CN105802875B - 一种细菌及其产生的硫酸软骨素酶abc - Google Patents

一种细菌及其产生的硫酸软骨素酶abc Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，提供了一种细菌及其产生的硫酸软骨素酶ABC。本发明涉及一种来源于潮间带污泥的不动杆菌（Acinetobactersp.C26），该菌株具有营养条件简单、易培养、代时短的特点；使用本发明的菌株生产硫酸软骨素酶活力高、稳定性好、成本低的特点，能够实现大规模培养，满足工业化的应用。

Description

一种细菌及其产生的硫酸软骨素酶ABC
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种不动杆菌及其产生的硫酸软骨素酶ABC。
背景技术
硫酸软骨素（Chondroitin sulfate）是一种酸性粘多糖，以葡萄糖醛酸和氨基己糖形成的双糖单位，交替连接而成的一类大分子多糖，广泛分布于动物和人的软骨中，如动物喉骨、鼻骨、软骨，肌膜和血管壁等。硫酸软骨素有多种异构体，根据硫酸基在氨基已糖所处的不同位置，又可将其分为硫酸软骨素A（二糖单位：→4GlcAβ1,3GalNAc4Sβ1→）、硫酸软骨素B（二糖单位：→4IdoAα1,3GalNAc4Sβ1→）、硫酸软骨素C（二糖单位：→4GlcAβ1,3GalNAc6Sβ1→）、硫酸软骨素D（二糖单位：→4GlcA2Sβ1,3GalNAc6Sβ1→）等。最新研究报道显示，硫酸软骨素的分子量与其生物活性、药理作用有一定的相关性，特别是低分子量的硫酸软骨素，对防止动脉粥样硬化、风湿性炎症和伤口愈合有更显著的疗效。
硫酸软骨素酶（ChSase）是一类能将硫酸软骨素、软骨素等糖胺聚糖降解为不饱和二糖（△Di）及寡糖的裂解酶，主要来源于微生物。根据硫酸软骨素酶作用的底物不同可分为硫酸软骨素酶AC、硫酸软骨素酶B、硫酸软骨素酶C、硫酸软骨素酶ABC。目前最主要用于药用价值研究中的是硫酸软骨素酶ABC，可降解硫酸软骨素A、硫酸软骨素B（硫酸皮肤素）和硫酸软骨素C。ABC酶降解硫酸软骨素A、B或C的产物可通过紫外可见分光光度计于波长232 nm处检测，此酶通过β消除机理作用于二糖重复单元之间的β-1, 4糖苷上并将其切断。基于降解原理硫酸软骨素酶具有药理活性，包括溶解椎间盘内髓或破裂的纤维环、降解囊性纤维变性部位的粘液物、阻止玻璃体与视网膜的粘连、促进神经轴的再生、抗肿瘤以及增强软骨细胞与软骨的粘附力等，可用于新药的研发。近年来，硫酸软骨素酶在研究机体蛋白聚糖结构与功能、开发新型药用酶、制备低聚硫酸软骨素及寡糖等方面有重要用途，日益受到研究人员的关注。
本发明人通过查阅相关的资料，发现目前报道有来源于肝素黄杆菌（Flavobacterium heparinum）的三种硫酸软骨素酶，分子量74kDa、41.8kDa和55.2kDa（Kenan GU等）；来源于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的硫酸软骨素酶，分子量71.2kDa（陶科等）；来源于肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)的硫酸软骨素酶，分子量75kDa（James Fethiere等）；来源于温和气单胞菌（Aeromonas sobria）的硫酸软骨素酶，分子量80kDa（阎浩林等）；来源于少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas paucimobilis）的硫酸软骨素酶，分子量82.3kDa（刘万顺等）；来源于普通变形杆菌（Proteus vulgaris）的两种硫酸软骨素酶，分子量100kDa和105kDa（Akio Hamai等）；来源于多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）的两种硫酸软骨素酶，分子量104kDa和108kDa（专利号：CN 102277345A）。
通过大量信息检索，同时在产酶微生物与酶的分子量两方面比对，未发现有与本发明人研究的硫酸软骨素酶ABC相同的。
发明内容
本发明的目的是提供了一种不动杆菌及其产生的硫酸软骨素酶ABC，本发明分离纯化出一株来源于海洋的不动杆菌Acinetobacter sp.C26，其特征是产生硫酸软骨素酶ABC，并对其进行生物材料保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC；地址：湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学；保藏号为：CCTCC M 2015654。保藏日期为：2015年10月30日，利用该菌株通过液体发酵可以获得活力高、稳定性好、成本低的硫酸软骨素酶ABC。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种不动杆菌，其分类命名为不动杆菌Acinetobacter sp.C26，保藏编号：CCTCC M 2015654。
