KR20030066799A - 아민 및 히드록시드의 효소적 탈보호 - Google Patents

아민 및 히드록시드의 효소적 탈보호 Download PDF

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Abstract

본 발명은 보호된 히드록시드 또는 아민을 보호기를 제거하는데 효과적인 효소와 접촉시키는 것을 포함하는, 화학식 ArC*(R)H-(CH2)n-O-C(=O)-의 기 (치환기는 상기에 기재된 바와 같음)로 보호된 히드록시드 또는 아민을 탈보호시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기와 같이 보호된 아민 화합물을 증식 선택적 양으로 함유한 배지에서 예기된 박테리아를 증식시키는 단계 및 상기 배지에서 증식한 박테리아를 단리시키는 단계를 포함하는, 보호기를 제거하는데 효과적인 효소를 생산하는 박테리아를 단리시키는 방법을 제공한다.

Description

아민 및 히드록시드의 효소적 탈보호 {Enzymatic Deprotection of Amines and Hydroxides}
본 출원은 35 U.S.C. §119(e)항에 준하여 2001년 1월 4일에 출원한 미국 출원 제60/259,715호를 우선권으로 주장한다.
본 발명은 아민 및 히드록시드 보호기를 제거하기 위한 온화한 효소적 방법에 관한 것이다.
N-카르보벤질옥시 (N-CBZ)기는 일반적으로 유기 합성 도중 아미노 및 히드록시기를 보호하기 위하여 사용된다. 또한, 다른 유사한 "카바메이트" 보호기도 아미노기를 보호하기 위하여 사용된다. 화학적 탈보호는 일반적으로 팔라듐 촉매를 이용한 수소첨가와 같은 방법에 의해 달성된다. 그런데, 만약 탈보호 조건에 영향을 받을 수 있는 다른기 (예를 들어, 수소첨가 도중 황)가 존재한다면, 대안적인 탈보호 방법이 필요하게 된다. 상기 보호기를 특이적으로 제거하는데 효과적인 효소 활성을 제공하는 본 발명의 선택 기술을 이용하여 미생물들을 토양 샘플로부터 쉽게 단리할 수 있음을 발견하였다. 그러므로, 온화한 조건 (예를 들어, 실온 및 주변 압력에서 수성 배지)하에 수행되는 효소적 탈보호 방법을 이용하여, 영향받기 쉽거나 영향받을 가능성이 있는 기가 손상되지 않게 할 수 있다.
<발명의 개요>
본 발명은 보호된 히드록시드 또는 아민과 보호기를 제거하는데 효과적인 효소를 접촉시키는 단계; 및 아민을 회수하는 단계를 포함하는, 화학식 ArC*(R)H-(CH2)n-O-C(=O)-의 기 (치환기는 하기에 기재되어 있음)로 보호된 히드록시드 또는 아민을 탈보호시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기와 같이 보호된 아민 화합물을 증식 선택적 양으로 함유한 배지에서 예기된 박테리아를 증식시키는 단계; 및 상기 배지에서 증식한 박테리아를 단리시키는 단계를 포함하는, 보호기를 제거하는데 효과적인 효소를 생산하는 박테리아를 단리하는 방법을 제공한다.
추가로, 본 발명은 키랄 탄소에 연결된 아민 또는 히드록시드의 원하는 거울상 이성질체를 분할하는 방법을 제공한다. 상기의 기로 보호된 아민 또는 히드록시드를 본 발명의 방법으로 입체 특이적이게 가수분해한다. 원하는 거울상 이성질체는 가수분해되는 것 또는 가수분해에 저항적인 것 중 하나이다.
한 실시양태에서, 접촉 단계에서 하기의 반응이 일어난다.
(식 중, Pr-은 상기 기재된 보호기임)
다른 실시양태에서, 접촉에 의해 하기의 반응이 일어난다.
