KR100353692B1

KR100353692B1 - 키티나아제를 생성하는 사이토파가속 에이치제이 균주를이용한 키틴 올리고당의 제조방법

Info

Publication number: KR100353692B1
Application number: KR1020000029040A
Authority: KR
Inventors: 이강만; 노희정; 이동미
Original assignee: 이강만
Priority date: 2000-05-29
Filing date: 2000-05-29
Publication date: 2002-09-27
Also published as: KR20010107443A

Abstract

본 발명은 바닷가 토양으로부터 분리한 키틴 분해활성을 가지는 신규의 사이토파가(Cytophaga)속 HJ 균주와 상기 균주가 생성하는 키티나아제를 이용한 키틴 올리고당의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서 사이토파가 속 HJ 균주를 HJ배지에서 종배양하고 HJ배지에 키틴을 0.5%되게 첨가한 본배양배지에서 배양하여 배양액으로부터 제조된 키티나아제는 이당체인 N-아세틸 키토바이오스를 주로 생성하는 특성을 나타내며, 단량체의 생성율이 낮기 때문에 키틴 올리고당을 제조하는데 유용하게 이용할 수 있다.

Description

키티나아제를 생성하는 사이토파가속 에이치제이 균주를 이용한 키틴 올리고당의 제조방법{Chitooligosaccharides production by using the chitinase of Cytophaga sp. HJ}

키틴은 N-아세틸-글루코자민이 β-1→4결합으로 연결된 고분자물질로 갑각류, 곰팡이 세포벽 등의 구성물질로 자연계에서 셀룰로즈 다음으로 많이 생성되는 생고분자물질이다. 키틴은 고분자물질이며 결정성을 가지고 있어서 물에 녹지 않아 그 이용이 제한되고 있다. 키틴은 산이나 효소를 처리하면 구성당이 두 개 이상 연결된 상태의 키틴 올리고당을 얻을 수 있으며 이들 올리고당은 수용성일 뿐만 아니라 항암성, 면역 항진성, 비피더스 팩터(bifidus factor)작용 등의 생리활성을 가진다(P.R. Austin, C.J. Brine, J.E. Castle, J.P. Zikakis, 1981, " Chitin: New facets of research", Science 212, 749-753. L.M. Prescott, J.P. Harley, D.A. Klein, Microbiology, 1999, WCB-McGraw Hill, p.577).

키틴을 분해하여 수용성 키틴 올리고당을 제조하는 방법으로는 산분해법과 효소분해법이 알려져 있다. 산분해 방법은 염산 등을 사용하며, 따라서 공정폐기물의 처리가 문제가 될 뿐만 아니라 생성 올리고당의 크기가 균일하지 못한 단점이 있다. 이에 반하여 효소분해방법은 온화한 조건에서 분해작용이 일어나 생성되는 올리고당의 분포가 효소의 특성에 따라 특정적일 수 있으며 강산을 사용하지 않기 때문에 공정폐기물의 문제도 없다.

키틴을 분해하는 키티나아제를 생성하는 것으로 알려진 미생물에는 Aeromonas hydrophila(Yabuki, M., et al. J. Gen. Appl. Microbiol. 32, 25-38(1986)), Trichodrema harzianum(Ulhoa, C.J. Peberdy J. F., J. Gen. Microbiol. 137, 2163-2169 (1991)), Saccharomyces cerevisiae(Cabib, E., et al, J. Gen. Microbiol. 138, 97-102(1992)), Vibrio alginolyticus(Murao, S., et al. Biosci. Biotech. Biochem.56, 368-369(1992)), Streptomyces kurssanovii(Stoyachenko, I.A., et al., Carbohydr. Polym. 24, 47-54(1994)), Streptomyces erythraeus(Hara, S. et al, J. Biochem. 105, 484-489(1989)), Streptomyces olivaceoviridis(Romaguera, A. et al, J. Bacteriol. 174, 3450-3454(1992)) Streptomyces thermoviolaceus(Tsujibo, H. et al, Appl. Environ. Microbiol. 59, 620-622(1993)), Aeromonas sp. No 10S-24(Ueda, M. et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 2162-2164(1995)), Bacillus licheniformis(Takayanagi, T. et al, Biochem. Biophys. Acta, 1078,404-410(1991)), Bacillus stearothermophilus(Sakai. K. et al. Appl. Environ. Micribiol. 60,2911-2915(1994)), Altermonas sp. strain O-7(Tsujibo, H. et. al. Can. J. Microbiol. 38, 891-899(1992))등이 있다. 이들 미생물에는 키틴을 분해하여 올리고당을 생성하는 키티나아제가 있음이 보고되었다.

