KR100887682B1 - 한국산 미역귀 유래의 푸코이단 분해능을 보유한 신규한스핑고모나스속 균주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 갈조류 유래의 푸코이단을 푸코 올리고당으로 분해할 수 있는 효소를 보유한 스핑고모나스(Sphingomonas) 속 미생물, 상기 스핑고모나스 속 미생물을 푸코이단과 펩톤을 포함한 배지에서 pH를 5.0 내지 10.0으로 하고 염 농도를 0 내지 3%로 한 조건에서 배양하는 상기 스핑고모나스 속 미생물의 배양방법 및 상기 스핑고모나스 속 미생물과 푸코이단을 접하게 하여 푸코이단을 푸코 올리고당으로 분해하는 푸코 올리고당의 제조방법에 관한 것이다. 푸코 올리고당은 푸코이단 보다 더욱 탁월한 항혈전, 항암 및 항바이러스 효능을 발휘한다.

푸코이단, 푸코 올리고당, 스핑고모나스 속 미생물

Description

한국산 미역귀 유래의 푸코이단 분해능을 보유한 신규한 스핑고모나스속 균주 {Novel Spingomonas sp. Strain Capable of Degrading Fucoidan of Korean Undaria Pinatifida Sporophyll}

도 1은 여러 푸코이단 분해균주의 푸코이단 분해능을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 푸코이단 분해균주 PF-1을 배양한 후 배양 여액과 균주 각각의 푸코이단 분해능을 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 푸코이단 분해균주 PF-1에 의한 미역귀 유래 푸코이단의 분해능을 HPLC로 분석한 결과를 나타낸 것이다[(A): 미역귀의 푸코이단, (B): 미역귀의 푸코이단과 푸코이단 분해균주 PF-1의 반응물].

도 4는 본 발명의 푸코이단 분해균주 PF-1에 의한 다시마 유래 푸코이단의 분해능을 HPLC로 분석한 결과를 나타낸 것이다[(A): 다시마의 푸코이단과 푸코이단 분해균주 PF-1의 반응물, (B): 다시마의 푸코이단].

도 5는 본 발명의 푸코이단 분해균주 PF-1에 의한 푸코이단 분해 산물을 TLC로 분석한 결과를 나타낸 것이다(A: 표준물질, B: L-푸코오스, C: 푸코이단, D: 푸코이단 분해효소 E: 푸코이단과 푸코이단 분해균주 PF-1의 반응물).

도 6은 본 발명의 푸코이단 분해균주 PF-1에 의한 푸코이단 분해 산물을 HPLC로 분석한 결과를 나타낸 것이다(A: 푸코이단, B: 푸코이단과 푸코이단 분해균 주 PF-1의 반응물).

도 7은 Bio-Gel P-4 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 각각 분자량이 다른 표준물질의 용출 위치를 나타낸 것이다.

도 8은 본 발명의 푸코이단 분해균주 PF-1에 의한 푸코이단 분해 산물을 Bio-Gel P-4 칼럼크로마토그래피로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 9는 배지 조성 별로 본 발명에 따른 푸코이단 분해균주 PF-1의 성장률을 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 10은 0.2% 푸코이단 배지에서 본 발명에 따른 푸코이단 분해균주 PF-1과 대장균의 성장률을 비교한 결과를 나타낸 것이다.

도 11은 본 발명에 따른 푸코이단 분해균주 PF-1의 pH 변화에 따른 성장률을 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 12는 본 발명에 따른 푸코이단 분해균주 PF-1의 계통분석도를 나타낸 것이다.

본 발명은 푸코이단 분해능을 보유한 신규한 스핑고모나스속 균주에 관한 것으로, 보다 자세하게는 갈조류 유래의 푸코이단을 푸코 올리고당으로 분해할 수 있는 효소를 보유한 스핑고모나스(Sphingomonas) 속 미생물, 상기 스핑고모나스 속 미생물을 푸코이단과 펩톤을 포함한 배지에서 pH를 5.0 내지 10.0으로 하고 염 농 도를 0 내지 3%로 한 조건에서 배양하는 상기 스핑고모나스 속 미생물의 배양방법 및 상기 스핑고모나스 속 미생물과 푸코이단을 접하게 하여 푸코이단을 푸코 올리고당으로 분해하는 푸코 올리고당의 제조방법에 관한 것이다.

다시마, 미역, 톳 같은 갈조류에는 중성 다당인 라미나란 (laminaran)과 황산기를 함유한 산성 다당이 다량 함유되어 있는데 대표적인 함황 산성 다당이 푸코이단이다. 푸코이단은 L-푸코오스에 에스테르화 황산을 주성분으로 하며 소량의 D-자일리톨, D-갈락토오스 및 우론산 등을 함유한 함황 헤테로 (hetero)형 산성 다당으로, 일반적으로 분자량이 20만 달톤이 넘는 거대분자로서, 푸코이단의 생리활성을 나타내는 주요성분은 주로 황산기인 것으로 알려져 있다.

