥样硬化和心绞痛、保存角膜及治疗角膜损伤等方面有显著的作用，已在食品、化妆品及保健品等行业进行应用。而酶解法制备低分子硫酸软骨素相对于目前广泛采用的酸水解法、离子交换法等具有不不需要特设复杂的实验设备、不污染环境等显著特点已成为应用和研究的趋势。虽然目前对软骨素酶有了一定的研究，但在国外，也就只有少数来自Proteus vulgaris和Flavobacterium heparinum的ChSase ABC、ChSase AC出售,但由于菌的产酶效率不高和其他问题，目前没有并未实现大规模生产，而且价格十分昂贵。在国内，目前除了少数基础研究，生产应用更是比较空白。因此目前急需一种高效、操作方便、生产周期短、适合大规模生产的方法来解决目前的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种软骨素酶的大规模生产方法，通过菌种的活化、逐级放大和在发酵罐中发酵获得软骨素酶，从而解决目前软骨素酶批量生产的空白。
本发明的方法根据菌体的对数期和稳定期生长情况和产酶情况的不同，对发酵条件进行分段实时调整，从而提高了软骨素酶的生产效率。
本发明的软骨素酶的大规模生产方法，包括如下的步骤：
1)菌种活化：
将食砜节杆菌CGMCC 1.3977菌种接种到种子培养基中，在28℃、150rpm的条件下振荡培养70h制成种子液；
其中种子培养基的组成如下：硫酸软骨素0.8％、MgSO4·7H200.8％、酵母浸粉0.6％、KH2PO40.02％、起始pH调整为6；
2)种子罐发酵：
将步骤1)制备的种子培养液按照体积比1.5％～2.5％的比例接种到20L种子罐的发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度为25～30℃，优选为27～29℃，溶氧20％～60％，优选控制在40％～50％，搅拌转速为100rpm～150rpm，优选100rpm～125rpm；通气量开始为1～4L/min，优选2～3L/min，随着溶氧降低到临近20％～60％时，以1L/min的梯度适时调整；
发酵培养液的装液量为发酵罐容积的50％～70％，优选为60％～65％。
发酵培养液的组成为硫酸软骨素0.8％、MgSO4·7H200.8％、酵母浸粉0.6％、KH2PO40.02％、起始pH调整为6。
3)生产罐发酵：
在种子罐发酵的8～16h内，按照体积比1.5％～2.5％的比例接种到500L生产罐的发酵培养基中进行发酵培养，发酵罐的装液量为50％～70％，优选为60％～65％；
在发酵开始至发酵的4～14h内发酵温度为25～30℃，优选27～29℃，4～13h至发酵结束，发酵体系温度调低为25～27℃，优选为26～27℃；
在发酵开始后的前4～12h，溶氧控制在20％～60％，优选控制在40％～50％。其中相关参数搅拌转速为100rpm～150rpm，优选100rpm～125rpm，通气量开始为25～50L/min，优选30～40L/min随着溶氧降低到临近20％～60％时，以10L/min的梯度适时调整。
在发酵开始后的4～12h至发酵结束，溶氧控制在5％～30％，优选10％～20％，搅拌不变，通气适时调整。
在发酵开始后的4～14h至发酵结束要进行补料，补料起始时间在发酵温度降低调节后的1～4h，优选2～3h开始，补料时间不能提前，提前补料对产酶有很大影响。补料方法为：
以补料培养基中的软骨素浓度计算，将培养基配制浓度为25％的溶液，按补料液与发酵体系的体积比为1：100～1:300向所述的发酵体系中添加补料液。
补料的方式为定时补料，每隔2h添加补料培养基一次，直至发酵结束。
补料培养基的组成为：硫酸软骨素钠90％～100％，酵母浸粉0～10％。