또 다른 실시양태에서, 접촉에 의해 하기의 반응이 일어난다.
.
본 발명은 화학식 ArC*(R)H-(CH2)n-O-C(=O)- (식 중, R은 H이거나 독립적으로 Ar과 같고, n은 0 또는 1 내지 4임)의 수많은 카바메이트 보호기를 제거하기 위해 사용될 수 있다. Ar은 5 내지 6개의 고리 원자 및 O, N 또는 S 중에서 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 갖는 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 나타낸다. Ar은 아미노, 알카노일옥시, 알콕시, 알킬, 알킬아미노, 알릴, 카르복시, 시클로알킬, 할로, 할로알킬, 히드록시, 히드록시알킬 또는 니트로로 치환될 수 있거나, (a) 추가의 아릴로 치환되지 않는 점을 제외하고는 Ar과 독립적으로 동일한 Ar*, (b) Ar*-알킬- 또는 (c) Ar*O- 중 하나 이하로 치환될 수 있다. R이 Ar일 때 C*에 인접한 Ar의 고리 원자는 -CH2-, -O-, -NH-, -S(O)q- 또는 -P(O)r- (q는 0 또는 1 내지 2이고, r은 0 또는 1 내지 2임)로 치환되어 R상의 상응하는 위치에 가교를 형성할 수있다. 한 실시양태에서, R이 H일 때 n은 0이다. 다른 실시양태에서, R이 Ar과 같을 때 n은 1이다. 실시예 (표 2 참조)에 도시된 대로, 상기 방법은 입체 특이적이고, 따라서 라세미 혼합물을 분리하는데 이용될 수 있다.
이러한 보호기로는 9-플로오레닐메틸 카바메이트, 9-(2-술포)플루오레닐메틸 카바메이트, 9-(2,7-디브로모)플루오레닐메틸 카바메이트, 2,7-디-t-부틸-[9-(10,10-디옥소-10,10,10,10-테트라히드로티옥산틸)메틸 카바메이트, 벤질 카바메이트, p-메톡시벤질 카바메이트, p-니트로벤질 카바메이트, p-브로모벤질 카바메이트, p-클로로벤질 카바메이트, 2,4-디클로로벤질 카바메이트, 9-안트릴메틸 카바메이트, 디페닐 메틸 카바메이트, m-클로로-p-아실옥시벤질 카바메이트, p-(디히드록시보릴)벤질 카바메이트, 5-벤즈이속사졸릴메틸 카바메이트, 2-(트리플루오로메틸)-6-크로모닐메틸 카바메이트, m-니트로벤질 카바메이트, 3,5-디메톡시벤질 카바메이트, 3,4-디메톡시-6-니트로벤질 카바메이트, S-벤질 티오카바메이트, p-시아노벤질 카바메이트, 2-푸라닐메틸 카바메이트, 4-(트리메틸암모늄)벤질 카바메이트 및 2,4,6-트리메틸벤질 카바메이트와 같은 화합물을 들 수 있다. 이런 보호기들은 [Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991] (특히 315 내지 348쪽) 등의 표준 서적에 기재되어 있다.
치환기의 알킬 화합물은 C1-C6또는 C2-C6(C1잔기는 화학적으로 (예를 들어, 알카노일의 경우) 부적합함)이다. 시클로알킬 라디칼은 C3-C6이다. 할로알킬은 바람직하게는 퍼할로알킬, 또한 바람직하게는 트리플루오로메틸을 나타낸다. 할로는 바람직하게는 클로로 또는 플루오로이다.
한 실시양태에서, 카바메이트 보호기는 페닐이 치환될 수 있는 페닐메틸옥시카르보닐기이다. 페닐메틸옥시카르보닐의 치환에 대한 설명은 예를 들어, 상기 Ar에 대해 인용한 것들을 포함한다.
