JPWO2003062412A1 - 硫酸化フカン - Google Patents

Abstract

糖鎖工学的に有用なヒバマタ目褐藻類由来硫酸化フカンを分解する酵素、該酵素の製造方法、及び硫酸化フカンに該酵素を作用させて得られるオリゴ糖及びその製造。

Description

技術分野
本発明は糖鎖工学分野において有用な硫酸化フカンを分解する酵素、該酵素の製造方法、並びに糖鎖工学用試薬として有用な硫酸化フカンオリゴ糖及びそれらの製造方法に関する。
背景技術
褐藻類には何種類もの硫酸化多糖が含まれている。これらの硫酸化多糖は硫酸化フカンあるいはフコイジンと総称されることが多いが、その構造は由来となる海藻により異なる。例えば、Ｆｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ、ガゴメ、マコンブ、オキナワモズク、モズク、ワカメメカブそれぞれから抽出される硫酸化多糖は異なる構造を持つ（例えば、酒井武、他１名、「バイオサイエンスとインダストリー」、２００２年６月、第６０巻、第６号、ｐ．３７７−３８０参照。）。また、一般に一種の海藻から硫酸化多糖画分を調製すると、数種の分子種の硫酸化多糖が混在している。
これまでに構造が決定された硫酸化多糖の分子種としては、硫酸化フカン（例えば、国際公開第９９／４１２８８号パンフレット参照。）、硫酸化フコグルクロノマンナン（例えば、国際公開第９６／３４００４号パンフレット、国際公開第０２／０８６１１６号パンフレット参照。）、硫酸化フコガラクタン（例えば、国際公開第００／５０４６４号パンフレット参照。）、硫酸化グルクロノフカン（例えば、国際公開第０１／８１５６０号パンフレット参照。）等が挙げられる。硫酸化フカン画分には強い抗凝血活性（例えば、国際公開第９９／４１２８８号パンフレット参照。）、硫酸化フコグルクロノマンナン画分には癌細胞に対するアポトーシス誘導活性（例えば、国際公開第９７／２６８９６号パンフレット参照。）が報告されている等、硫酸化多糖は一般に何らかの生物活性を持つことが多い。そのため、硫酸化多糖を医薬品として開発する試みがなされている。
硫酸化多糖を医薬品として開発する際、その構造を決定する必要が生じるが、その硫酸化多糖を分解する酵素を用いれば構造を決定する際に非常に有利である。しかし褐藻類の硫酸化多糖を分解する酵素は市販されておらず、しかも褐藻類の硫酸化多糖は海藻の種によって異なるため、硫酸化多糖の構造を決めるにはその硫酸化多糖を特異的に分解する酵素が必要となる。
Ｆｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フカンは抗凝血作用、クラミジアの子宮表皮細胞への定着阻害作用、アレルギー反応抑制作用、移植臓器の拒絶抑制作用等を持つことが報告されている（例えば日本特許第３０４２５４３号公報参照）。これらの活性と構造の関係を解明するためＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓやＡｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ由来硫酸化フカンの構造が研究されているが、物理化学的な分析によりその平均的な構造が提唱されているものとして、酸加水分解により一部のオリゴ糖を調製し構造を解明したもの（Ｌｉｏｎｅｌ Ｃｈｅｖｏｌｏｔ、他４名、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、２００１年、第３３０巻、ｐ．５２９−５３５）が挙げられる。該文献には、非還元末端糖の第２位と第３位の炭素に硫酸基が結合した硫酸化フカンの構造式が開示されている。しかしながら、構造を決定したオリゴ糖画分は全体の２％程度であり、そのオリゴ糖画分は種々の分子量のオリゴ糖の混合物であり、還元性末端糖及び非還元性末端糖も一定ではない。すなわち、提唱された構造が全フコイダンの主鎖構造であることが証明されていないばかりか、生産効率も低く、構造の均一なオリゴ糖に分離することは困難である。
また、Ｆｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓやＡｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍから硫酸化フカン画分を調製すると、数種の分子種の硫酸化多糖が混在している。一般に、目的とする生物活性を担う分子種以外の硫酸化多糖は不必要であり、時には不必要な分子種が副作用を誘発させるだけの場合もある。
また、構造的に均一なＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓやＡｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ由来硫酸化フカンのオリゴ糖を、再現性よく調製できれば生物活性と構造の関係を解明する際非常に有用である。例えば、褐藻類由来硫酸化多糖画分に含まれる硫酸化フカンを分解してオリゴ糖を生成させる酵素（例えば、国際公開第９９／４１２８８号パンフレット参照）が知られているが、この酵素はコンブ目褐藻類の硫酸化フカンによく作用して硫酸化フカンオリゴ糖を生成させるが、Ｆｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓやＡｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ等のヒバマタ目褐藻類の硫酸化フカンには作用しない。さらに、国際公開第９６／３４００４号パンフレット、国際公開第０２／０８６１１６号パンフレット記載の硫酸化フコグルクロノマンナンを分解する酵素、国際公開第００／５０４６４号パンフレット記載の硫酸化フコガラクタンを分解する酵素は、Ｆｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓやＡｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ等のヒバマタ目褐藻類の硫酸化フカンには作用しない。
発明の目的
以上のことから、ヒバマタ目褐藻類由来硫酸化多糖画分に含まれる分子種のそれぞれを特異的に分解する酵素、酵素的に製造した構造が均一なオリゴ糖、及びそれらの製造方法が求められていた。
すなわち、本発明の目的は、糖鎖工学的に有用なヒバマタ目褐藻類由来硫酸化フカンを分解する酵素、該酵素の製造方法、及び硫酸化フカンに該酵素を作用させて得られるオリゴ糖及びその製造方法を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは鋭意研究の結果、フコフィラス属に属する細菌の１菌株、フコフィラス フコイダノリィティカス（Ｆｕｃｏｐｈｉｌｕｓ ｆｃｏｉｄａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＳＩ−１２３４が、新規な硫酸化フカン分解酵素を生産することを見出し、該酵素の製造方法を見出した。また、該酵素を利用してヒバマタ目褐藻類由来硫酸化多糖画分から構造の均一な新規な硫酸化フカンオリゴ糖を製造できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の第１の発明は、フコフィラス属細菌の培養物から得られた硫酸化フカン分解酵素に関する。
本発明の第１の発明において、該酵素は、硫酸化フカン分解酵素生産能を有するフコフィラス属細菌を培養し、その培養物から採取することができる。
本発明の第１の発明において、硫酸化フカン分解酵素は特に限定はされないが例えば、エンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼ、エキソ型Ｌ−フコシダーゼ、硫酸化フカン低分子化酵素Ａ、硫酸化フカンデアセチラーゼおよびそれらの任意の組み合わせが含まれる。
エンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼとしては、下記の理化学的性質を有するものが例示される：
（Ｉ）下記式（Ｖ）で表される硫酸化フカンオリゴ糖に作用して、α−（１−４）Ｌ−フコシル結合をエンド的に切断する；

（ＩＩ）約６〜８の範囲に至適ｐＨを有する；
（ＩＩＩ）約１０〜４０℃に至適温度を有する；
（ＩＶ）分子量：ゲルろ過法にて測定した場合、約１１万〜１３万である。
エキソ型Ｌ−フコシダーゼは、下記の理化学的性質を有することを特徴とする：
（Ｉ）硫酸化フカンに作用して、Ｌ−フコース残基をエキソ的に切断する；
硫酸化フカン低分子化酵素Ａの理化学的性質は以下の通りである。
（Ｉ）作用：硫酸化フカンに作用して、硫酸基を切断し、硫酸を遊離する（硫酸化フカンスルファターゼ）。硫酸化フカンの低分子化を促進する。
硫酸化フカンデアセチラーゼの理化学的性質は以下の通りである。
（Ｉ）作用：硫酸化フカンに作用して、酢酸を遊離する。硫酸化フカンの低分子化を促進する。
本発明の第２の発明は、褐藻類由来硫酸化多糖に本発明の第１の発明の硫酸化フカン分解酵素を作用させて得られる硫酸化フカンオリゴ糖に関する。
本発明の第２の発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、褐藻類由来硫酸化多糖に本発明の第１の発明の硫酸化フカン分解酵素を作用させて取得することを特徴とする硫酸化フカンオリゴ糖の製造方法によって調製することができる。
本発明の第３の発明は、下記一般式（Ｉ）で表される糖化合物又はその塩に関する。