푸코이단은 기타 식이 섬유 다당인 알긴산, 가라기난 (carrageenan), 라미나란 등과는 구조 및 생리적 작용이 다르고, 오히려 동물의 혈액응고 저해능이 있는 산성 다당인 헤파린과 구조 및 작용이 매우 유사하고 헤파린과 비교시 약 40% 정도의 항혈액응고 및 혈액정화 활성을 나타낸다 (Chizhov 등, Chordajlum Carbohydrates Res, 1999, vol.319, pp.108-119). 또한, 항염증(antiinflammatory), 항암(antitumor), 항바이러스(antiviral) 및 면역억제 (immunosuppressive) 등의 탁월한 생리활성능이 밝혀지고 있다 (McClure 등, AIDA Res. Hum. Retroviruses, 1992, vol.8, pp.19-26; Nagumo와 Nishino, In Polysaccharides in Medicinal Applications, 1997, pp.545-574; Patankar 등, J. Biol. Chemi. 1993, vol.268, pp.21770-21776).

푸코이단의 항암활성 기작은 종양세포의 표면전하에 작용하여 음전하를 띄게 하여 전이를 억제하거나 숙주의 면역 방어 기능을 활성화시킴으로써 항암활성을 나타낸다 (Yamamoto 등, JPN. J. Exp. Med. 1981, vol.51, pp.187-189). 또한, 황산기를 갖는 푸코이단은 항 HIV 작용도 가지고 있다 (Schaeffer 와 Krylov, Ecotoxicolgy Environmental Safety, 2000, vol.45, pp.208-227). 이러한 생리적 기능성 이외에도 푸코이단은 점성이 낮고 우수한 용해성으로 수용성 식이섬유 소재로서 응용 가능성이 매우 높다.

한편 항암활성, 항 HIV, 항혈액응고 작용 등은 모두 거대 분자량의 상태보다 작은 분자량 (올리고당) 상태에서 활성이 증가한다고 보고되었다 (Schaeffer와 Krylov, Ecotoxicolgy Environmental Safety, 2000, vol.45, pp.208-227; Koyanagi 등, Biochemicl Pharmacology, 2003, vol.65, pp.173-179; Nishino 등, Phytochemistry, 1991, vol.30, pp.535-539).

푸코이단은 일반적으로 20만 달톤이 넘는 거대 분자로서 이를 분해하여 작은 분자량으로 만드는 분해능을 가진 효소들이 몇몇 해양 세균류에서 알려져 있다. 이런 효소들은 푸코이단 사슬 내부의 글리코시드 결합에 분열을 일으켜 분자량을 빠르게 감소시키거나, 말단부터 끊어 올리고당을 만들어 천천히 분자량을 감소시킬 수 있다. 푸코이단 분해 효소는 점성의 감소, 환원당의 증가, 알부민의 침전, TLC 분석 또는 크기 배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography)의 방법에 의해 확인할 수 있다.

그러나 푸코이단 분해 효소 정제의 어려움 중 하나는 효소의 분해 기작에 관하여 알려진 것이 없고, 푸코이단 분해를 연구할 때 푸코이단의 원산지가 다르면 푸코이단의 구조가 다르기 때문에 조사 결과를 비교하기 어렵다는 것이다.

푸코이단을 분해하는 효소들은 바다의 연체동물이나 박테리아에서 주로 보고되어 있다. 슈도모나스 아틀란티카 (Pseudomonas atlantica)와 슈도모나스 가라기노바 (Pseudomonas carrageenova)라는 두 해양 미생물에서 푸코이단을 분해하여 환원당을 생산하는 능력이 처음 보고되었다 (Yaphe and Morgan, Nature, 1959, vol.463, pp.761-762). 그 후 비브리오 속 (Vibrio sp.)과 슈도알테로모나스 시트레아 (Pseudoalteromonas citrea)에서 분해효소가 발견되었다 (Furukawa등, Nippon Suisan Gakk. 1992, vol.58, pp.1499-1503; Furukawa 등, Biosci. Biotech. Biochem. 1992, vol.56, pp.1829-1834; Bakunina 등, Microbiology, 2002, vol.71, pp.41-47). 최근에 푸코이단 분해능을 가진 미생물의 연구가 활발히 진행되고 있으며, 플라보박테리아세애 (Flavobacteriaceae)등 해양 미생물들이 발견되고 있다 (Takeshi 등, Marine Biotechnology, 2004, vol.6, pp.335-346; Urvantseva 등, Biochemistry and Microbiology, 2006, vol.42, pp.484-491; Descamps 등, Marine Biotechnology, 2005, vol.7, pp.1-13). 이러한 해양미생물 뿐만 아니라 가리비나 전복 종류의 H. 루페센스 (H. rufescens), H. 코루가타 (H. corrugata), H. 지잔테아 (H. gigantea), P. 예소엔시스 (P. yessoensis), P. 막시무스(P. maximus)와 같은 연체동물에서도 푸코이단 분해능이 확인되었다 (Thanassi와 Nakada, Arch. Biochem. Biophys. 1967, vol.118, pp.172-177; Tanaka와 Sorai, FEBS Letter, 1970, vol.9, pp.45-48; Kitamura 등, Biosci. Biotech. Biochem. 1992, vol.56, pp.490-494).