본 발명에 사용되는 효소원은 적합한 활성을 갖는 독립된 박테리아로서 단리될 수 있다. 단리 방법으로는 충분한 증식 보충 질소를 오로지 아민 화합물 (아민은 해당 카바메이트 보호기 또는 관련된 카바메이트 보호기에 의해 보호되어 있음)로부터만 얻는 배지에서의 증식에 의해 선택하는 것이 바람직하다. 하기의 실시예는 상기 박테리아가 환경 또는 토양 샘플과 같은 매우 평범한 박테리아원으로부터 단리될 수 있음을 설명한다.
하기의 실시예는 발명자들에 의해 확인된 선택 기술이 일반적인 실험을 이용하여 적합한 박테리아, 이어서 적합한 효소원을 분리하는데 효과적임을 실증한다. 실시예는 CBZ-보호된 질소를 이용한 증식에 의해 선택 단리되는 박테리아에 관한 것이다. 그런데, 이 설명은 제거되어야 할 보호기에 매치되는 동일한 보호기 이용 방법에 의해 불필요한 실험없이 효소를 수집할 수 있다는 출원인의 이해를 확인시켜 준다.
효소적 제거에 관련된 아민 또는 히드록시드가 주어진 효소에 의한 분할에 대해 기질이 저항하게 하는 원인의 가장 유력한 후보로 확인되면, 그 아민 (또는 유사체, 또는 히드록시드의 아민 유사체)의 적합하게 보호된 형태를 이용하여 다른박테리아, 나아가 다른 효소를 선택할 수 있다. 별도의 탈보호 효소, 또는 유용한 효소를 생산하는 각각의 박테리아 배양균의 집합물을 저장하여 대체 효소가 필요할 경우에 선별해 낼 수 있다. 보호 및 탈보호될 아민 또는 히드록시드가 비교적 먼 잔기에 연결된 아민 또는 히드록시드 부분을 가진 복합체 분자일 경우, 선택 과정에 사용된 아민 모델을 아민 또는 히드록시드에 인접한 복합체 부분에 맞게 적용할 수 있다. 복합체 분자에서 유래된 근접 잔기가 유사하게 유래되도록 하는 것이 바람직하다.
하기에 설명한 대로, 박테리아의 전세포, 전세포의 추출물, 또는 정제된 효소 제조물은 본 발명에 의해 제공되는 탈보호를 위해 사용될 수 있다. 효소는 촉매적으로 작용하므로 전형적으로 적은 양이 사용되기 때문에, 효소원에서 나오는 불순물 (예를 들어, 순도가 낮은 것)은 의도된 생성물처럼 거동하는 물질을 감지될 양만큼 생산하지는 않는다. 그러므로, 효소원에 의해 생긴 불순물은 반응 후 후처리 작업에서 신속하게 제거된다. 특히, 추출물이 사용되는 경우, 불순물은 큰 거대분자이고 의도된 전형적 생성물은 전형적으로 거대분자가 아니므로, 불순물은 생성물로부터 신속하게 분리된다.
또한 하기에 설명한 대로, 효소 선택 과정에 사용된 기질은 효소 활성을 측정하기 위한, 나아가 선택적인 미생물학적 강화와 전통적인 단백질 화학 기술로 효소를 단리하기 위한 편리한 도구를 제공한다.
보호기에 의해 보호된 아민 또는 히드록시드는 임의 분자상의 임의 아민 또는 히드록시드가 될 수 있다. 많은 실시양태에서, 아민 또는 히드록시드는 비반복적인 합성 기술에 적합한 크기를 갖는 분자상에서 발견된다. (물론, 본 발명의 탈보호 기술은 펩타이드 또는 핵산 합성에 이용되는 것과 같은 반복적 기술에도 사용될 수 있다.) 한 바람직한 실시양태에서, 아민 또는 히드록시드는 경구 소화 후 동물에서 생체이용가능한 생체활성 약품의 일부분이거나 상기 생체활성 약품의 전구물질의 일부분이다.