（式中、ＲはＨ又はＳＯ_３Ｈ又はＣＨ_３ＣＯ又は下記一般式（ＶＩＩ）であり、Ｒ_１はＨ又はＳＯ_３Ｈ又はＣＨ_３ＣＯである。Ｒ、Ｒ_１のうち少なくとも１つはＳＯ_３Ｈである。ｎは１以上の整数である。）

（式中、ＲはＨ又はＳＯ_３Ｈ又はＣＨ_３ＣＯである。）
本発明の第４の発明は、下記一般式（Ｉ）で表される硫酸化フカンオリゴ糖又はその塩に関する。

（式中、ＲはＨ又はＳＯ_３Ｈ又はＣＨ_３ＣＯ又は下記一般式（ＶＩＩ）であり、Ｒ_１はＨ又はＳＯ_３Ｈ又はＣＨ_３ＣＯである。Ｒ、Ｒ_１のうち少なくとも１つはＳＯ_３Ｈである。ｎは１〜４の整数である。）

（式中、ＲはＨ又はＳＯ_３Ｈ又はＣＨ_３ＣＯである。）
本発明の第５の発明は、本発明の第１の発明の硫酸化フカン分解酵素をヒバマタ目褐藻類由来硫酸化多糖に作用させて下記一般式（ＶＩＩＩ）で表される硫酸化フカンオリゴ糖を製造する製造方法に関する。

（式中、ＲはＨ又はＳＯ_３Ｈ又はＣＨ_３ＣＯ又は下記一般式（ＶＩＩ）であり、Ｒのうち少なくとも１つはＳＯ_３Ｈである。ｎは１以上の整数である。）

（式中、ＲはＨ又はＳＯ_３Ｈ又はＣＨ_３ＣＯである）。
発明の詳細な説明
以下本発明に関して具体的に説明する。
本発明の糖化合物を得るための原料としては、特に限定されるものではないが、例えば、Ｆｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ、Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ等ヒバマタ目の褐藻類由来の硫酸化フカンが使用できる。該ヒバマタ目褐藻類は本発明の糖化合物の生産効率が高く原料として好適である。
本発明の硫酸化フカン分解酵素とは、褐藻類由来硫酸化フカンに作用して還元性末端にフコースを持つオリゴ糖を生成させる酵素である。
本発明の硫酸化フカン由来オリゴ糖は、硫酸化フカンに本発明の硫酸化フカン分解酵素を作用させて得られるオリゴ糖で、還元性末端糖がフコースである。
本発明で使用する硫酸化フカンを製造する際にはまず、褐藻類を水性溶媒で抽出し、硫酸化多糖画分を得る。その際硫酸化フカンの低分子化を防ぐためには、ｐＨは４〜９、温度は１００℃以下が好ましい。また、上記硫酸化多糖画分中のアミノ酸や低分子性の色素等は限外ろ過で効率良く除去できる。疎水性物質の除去には活性炭処理等も有効である。
このようにして褐藻類の硫酸化多糖画分を得ることができる。該硫酸化多糖画分、硫酸化フカンを含有する画分である硫酸化フカン画分、硫酸化フカンのいずれもが本発明の硫酸化フカン分解酵素の基質として使用できる。該画分を陰イオン交換カラムで分離すればより純度の高い硫酸化フカンを得られる。上記の硫酸化多糖画分も陰イオン交換カラムで精製した硫酸化フカンもともに本発明の硫酸化フカン分解酵素を精製する際の活性測定用基質、及び硫酸化フカンオリゴ糖製造時の原料として使用できる。
本発明の硫酸化フカン分解酵素の製造に使用される細菌としては、硫酸化フカン分解酵素を生産する細菌であれば特に限定はないが例えば、フコフィラス フコイダノリティカス（Ｆｕｃｏｐｈｉｌｕｓ ｆｕｃｏｉｄａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＳＩ−１２３４株が挙げられる。
なお、上記のフコフィラス フコイダノリティカスＳＩ−１２３４株はナマコの腸内より本発明者らが新たに検索して得た細菌で、その菌学的性質は次のとおりである。
ａ．形態的性質
本菌は直径１．２〜１．６μｍの球菌である。
胞子の有無 なし
グラム染色性 陰性
ｂ．生理的性質
（１）生育温度 ２５℃で生育する。
（２）酸素に対する態度 好気性
（３）カタラーゼ 陽性
（４）オキシダーゼ 陰性
（５）塩類要求性
０％食塩培地での生育 陰性
１％食塩培地での生育 陰性
海水培地での生育 陽性
（６）キノン系 メナキノン７
（７）菌体内ＤＮＡのＧＣ含量 ５２％
（８）ＯＦ−テスト 酸を生成しない
（９）集落の色調 特徴的な集落色素を生成せず
（１０）運動性 陰性
（１１）滑走性 陰性
（１２）鞭毛 なし
本菌株は、バージーズ マニュアル オブ ディターミネィティブ バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｌｉｏｌｏｇｙ）、第９巻（１９９４）に記載の基本分類によればグループ４（グラム陰性好気性桿菌及び球菌）に分類される。しかし本菌株は、電子伝達鎖にメナキノン７を有し、ＧＣ含量が５２％という点でグループ４に属する菌と大いに異なる。
そこで、本菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列を決定し、既知の細菌と相同性を比較したところ１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの全域（約１５００塩基）にわたって相同性の高い既知菌株は存在しなかった。１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの全配列の相同性が９０％以下の場合、両細菌の属が同じであることはない。一方ＤＮＡデータベースに登録されている１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの配列をもとに、系統樹を作成したところ、本菌株と類縁の細菌は総てＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａに属するものであった。そこで、本発明者らは、遺伝子的分類において本菌株はＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａの新属の細菌であると断定し、フコフィラス フコイダノリティカス ＳＩ−１２３４と命名した。
なお、上記菌株はＦｕｃｏｐｈｉｌｕｓ ｆｕｃｏｉｄａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ ＳＩ−１２３４と表示され、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１７５１７として平成１１年８月１８日（原寄託日）より寄託され、ブダペスト条約に基づき上記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−７４９５として平成１３年３月７日（移管日）より寄託されている。
本菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの配列を配列表の配列番号１に記載する。従って、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの配列より、フコフィラス フコイダノリティカス ＳＩ−１２３４と同属と判断される細菌から得られた硫酸化フカン分解酵素も本発明の硫酸化フカン分解酵素に含まれる。すなわち、菌学的にフコフィラス フコイダノリティカス ＳＩ−１２３４と同属と判断される細菌に加え、その１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの配列がフコフィラス フコイダノリティカス ＳＩ−１２３４と同属と判定できる細菌はフコフィラス属細菌であると判断される。
本発明の硫酸化フカン分解酵素を生産する細菌を培養するにあたり、培地に加える栄養源は使用する微生物が利用し、該酵素を生産するものであればよく、炭素源としては、例えば、硫酸化フカン、Ｆｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓやＡｓｃｏｐｈｙｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ等の海藻、アルギン酸、ラミナラン、フコース、グルコース、マンニトール、グリセロール、サッカロース、マルトース、デンプン等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニウム、尿素、尿酸等が適当である。その他にナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛等の塩化物、リン酸塩、硫酸塩等を加えてもよい。なお、一般に海水から採取した微生物は、海水あるいは市販の人工海水中で極めて生育し易い。
また、培養条件は使用する微生物、培地組成等に応じ、本発明の硫酸化フカン分解酵素の生産量が最大になるように設定するが、一般に培養温度は１５〜３０℃、培地のｐＨは５〜９がよく、５〜７２時間の通気攪拌培養で本発明の硫酸化フカン分解酵素の生産量は最高に達する。培養終了後、遠心分離で菌体と培養上清に分画し、それぞれから本発明の硫酸化フカン分解酵素を得ることができる。
上記のフコフィラス フコイダノリィティカス ＳＩ−１２３４を適当な培地で培養し、その菌体を集め、通常の細胞破砕手段、例えば超音波処理で菌体を破砕すると無細胞抽出液が得られる。次いでこの抽出液から通常の精製手段により、硫酸化フカン分解酵素を精製することもできる。例えば、塩析、イオン交換カラムクロマト、疎水カラムクロマト、ゲルろ過等により精製した本発明の硫酸化フカン分解酵素を得られる。また、上述の培養上清中にも本発明の硫酸化フカン分解酵素が存在するので、菌体内酵素と同様の精製手段で精製できる。本発明の硫酸化フカン分解酵素は、少なくとも以下の４種類の酵素、エンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼ、エキソ型Ｌ−フコシダーゼ、硫酸化フカン低分子化酵素Ａ、硫酸化フカンデアセチラーゼを含む。
本発明の硫酸化フカン分解酵素の理化学的性質は以下の通りである。
（Ｉ）作用：硫酸化フカンに作用して、フコースを還元性末端に持つオリゴ糖を生成させる。
（ＩＩ）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは７．０〜８．５付近にある（図１）。
すなわち図１は本酵素の反応時のｐＨと相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸はｐＨを示す。
（ＩＩＩ）至適温度：本酵素の至適温度は約３０〜４０℃付近にある（図２）。
すなわち、図２は本酵素の反応時の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸は温度（℃）を示す。
本発明の硫酸化フカン分解酵素の一例であるエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼの理化学的性質は以下の通りである。
（Ｉ）下記式（Ｖ）で表される硫酸化フカンオリゴ糖に作用して、α−（１−４）Ｌ−フコシル結合をエンド的に切断する；