이와 같이 푸코이단을 분해하는 미생물들은 일부 보고되어 있으나, 특히 한국산 미역귀에서 추출한 푸코이단을 분해할 수 있는 한국 해양수 유래 미생물은 개시되지 않았으며, 세계적으로도 상업적으로 유용한 푸코이단 분해효소 제품은 없다.

이에, 본 발명자들은 한국산 미역귀에서 추출한 푸코이단을 분해할 수 있는 한국 해양수 유래 미생물을 분리하고자 노력한 결과, 한국 해양수로부터 미역 및 다시마와 같은 갈조류의 푸코이단을 분해하는 분해균주를 동정하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 한 관점으로서, 갈조류 유래의 푸코이단을 푸코 올리고당으로 분해할 수 있는 효소를 보유한 스핑고모나스(Sphingomonas) 속 미생물을 제공한다.

다른 관점으로서, 상기 스핑고모나스 속 미생물을 푸코이단과 펩톤을 포함한 배지에서 pH를 5.0 내지 10.0으로 하고 염 농도를 0 내지 3%로 한 조건에서 배양하는 상기 스핑고모나스 속 미생물의 증식방법을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 상기 스핑고모나스 속 미생물과 푸코이단을 접하게 하여 푸코이단을 푸코 올리고당으로 분해하는 푸코 올리고당의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 갈조류 유래의 푸코이단을 푸코 올리고당으로 분해하는 효소를 보유한 스핑고모나스(Sphingomonas) 속 미생물에 관한 것이다.

"갈조류(brown algae)"는 엽록소 이외의 갈조소(갈색)를 보유하여 갈색을 띠는 조류의 일종으로서 예를 들면 미역, 다시마, 톳, 모조반 등이 포함된다.

갈조류에는 푸코이단이 풍부하게 함유되어 있는데, "푸코이단"은 황산기를 가진 수용성 다당으로서, 글루코오스, 갈락토오스, 푸코오스, 만노오스, 람노오스, 자일로스, 글루쿠론산 등을 포함하며, 분자량이 매우 다양하고 복잡한 형태의 헤테로 다당체이다. 푸코이단은 항혈액 응고작용, 항스트레스, 콜레스테롤 저하작용, 항종양 작용 등 다양한 생리적 기능을 가지고 있다.

푸코이단의 분해 산물인 "푸코 올리고당"은 항혈액 응고작용, 항스트레스, 콜레스테롤 저하작용, 항종양 작용이 푸코이단 보다 우수한 것으로 알려져 있다. 올리고당은 일반적으로 수 개(2-10개)의 단당으로 이루어진다.

본 발명자들은 한국 해수로부터 갈조류의 푸코이단을 분해하는 효소를 보유한 스핑고모나스(Sphingomonas) 속 미생물을 분리하였다. 상기 균주를 API 20NE kit를 사용하여 생화학적 특성을 조사한 결과, 막대형이고 그람 음성균으로 확인되었으며, 콜로니는 약간 갈색을 띠었고, 옥시다제(oxidase)는 음성, 카탈라제(catalase) 검사는 양성으로 나타났다.

또한, 계통분석을 위하여 여러 미생물의 16s rDNA 염기서열과 상동성을 비교한 결과, 스핑고모나스 속에 속하는 균주로서, 특히 스핑고모나스 파우시모빌리스(Sphingomonas paucimobilis)와 99%의 높은 상동성을 보여주었다.

이에 따라 본 발명자들에 의해 한국의 해수로부터 분리되고, 갈조류의 푸코이단을 푸코 올리고당으로 분해할 수 있는 효소를 보유한 균주는 스핑고모나스 파우시모빌리스에 속하는 신균주로 분류하여 "스핑고모나스 파우시모빌리스 PF-1"로 명명하고 2007년 5월 17일자로 한국생명공학연구원내 생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 기탁하여 기탁번호 KCTC 11130BP를 부여받았다.

본 발명의 푸코이단 분해균주가 보유한 푸코이단 분해 효소는 푸코이단 분해균주에 부착된 상태에서 푸코이단을 푸코 올리고당으로 분해할 수 있다. 따라서, 푸코 올리고당을 높은 수율로 얻고자 한다면 본 발명의 푸코이단 분해균주를 높은 수율로 증식시키는 것이 선행되어야 한다.

이를 위하여 본 발명의 푸코이단 분해균주는 푸코이단과 펩톤을 포함한 배지에서 배양하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 푸코이단 분해균주는 염농도를 0 내지 0.3%로 하여 배양한다. 아울러, 본 발명의 푸코이단 분해균주는 pH를 5.0 내지 10.0, 바람직하게는 pH를 6.0 내지 9.0으로 하여 배양한다.

한편, 본 발명의 또 다른 관점은 본 발명의 푸코이단 분해균주와 푸코이단을 접하게 하여 상기 푸코이단 분해균주가 보유한 푸코이단 분해 효소로 하여금 푸코이단을 분해하도록 하여 푸코 올리고당을 생산하는 방법에 관한 것이다. 푸코이단 분해 균주와 푸코이단이 접한다는 것은 예를 들면 이들을 동일한 시험관 내에 위치시킨다거나, 푸코이단이 함유된 배지에서 푸코이단 분해 균주를 배양하는 것을 포함한다.