한 면에서, 아민은 바람직하게는 α- 또는 β-아미노산, 보다 바람직하게는 α-아미노산이다.
아민은 예를 들어, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 4-히드록시프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌, 글리신, 세린, 호모세린, 트레오닌, 시스테인, 호모시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민, 아스파라긴산, 글루탐산, 리신, α-아미노-ε-카프로락탐 (리신 락탐), α-아미노-δ,δ-디메틸-ε-카프로락탐, ε-메틸리신, 오르니틴, 아르기닌, 히스티딘 또는 3-메틸히스티딘이거나, 그들의 알킬 부분이 히드록시 또는 알킬로, 아미노가 하나 이하의 알킬로, 또는 페닐 잔기가 Ar에 대해 상기 인용된 라디칼로 치환된 어느 것일 수 있다. 상기 아미노산은 L 또는 D 아미노산일 수 있다. 게다가, 상기 아미노산을 유도시켜, 아민 또는 카르복실산 잔기와의 탈수 반응에 의해 형성된 결합을 통하여, 또는 아민 잔기에서 형성되는 탄소-질소 결합에 의해 보다 큰 분자의 부분을 형성하게 할 수 있다.
특히, 본 발명에 유용한 다른 알파 아미노산의 종류는 하기 화학식에 따른다:
상기 식에서,
m은 0 또는 1이고;
Y는 CH2, S-(O)t또는 O이고 (단, m이 1일 때에만 Y는 S-(O)t또는 O임);
X는 S-(O)t또는 O이고;
n은 1 또는 2이고;
t는 0, 1 또는 2이고;
R3는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴-(CH2)p-이고;
p는 0 또는 1 내지 6이다.
상기 아민 중, 특히 바람직한 아민은
이다.
이 화합물들은 미국 특허 5,508,272에 보다 자세히 기재되어 있다. 이 화합물을 제조하고 사용하는 것에 대한 상기 특허의 교시 내용은 참고로 포함된다. 본발명의 용도에 대하여 특히 관심있는 추가의 화합물은 WO 00/47207 및 미국 특허 5,552,397에 기재되어 있다. 상기 특허에 기재된 화합물의 제조에 대한 교시 내용은 참고로 포함된다.
보호된 아민 또는 히드록시드는 일반적으로 ArC*(R)H-(CH2)n-O-C(=O)-X (X는 이탈기 (예를 들어, 브로모, 클로로, 토실)임)과 상응하는 아민 또는 히드록시드를 반응시켜 형성된다. ArC*(R)H-(CH2)n-O-C(=O)-X는 예를 들어 ArC*(R)H-(CH2)n-OH와 포스겐, 카르보밀 디아이다졸, 트리포스겐 또는 대등한 시약을 반응시켜 형성된다.
정의
본 출원의 목적을 위해 하기 용어들은 각각 하기에 열거된 의미를 갖는다.
·생체활성 약품.생체활성 약품은 세포, 바이러스, 조직, 기관 또는 유기체에 작용할 수 있는 화합물과 같은 물질로써, 세포, 바이러스, 기관 또는 유기체의 기능에 변화를 줄 수 있는 살충제 또는 약물 (예를 들어, 약제)을 포함하되 이들로 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 유기체는 포유류, 보다 바람직하게는 인간이다.
·아민 화합물의 증식 선택적 양을 함유한 배지.보호된 아민 화합물의 증식 선택적 양을 함유한 배지는 상기 아민 화합물외 임의의 다른 아민의 양이 증식-매개된 선택 과정에서 박테리아의 증식을 촉진시킬 유효량 미만인 배지이다. 보호된 아민이 필수적으로 유일한 질소원이어야 바람직하다.