该菌株对数期细胞直径约为1.0-1.5μm×1.5-2.5μm，24h后菌落直径为2-3mm，菌落呈圆形，边缘光滑。
本发明还提供了所述的不动杆菌液体发酵生产的硫酸软骨素酶ABC，它通过以下制备方法制得：
（1）将所述不动杆菌Acinetobacter sp.C26斜面菌种接种到已灭菌的种子培养基中，在培养温度18℃-37℃、转速120-180rpm的条件下培养16-48h，获得种子培养液；
（2）将步骤（1）所述的种子培养液接种到已灭菌的发酵培养基中，在培养温度18℃-30℃、转速120-180rpm的条件下培养16-48h，获得硫酸软骨素酶ABC发酵液；
（3）离心或过滤分离步骤（2）所述硫酸软骨素酶ABC发酵液，取上清液；
（4）用硫酸铵沉淀步骤（3）所述上清液，离心或过滤收集粗蛋白；
（5）缓冲液复溶步骤（4）收集的粗蛋白，超滤或透析除去小分子杂质，得到纯化的硫酸软骨素酶ABC。
（6）将步骤（5）中得到的酶液进行阴离子交换柱层析，用pH7.5的含NaCl的Tris-HCl缓冲液洗脱所述交换柱，分离具有硫酸软骨素酶ABC活性的蛋白质组分。
（7）将步骤（6）中得到的具有硫酸软骨素酶ABC活性的蛋白质组分进行5倍浓缩及凝胶过滤柱层析，用pH6-8的缓冲液洗脱所述凝胶柱，分离具有硫酸软骨素酶ABC活性的蛋白质组分。
制得的所述硫酸软骨素酶ABC的分子量为76.1 kDa。
本发明的优点和技术效果是：本发明涉及一株来源于海洋的不动杆菌Acinetobacter sp.C26。经过基因测序，发现其遗传标志是包含序列表所示的16SrDNA核酸序列，通过在GenBank数据库同源比对和生理生化鉴定，确定其为不动杆菌属，命名为Acinetobacter sp.C26。该菌株在发酵产酶培养基中培养24h，发酵液中硫酸软骨素酶活力达到最高，用本发明的菌株生产制备硫酸软骨素酶ABC，具有产品活性高、稳定性好、生产周期短、成本低的特点，能够实现工业化生产。
本发明涉及一种来源于Acinetobacter sp.C26的硫酸软骨素酶ABC，该酶的特征在于是一种可以分别作用于硫酸软骨素A、硫酸软骨素B和硫酸软骨素C使其降低粘度和生成不饱二糖和低聚糖，菌株Acinetobacter sp.C26通过液体培养获得含酶发酵液，发酵液中硫酸软骨素酶ABC活力高达1.3×104U/L；发酵液通过液体发酵、冷冻离心、硫酸铵沉淀法收集、超滤或透析，获得纯化的硫酸软骨素酶ABC，将纯化的硫酸软骨素酶ABC通过Q-Sepharose®Fast Flow阴离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析技术处理，获得一种电泳纯的硫酸软骨素酶ABC。通过标准蛋白检测出该酶的分子量为76.1kDa（如图1所示），其分子量不同于已有报道该属所产的硫酸软骨素酶ABC。
附图说明
图1：纯化后的硫酸软骨素酶ABC经SDS-PAGE电泳后结果。左边为标准蛋白分子量，右边为不动杆菌Acinetobacter sp.C26制备并经纯化的硫酸软骨素酶ABC单带，数量表示单位：kDa。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明做进一步说明
1. 一株Acinetobacter sp.C26菌株的筛选与纯化
本发明不动杆菌Acinetobacter sp.C26菌株的获得：采集胶东海岸潮间带淤泥，加入到装有25mL的富集培养基中（硫酸软骨素 0.5g，酵母膏5g，K2HPO4 1g，MgSO4 0.5g，NaCl15g，H2O 1000mL，pH7.2）的三角瓶中，28℃，160rpm摇瓶培养2d，然后将富集培养液用无菌生理盐水稀释100倍，取 0.1mL涂布初筛分离培养基 (硫酸软骨素 0.5g，K2HPO4 1g，MgSO4 0.5g，酵母膏5g，NaCl 15g，CaCl2 0.01g，琼脂粉18.0g，H2O 1000mL，自然pH ) 平板。28℃倒置培养2d，获得选取平板上有边缘光滑的浅黄色菌落，挑取单个菌落在上述分离培养基中培养，得到一株能产硫酸软骨素酶ABC的细菌即为Acinetobacter sp.C26菌株。
2. 所述Acinetobacter sp.C26菌株的鉴定
采用chelex-100提取菌株DNA。正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCMTGCTCAG-3′，反向引物1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。反应体系50μL；反应条件：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。PCR产物的纯化、克隆、测序，将16SrDNA基因序列测序结果 (序列表)在GenBank数据库进行同源比对确定其为不动杆菌属。