이러한 푸코 올리고당은 푸코이단 보다 항혈액 응고작용, 항스트레스, 콜레스테롤 저하작용, 항종양 작용이 우수하므로 단독으로 또는 약제학적으로 허용된 담체와 조합되어 동맥경화, 혈전증, 심장질환, 고혈압 등의 심혈관계 질환, 여러 종양의 예방과 치료 및 스트레스 완화에 이용될 수 있다.

본 발명의 푸코 올리고당을 함유하는 약제학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 멸균 주사용액, 좌제 및 경피 투여용 제제로 제형화하여 사용될 수 있다. 푸코 올리고당을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제형화한다.

또한, 푸코 올리고당은 각종 심혈관계 질환과 종양의 완화 및 스트레스의 해소를 돕는 것을 목적으로 하는 식품 (건강기능식품)에 첨가될 수도 있다. 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 합성 풍미제 및 천연 풍미 제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 건강기능식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 푸코이단 분해균의 선별 및 푸코이단 분해능 측정

실시예 1-1: 푸코이단 분해균의 분리

해조류 유래의 푸코이단에 대해 분해능을 가진 균주를 탐색하기 위해 국내 제주도 해안일대에서 해수 총 72 시료를 채취하였다. 채취한 시료에서 푸코이단 분해 균주를 분리 · 배양하기 위해 사용된 배지의 조성은 다음과 같다. 0.2㎛ 셀룰로오스 필터로 여과된 해수 1 리터당 0.2%(w/v) 푸코이단, 10g 펩톤, 1g 효모 추출물, 1mM Fe·HNO₃(Kanto Chemical, Japan), 0.0016g 암모늄 니트레이트, 0.008g 디소듐 포스페이트를 첨가한 후 pH 7.8로 맞추었다. 이를 멸균한 다음 각 해수 시료를 배양액의 10%(v/v)가 되도록 첨가한 후 180rpm으로 25℃에서 3일 동안 배양하 였다. 상기 배양액을 10g 펩톤, 0.005g 암모늄 니트레이트, 1mM Fe·HNO₃, 10g 푸코이단 및 15g 한천을 첨가한 한천 평판배지에 각각 200㎕씩 도말한 후 30℃에서 4~5일 동안 배양하여 성장이 우수한 185개의 균주를 분리하였다. 185개 균주를 한천을 제외한 액체 배양액에서 120rpm으로 25℃에서 3일 동안 배양한 후 이 배양액을 100℃에서 10분 동안 처리하여 균의 증식 및 효소활성을 저지하고 푸코이단 분해능을 측정하였다. 분해능의 측정은 Somogyi-Nelson 법 (Chaplin과 Kennedy, In Carbohydrate Analysis, 3-4, 1994)으로 후술되는 실시예 1-2와 같이 실시하여 환원당을 측정하였다.

실시예 1-2: 푸코이단 분해균의 푸코이단 분해능 측정

0.2㎛ 셀룰로오스 필터로 여과된 해수 1ℓ당 0.3%(w/v) 푸코이단, 10g 펩톤, 1g 효모 추출물, 0.005g 암모늄 니트레이트 및 1mM 제1철 용액 (pH 7.8)을 첨가하였다. 이 배지를 멸균한 후 앞서 분리한 185개의 균주를 각각 접종하였다. 3 일간 배양한 후 1㎖의 배양액을 취하여 원심분리 후 100℃로 가열하여 반응을 정지시켰다. 200㎕의 배양액에 1㎖의 Somogyi 시약을 첨가하고 100℃에서 5분 동안 가열한 후 실온으로 냉각하고 1㎖의 Nelson 시약을 첨가하였다. 이를 12,000rpm으로 10초 동안 원심분리한 후 분광광도계로 510nm에서 흡광도를 측정하여 이를 효소활성으로 환산하였으며 표준당으로는 L-푸코오스 용액을 사용하였다. 상기와 같은 방법으로 최초 185 분리균들로부터 푸코이단 분해능이 유의한 20여 균주를 1차 선 별하였다.

실시예 1-3: 푸코이단 분해균의 최종 선별

푸코이단 분해능이 있는 푸코이단 분해균주 PF-1을 2ℓ의 최소배지 (0.2% 푸코이단 + 2% 펩톤)에서 120rpm으로 30℃에서 4일 동안 배양한 후 원심분리하여 상등액과 침전물을 분리하였다. 분리한 상등액은 UF(Ultra filtration, MWCO 10,000)로 농축하였고, 온전한 세포(Intact cell)를 사용하였다. 상등액과 침전물을 각각 0.2% 푸코이단 50㎖ (0.01% 소듐 아지화물 함유) 용액에 넣고 진탕수조에서 120rpm으로 30℃에서 96시간 동안 반응시켜 Somogyi-Nelson 방법을 이용하여 환원당을 측정하였다. 그 결과에 의해 원심분리한 온전한 세포를 분해 효소액으로 사용하였다.