<실시예 1>: 미생물의 단리를 위한 선택 기술
선택적 배양 기술을 이용하여, N-α-CBZ-L-리신을 유일한 질소원으로 사용할 수 있는 미생물을 단리하였다. 토양 샘플은 뉴저지 주의 다양한 장소로부터 수집하였다. 약 1 그람의 토양 샘플을 5 mL의 물에 현탁시키고, 완전히 혼합하고, 샘플을 정치시켰다. 다양한 샘플의 상청액을 1% N-α-CBZ-L-리신을 함유한 배지 A (2% 글루코스, 0.2% KH2PO4, 0.2% K2HPO4, 0.01% MgSO4, 0.001% FeSO4, 0.001% ZnSO4, pH 7.0)에 접종하였다. 4일 동안 증식시킨 후 배지가 흐려졌을 때, 배양균을 페트리 접시에 있는 1.5% 아가를 함유한 상기 배지로 옮겼다. 이 강화 배양 기술로부터 8 종류의 다른 군체를 단리하였다. 한 배양균 (Z-2)은 추가로 스핑고모나스 파우시모빌리스 (Sphingomonas paucimobilis) 균주로 확인되었고, 메릴랜드 주 록빌 소재 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)에 스핑고모나스 파우시모빌리스 균주 ATCC 202027로 기탁하였다. 이 배양균을 CBZ-탈보호 효소원으로 사용하였다.
<실시예 2>: 스핑고모나스 파우시모빌리스의 증식
스핑고모나스 파우시모빌리스를 N-α-CBZ-L-페닐알라닌 또는 [4S-(4α,7α,10αβ)]-옥타히드로-5-옥소-4-[[(페닐메톡시)카르보닐]아미노]-7H-피리도-[2,1-b][1,3]티아제핀-7-카르복실산, 메틸 에스테르 (화합물 A)를 유일한 질소원으로 하여 증식시켰다. 스핑고모나스 파우시모빌리스 배양균을 1% N-α-CBZ-L-페닐알라닌 또는 1% 화합물 A를 함유한 배지 A에 접종시켰다. 2일 동안 증식시킨 후, 배양균을 페트리 접시에 있는 1% N-α-CBZ-L-페닐알라닌 또는 1%BMS199541, 및 1.5% 아가를 함유한 배지 A로 옮겼다. 1% N-α-CBZ-L-페닐알라닌 및(또는) 1% 화합물 A를 함유한 배지 B (0.015% 효모 추출물, 2% 글루코스, 0.2% KH2PO4, 0.2% K2HPO4, 0.01% MgSO4및 0.2% NaCl, pH 7) 100 mL에서 증식시킨 페트리 접시로부터 군체를 단리하였다. 배양균을 회전 쉐이커에서 280 RPM하에 28℃에서 24시간 동안 증식시켰다. 이 배양균으로부터 바이알 (2mL 바이알 중 1mL의 배양균)을 제조하고, 추후의 사용을 위해 -70℃에 보관하였다.
한 바이알 (배지 B에 스핑고모나스 파우시모빌리스 1mL를 함유)을 배지 B 100mL에 접종하는데 사용하였다. 배양균을 회전 쉐이커에서 280 RPM하에 28℃에서 48시간 동안 증식시켰다. 18,000 ×g로 15분 동안 원심분리하여 세포를 수확하고, 추후의 사용을 위해 -70℃에 보관하였다.
<실시예 3>: 전세포를 이용한 생체형질변환
이 과정에서, 스핑고모나스 파우시모빌리스를 250mL 플라스크에 기질 (화합물 A 또는 CBZ-L-페닐알라닌) 25mg을 함유한 배지 B 25mL에서 증식시켰다. 플라스크를 쉐이커에서 250 RPM하에 28℃에서 증식시켰다. 48시간 동안 생체형질변환시킨 후, 원심분리하여 세포를 제거하였다. 생성물로 [4S-(4α,7α,10αβ)]-옥타히드로-5-옥소-4-아미노-7H-피리도-[2,1-b][1,3]티아제핀-7-카르복실산, 메틸 에스테르 (화합물 B) 또는 L-페닐알라닌을 함유한 상청액을 HPLC로 분석하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.