发酵过程中每两小时取样检测一次酶活，直至两次相邻的酶活不再有增加时结束发酵过程。
本发明的有益效果：
通过对食砜节杆菌CGMCC 1.3977发酵过程的深入研究，本发明建立了大规模发酵的细致工艺，这大大提高了软骨素酶的生产效率，使得软骨素酶的酶活可达42000/L，比粗放的发酵提高酶活大于1000％，而且大大缩短了发酵时间，发酵时间由粗放方法的72h缩短为24h左右。这大大提高了发酵罐的利用效率，降低成本，而且该方法操作简单易行，非常适合大规模工业化生产。
具体实施方式
本发明的方法在软骨素酶的发酵过程中，前4～14h为发酵的对数期，在开始发酵后的4～14h直至发酵结束为稳定期。
下面结合实例对本发明做进一步的说明，以便本领域内的技术人员参照说明书能够具体实施。
本发明的菌种为食砜节杆菌CGMCC 1.3977,收藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
本发明的种子培养基和发酵培养基的组成：
硫酸软骨素0.8％、MgSO4·7H200.8％、酵母浸粉0.6％、KH2PO40.02％、起始pH调整为6。
本发明中所涉及的软骨素酶的测定为：
取0.1ml经6000r/min离心10min的发酵上清液和3.9mL含0.2％硫酸软骨素的0.02mol/L Tris-HCL溶液，加入5mL的比色管中，37℃水浴反应20min后，立即置于沸水浴中煮沸5min，对照管以相同的条件加入灭活的发酵上清液，在232nm处测定光吸收值。硫酸软骨素在酶催化下形成不饱和双糖结构，在232nm处有最大光吸收。
酶的活力单位为：37℃条件下，每分钟降解硫酸软骨素形成1μmol不饱和双糖的酶量。
酶活力计算单位公式为：
式中：
ε指不饱和二糖产物的毫摩尔消光系数(5.1)；
A指不饱和二糖产物在232nm处的吸光度；
t指反应的时间(min)；
d指比色杯的厚度(1cm)；
Vs指样本的体积(ml)；
Vt指反应的总体积(ml)。
实施例1
将菌种的甘油菌或者斜面菌接种到50ml(摇瓶装液量20％)的种子培养基中，在28℃、150rpm的条件下振荡培养70h。
将培养70h的后的种子液按照1.5％的比例接种至10L新鲜的发酵培养基中(20L种子罐装液量50％)进行发酵培养，在发酵开始的前8～14h为菌体发酵的快速生长期。此阶段调节发酵温度为27℃，在发酵开始后的8～12h，溶氧控制在40％左右，搅拌转速为125rpm，通气量为开始为3L/min，随着溶氧降低到临近40％时，以1L/min的梯度适时调整。
在发酵开始后12～14h，溶氧控制在13％左右，搅拌速率不变，通气适时调整。
将培养14h的后的种子菌液按照2％的比例接种至275L新鲜的发酵培养基中(500L发酵罐装液量55％)进行发酵培养，在发酵开始的前5～10h为菌体发酵的快速生长期，开始后10h至发酵结束为稳定期，根据菌体不同时期生长情况和产酶情况的不同，对发酵条件进行分段实时调整。
在发酵开始至发酵的10h内发酵温度为27.5℃，10h至发酵结束，发酵体系温度调低为26.5℃。
在发酵开始后的5～9h，溶氧控制在40％左右，搅拌转速为125rpm，通气量为开始为35L/min，随着溶氧降低到临近40％时，以10L/min的梯度适时调整。
在发酵开始后的9h至发酵结束，溶氧控制在14％左右，搅拌速率不变，通气适时调整。
在发酵开始后的12h开始补料，每隔2h补料一次直至发酵结束。补料液为25％补料培养基溶液，每次补料的体积为2L。
发酵开始12h后的时间内，每两小时取样检测一次酶活，直至两次相邻的酶活不再有增加时结束发酵过程，发酵过程为26h。
最终测定的发酵酶活为42170U/L。
其中，补料培养基为：97％硫酸软骨素钠，3％酵母浸粉。
实施例2