그 결과, 푸코이단 분해에 유의성이 있는 것으로 판단된 20개의 1차 분리균주의 환원당을 측정하여 푸코이단 분해능이 가장 우수한 1개의 균주를 최종 선별하였다(도 1). 일례로서 분리균 14-6-3과 16-1-1은 분리 과정에서 임의로 붙여진 분해균의 이름이며, 환원당 측정결과 PF-1은 14-6-3과 16-1-1과 비교해 보았을 때, PF-1이 다른 두 종류의 분해균에 비하여 약 4배 정도 환원당 값이 높게 나타났으며 푸코이단 분해능이 가장 우수한 이 균주를 선별하였다. 상기 균주는 2007년 5월 17일자로 한국생명공학연구원내 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 11130BP를 부여받았다.

실시예 2: 환원당 정량에 의한 푸코이단 분해능 측정

푸코이단 분해능이 있는 분해균주 PF-1을 2ℓ의 최소배지에서 배양하였다. 배양물을 원심분리하여 상등액과 침전물인 PF-1 세포 자체를 따로 모아서 0.2% 푸코이단과 반응시킨 후 Somogyi-Nelson 방법을 이용하여 환원당을 측정하였다(도 2). 측정 결과 상등액에서는 환원당 값이 거의 나오지 않았지만, 침전물인 PF-1 세포를 현탁시킨 용액에서는 시간이 지나면서 환원당 값이 증가하였다. 이는 푸코이단을 분해하는 PF-1의 효소는 PF-1 세포 표면에서 떨어져 나와 푸코이단과 반응하는 것이 아니라, PF-1 세포 표면에 붙어 있는 상태에서 푸코이단과 반응하는 것을 알 수 있었다.

실시예 3: 푸코이단 분해균주 PF-1에 의한 갈조류 유래 푸코이단 분해능 측정

실시예 3-1: 푸코이단 분해균주 PF-1에 의한 미역귀 유래 푸코이단 분해능 측정

PF-1 균주의 미역귀 유래 푸코이단 분해능을 조사하기 위해 푸코이단 분해균주 PF-1을 0.2% 펩톤과 0.2% 푸코이단이 함유된 배지 2ℓ에서 3 일간 배양한 후 원심분리하여 상등액은 따로 모으고 침전물을 모아서 푸코이단 분해 효소액으로 이용하였다. 상기 푸코이단 분해 효소액과 0.5% 푸코이단을 진탕 배양기에서 반응(4일, 30℃, 120rpm)시킨 후 그 분해 여부를 HPLC로 분석하였다(도 3). HPLC 분석을 위해 (A) 1%의 푸코이단 용액을 10㎕ 주입하였고, (B) 균주에 의한 분해 산물 10㎕ 를 Shodex Ohpak SB-805HQ (8.0 x 300mm, Showa, Japan) 칼럼에 주입하고, 분 당 0.8㎖의 속도로 물로 용출시키면서 ELSD (Evaporative light scattering detector, Alltech)로 검출하였다. 도 3의 (A)의 1번 피크는 대조군으로서 분해되지 않은 미역귀의 푸코이단이고, (B)의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8번 피크는 푸코이단 분해균주 PF-1에 의해 분해되어 생성된 미역귀 유래 푸코-올리고당이다.

실시예 3-2: 푸코이단 분해균주 PF-1에 의한 다시마 유래 푸코이단 분해능 측정

PF-1 균주의 다시마 유래 푸코이단 분해능을 조사하기 위해 다시마 (Fucus versiculosus)에서 추출, 정제하여 시약으로 판매하고 있는 고순도의 푸코이단 (Sigma사, 미국)을 구입하여 실시예 3-1에서와 같이 분해 효소액과 함께 배양한 후 그 분해 여부를 HPLC로 분석하였다(도 4). HPLC 분석을 위해 (A) 균주에 의한 분해산물 10㎕를 주입하였고, (B) 1%의 푸코이단 용액을 10㎕ Shodex OHpak SB-805HQ (8.0 x 300mm, Showa, Japan) 컬럼에 주입하고, 분 당 0.8㎖의 속도로 물로 용출시키면서 ELSD (Evaporative light scattering detector, Alltech)로 검출하였다. 도 4의 (A)의 2, 3, 4, 5번 피크는 푸코이단 분해균주 PF-1에 의해 분해되어 생성된 다시마 유래 푸코-올리고당이며, (B)의 1번 피크는 대조군으로서 효소 분해되지 않은 푸코이단이다.

실시예 4: 푸코이단 분해 산물의 분석

실시예 4-1: TLC를 이용한 PF-1 푸코이단 분해 산물의 분석

푸코이단 분해균주 PF-1을 0.2% 펩톤 및 0.2% 푸코이단을 함유한 배지 2ℓ에서 3 일간 배양한 후 원심분리하여 침전물을 모아서 푸코이단 분해 효소액으로 이용하였다. 50mM 소듐 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 35㎖에 1% 푸코이단을 녹여 푸코이단 분해 효소액 37㎖와 혼합한 후 진탕배양기에서 반응(4일, 300℃, 120rpm)시킨 것을 TLC(Thin-layer chromatography)를 이용하여 분석하였다. 글루코오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스, L-푸코스(Sigma Chem. Co. USA), 추출 푸코이단을 표준물질로 사용하였으며, 전개판으로는 머크사의 Kieselgel 60 판을 사용하였고, 전개용매로는 n-부탄올, 아세트산, 물을 2:1:1의 부피로 섞어 사용하였다. 발색시약으로는 알코올과 황산을 7:3의 부피로 섞어 사용하였다.