再经过伯杰手册不动杆菌属的形态和生理生化鉴定，其特征是：革兰氏阴性，不形成芽孢，无鞭毛，氧化酶阴性，接触酶阳性，专性好氧，可以水解淀粉，不对D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、D-甘露糖、乳糖产酸，在标准营养肉汤中生长良好，无特殊的生长需要。该菌株分离自近海污泥，菌株对数期细胞直径约为1.0-1.5μm×1.5-2.5μm，24h后菌落直径为2-3mm，边缘光滑，确定其为不动杆菌，命名Acinetobacter sp.C26。
对该菌株进行菌株保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC；地址：湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学；保藏号为：CCTCC M 2015654。
3. 利用所述Acinetobacter sp.C26生产硫酸软骨素酶ABC
将Acinetobacter sp.C26菌株接种到已灭菌的种子培养基（硫酸软骨素 0.6g，牛肉膏15g，蛋白胨10g，MgSO4 0.5g，NaCl 5g，FCl3 0.1g ，CaCl2 0.01g，H2O 1000mL，自然pH）中，培养温度24℃，培养转速160rpm，培养时间36h，获得种子培养液，将种子培养液接种到灭菌的发酵培养基（硫酸软骨素3g，牛肉膏5g，蛋白胨10g， MgSO4 0.5g，NaCl 15g，CaCl2 0.01g，H2O 1000mL，自然pH）获得含硫酸软骨素酶ABC的发酵液，发酵液酶活为1.3×104U/L。
本发明所有涉及到硫酸软骨素酶ABC活力定义与测定皆参考下面的描述
（1）硫酸软骨素酶ABC活测定方法：分别配制7.98ml 20mM pH7.5含有0.2%的硫酸软骨素A、硫酸软骨素B、硫酸软骨素C的Tris-HCl缓冲溶液作为三种酶解底物，添加20μL酶液，37℃反应20min，在232nm波长下检测反应结束后体系中的吸光值，根据摩尔消光系数（5.1）计算反应结束后体系中的不饱和双键摩尔数。
（2）硫酸软骨素酶ABC活力定义：在37℃下，每min降解硫酸软骨素产生1μM不饱和双键所需要的酶量定义为一个酶活力单位（U）。
4. 来源于所述Arthrobacter globiformis A152菌株的透明质酸酶分离纯化
通过冷冻离心去除发酵液中的菌体，离心条件：温度4℃、转速6000rpm、离心时间10min，经过离心得到含硫酸软骨素酶ABC的发酵上清液，发酵上清液经过70%硫酸铵沉淀后收集蛋白沉淀，用20mM pH7.5的Tris-HCl复溶后通过截留分子量为3kDa的聚醚砜超滤膜除去小分子杂质，浓缩5倍获得纯化的硫酸软骨素酶ABC。
将纯化的硫酸软骨素酶ABC加样于Q-Sepharose® Fast Flow柱，洗脱液为含有NaCl(0-1M) 20mM pH 7.5 Tris-HCl缓冲液，进行梯度洗脱，收集有酶活性的组分（比活为243.94 U/mg）。将Q-Sepharose ® Fast Flow部分纯化后的活性蛋白加样于SephadexG100凝胶柱，洗脱液为20mM pH6.0 Tris-HCl缓冲液，获得一种电泳纯的硫酸软骨素酶ABC（比活为348.64U/mg）。
5. 来源于所述Acinetobacter sp.C26菌株的硫酸软骨素酶ABC分子量测定
具体方法：将经过SephadexG100凝胶层析得到的酶蛋白组分浓缩5倍，取20μL，加入8μL Sample Buffer在沸水浴中加热5min使其变性，取出冷却后，与预染maker一起上样进行电泳实验，电泳后用考马斯亮 R250染色45min，脱色后测定标准蛋白质和样品的迁移距离，计算相对迁移率，以相对迁移率和各标准蛋白质分子量的对数以最小二乘法做标准曲线，计算该酶的分子量，该酶在 SDS-PAGE 上显示的分子量分别为：76.1kDa( 如图1)。
6. 来源于所述Acinetobacter sp.C26菌株的硫酸软骨素酶ABC的底物活性验证
用20MmpH7.5的Tris-HCl缓冲液，分别配置成0.2%浓度的硫酸软骨素A、B、C溶液，取7.98mL底物溶液恒温至37°C，加0.02mL酶液，37℃反应20min，沸水浴4min灭活，在232nm波长下测出反应结束后体系中的吸光值，根据摩尔消光系数（5.1）计算反应结束后体系中不饱和双键的摩尔数，经计算，该酶的硫酸软骨素A底物活力为11820U/L，硫酸软骨素B底物活力为12480U/L，硫酸软骨素C底物活力为11080U/L。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国海洋大学
<120> 一种细菌及其产生的硫酸软骨素酶ABC
<130> 2015
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1156
<212> DNA
<213> Acinetobacter sp.