（ＩＩ）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは６〜８付近にある（図１８）。
すなわち図１８は本酵素の反応時のｐＨと相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸はｐＨを示す。
（ＩＩＩ）至適温度：本酵素の至適温度は約１０〜４０℃付近にある（図１９）。
すなわち、図１８は本酵素の反応時の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸は温度（℃）を示す。
（ＩＶ））分子量：ゲルろ過法にて測定した場合、約１１万〜１３万である。
本発明の硫酸化フカン分解酵素の一例であるエキソ型Ｌ−フコシダーゼの理化学的性質は以下の通りである。
（Ｉ）作用：硫酸化フカンに作用して、Ｌ−フコース残基をエキソ的に切断する。
本発明の硫酸化フカン分解酵素の一例である硫酸化フカン低分子化酵素Ａの理化学的性質は以下の通りである。
（Ｉ）作用：硫酸化フカンに作用して、硫酸基を切断し、硫酸を遊離する（硫酸化フカンスルファターゼ）。硫酸化フカンの低分子化を促進する。
本発明の硫酸化フカン分解酵素の一例である硫酸化フカンデアセチラーゼの理化学的性質は以下の通りである。
（Ｉ）作用：硫酸化フカンに作用して、酢酸を遊離する。硫酸化フカンの低分子化を促進する。
本発明の硫酸化フカン分解酵素は、硫酸化フカン分解活性を測定して確認でき、生産菌の無細胞抽出液でも、各種カラムクロマトで精製後の酵素溶液でも確認できる。
フコフィラス フコイダノリティカスＳＩ−１２３４株は硫酸化フカンを資化する微生物であり、硫酸化フカンを分解するために菌体内及び菌体外に本発明の硫酸化フカン分解酵素を生産する。
本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、本発明の硫酸化フカン分解酵素を硫酸化フカン、若しくは硫酸化フカン含有物に作用させて調製できる。硫酸化フカン含有物としては、例えば硫酸化フカンの部分精製品、褐藻類由来硫酸化多糖画分、褐藻類の水性溶媒抽出物、若しくは褐藻類藻体が好適に使用できる。
本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を調製する際、硫酸化フカン、若しくは硫酸化フカン含有物の溶解は定法で行えばよく、溶解液中の硫酸化フカン、若しくは硫酸化フカン含有物はその最高溶解濃度でもよいが、通常はその操作性、反応に使用する本発明の硫酸化フカン分解酵素の量等を考慮して選定すればよい。硫酸化フカンの溶解液としては、水、緩衝液等より目的に応じて選択すればよい。溶解液のｐＨは通常中性付近で、酵素反応は通常３０℃付近で行う。反応に使用する本発明の硫酸化フカン分解酵素の使用量、反応液の組成、反応時間等の調整により、硫酸化フカンオリゴ糖の分子量を調整できる。この様にして得られた本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を分子量分画あるいは陰イオン交換カラムで分画して、更に均一な分子量の本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を調製できる。分子量分画は定法、例えばゲルろ過法や限外ろ過法を使用すればよい。低分子化物は、必要に応じて更にイオン交換樹脂処理、活性炭処理等の精製操作を行ってもよく、必要に応じて脱塩処理、無菌処理、凍結乾燥処理もできる。これらの方法で、後述のごとく、ＮＭＲ分析で構造決定可能な均一な構造の本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を得られる。
本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、硫酸基を分子中に有しており、該基は種々の塩基と反応し、塩を形成する。本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、塩になった状態が安定であり、通常ナトリウム及び／又はカリウム及び／又はカルシウム等の塩の形態で提供される。これらの物質の塩はダウエックス５０Ｗ等の陽イオン交換樹脂を利用して遊離の本発明の硫酸化フカンオリゴ糖に導ける。また、これらは、必要に応じ公知慣用の塩交換を行い所望の種々の塩に交換できる。
本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、薬学的に許容される塩、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム、亜鉛等のアルカリ土類金属、アンモニア等の塩とすることができる。
本発明の糖化合物、硫酸化フカンオリゴ糖は、その非還元末端糖の第２位、第３位の炭素に水酸基が結合しているのが特徴である。さらに、本発明の糖化合物、硫酸化フカンオリゴ糖においては、アセチル基、フコシル基が結合していてもよい。
本発明の硫酸化フカン分解酵素は硫酸化フカンを低分子化するため硫酸化フカンの構造解析に使用できる。また、本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は糖鎖工学用試薬として使用できる。例えば、特公平５−６５１０８号公報記載の方法により２−アミノピリジル化（ＰＡ化）を行い、後述のごとく該オリゴ糖のＰＡ化物を調製すれば、種々の硫酸化フカン分解酵素の基質として使用できるなど糖鎖工学用試薬として極めて有用な物質を提供できる。また、本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を抗原として、抗体を作製することができ、該抗体は硫酸化多糖の構造の特定に使用できる。
実施例
以下に本発明を実施例をもって具体的に示すが、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
参考例１ Ｆｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化多糖画分の調製
乾燥したＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ藻体を粉砕し、その１ｋｇを１０リットルの８０％エタノールに懸濁し、２５℃で３時間攪拌後ろ過、洗浄し残さを得た。その残さを３０リットルの１００ｍＭ 塩化ナトリウムを含む３０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中に懸濁し、９５℃で２時間処理後、３０℃に冷却し、１００ｇの活性炭、３０００Ｕのアルギン酸リアーゼ（ナガセ生化学工業製）、及び３．７５リットルのエタノールを添加し２４時間攪拌後、遠心分離して上清を得た。その上清を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で４リットルに濃縮後、１００ｍＭ 塩化ナトリウムで溶媒を置換した。この溶液を４℃まで冷却し、０．５Ｎ 塩酸でｐＨを２．０とし、生じた沈殿を遠心分離で除去し、上清を得た。その上清のｐＨを１Ｎ 水酸化ナトリウムで８．０とし、上記の限外ろ過機で２リットルに濃縮後、２０ｍＭ 塩化ナトリウムで溶媒を置換し、遠心分離で不溶物を除去後、凍結乾燥して８０ｇのＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化多糖画分を得た。
参考例２ Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ由来硫酸化多糖画分の調製
市販のＡｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ粉末１ｋｇから、参考例１の方法で１００ｇのＡｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ由来硫酸化多糖画分を得た。
参考例３ ガゴメコンブ由来硫酸化多糖画分の調製
市販の乾燥ガゴメコンブをカッターミル（増幸産業製）で破砕してチップとし、１ｋｇのチップから、参考例１の方法で３８ｇのガゴメコンブ由来硫酸化多糖画分を得た。
参考例４ Ｆｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フカン画分の調製
７ｇの参考例１記載のＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化多糖画分を７００ｍｌの１００ｍＭ 塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ イミダゾール塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、同緩衝液で平衡化させた５リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００にかけた。試料を流した後、１０リットルの同緩衝液で洗浄し、１００〜１６００ｍＭの塩化ナトリウム濃度勾配で溶出させ、分取（５００ｍｌ）した。各画分に含まれる総糖量をフェノール硫酸法で、総ウロン酸量をカルバゾール硫酸法で測定した。溶出塩化ナトリウム濃度７００〜８００ｍＭの画分を、限外ろ過（排除分子量１０万）で濃縮、脱塩後凍結乾燥し、１．０ｇのＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フカン画分を得た。
参考例５ Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ由来硫酸化フカン画分の調製
７ｇの参考例２記載のＡｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ由来硫酸化多糖画分から、参考例４の方法で１．１ｇのＡｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ由来硫酸化フカン画分を得た。
参考例６ 硫酸化フカン分解酵素活性測定方法
本発明の硫酸化フカン分解酵素は硫酸化フカンに作用して硫酸化フカンを低分子化させる。これを利用して下記の方法で硫酸化フカン分解酵素の活性を測定した。また、本発明の硫酸化フカン分解酵素はＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ及びＡｓｃｏｐｈｙｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ由来硫酸化フカンに作用するが、活性測定にはＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フカンを基質に用いた。
すなわち、２．５％の濃度になるように溶解した参考例４記載のＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フカン画分溶液４．８μｌ、６０μｌの５０ｍＭ イミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）、６μｌの１Ｍ 塩化カルシウム、９μｌの４Ｍ 塩化ナトリウム、２８．２μｌの水、及び１２μｌの本発明の硫酸化フカン分解酵素とを混合し、３０℃で３時間反応させた後、反応液を１００℃で１０分間処理し、ＨＰＬＣで分析した。対照として、本発明の硫酸化フカン分解酵素の代わりに、その酵素溶液の溶媒を用いて反応させたもの及び硫酸化フカン画分の代わりに水を用いて反応させたものを同様に分析した。ＨＰＬＣの分析は下記の様に行った。
カラム ＳｈｏｄｅｘＳＢ−８０６ＨＱ
カラム温度 ２５℃
溶離液 ５ｍＭ アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ 塩化ナトリウム
流速 １ｍｌ／分
検出 示差屈折率検出器
１単位の硫酸化フカン分解酵素活性は上記反応系において１分間に１μｍｏｌｅのフコシル結合を切断する酵素量とした。切断したフコシル結合の量は下記式により求めた。
Ｆｄ×（Ｓｍ／Ｐｍ−１）／（Ｓｍ×１８０×０．０１）＝Ｕ／ｍｌ
Ｆｄ：反応に用いた硫酸化フカン量（μｇ）
Ｓｍ：基質硫酸化フカンの平均分子量
Ｐｍ：反応後の硫酸化フカンの平均分子量
１８０：反応時間（分）
０．０１：酵素液量（ｍｌ）
また、タンパク質の定量は、酵素液の２８０ｎｍの吸光度を測定することにより行い、その際１ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液の吸光度を１．０として計算した。
実施例１ 硫酸化フカン分解酵素の調製
フコフィラス フコイダノリィティカス（Ｆｕｃｏｐｈｉｌｕｓ ｆｃｏｉｄａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＳＩ−１２３４を、参考例１に記載のＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化多糖画分０．２％とペプトン１％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）ｐＨ８．０からなる培地６００ｍｌを１２０℃、２０分間オートクレーブ処理した培地に接種し、２４℃で７２時間培養して種培養液とした。参考例１に記載のＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化多糖画分０．２％、ペプトン１％、及び消泡剤（ＫＭ７０、信越化学工業製）を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）ｐＨ８．０からなる培地２０リットルを３０リットルのジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２０分間オートクレーブ処理した培地に、上記の種培養液を接種し、毎分１２５回転の回転速度で、２４℃で４８時間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。