본 발명은 상기와 같은 사실에 의거하여 안출한 것으로서, 본 발명자들은 고분자인 키틴으로부터 특정 크기의 키틴 올리고당을 생산하는데 이용할 수 있는 미생물 균주를 개발하고자 키틴 분해 활성을 가지는 미생물을 바닷가 토양 시료로부터 분리하는 연구결과로써 이당체인 N-아세틸 키토바이오스를 주로 생성하는 미생물을 선별확인하여 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서, 본 발명의 목적은 키틴 분해 효소 생성균주인 신규의 사이토파가(Cytophaga)속 HJ 균주를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 균주가 생성하는 키티나아제를 이용하여 키틴 올리고당을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 사이토파가 속 HJ 세균의 증식곡선과 키티나아제 활성변화를 나타낸 그래프이다.

도 2는 사이토파가 속 HJ 세균이 생성하는 키티나아제의 단백질 정제도를 보여 주는 SDS-PAGE 그림이다. 1:molecular marker, 2:30-60% 황산암모늄 침전, 3:DEAE-Biogel A 활성분액, 4:octyl-sepharose 칼럼 활성분액, 5:2차 DEAE-Biogel A 칼럼 활성 분액을 나타낸다.

도 3은 키티나아제의 pH 변화에 따른 활성(■)과 안정성(●)을 보여 주는 그림이다.

도 4는 키티나아제의 온도변화에 따른 활성과(■)과 안정성(●)을 보여 주는 그림이다.

도 5는 키티나아제의 기질특이성을 나타내는 그래프이다(콜로이달 키틴:■, 키토산(아세틸화도=15-25%):●, 키토산(아세틸화도=7-8%):▲, N-트리메칠 키토산:▼, 글리콜키토산:◆)

도 6은 키티나아제와 키틴의 반응 생성물 분석 결과를 보여 주는 고속액체크로마토그래프이다(그림 A: 1=1량체, 2=2량체, 3=3량체, 4=4량체, 5=5량체, 6=6량체이고, 그림 B: 30분 반응액, 그림 C: 24시간 반응액, a=1량체, b=2량체, c,d,e,f,g=미지의 올리고머들).

이하, 본 발명을 실시예를 들어 보다 구체적으로 설명하면 아래와 같다.

균주의 채취 및 분리

한국 부산 광안 해수욕장에서 채취한 모래 20g을 colloidal chitin을 함유하는 선별배지(조성: colloidal chitin 0.5%. MgSO_4·7H₂O 0.05%. KH₂PO₄0.03%, K₂HPO₄0.07%. FeSO_4·7H₂O 0.1%, ZnSO₄0.01%, MnCl₂0.01%) 50ml에 첨가하여 30도에서 진탕하면서 7일간 배양하였다. 배양액 1ml을 선별고체배지(조성: colloidal chitin 0.5%. MgSO_4·7H₂O 0.05%. KH₂PO₄0.03%, K₂HPO₄0.07%. FeSO_4·7H₂O 0.1%, ZnSO₄0.01%, MnCl₂0.01%, agar 1.5%)에 도말하여 30도에서 배양하면서 투명대를 형성하는 균주를 선별하였다. 선별된 신규의 키틴 분해 균주의 미생물학적 특성을 조사한 결과, 그의 형태학적, 생리학적 특성은 하기 표 1과 같다.

신규 미생물의 미생물학적 특성

미생물학적 특성	시험결과
그람염색	음성
균의 형태	간균
균의 크기	(1.2-1.5)×(0.4-0.5μm)
운동성	양성
편모존재여부	없음
집락색	밝은 노랑색
산소요구성	호기성
catalase생성여부	양성
oxidase생성여부	양성
질산염 환원성	양성
chitin, gelatin, casein, starch분해	양성

이러한 특성은 세균분류의 기준서인 버지스 매뉴얼(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology pp. 2010-2136, 1989, Williams Wilkins, Baltimore)에 명시되어 있는 특성들과 비교하여 사이토파가(Cytophaga)속 세균으로 분류되었으나, 기지의 미생물과 똑같은 특성을 보이지 않아 사이토파가(Cytophaga)속 HJ 균주로 명명하고, 2000년 5월 1일 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물 보존센터(KCCM)에 수탁번호_KFCC-11164로 기탁하였다.