<400> 1
tggaattgtc tacgtgcgct cgcggatgcg cctgatcata tacctgtaga ccatgatcag 60
aactcttcgt cccatggtgt gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc 120
ggcattctga tccgcgatta ctagcgattc cgacttcatg gagtcgagtt gcagactcca 180
atccggacta cgatcggctt tttgagatta gcatcctatc gctaggtagc aaccctttgt 240
accgaccatt gtagcacgtg tgtagccctg gtcgtaaggg ccatgatgac ttgacgtcgt 300
ccccgccttc ctccagtttg tcactggcag tatccttaaa gttcccggca tgacccgatg 360
gcaagtaagg aaaagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag 420
ctgacgacag ccatgcagca cctgtatcag agttcccgaa ggcaccaatc catctctgga 480
aagttctctg tatgtcaaga ccaggtaagg ttcttcgcgt tgcatcgaat taaaccacat 540
gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat tcatttgagt tttagtcttg cgaccgtact 600
ccccaggcgg tctacttatc gcgttagctg cgccactaaa gcctcaaagg ccccaacggc 660
tagtagacat cgtttacggc atggactacc agggtatcta atcctgtttg ctccccatgc 720
tttcgtacct cagcgtcagt attaggccag atggctgcct tcgccatcgg tattcctcca 780
gatctctacg catttcaccg ctacacctgg aattctacca tcctctccca tactctagcc 840
tcccagtatc gaatgcaatt cctaagttaa gctcagggat ttcacatccg acttaaaaag 900
ccgcctacgc acgctttacg cccagtaaat ccgattaacg ctcgcaccct ctgtattacc 960
gcggctgctg gcacagagtt agccggtgct tattctgcga gtaacgtcca ctatcccggt 1020
agtattaata ccagtagcct ctctcgctta aagtgcttta caccaaagct ctcacacacg 1080
cgcatgctgg atcagttccc ccatgtcata tcccactgct gcctcccgta gagtctggac 1140
cgtgtctcag tcccat 1156
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agagtttgat cmtgctcag 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acggctacct tgttacgact t 21

Claims (4)

1.一种不动杆菌（Acinetobacter sp），该菌株保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学；保藏日期：2015年10月30日，保藏号：CCTCCNO：M 2015654。
2.根据权利要求1所述的不动杆菌，其特征在于：该菌株可以用来生产硫酸软骨素酶ABC。
3.权利要求1所述的不动杆菌生产的硫酸软骨素酶ABC，其特征在于它通过以下制备方法制得
（1）将斜面菌种接种到已灭菌的种子培养基中，在培养温度18℃-37℃、转速120-180rpm的条件下培养16-48h，获得种子培养液；
（2）将步骤（1）所述的种子培养液接种到已灭菌的发酵培养基中，在培养温度18℃-30℃、转速120-180rpm的条件下培养16-48h，获得硫酸软骨素酶ABC发酵液；
（3）离心或过滤分离步骤（2）所述硫酸软骨素酶ABC发酵液，取上清液；
（4）用硫酸铵沉淀步骤（3）所述上清液，离心或过滤收集粗蛋白；
（5）缓冲液复溶步骤（4）收集的粗蛋白，超滤或透析除去小分子杂质，得到纯化的硫酸软骨素酶ABC；
（6）将步骤（5）中得到的酶液进行阴离子交换柱层析，用pH7.5的含NaCl的Tris-HCl缓冲液洗脱所述交换柱，分离具有硫酸软骨素酶ABC活性的蛋白质组分；
（7）将步骤（6）中得到的具有硫酸软骨素酶ABC活性的蛋白质组分进行5倍浓缩及凝胶过滤柱层析，用pH6-8的缓冲液洗脱所述凝胶柱，分离具有硫酸软骨素酶ABC活性的蛋白质组分。
4.根据权利要求3所述的硫酸软骨素酶ABC，其特征在于：所述硫酸软骨素酶ABC的分子量为76.1 kDa。
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