この菌体を７００ｍｌの２５０ｍＭ 塩化ナトリウムと１０ｍＭ 塩化カルシウムを含む１０ｍＭ イミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して上清を得た。この上清を同じ緩衝液で充分透析し、遠心分離して上清、すなわち、本発明の硫酸化フカン分解酵素粗酵素溶液を得た。
なお、上記の培養上清と粗酵素溶液に含まれる、硫酸化フカン分解酵素活性を参考例６記載の方法で測定した結果、培養液上清には培地１ｍｌあたり０．０５ｍＵ、菌体抽出液には培地１ｍｌあたり０．０５ｍＵの活性が検出された。
上記の硫酸化フカン分解酵素粗酵素溶液を限外ろ過により溶媒を１０ｍＭ 塩化カルシウム、３０ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に交換し、同緩衝液で平衡化させた５００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００にかけた。すなわち、酵素溶液を添加後、上記緩衝液で充分洗浄し、３０ｍＭから３５０ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。分取は１本あたり５１ｍｌとした。
各フラクションの硫酸化フカン分解酵素活性を測定し、活性画分のうち、塩化ナトリウム濃度６０〜１４０ｍＭで溶出された画分をＤＥＡＥ−１画分、塩化ナトリウム濃度１４０〜２３０ｍＭで溶出された画分をＤＥＡＥ−２画分とした。
上記のＤＥＡＥ−１画分を１０ｍＭ 塩化カルシウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させた２００ｍｌの硫酸化セルロファイン（生化学工業）にかけた。すなわち、酵素溶液を添加後、上記緩衝液で充分洗浄し、１００ｍＭから６００ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。分取は１本あたり２０ｍｌとした。
各フラクションの硫酸化フカン分解酵素活性を測定し、活性画分のうち、塩化ナトリウム濃度２９０〜３７０ｍＭで溶出された画分をＤＥＡＥ−１Ｓ画分とした。
上記のＤＥＡＥ−２画分を１０ｍＭ塩化カルシウム、２００ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させた２００ｍｌの硫酸化−セルロファイン（生化学工業）にかけた。すなわち、酵素溶液を添加後、上記緩衝液で充分洗浄し、２００ｍＭから１５００ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。分取は１本あたり２０ｍｌとした。
各フラクションの硫酸化フカン分解酵素活性を測定し、活性画分のうち、塩化ナトリウム濃度２４０〜３５０ｍＭで溶出された画分をＤＥＡＥ−２Ｓ画分とした。
実施例２ 硫酸化フカン分解酵素粗酵素溶液を用いた硫酸化フカンオリゴ糖の調製、精製、及び構造解析
（１）基質の調製
乾燥したＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ藻体６０ｇを粉砕し、１リットルの８０％エタノールに懸濁し、２時間攪拌後、ろ過し、残さを充分洗浄した。得られた残さに対して上記の洗浄工程をさらに２回行い、洗浄残さを得た。この洗浄残さに４リットルの５０ｍＭ 塩化カルシウム、４００ｍＭの塩化ナトリウム、及び１０％エタノールを含む２０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁後、２４時間攪拌し、遠心分離によりＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ抽出液を得た。
得られたＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ抽出液に上記の抽出用緩衝液を加えながら、排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により限外ろ過し、低分子物質を除去した。最終的に３２０ｍｌとし、遠心分離により沈殿を除去した。こうして、Ｆｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ高分子画分を得た。
（２）硫酸化フカンオリゴ糖の調製
実施例２−（１）記載のＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ高分子画分全量に実施例１記載のＤＥＡＥ−１Ｓ画分（硫酸化フカン分解酵素活性として１．７８ｍＵ）及びＤＥＡＥ−２Ｓ画分（硫酸化フカン分解酵素活性として１．９７ｍＵ）を混合し、２５℃で５日間反応させた後、実施例１記載のＤＥＡＥ−１Ｓ画分（硫酸化フカン分解酵素活性として１．５４ｍＵ）及びＤＥＡＥ−２Ｓ画分（硫酸化フカン分解酵素活性として１．７０ｍＵ）を混合し、２５℃で１３日間反応させた。
反応液を排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過装置にかけ、分子量１万以下のオリゴ糖画分を回収し、硫酸化フカンオリゴ糖混合物１とした。
（３）硫酸化フカンオリゴ糖の精製
実施例２−（２）で得られた硫酸化フカンオリゴ糖混合物１に水を加え、１０ｍＭとなるようにイミダゾールを、１０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを添加し、１０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ イミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した５００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、１リットルの同じ緩衝液で洗浄後、１０〜１２００ｍＭの塩化ナトリウム濃度勾配で溶出させ、１本あたり５０ｍｌで分取した。各フラクションの総糖量をフェノール−硫酸法で測定した。その結果、５種のピークが存在していたのでそれぞれのピーク部分を集めオリゴ糖１−（１）から１−（５）画分とした。
オリゴ糖１−（１）〜１−（３）画分をそれぞれ、エバポレーターで４０ｍｌに濃縮後、１０％エタノールで平衡化させたセルロファインＧＣＬ−２５のカラム（４．１×９０．５ｃｍ）にかけ、１０％エタノールで溶出して脱塩した。オリゴ糖１−（１）及び１−（２）はそのまま凍結乾燥により乾固した。こうして１５ｍｇ及び７５ｍｇの本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）及び１−（２）を得た。
脱塩したオリゴ糖１−（３）画分を集め、１０ｍＭとなるようにイミダゾールを、２００ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、ｐＨを６とした。このオリゴ糖溶液を２００ｍＭ 塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ イミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、３００ｍｌの同じ緩衝液で洗浄後、２００〜７００ｍＭの塩化ナトリウム濃度勾配で溶出させ、１本あたり１０ｍｌで分取した。各フラクションの総糖量をフェノール−硫酸法で測定した。その結果、溶出塩濃度４３０ｍＭから４８０ｍＭの画分に分子量が均一なオリゴ糖が存在していたのでその画分を集めた。この画分をエバポレーターで４０ｍｌに濃縮後、１０％エタノールで平衡化させたセルロファインＧＣＬ−２５のカラム（４．１×９０．５ｃｍ）にかけ、１０％エタノールで溶出して脱塩した。脱塩したオリゴ糖溶液を凍結乾燥により乾固した。こうして３５ｍｇの本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（３）を得た。
オリゴ糖１−（４）画分に水を加え、３００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ イミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６）と導電率を同じにした。このオリゴ糖溶液を３００ｍＭ 塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ イミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した５０ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、１００ｍｌの同じ緩衝液で洗浄後、３００〜８００ｍＭの塩化ナトリウム濃度勾配で溶出させ、１本あたり４．９ｍｌで分取した。各フラクションの総糖量をフェノール−硫酸法で測定した。その結果、溶出塩濃度４５０ｍＭから６３０ｍＭの画分に分子量が均一なオリゴ糖が存在していたのでその画分を集めた。この画分をエバポレーターで４０ｍｌに濃縮後、１０％エタノールで平衡化させたセルロファインＧＣＬ−２５のカラム（４．１×９０．５ｃｍ）にかけ、１０％エタノールで溶出して脱塩した。脱塩したオリゴ糖溶液を凍結乾燥により乾固した。こうして１１２ｍｇの本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（４）を得た。
オリゴ糖１−（５）画分に水を加え、４００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６）と導電率を同じにした。このオリゴ糖溶液を４００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、２００ｍｌの同じ緩衝液で洗浄後、４００〜９００ｍＭの塩化ナトリウム濃度勾配で溶出させ、１本あたり１０ｍｌで分取した。各フラクションの総糖量をフェノール−硫酸法で測定した。その結果、溶出塩濃度６４０ｍＭから７００ｍＭの画分に分子量が均一なオリゴ糖が存在していたのでその画分を集めた。この画分をエバポレーターで４０ｍｌに濃縮後、１０％エタノールで平衡化させたセルロファインＧＣＬ−２５のカラム（４．１×９０．５ｃｍ）にかけ、１０％エタノールで溶出して脱塩した。脱塩したオリゴ糖溶液を凍結乾燥により乾固した。こうして４４ｍｇの本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（５）を得た。
（４）構造解析
実施例２−（３）で得られた本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）〜（５）を２−アミノピリジンで蛍光標識し、還元末端糖及び糖組成の分析を行ったところ、本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）〜（５）の還元性末端糖は総てフコースであった。また、中性糖組成も、総てフコースのみからなるものであった。次に、硫酸含量（塩化バリウムを用いた比濁法による）を測定し、質量分析装置（ＡＰＩ−ＩＩＩ、パーキンエルマー・サイエクス社製）で質量を分析した。また、ＪＮＭ−α５００型核磁気共鳴装置（日本電子社製）及びＤｉｇｉｔａｌ ＮＭＲ ＡＤＶＡＮＣＥ ６００（Ｂｒｕｋｅｒ Ａｎａｌｙｔｉｋ社製）でＮＭＲ分析を行った。分析試料は定法により重水で置換後、構造解析を行った。構成糖の結合様式は、^１Ｈ−検出異種核検出法であるＨＭＢＣ法を用いて行った。^１Ｈ−ＮＭＲの帰属にはＤＱＦ−ＣＯＳＹ法及びＨＯＨＡＨＡ法を、^１３Ｃ−ＮＭＲの帰属にはＨＳＱＣ法を用いた。以下に本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）〜（５）の物性を示す。
（ａ）本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）の物性
質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３に、^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図４に、マススペクトルを図５にそれぞれ示した。図３、４において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図５において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；８４２
ＭＳ ｍ／ｚ；４３１．１，［Ｍ＋Ｎａ^＋−２Ｈ^＋］^２−；８８５．２，［Ｍ＋２Ｎａ^＋−３Ｈ^＋］^−
１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表１、２に示す。