TLC (Thin-layer chromatography)를 이용하여 분석한 결과는 도 5와 같다. A는 표준물질을 사용한 것이고, B는 L-푸코오스 (Sigma), C는 본 발명자가 미역귀에서 추출한 푸코이단이며, D는 푸코이단 분해효소만 사용한 것이고, E는 푸코이단 분해효소액과 푸코이단을 반응시킨 것이다. C와 D에는 나타나지 않은 두 개의 점이 E에서 나타났다. 이는 PF-1 푸코이단 분해 효소액이 푸코이단을 가수분해하여 말토트리오스와 말토테트라로스의 위치에 두 개의 점을 형성하는 것으로 해석될 수 있다. 또한, TLC 분석결과 본 발명에 따른 푸코이단 분해균주 PF-1은 푸코오스 단량체는 만들지 않고 푸코 올리고당만을 생성하는 효소 활성을 가지는 균주로 판명 되었다.

실시예 4-2: HPLC를 이용한 PF-1 푸코이단 분해 산물의 분석

HPLC(Dionex)를 이용한 푸코 올리고당 측정은 Shodex OHpak SB-805HQ (MW: ~4 x 10⁶Da, 8.0 x 300mm, Showa, Japan)과 ELSD (Evaporative light scattering detector, Alltech)를 사용하여 확인하였다. 용출 용매는 증류수이고 유속은 0.8㎖/분으로 하였으며, 0.5% 시료 (PF-1 효소 반응물, 75% 에탄올, 탈염처리) 용액을 10㎕ 주입하여 분석하였다. 말토-올리고머 (Sigma Chem. Co., USA)의 분자량을 0.5%의 504.4, 666.6, 828.7, 990.88, 1153Da으로 해서 10㎕씩 주입하여 표준용액으로 사용하였다(도 6). A는 1%의 푸코이단을 HPLC로 분석하였고, B는 효소 반응 후 75% 알코올을 이용하여 미반응 푸코이단을 침전시킨 후 분석하였다. B의 피크 1은 분해되지 않은 푸코이단 (RT: 8.2)이며, 피크 2에서 피크 5까지는 PF-1 푸코이단 분해 효소액에 의해 분해된 산물 (RT: 1; 7.44, 2; 14.09, 3; 15.73, 4; 16.31, 5; 17.83, 6; 19.06)로 규명되었다.

실시예 4-3: Bio Gel P-4 칼럼 크로마토그래피를 이용한 PF-1 푸코이단 분해 산물의 분석

PF-1 푸코이단 분해 효소액에 의해 푸코이단 분해 후 생성된 올리고당의 정제 및 성분 당 분석을 통한 푸코 올리고당의 확인을 위해 Bio-Gel P-4 칼럼 크로마 토그래피를 이용하였다. 효소 분해로 생성된 반응물을 75% 알코올로 침전시킨 후 12,000rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상등액을 농축하였다. 농축용액 중 1㎖를 Bio-Gel P-4 칼럼에 넣어 용출시켰다. 시료의 용출은 50mM 소듐 니트레이트를 사용하였고, 유속은 분당 0.3㎖이다. 표준물질로는 L-푸코오스, 글루코오스, 말토스, 말토트리오스, 말토펜토오스, 말토헵타토오스를 사용하였다. 용출액을 분획물 수집기(fraction collector)로 1㎖씩 모은 후 페놀-황산법 (Knutson and Jeanes, Anal. Bio. Chem., 24, 470, 1968)으로 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 도 7은 Bio-Gel P-4 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 표준물질을 측정한 것으로서, 1: 말토헵타오스, 2: 말토펜타오스, 3: 말토트리오스, 4: 말토오스; 5: 글루코오스, 6: L-푸코오스를 각각 나타내며, 도 8은 PF-1 푸코이단 분해 효소액을 이용하여 푸코이단을 분해한 시료를 측정한 것이다. 도 8의 피크-1은 분해되지 않은 푸코이단 잔여물로 맨 앞에 위치하며, 피크-2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 은 PF-1 푸코이단 분해 효소액에 의해 분해된 푸코이단 분해 산물이다. 도 8에서 나타낸 피크별 분자량 및 성분당 분석결과는 표 1과 같다.

Bio-Gel P-4 칼럼 크로마토그래피의 피크 별 분자량 및 성분당 조성 분석 결과

피크 번호	분자량(Da)	성분당 (pmol)
2-1	3749.08	푸코오스 (1.03) 갈락토오스 (1.82)
2-2	2696.91	푸코오스 (0.76) 갈락토오스 (0.83) 만노오스 (0.5)
2-3	2569.37	푸코오스 (1.16) 갈락토오스 (1.95) 만노오스 (0.68)
3	2122.99	푸코오스 (0.72) 갈락토오스 (1.05) 만노오스 (1.19)
4	2059.23	푸코오스 (0.81) 갈락토오스 (1.03) 만노오스 (1.16)
5	1644.74	푸코오스 (0.62) 갈락토오스 (1.09) 만노오스 (0.44)
6	1398.67	푸코오스 (0.3) 갈락토오스 (0.32) 만노오스 (0.12)
7	528.80	푸코오스 (1.23) 갈락토오스 (0.12) 만노오스 (0.35)
8	305.61	푸코오스 (3.9) 갈락토오스 (0.17)

실시예 5: 푸코이단 분해균의 생화학적 특성 조사

선별된 푸코이단 분해균의 생화학적 특성을 관찰하기 위하여 LB 액체 배지를 이용하여 30℃에서 pH 7.8로 3일 동안 배양한 후 그람염색을 실시하였고, NaCl 농도별, pH 별로 푸코이단 분해균의 성장을 측정하였다.