目前一般的发酵方法：
将菌种的甘油菌或者斜面菌接种到50ml(摇瓶装液量20％)的种子培养基中，在28℃、150rpm的条件下振荡培养70h。
将培养70h的后的种子液按照1.5％的比例接种至14L新鲜的发酵培养基中(20L种子罐装液量70％)进行发酵培养，培养条件为26℃，150rpm，其他参数无细节控制。
发酵开始12h后的时间内，每两小时取样检测一次酶活，直至两次相邻的酶活不再有增加时结束发酵过程，发酵过程为72h。
最终测定的发酵酶活为3920U/L。
实施例3
将菌种的甘油菌或者斜面菌接种到50ml(摇瓶装液量20％)的种子培养基中，在28℃、150rpm的条件下振荡培养70h。
将培养70h的后的种子液按照1.5％的比例接种至10L新鲜的发酵培养基中(20L种子罐装液量50％)进行发酵培养，在发酵开始的前8～14h为菌体发酵的快速生长期。此阶段调节发酵温度为27℃，在发酵开始后的8～12h，溶氧控制在40％左右，搅拌转速为125rpm，通气量为开始为3L/min，随着溶氧降低到临近40％时，以1L/min的梯度适时调整。
在发酵开始后12～14h，溶氧控制在13％左右，搅拌速率不变，通气适时调整。
将培养20h的后的种子菌液按照2％的比例接种至275L新鲜的发酵培养基中(500L发酵罐装液量55％)进行发酵培养，在发酵开始的前5～9h为菌体发酵的快速生长期，开始后9h至发酵结束为稳定期，根据菌体不同时期生长情况和产酶情况的不同，对发酵条件进行分段实时调整。
在发酵开始至发酵的9h内发酵温度为27.5℃，9h至发酵结束，发酵体系温度调低为26.5℃。
在发酵开始后的5～8h，溶氧控制在40％左右，搅拌转速为125rpm，通气量为开始为35L/min，随着溶氧降低到临近40％时，以10L/min的梯度适时调整。
在发酵开始后的9h至发酵结束，溶氧控制在15％左右，搅拌速率不变，通气适时调整。
在发酵开始后的11h开始补料，每隔2h补料一次直至发酵结束。补料液为25％补料培养基溶液，每次补料的体积为2L。
发酵开始9h后的时间内，每两小时取样检测一次酶活，直至两次相邻的酶活不再有增加时结束发酵过程，发酵过程为13h。
最终测定的发酵酶活为2740U/L。
其中，补料培养基为：97％硫酸软骨素钠，3％酵母浸粉。
实施例4
将菌种的甘油菌或者斜面菌接种到50ml(摇瓶装液量20％)的种子培养基中，在28℃、150rpm的条件下振荡培养70h。
将培养70h的后的种子液按照1.5％的比例接种至10L新鲜的发酵培养基中(20L种子罐装液量50％)进行发酵培养，在发酵开始的前8～14h为菌体发酵的快速生长期。此阶段调节发酵温度为27℃，在发酵开始后的8～12h，溶氧控制在40％左右，搅拌转速为125rpm，通气量为开始为3L/min，随着溶氧降低到临近40％时，以1L/min的梯度适时调整。
在发酵开始后12～14h，溶氧控制在13％左右，搅拌速率不变，通气适时调整。
将培养14h的后的种子菌液按照2％的比例接种至275L新鲜的发酵培养基中(500L发酵罐装液量55％)进行发酵培养，在发酵开始的前5～10h为菌体发酵的快速生长期，开始后10h至发酵结束为稳定期，根据菌体不同时期生长情况和产酶情况的不同，对发酵条件进行分段实时调整。
在发酵开始至发酵的10h内发酵温度为27.5℃，10h至发酵结束，发酵体系温度调低为26.5℃。
在发酵开始后的5～9h内溶氧和通气量不进行细节控制。
在发酵开始后的9h至发酵结束，溶氧控制在14％左右。
在发酵开始后的12h开始补料，每隔2h补料一次直至发酵结束。补料液为25％补料培养基溶液，每次补料的体积为2L。
发酵开始12h后的时间内，每两小时取样检测一次酶活，直至两次相邻的酶活不再有增加时结束发酵过程，发酵过程为20h。