糖組成 Ｌ−フコース４分子
硫酸基 ３分子
なお、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（ＩＩ）の通りである。

（ｂ）本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（２）の物性
質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図６に、^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図７に、マススペクトルを図８にそれぞれ示した。図６、７において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図８において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；９２２
ＭＳ ｍ／ｚ；４８２．１，［Ｍ＋２Ｎａ^＋−４Ｈ^＋］^２−；９８７．１，［Ｍ＋３Ｎａ^＋−４Ｈ^＋］^−
１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表３、４に示す。

糖組成 Ｌ−フコース４分子
硫酸基 ４分子
なお、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（ＩＩＩ）の通りである。

（ｃ）本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（３）の物性
質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図９に、^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１０に、マススペクトルを図１１にそれぞれ示した。図９、１０において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図１１において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；１４５４
ＭＳ ｍ／ｚ；３７９．１，［Ｍ＋３Ｎａ^＋−７Ｈ^＋］^４−；５１３．２，［Ｍ＋４Ｎａ^＋−７Ｈ^＋］^３−；７８１．１，［Ｍ＋５Ｎａ^＋−７Ｈ^＋］^２−
１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表５、６に示す。

糖組成 Ｌ−フコース６分子
硫酸基 ７分子
なお、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（ＩＶ）の通りである。

（ｄ）本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（４）の物性
質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１２に、^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１３に、マススペクトルを図１４にそれぞれ示した。図１２、１３において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図１４において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；１９８６
ＭＳ ｍ／ｚ；４１８．３，［Ｍ＋５Ｎａ^＋−１０Ｈ^＋］^５−；５２８．５，［Ｍ＋６Ｎａ^＋−１０Ｈ^＋］^４−；７１２．４，［Ｍ＋７Ｎａ^＋−１０Ｈ^＋］^３−；１０８０．６，［Ｍ＋８Ｎａ^＋−１０Ｈ^＋］^２−
１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表７〜９に示す。

糖組成 Ｌ−フコース８分子
硫酸基 １０分子
なお、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（Ｖ）の通りである。