기질 생성물 전환율%
화합물 A 화합물 B 100
CBZ-L-페닐알라닌 L-페닐알라닌 100
HPLC 분석
HPLC 분석은 휴렛-패커드 (Hewlett-Packard)(HP) 1090 기계와 바이닥 (Vydac) C-18 역상 컬럼을 이용하여 수행하였다. 이동상은 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)을 함유한 용매 A 및 70% 아세토니트릴: 30% 물 중 0.1% TFA를 함유한 용매 B이었다. 용매 A 및 B를 하기의 구배로 기질과 생성물을 분리하는데 이용하였다:
0분: 100% A,
0 내지 15분: 50% B,
15 내지 25분: 100% B,
25 내지 26분: 0% B, 및
26 내지 30분: 0% B.
유동속도는 1mL/분이었다. 컬럼 온도는 주변온도이고, 검출 파장은 215nm였다. 이 조건하에, 화합물 A, 화합물 B, CBZ-L-페닐알라닌 및 L-페닐알라닌의 체류 시간은 각각 15.48분, 7.28분, 16.99분, 및 7.35분이었다. 모든 다른 CBZ-함유 화합물도 이 조건을 이용하여 분석하였다.
<실시예 4>: 스핑고모나스 파우시모빌리스 ATCC 202027의 세포 추출물을 이용한 CBZ의 탈보호
스핑고모나스 파우시모빌리스 ATCC 202027의 세포 추출물의 제조
세포 추출물의 제조를 4 내지 7℃에서 수행하였다. 세포를 50 mM 칼륨 포스페이트 완충액 (pH 7.0)으로 세척하고, 세척한 세포 (100g)를 완충액 A (10% 글리세롤를 함유한 pH 7.0의 50mM 포스페이트 완충액, 및 2 mM DTT) 500mL에 현탁시켰다. 세포 현탁액에, 이소프로판올 중 1mM 페닐메틸술포닐 플루오리드 (PMSF) 용액을 첨가하였다. 세포 현탁액 (20% W/V, 습윤 세포)을 12,000psi (2 통로)로 마이크로플루이디저 (Microfluidizer) (Microfluidics, Inc)를 통하여 통과시키고, 흩어진 세포들을 25,000 ×g로 30분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 원심분리 후 수득한 상청액을 세포 추출물이라 일컫는다.
세포 추출물을 이용한 CBZ-탈보호
세포 추출물을 다양한 화합물로부터 CBZ기를 탈보호시키는데 사용하였다. 다양한 과정에서 CBZ기를 탈보호시키는데 이용하였다. 다양한 D 및 L- CBZ-보호된 아미노산을 세포 추출물과 함께 42℃에서 18 내지 20시간 동안 인큐베이션시켰다. 0.4% 트리플루오로 아세트산 (TFA)을 함유한 50% 아세토니트릴 2 용적을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 표 2에 도시한 결과에서 효소가 CBZ-보호된 L-아미노산으로부터 CBZ기를 가수분해시키는데 특이적임을 알 수 있다.
<실시예 5>: CBZ-탈보호 효소의 정제 및 CBZ-함유 화합물로부터의 CBZ기 탈보호를 위한 정제된 효소의 용도.
효소 평가분석
화합물 A 또는 CBZ-페닐알라닌 0.5mg을 50mM 포스페이트 완충액 (pH 7) 중 세포 추출물/분획 0.4mL와 함께 45℃에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 0.4% TFA를 함유한 50% 아세토니트릴 1mL를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 샘플을 여과하고 생성물 및 시작 물질에 대해 HPLC로 분석하였다.
단백질 평가분석
바이오-라드 (Bio-Rad) 단백질 평가분석을 이용하여 단백질의 농도를 측정하였다. 평가분석은 제조자 (바이오-라드)의 프로토콜에 따라 수행하였다.