最终测定的发酵酶活为6850U/L。
其中，补料培养基为：97％硫酸软骨素钠，3％酵母浸粉。
实施例5
将菌种的甘油菌或者斜面菌接种到50ml(摇瓶装液量20％)的种子培养基中，在28℃、150rpm的条件下振荡培养70h。
将培养70h的后的种子液按照1.5％的比例接种至10L新鲜的发酵培养基中(20L种子罐装液量50％)进行发酵培养，在发酵开始的前8～14h为菌体发酵的快速生长期。此阶段调节发酵温度为27℃，在发酵开始后的8～12h，溶氧控制在40％左右，搅拌转速为125rpm，通气量为开始为3L/min，随着溶氧降低到临近40％时，以1L/min的梯度适时调整。
在发酵开始后12～14h，溶氧控制在13％左右，搅拌速率不变，通气适时调整。
将培养14h的后的种子菌液按照2％的比例接种至275L新鲜的发酵培养基中(500L发酵罐装液量55％)进行发酵培养，在发酵开始的前5～10h为菌体发酵的快速生长期，开始后10h至发酵结束为稳定期，根据菌体不同时期生长情况和产酶情况的不同，对发酵条件进行分段实时调整。
在发酵开始至发酵的10h内发酵温度为27.5℃，10h至发酵结束，发酵体系温度调低为26.5℃。
整个发酵过程溶氧控制在40％左右，搅拌转速为125rpm，通气量为开始为35L/min，随着溶氧降低到临近40％时，以10L/min的梯度适时调整。
在发酵开始后的12h开始补料，每隔2h补料一次直至发酵结束。补料液为25％补料培养基溶液，每次补料的体积为2L。
发酵开始12h后的时间内，每两小时取样检测一次酶活，直至两次相邻的酶活不再有增加时结束发酵过程，发酵过程为20h。
最终测定的发酵酶活为22620U/L。
其中，补料培养基为：97％硫酸软骨素钠，3％酵母浸粉。
实施例6
将菌种的甘油菌或者斜面菌接种到50ml(摇瓶装液量20％)的种子培养基中，在28℃、150rpm的条件下振荡培养70h。
将培养70h的后的种子液按照1.5％的比例接种至10L新鲜的发酵培养基中(20L种子罐装液量50％)进行发酵培养，在发酵开始的前8～14h为菌体发酵的快速生长期。此阶段调节发酵温度为27℃，在发酵开始后的8～12h，溶氧控制在40％左右，搅拌转速为125rpm，通气量为开始为3L/min，随着溶氧降低到临近40％时，以1L/min的梯度适时调整。
在发酵开始后12～14h，溶氧控制在13％左右，搅拌速率不变，通气适时调整。
将培养14h的后的种子菌液按照2％的比例接种至275L新鲜的发酵培养基中(500L发酵罐装液量55％)进行发酵培养，在发酵开始的前6～12h为菌体发酵的快速生长期，开始后12h至发酵结束为稳定期，根据菌体不同时期生长情况和产酶情况的不同，对发酵条件进行分段实时调整。
在发酵开始至发酵的12h内发酵温度为27.5℃，12h至发酵结束，发酵体系温度调低为26.5℃。
在发酵开始后的5～10h，溶氧控制在40％左右，搅拌转速为125rpm，通气量为开始为35L/min，随着溶氧降低到临近40％时，以10L/min的梯度适时调整。
在发酵开始后的10h至发酵结束，溶氧控制在14％左右，搅拌速率不变，通气适时调整。
在发酵开始后即开始补料，每隔2h补料一次直至发酵结束。补料液为25％补料培养基溶液，每次补料的体积为2L。
发酵开始12h后的时间内，每两小时取样检测一次酶活，直至两次相邻的酶活不再有增加时结束发酵过程，发酵过程为20h。
最终测定的发酵酶活为6770U/L。
其中，补料培养基为：97％硫酸软骨素钠，3％酵母浸粉。