또한, API 20NE kit을 사용하여 생화학적 특성을 조사하였고, 그 결과는 표 2와 표 3에 나타내었다. 결과를 보면 그람염색은 음성이었으며, 한천 배지에 균을 도말한 후 3일간 배양하여 균 집락의 색을 관찰시 약간 갈색을 띄었다. 옥시다제(Oxidase) 검사는 음성, 카탈라제(catalase) 검사는 양성으로 나타났다. NaCl의 농도에 따라 균의 성장을 측정해보았을 때 0%와 3%에서 가장 잘 성장하는 것으로 나타났는데, 이는 해양환경에서 분리되었기에 해양환경과 비슷한 염농도에서 균이 잘 성장하는 것으로 보인다. 따라서 푸코이단 분해균주 PF-1은 염이 있어도 견뎌내며 자라는 내염성균으로 판단된다.

푸코이단 분해균주 PF-1의 특성

시험	결과	시험	결과
세포 형태	막대형	1% NaCl	+++
그람 염색	-	1% NaCl	+++
콜로니 색상	희끗한 갈색	1% NaCl	++
옥시다제	-	1% NaCl	-
카탈라제	+	1% NaCl	-
		1% NaCl	-
0% NaCl에서 성장	+++	새로운 브로스	+++
0.5% NaCl에서 성장	+++	푸코이단	+

기호: +++ > ++ > +, 양성; -, 음성

실시예 6: 푸코이단 분해균주 PF-1의 배양 환경에 따른 성장률 측정

실시예 6-1: 푸코이단 분해균주 PF-1의 배양 배지 조성에 따른 성장률 측정

푸코이단 분해균의 배지 성분에 따른 성장을 알아보기 위하여 0.2% 푸코이단 및 2% 펩톤과 0.2% 푸코이단만 들어있는 배지를 각각 만들어 각 배지에서의 성장을 측정하였다. 구체적으로 설명하면, NSW 배지 (0.2㎛ 셀룰로오스 필터로 여과한 해수 1리터 당 0.2%(w/v) 푸코이단, 10g 펩톤, 1g 효모 추출물, 1mM 제1철 용액, 0.0016g 암모늄 니트레이트, 0.008g 디소듐 포스페이트를 첨가, pH 7.8로 보정)와 0.2% 푸코이단 배지를 만들어 대조군으로 대장균을 사용하여 대장균과 푸코이단 분해균주 PF-1의 성장을 비교하였다. 푸코이단 분해능을 가진 PF-1의 성장곡선을 배지 조성별 (0.2% 푸코이단 +2% 펩톤, 0.2% 푸코이단)로 측정한 결과는 도 9와 같다. 탄소원과 질소원만 들어 있는 0.2% 푸코이단 + 2% 펩톤 배지에서 PF-1의 성장이 가장 높았다. 이 실시예에서는 푸코이단만을 분해하는지 정확히 알 수 없었기 때문에 2% 펩톤이 제외된 0.2% 푸코이단만 들어있는 배지를 만들어 성장을 측정한 결과 0.2% 푸코이단 + 2% 펩톤 배지보다는 낮은 성장을 보였다. 이는 푸코이단 분해균주 PF-1이 푸코이단을 분해하는 효소를 가지고 있어 푸코이단을 분해하여 분해물을 섭취하여 성장하는 것이다.

실시예 6-2: 푸코이단 분해균주 PF-1과 대조군인 대장균의 푸코이단 분해능 측정

또한, 푸코이단 분해균주 PF-1이 증식할 수 있는 0.2% 푸코이단 배지에서 대장균도 증식 가능한지를 관찰하였다(도 10). 푸코이단 분해균주 PF-1은 0.2% 푸코이단 배지에서 느리지만 푸코이단을 분해하여 성장에 필요한 탄소원과 질소원을 섭취하여 꾸준히 증식하는 반면에 대장균은 푸코이단을 분해할 수 있는 효소를 생성하지 못하여 증식하지 못하였다.

실시예 6-3: 푸코이단 분해균주 PF-1의 최적 pH 측정

푸코이단 분해능을 가진 균주 PF-1의 최적 pH를 알아보기 위하여 pH를 2.0 ~10.0까지 변화시키면서 PF-1의 증식을 측정한 결과 pH 6.0~9.0에서 높은 증식률을 나타냈으며, pH 5.0 이하 및 10.0 에서는 성장이 감소하는 것을 알 수 있었다(도 11). 이 결과를 토대로 본 발명에서 분리한 푸코이단 분해균주 PF-1은 pH에 대한 민감도가 그리 크지 않은 것으로 나타났다.