（ｅ）本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（５）の物性
質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１５に、^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１６に、マススペクトルを図１７にそれぞれ示した。図１５、１６において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図１７において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；２５１８
ＭＳ ｍ／ｚ；３２７．６，［Ｍ＋５Ｎａ^＋−１３Ｈ^＋］^８−；３７７．８，［Ｍ＋６Ｎａ^＋−１３Ｈ^＋］^７−；４４４．５，［Ｍ＋７Ｎａ^＋−１３Ｈ^＋］^６−；５３８．０，［Ｍ＋８Ｎａ^＋−１３Ｈ^＋］^５−；６７８．１，［Ｍ＋９Ｎａ^＋−１３Ｈ^＋］^４−；９１２．４，［Ｍ＋１０Ｎａ^＋−１３^＋］^３−
１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表１０〜１３に示す。

糖組成 Ｌ−フコース１０分子
硫酸基 １３分子
なお、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（ＶＩ）の通りである。

（５）本発明の硫酸化フカン分解酵素に含まれる酵素種
実施例２に示すオリゴ糖１−（１）〜（５）は総て一般式（Ｉ）で表すことができる。すなわち同じ骨格を持つ多糖から生成してきたと考えられる。これらのオリゴ糖の還元性末端糖が総てＬ−フコースであることから、硫酸化フカン分解酵素にはエンド型α−Ｌ−フコシダーゼが存在していることがわかった。また、これらのオリゴ糖は２糖繰り返し構造を持っていることから、上記のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼはα（１−４）Ｌ−フコシル結合を切断する酵素であることがわかった。また、上記のオリゴ糖を得たときの反応液には硫酸、Ｌ−フコース、酢酸が検出されたことから、実施例１で得られた硫酸化フカン分解酵素標品中には、スルファターゼ活性、フコシダーゼ活性、デアセチラーゼ活性が混在することが示唆された。
（６）エンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼ活性測定
実施例２記載の硫酸化フカンオリゴ糖１−（４）を用いて、エンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼの活性測定系を確立した。まず、実施例２−（４）記載の方法で本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（４）の還元性末端を２−アミノピリジンで蛍光標識した。エンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼの活性は以下の様にして測定した。
すなわち、７５μｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、７．５μｌの２ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミン溶液、３．７５μｌの４Ｍ塩化ナトリウム、５０．２５μｌの水、６μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌの本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（４）の還元性末端を２−アミノピリジンで蛍光標識したもの、及び７．５μｌの本発明のエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼ溶液を混合し、３０℃で３時間反応させた後、反応液を１００℃で１０分間処理し、ＨＰＬＣで分析した。対照として、本発明のエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼの代わりに、その酵素の溶媒を用いて反応させたもの及び基質の代わりに水を用いて反応させたものを同様に分析した。ＨＰＬＣは下記の様に行った。
カラム ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｏｃｔｙｌ−８０Ｔｓ（４．６ｘ２５０ｍｍ，東ソー製）
カラム温度 ４０℃
溶離液
各溶離液の２００ｍＭ酢酸トリエチルアミン緩衝液ｐＨ５．５とアセトニトリルの比率を以下に記載する。
Ａ液 ９５：５
Ｂ液 ７０：３０
Ｃ液 ４０：６０
ＨＰＬＣによる分析時の溶離液の組成を以下に記載する。
０〜７分 Ａ液
７〜２５分 Ａ液からＡとＢ液の混合液（Ａ：Ｂ＝１０：９０）へのグラジエント。
２５〜２６分 ＡとＢ液の混合液（Ａ：Ｂ＝１０：９０）からＣへのグラジエント。
２６〜３４分 Ｃ液
流速 １ｍｌ／分
検出 蛍光（励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍ）
１単位のエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼ活性は上記反応系において１分間に１μｍｏｌｅのフコシル結合を切断する酵素量とした。切断したフコシル結合の量は下記式により求めた。
Ｓ／（１８０×０．００７５×１０^６）＝Ｕ／ｍｌ
Ｓ：分解された基質のモル数（ｐｍｏｌｅ）
１８０：反応時間（分）
０．００７５：酵素液量（ｍｌ）
また、タンパク質の定量は酵素液の２８０ｎｍの吸光度を測定することにより行い、その際１ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液の吸光度を１．０として計算した。
実施例３ エンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼ
（１） エンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼの部分精製
実施例１の方法でフコフィラス フコイダノリィティカス ＳＩ−１２３４を培養し、培養液６０リットルから、遠心分離により菌体を回収した。
得られた菌体を２３６０ｍｌの１０ｍＭ塩化カルシウムと４００ｍＭの塩化ナトリウムと５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して上清を得た。この上清を５０ｍＭの塩化ナトリウムと５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で充分透析し、生じた沈殿を遠心分離により除去して上清、すなわち本発明のエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼの粗酵素溶液を得た。
上記のエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼ粗酵素溶液を上記と同じ緩衝液で平衡化させた、３０００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００にかけた。すなわち、本発明のエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼの粗酵素溶液を添加後、上記緩衝液で充分洗浄し、５０ｍＭから６００ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。分取は１本あたり６０ｍｌとした。
各フラクションの本発明のエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼ活性を測定し、活性画分を２００ｍＭの塩化ナトリウムと２０ｍＭのリン酸２水素カリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させた１５０ｍｌのヒドロキシルアパタイトカラムにかけた。すなわち、酵素溶液を添加後、平衡化用緩衝液で充分洗浄し、２０ｍＭから４００ｍＭのリン酸２水素カリウムの濃度勾配により溶出させた。分取は１本あたり１０ｍｌとした。
各フラクションのエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼ活性を測定し、活性画分を排除分子量１万の限外ろ過膜を装着させた限外ろ過機で濃縮し、１００ｍＭの塩化ナトリウムと５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化させたセファクリルＳ−２００のカラム（４．４×１００ｃｍ）にかけた。すなわち、酵素溶液を添加後、上記緩衝液で溶出させた。分取は１本あたり１３ｍｌとした。以上の精製工程を表１４に示す。