尽管本发明的实施方案已经公开如上，但其包含并不限于说明书和实施方式中的方案，它完全适用于各种适合本发明的领域，对于本领域中的技术人员很显然可以做很多改变和变化而不背离本发明的基本精神。所以这些变化和改进都在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种软骨素酶的大规模生产方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)菌种活化：
将食砜节杆菌接种到种子培养基中进行扩大培养获得种子液；
2)种子罐发酵
将步骤1)制备的种子培养液按照体积比1.5％～2.5％的比例接种到20L种子罐的发酵培养基中进行发酵培养，获得种子培养液；发酵条件为：发酵温度为25～30℃，溶氧控制在20％～60％，搅拌转速为100rpm～150rpm，通气量开始为1～4L/min，随着溶氧降低到临近20％～60％时，以1L/min的梯度适时调整；
3)发酵罐发酵
将步骤2)的种子培养液按照体积比1.5％～2.5％的比例接种到500L生产罐的发酵培养基中进行发酵培养，发酵罐的装液量为50％～70％，发酵体系的溶氧：在发酵开始后的4～12h至发酵结束，溶氧控制在5％～30％。
2.如权利要求1所述软骨素酶大规模的生产方法，其特征在于，步骤2)种子罐发酵的发酵条件为：发酵温度为27～29℃，溶氧40％～50％，搅拌转速为100rpm～125rpm；通气量开始为2～3L/min，随着溶氧降低到临近40％～50％时，以1L/min的梯度适时调整。
3.如权利要求1所述软骨素酶大规模的生产方法，其特征在于，步骤3)所述的生产罐种子培养液的转接时间为种子罐发酵的8～16h内，在菌体生长的对数期末期。
4.如权利要求1所述软骨素酶大规模的生产方法，其特征在于，步骤3)所述的生产罐发酵温度：在发酵开始至发酵的4～14h内为25～30℃，4～13h至发酵结束，温度调低为25～27℃。
5.如权利要求4所述软骨素酶大规模的生产方法，其特征在于，步骤3)所述的生产罐发酵温度：在发酵开始至发酵的4～14h内为27～29℃，4～13h至发酵结束，温度调低为26～27℃。
6.如权利要求1所述软骨素酶大规模的生产方法，其特征在于，步骤3)所述的发酵体系的溶氧：在发酵开始后的前4～12h，溶氧控制在20％～60％；其中相关参数搅拌转速为100rpm～150rpm，通气量开始为25～50L/min，随着溶氧降低到临近20％～60％时，以10L/min的梯度适时调整。
7.如权利要求6所述软骨素酶大规模的生产方法，其特征在于，步骤3)所述的发酵体系的溶氧：在发酵开始后的前4～12h，溶氧控制在40％～50％；其中相关参数搅拌转速为100rpm～125rpm，通气量开始为30～40L/min随着溶氧降低到临近40％～50％时，以10L/min的梯度适时调整。
8.如权利要求1所述软骨素酶大规模的生产方法，其特征在于，步骤3)所述的11.如权利要求9所述软骨素酶大规模的生产方法，其特征在于，步骤(3)所述的发酵体系的溶氧：在发酵开始后的4～12h至发酵结束，溶氧控制在10％～20％。
9.如权利要求1所述软骨素酶大规模的生产方法，其特征在于，步骤3)所述的发酵体系的补料：在发酵开始后的4～14h至发酵结束要进行补料，补料方法为：
以补料培养基中的软骨素浓度计算，将培养基配制浓度为25％的溶液，按补料液与发酵体系的体积比为1：100～1:300向所述的发酵体系中添加补料液；
补料的方式为定时补料，每隔2h添加补料培养基一次，直至发酵结束；
补料培养基的组成为：硫酸软骨素钠90％～100％，酵母浸粉0～10％。
10.权利要求9所述软骨素酶大规模的生产方法，其特征在于，步骤3)所述的发酵体系的补料：补料时间须在发酵温度降低调节后的1～4h，优选2～3h。
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