실시예 7: 16s rDNA 및 염기서열에 의한 푸코이단 분해균의 동정

실시예 7-1: DNA 분리 정제

푸코이단 분해균주 PF-1에서 DNA를 분리하기 위해 구아니딘 티오시아네이트/페놀/클로로포름 방법[32]를 사용하였다. 약 0.5㎖의 PF-1 배양액에 0.25㎖의 용액 (4M 구아니딘 티오시아네이트, 0.25M 소듐 시트레이트, 0.5% 사르코실)과 0.5㎖의 페놀-클로로포름(1:1)을 첨가하여 약 1시간 정도 혼합한 후 원심분리하여 상등액을 회수하여 DNA를 이소프로필알코올로 침전하였다. 회수된 침전물을 70% 알코올로 세척한 후 말려서 증류수에 녹여 PCR에 사용하였다.

실시예 7-2: PCR의 반응 조건

PCR 반응액에는 10mM Tris-HCl (pH 8.0), 50mM KCl, 1.5mM MgCl₂, 200μM dNTPs, 2.5 units Taq DNA 폴리머라제, 100 pmol 프라이머와 DNA 주형을 넣어 총 부피를 100㎕가 되도록 하였다. 각 시료는 증폭기에서 증폭 사이클을 시작하기 전에 94℃에서 5분간 DNA를 변성시킨 후 PCR을 실시하였으며, 45 사이클을 종료한 후 72℃에서 7분간 연장 반응시킨 다음 반응을 종료하였다. 각 사이클은 94℃ 1분, 35℃ 2분, 72℃ 2분으로 하였다.

실시예 7-3: 16s rDNA의 염기서열을 이용한 계통분석

결정된 염기서열(CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TACGGAGGGG GCTAGCGTTG TTCGGAATTA CTGGGCGTAA AGCGCACGTA GGCGGATTTG TAAGTCAGAG GTGAAAGCCT GGAGCTCAAC TCCAGAACTG CCTTTGAGAC TGCATCGCTT GAATCCAGGA GAGGTCAGTG GAANTCCGAG TGTAGAGGTG AAATTCGTAG ATATTCGGAA GAACACCAGT GGCGAAGGCG GCTGACTGGA CTGATATTGA CGCTGAGGTG CGAAAGCGTG GGGAGCAAAC AGGATTAGAT ACCCTGGTAG TCCACGCCGT AAACGATGA - 서열번호: 1)의 상동성 검사는 GenBank의 database에 등록된 정보를 대상으로 블라스트 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)으로 수행하였다. 계통분석은 DNAstar의 MegAlign 프로그램을 사용하여 결정하였다. GenBank에 등록된 다른 균주들의 16s rDNA 염기서열 정보와 MegAlign 프로그램을 이용하여 이웃 결합 방법(neighbor-joining method) (Saitou 와 Nei, Mol. Biol. 4:406-425, 1987)에 의해 염기 서열간의 계통수(phylogentic tree)를 얻었다.

PCR로 증폭된 16S rDNA를 이용하여 푸코이단 분해능을 가진 PF-1의 염기서열 분석은 다음과 같이 진행하였다. 먼저 국립 생명공학정보 센터(NCBI)의 블라스트 검색을 통해 유사도를 조사한 결과 스핑고모나스 파우시모빌리스(Sphingomonas paucimobilis)(AM 237363)와 99%의 높은 염기서열 상동성을 보여 상기의 생화학적 방법과 동일한 결과를 보여줌을 확인하였다. 결정된 염기서열과 유사한 유형의 균주들과의 유연관계를 조사한 결과는 도 12에 나타내었다.

본 발명의 푸코이단 분해균주는 갈조류의 푸코이단을 푸코 올리고당으로 분해하며, 상기 푸코 올리고당은 항혈액 응고작용, 항스트레스, 콜레스테롤 저하작용, 항종양 작용을 발휘하므로 다양한 약제에 활성성분으로서 이용할 수 있다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Novel Spingomonas sp. Strain Capable of Degrading Fucoidan of Koean Undaria Pinatifida Sporophyll <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 309 <212> DNA <213> Sphingomonas paucimobilis <400> 1 cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggg gctagcgttg ttcggaatta ctgggcgtaa 60 agcgcacgta ggcggatttg taagtcagag gtgaaagcct ggagctcaac tccagaactg 120 cctttgagac tgcatcgctt gaatccagga gaggtcagtg gaantccgag tgtagaggtg 180 aaattcgtag atattcggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctgactgga ctgatattga 240 cgctgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt 300 aaacgatga 309

Claims (5)

1. 갈조류 유래의 푸코이단을 푸코 올리고당으로 분해할 수 있는 효소를 보유한 기탁번호가 KCTC 11130BP인 스핑고모나스(Sphingomonas) 속 미생물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1항에 따른 스핑고모나스 속 미생물을 푸코이단과 펩톤을 포함한 배지에서 pH를 5.0 내지 10.0으로 하고 염 농도를 0 내지 3%로 한 조건에서 배양하는 상기 스핑고모나스 속 미생물의 배양방법.
5. 제 1항에 따른 스핑고모나스 속 미생물과 푸코이단을 접하게 하여 푸코이단을 푸코 올리고당으로 분해하는 푸코 올리고당의 제조방법.

Images