本発明のエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼがエンド的にα１−４Ｌ−フコシル結合を切断することを確認するため下記の実験を行った。
すなわち、本発明のエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼを、還元性末端を２−アミノピリジンで蛍光標識した本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（４）に作用させた反応液を少量とり、乾固後、その中に存在するオリゴ糖を２−アミノピリジンで蛍光標識し、ＨＰＬＣにより分析した。なお、標準物質として本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（２）を２−アミノピリジンで蛍光標識したものを用いた。その結果、酵素反応により切断されて生じたオリゴ糖は総て本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（２）と同じ物質であることがわかった。すなわち、本発明のエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼが、Ｆｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フカンに存在するα−（１−４）Ｌ−フコシル結合をエンド的に切断する酵素であることが確認された。本発明のエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼの至適ｐＨと至適温度をそれぞれ図１８、図１９に示す。
しかしながら、本発明のエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼを単独でＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フカン画分に作用させても低分子化させることができなかった。上述のように本発明の硫酸化フカン分解酵素を用いて硫酸化フカンオリゴ糖を調製する際には、反応液中にＬ−フコース、硫酸、酢酸が生じることが分かっている。このことから、本発明のエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼで硫酸化フカンを分解する際には、フコシダーゼ、スルファターゼ、デアセチラーゼ等が共存する必要があると考えられた。
そこで、本発明のエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼと共存してＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フカンを低分子化させる活性を探索した。
（２） 硫酸化フカン低分子化酵素Ａ
本発明のエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼと共存してＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フカンを低分子化させる酵素を調製するため、まず該酵素の活性測定系を以下の様に設定した。
すなわち、１２μｌの５００ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、４．８μｌの２．５％のＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フカン画分、６μｌの１Ｍの塩化カルシウム、９μｌの４Ｍ塩化ナトリウム、４０．２μｌの水、２４μｌの０．３５−０．４ｍＵ／ｍｌの本発明のエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼ、及び２４μｌの本発明の硫酸化フカン低分子化酵素Ａ溶液を混合し、３０℃で３時間反応させた後、反応液を１００℃で１０分間処理し、ＨＰＬＣで分析した。対照として、本発明の硫酸化フカン低分子化酵素Ａ溶液の代わりに、その酵素の溶媒を用いて反応させたものを同様に分析した。ＨＰＬＣは下記の様に行った。
カラム ＳＢ−８０６ＨＱ（４．６ｘ２５０ｍｍ，昭和電工製）
カラム温度 ２５℃
溶離液 ５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭの塩化ナトリウム
流速 １ｍｌ／分
検出 示差屈折率検出器
１単位の本発明の硫酸化フカン低分子化酵素Ａの酵素活性は上記反応系において１分間に１μｍｏｌの割合で、本発明のエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼによるフコシル結合の切断を増加させる酵素量とした。切断したフコシル結合の量は下記式により求めた。
（１２０／ＳＭｒ）×（ＳＭｒ／ＰＭｒ−１）×１／１８０×０．０２４＝Ｕ／ｍｌ
１２０：基質に使用した硫酸化フカン量（μｇ）
ＳＭｒ：基質の平均分子量
ＰＭｒ：反応生成物の平均分子量
１８０：反応時間（分）
０．０２４：酵素液量（ｍｌ）
また、タンパク質の定量は酵素液の２８０ｎｍの吸光度を測定することにより行い、その際１ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液の吸光度を１．０として計算した。
実施例４ 硫酸化フカン低分子化酵素Ａ
（１） 硫酸化フカン低分子化酵素Ａの部分精製
実施例１の方法でフコフィラス フコイダノリィティカス ＳＩ−１２３４を培養し、培養液６０リットルから、遠心分離により菌体を回収した。
得られた菌体を２７８０ｍｌの１０ｍＭ塩化カルシウムと４００ｍＭの塩化ナトリウムと５ｍＭのアジ化ナトリウムと５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して上清を得た。この上清を１０ｍＭの塩化カルシウムと１０ｍＭの塩化ナトリウムと５ｍＭのβ−メルカプトエタノールと５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で充分透析し、生じた沈殿を遠心分離により除去して上清を得た。
得られた上清を上記と同じ緩衝液で平衡化させた、３０００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００にかけた。すなわち、上記の上清を添加後、上記緩衝液で充分洗浄し、１０ｍＭから６００ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。分取は１本あたり６０ｍｌとした。
各フラクションの、本発明の硫酸化フカン低分子化酵素Ａの酵素活性を測定し、活性画分（６０−１１０ｍＭ塩化ナトリウム溶出画分）を１０ｍＭの塩化カルシウムと８０ｍＭの塩化ナトリウムと５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させた２００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラムにかけた。すなわち、該酵素溶液を添加後、平衡化用緩衝液で充分洗浄し、８０ｍＭから２４０ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。分取は１本あたり２０ｍｌとした。
各フラクションの硫酸化フカン低分子化酵素Ａの酵素活性を測定し、活性画分を、２００ｍＭの塩化ナトリウムと１０ｍＭの塩化カルシウムと５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させた２０ｍｌの硫酸化セルロファインのカラムにかけた。すなわち、酵素溶液を添加後、上記緩衝液で充分洗浄し、２００から７００ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。分取は１本あたり２ｍｌとした。以上の精製工程を表１５に示す。

本発明の硫酸化フカン低分子化酵素Ａの作用機作を確認するため下記の実験を行った。
すなわち、本発明の硫酸化フカン低分子化酵素Ａを、Ｆｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フカンに作用させた反応液を少量とり、その中に存在する遊離の硫酸の量をＨＰＬＣにより分析した。なお、標準物質としては硫酸ナトリウムを用いた。その結果、酵素反応により遊離の硫酸が生じることがわかった。すなわち、本発明の硫酸化フカン低分子化酵素Ａが、Ｆｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フカンに作用して硫酸基を切断する酵素であり、硫酸化フカンスルファターゼ活性を有することが確認された。
しかしながら、本発明のエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼと本発明の硫酸化フカン低分子化酵素ＡだけをＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フカン画分に作用させても実施例２に記載したオリゴ糖を得られるほどには低分子化させることができなかった。上述のように本発明の硫酸化フカン分解酵素を用いて硫酸化フカンオリゴ糖を調製する際には、反応液中にＬ−フコース、酢酸も生じることが分かっている。このことから、Ｆｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フカンを分解する際には、本発明のエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼと本発明の硫酸化フカン低分子化酵素Ａ以外に、フコシダーゼやデアセチラーゼ等が共存する必要があると考えられた。
そこで、本発明のエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼ及び本発明の硫酸化フカン低分子化酵素Ａと共存してＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フカンの低分子化を促進させる活性を探索した。なお、探索する対象の酵素を以下、エキソ型Ｌ−フコシダーゼという。
（２）エキソ型Ｌ−フコシダーゼ
本発明のエキソ型Ｌ−フコシダーゼを調製するため、まず該酵素の活性測定系を以下の様に設定した。
すなわち、１２μｌの５００ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、４．８μｌの２．５％のＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フカン画分、６μｌの１Ｍの塩化カルシウム、９μｌの４Ｍ塩化ナトリウム、１６．２μｌの水、２４μｌの０．３５−０．４ｍＵ／ｍｌの本発明のエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼ、２４μｌの０．０４−０．０５ｍＵ／ｍｌの本発明の硫酸化フカン低分子化酵素Ａ、及び２４μｌの本発明のエキソ型Ｌ−フコシダーゼを混合し、３０℃で３時間反応させた後、反応液を１００℃で１０分間処理し、ＨＰＬＣで分析した。対照として、本発明のエキソ型Ｌ−フコシダーゼ溶液の代わりに、その酵素の溶媒を用いて反応させたものを同様に分析した。ＨＰＬＣは下記の様に行った。
カラム ＳＢ−８０６ＨＱ（４．６ｘ２５０ｍｍ，昭和電工製）
カラム温度 ２５℃
溶離液 ５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭの塩化ナトリウム
流速 １ｍｌ／分
検出 示差屈折率検出器
１単位のエキソ型Ｌ−フコシダーゼ活性は上記反応系において１分間に１μｍｏｌｅの割合でフコシル結合の切断を増加させる酵素量とした。増加したフコシル結合の量は下記式により求めた。
（１２０／ＳＭｒ）×（ＳＭｒ／ＰＭｒ−１）×１／１８０×０．０２４＝Ｕ／ｍｌ
１２０：基質に使用した硫酸化フカン量（μｇ）
ＳＭｒ：基質の平均分子量
ＰＭｒ：反応生成物の平均分子量
１８０：反応時間（分）
０．０２４：酵素液量（ｍｌ）
また、タンパク質の定量は酵素液の２８０ｎｍの吸光度を測定することにより行い、その際１ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液の吸光度を１．０として計算した。
実施例５ エキソ型Ｌ−フコシダーゼの部分精製
実施例２の方法でフコフィラス フコイダノリィティカス ＳＩ−１２３４を培養し、培養液６０リットルから、遠心分離により菌体を回収した。
得られた菌体を２７８０ｍｌの１０ｍＭ塩化カルシウムと４００ｍＭの塩化ナトリウムと５ｍＭのアジ化ナトリウムと５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して上清を得た。この上清を１０ｍＭの塩化カルシウムと１０ｍＭの塩化ナトリウムと５ｍＭのβ−メルカプトエタノールと５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で充分透析し、生じた沈殿を遠心分離により除去して上清を得た。
得られた上清を上記と同じ緩衝液で平衡化させた、３０００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００にかけた。すなわち、上記の上清を添加後、上記緩衝液で充分洗浄し、１０ｍＭから６００ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。分取は１本あたり６０ｍｌとした。
各フラクションのエキソ型Ｌ−フコシダーゼ活性を測定し、活性画分（１７０〜２０５ｍＭ塩化ナトリウム溶出画分）を１０ｍＭの塩化カルシウムと５０ｍＭの塩化ナトリウムと５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で充分透析し、同緩衝液で平衡化させた５０ｍｌの硫酸化セルロファインカラムにかけた。すなわち、該酵素溶液を添加後、平衡化用緩衝液で充分洗浄し、５０ｍＭから１Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。分取は１本あたり５ｍｌとした。
各フラクションの本発明のエキソ型Ｌ−フコシダーゼ活性を測定し、活性画分を、１００ｍＭの塩化ナトリウムと１０ｍＭの塩化カルシウムと５ｍＭのβ−メルカプトエタノールと５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化させた２０ｍｌの硫酸化セルロファインのカラムにかけた。すなわち、酵素溶液を添加後、上記緩衝液で充分洗浄し、１００から７００ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。分取は１本あたり２．３ｍｌとした。以上の精製工程を表１６に示す。