균주의 배양

분리한 균주를 아래 종배양배지 50ml에 접종하여 20℃, 220rpm에서 24시간 배양하여 종배양액을 얻었다. 키티나아제 생산을 위한 본 배양에는 HJ 배지에 0.5% 농도가 되도록 콜로이달 키틴(colloidal chitin)을 첨가하고, 종배양액 50ml를 본 배양배지 1000ml에 접종하고 20℃, 220rpm에서 30시간 동안 배양한다(도 1 참조).

배지조성

종배양배지로 HJ 배지는 0.05% MgSO_4·7H₂O, 0.03% KH₂PO₄, 0.07% K₂HPO₄, 10^-5% FeSO_4·7H₂O, 10^-6% ZnSO_4·7H₂O, 10^-6% MnCl_2·4H₂O, 1.5% NaCl, 0.5% Yeast extract, 0.5% peptone, 0.2% glucose, pH 7.0으로 구성된다.

본배양배지는 0.05% MgSO_4·7H₂O, 0.03% KH₂PO₄, 0.07% K₂HPO₄, 10^-5% FeSO_4·7H₂O, 10^-6% ZnSO_4·7H₂O, 10^-6% MnCl_2·4H₂O, 1.5% NaCl, 0.5% Yeast extract, 0.5% peptone, 0.2% glucose, pH 7.0으로 구성된 HJ 배지에 콜로이달 키틴(colloidal chitin)을 0.5% 농도가 되도록 첨가하여 제조한다.

실시예 1. 키티나아제의 제조

본 배양액 1000mL을 원심분리(12000xg)하여 상등액을 얻는다. 상등액으로부터 30-60% 포화 암모늄설페이트를 이용하여 분별침전물을 얻고(약 200mg), DEAE-Biogel A, Octyl-sepharose CL-4B, DEAE-Biogel A 칼럼조작으로 효소단백질(약 40mg)을 분리정제한다. 분리된 단백질의 크기는 SDS-PAGE실험결과 도 2에서 보는 바와 같이 59.4 KDa이다.

키티나아제의 키틴 분해 특성

분리된 키티나아제는 pH 4.0-11 와 50 ℃이하에서 안정하다. 최적 pH는 4이고, 최적온도는 50℃이다(도 3, 도 4 참조).

분리된 키티나아제의 기질 특이성

분리된 키티나아제는 키틴을 가장 잘 분해하고, 7-8% 아세틸화된 키토산은 잘 분해하지 못한다(도 5 참조).

실시예 2. 키티나아제를 이용한 키틴올리고당의 제조

colloidal chitin이 0.09% 농도로 첨가된 10mM potassium phosphate 완충액 (pH 7.0) 1mL에 분리된 키티나아제 18mU를 가하여 20℃에서 30분 내지 24시간 반응시켜 반응액을 탄수화물 분석 컬럼(carbohydrate analysis column, Waters Co.)이 장착된 HPLC로 72% 아세토니트릴(acetonitrile): 28% H₂O 용매로 분리하여 반응생성물을 분자량의 크기에 따라 분획한다.

도 6에서 보는 바와 같이, 30분과 24시간 반응 모두에서 이량체인 oligomer가 단량체 보다 2.5배-1.8배 생성되어 기존의 발명들과 비교할 때 단량체의 생성이 감소되고 최종 수득되는 키틴올리고당 중에서 이량체가 대부분을 차지하고 있음을 볼 수 있다.

이상 설명하고 실시예를 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에서 사이토파가속 HJ 균주를 HJ배지에서 종배양하고, HJ 배지에 콜로이달 키틴을 0.5% 농도가 되도록 첨가한 본배양배지에서 배양하여 배양액으로부터 제조된 키티나아제는 이량체인 N-아세틸 키토바이오스를 주로 생성하는 특성을 나타내며, 단량체의 생성율이 낮기 때문에 키틴 올리고당을 제조하는데 유용하게 이용할 수 있다.

Claims

키티나아제를 생산하는 사이토파가(Cytophaga)속 HJ 균주(KFCC-11164).
사이토파가(Cytophaga)속 HJ 균주로부터 유래한 키틴나아제를 이용한 키틴 올리고당의 제조방법.