本発明のエキソ型Ｌ−フコシダーゼの作用機作を確認するため下記の実験を行った。
すなわち、本発明のエキソ型Ｌ−フコシダーゼを、Ｆｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フカンに作用させた反応液を少量とり、その中に存在する遊離のＬ−フコースの量を遊離型Ｌ−フコース定量用キットにより測定した。その結果、酵素反応により遊離のＬ−フコースが生じることがわかった。すなわち、本発明のエキソ型Ｌ−フコシダーゼが、Ｆｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フカンに作用してＬ−フコース残基を切断する酵素であり、エキソ型Ｌ−フコシダーゼであることが確認された。
本発明のエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼと本発明の硫酸化フカン低分子化酵素Ａと本発明のエキソ型Ｌ−フコシダーゼをＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フカン画分に作用させると、硫酸化フカンを低分子化させ実施例２に記載したオリゴ糖とほぼ同等の分子量のオリゴ糖が生成した。しかしながら、上述のように本発明の硫酸化フカン分解酵素を用いて硫酸化フカンオリゴ糖を調製する際には、反応液中に酢酸も生じることが分かっている。
そこで、Ｆｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フカンを１Ｎの水酸化ナトリウムで処理することによりＯ−アセチル基を加水分解したもの及び未処理のＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フカンを基質に用いて、本発明のエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼ及び本発明の硫酸化フカン低分子化酵素Ａを作用させたところ、明らかにＯ−アセチル基を除去した、Ｆｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フカンのみ低分子化が進むことがわかり、硫酸化フカンの脱アセチル化が、Ｆｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フカンの酵素的低分子化に必要な反応であることが確認できた。
また、この結果から、本発明のエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼと本発明の硫酸化フカン低分子化酵素Ａと本発明のエキソ型Ｌ−フコシダーゼの中に硫酸化フカンデアセチラーゼの混入が考えられたので、以下の反応系により該酵素活性を測定した。
すなわち、６μｌの５００ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、７．２μｌの２．５％のＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フカン画分、３μｌの１Ｍの塩化カルシウム、４．５μｌの４Ｍ塩化ナトリウム、３３．３μｌの水、及び６μｌの硫酸化フカンデアセチラーゼ含有酵素溶液を混合し、３０℃で３時間反応させた後、反応液を１００℃で１０分間処理し、市販の酢酸定量用キットを用いて酢酸量を定量した。対照として、硫酸化フカンデアセチラーゼ含有酵素溶液の代わりに、その酵素溶液の溶媒を用いて反応させたものを同様に分析した。この結果、実施例で部分精製した本発明の硫酸化フカン低分子化酵素Ａ及び本発明のエキソ型Ｌ−フコシダーゼにはともに硫酸化フカンデアセチラーゼが含まれていることがわかった。
このことから、Ｆｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フカンを分解する際には、本発明のエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼ、本発明の硫酸化フカン低分子化酵素Ａ、本発明のエキソ型Ｌ−フコシダーゼ及び硫酸化フカンデアセチラーゼが関与していることがわかった。
産業上の利用の可能性
本発明により硫酸化フカンの構造解析や硫酸化フカンオリゴ糖の再現性よい製造に用いることができる新規の硫酸化フカン分解酵素及び該酵素の製造方法が提供される。また、該酵素を使用することにより製造できる、糖鎖工学用試薬として有用な硫酸化フカンオリゴ糖及びそれらの製造方法が提供される。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１：本発明により得られる硫酸化フカン分解酵素のｐＨと相対活性（％）の関係を表すグラフである。
図２：本発明により得られる硫酸化フカン分解酵素の温度（℃）と相対活性（％）の関係を表すグラフである。
図３：本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図４：本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図５：本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
図６：本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（２）の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図７：本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（２）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図８：本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（２）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
図９：本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（３）の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図１０：本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（３）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図１１：本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（３）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
図１２：本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（４）の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図１３：本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（４）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図１４：本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（４）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
図１５：本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（５）の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図１６：本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（５）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図１７：本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（５）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
図１８：本発明により得られるエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼのｐＨと相対活性（％）の関係を表すグラフである。
図１９：本発明により得られるエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼの温度（℃）と相対活性（％）の関係を表すグラフである。

Claims (9)

1. フコフィラス（Ｆｕｃｏｐｈｉｌｕｓ）属細菌の培養物から得られたヒバマタ目褐藻由来硫酸化フカン分解酵素。
2. 下記の理化学的性質を有することを特徴とするエンド型α−（１−４）Ｌ−フコシダーゼである請求項１記載の硫酸化フカン分解酵素：
   （Ｉ）下記式（Ｖ）で表される硫酸化フカンオリゴ糖に作用して、α−（１−４）Ｌ−フコシル結合をエンド的に切断する；
   

   

   （ＩＩ）約６〜８の範囲に至適ｐＨを有する；
   （ＩＩＩ）約１０〜４０℃に至適温度を有する。
3. フコフィラス属細菌を培養し、その培養物から該酵素を採取することを特徴とする請求項１記載の硫酸化フカン分解酵素の製造方法。
4. 褐藻類由来硫酸化多糖に請求項１記載の硫酸化フカン分解酵素を作用させて得られる硫酸化フカンオリゴ糖。
5. 褐藻類由来硫酸化多糖に請求項１記載の硫酸化フカン分解酵素を作用させて取得することを特徴とする硫酸化フカンオリゴ糖の製造方法。
6. 下記一般式（Ｉ）で表される糖化合物又はその塩。
   

   

   （式中、ＲはＨ又はＳＯ_３Ｈ又はＣＨ_３ＣＯ又は下記一般式（ＶＩＩ）であり、Ｒ_１はＨ又はＳＯ_３Ｈ又はＣＨ_３ＣＯである。Ｒ、Ｒ_１のうち少なくとも１つはＳＯ_３Ｈである。ｎは１以上の整数である。）
   

   

   （式中、ＲはＨ又はＳＯ_３Ｈ又はＣＨ_３ＣＯである。）
7. 下記一般式（Ｉ）で表される硫酸化フカンオリゴ糖又はその塩。
   

   

   （式中、ＲはＨ又はＳＯ_３Ｈ又はＣＨ_３ＣＯ又は下記一般式（ＶＩＩ）であり、Ｒ_１はＨ又はＳＯ_３Ｈ又はＣＨ_３ＣＯである。Ｒ、Ｒ_１のうち少なくとも１つはＳＯ_３Ｈである。ｎは１〜４の整数である。）
   

   

   （式中、ＲはＨ又はＳＯ_３Ｈ又はＣＨ_３ＣＯである。）
8. 請求項１記載の硫酸化フカン分解酵素をヒバマタ目褐藻類由来硫酸化多糖に作用させて下記一般式（ＶＩＩＩ）で表される硫酸化フカンオリゴ糖を製造する製造方法：
   

   

   （式中、ＲはＨ又はＳＯ_３Ｈ又はＣＨ_３ＣＯ又は下記一般式（ＶＩＩ）であり、Ｒのうち少なくとも１つはＳＯ_３Ｈである。ｎは１以上の整数である）：
   

   

   （式中、ＲはＨ又はＳＯ_３Ｈ又はＣＨ_３ＣＯである）。
9. ヒバマタ目褐藻類がＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ又はＡｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍである、請求項８記載の硫酸化フカンオリゴ糖の製造方法。

Images