효소의 정제
모든 정제 단계는 실온에서 수행하였다. 효소의 정제는 CBZ-L-페닐알라닌을 기질로 사용하여 수행하였다. 상기에서 제조된 세포 추출물을 2시간 동안 DEAE-셀룰로스 (완충액 A로 미리 평형을 맞춤)에 일괄 흡착시켰다. 활성 효소를 함유한 결과물을 2시간 동안 일정하게 교반하면서 황산암모늄 (516g/L)으로 침전시켰다. 원심분리 (4℃에서 15,00rpm)로 수득한 생성 침전물을 1M 황산암모늄을 함유한 완충액 A에 용해시키고, 페닐세파로스 (1M 황산암모늄을 함유한 완충액 A로 미리 균형을 맞춘 20mL의 컬럼)상에 적재하였다. 컬럼을 1M 황산암모늄, 0.5M 황산암모늄 및 0.2M 황산암모늄을 함유한 완충액 A로 차례대로 세척하였다. 마지막으로, 효소를 완충액 A로 용리하였다. 활성 효소를 함유한 분획 (30mL)을 모아서, 아미콘 (Amicon) PM-10 막 (8mL)으로 농축시켰다. 그 후, 효소를 S-200 겔-여과 컬럼 (400mL 컬럼)에 적재하였다. 효소를 완충액 A로 유동속도 0.8mL/분으로 용리시켰다. 이 단계들에 의해 효소를 [13.9 단위/mg 단백질]의 특이적 활성을 갖도록 150배 넘게 정제하였다 (표 3). 단위는 [형성된 생성물/분/mg 단백질]의 μmole로 정의하였다. 효소는 SDS-PAGE로 측정된 대로, 서브유닛의 분자량이 45,000 달톤인 대략 154,000 달톤의 분자량을 가진 이합체형 단백질이었다.
이 부분에서 기재된 대로 제조된 정제 효소를 표 4에 도시한 바와 같이 CBZ-함유 화합물을 탈보호시키는데 사용하였다.
기질 생성물 전환율%
화합물 A 화합물 B 100
CBZ-L-페닐알라닌 L-페닐알라닌 100
<실시예 6>: 화합물 A의 제조 배치 250mg의 효소적 탈보호
세포 추출물을 상기에 기재한 대로 제조하였다. 세포 추출물 250 mL에 화합물 A 250 mg을 첨가하고, 95 RPM하에 28℃에서 인큐베이션하였다. 40시간 동안 반응시킨 후, 아세토니트릴 250 mL를 첨가하였다. 기질과 생성물을 HPLC로 분석하였다. 화합물 B의 몰 수득률은 87%였다.
<실시예 7>: CBZ-함유 화합물의 효소적 탈보호
상기 기재된 대로 스핑고모나스 파우시모빌리스 ATCC 202027로부터 제조한 세포 추출물을 사용하여 [(3S)-헥사히드로-2-옥소-1-[2-옥소-2-(1-피롤리디닐)에틸]-1H-아제핀-3-일]카르밤산, 페닐메틸 에스테르 (화합물 C)를 탈보호시켜 (S)-1-[(3-아미노헥사히드로-2-옥소-1H-아제핀-1-일)아세틸]피롤리딘 (화합물 D)를 수득하였다.
<실시예 8>: CBZ-함유 화합물의 효소적 탈보호
상기 기재된 대로 스핑고모나스 파우시모빌리스 ATCC 202027로부터 제조한 세포 추출물을 사용하여 [6-[(페닐메톡시)카르보닐]아미노] 헥사히드로-2,2-디메틸-7-옥소-1H-아제핀-1-아세트산, 에틸 에스테르 히드로클로라이드 (1)을 6-아미노헥사히드로-2,2-디메틸-7-옥소-1H-아제핀-1-아세트산, 에틸 에스테르, 히드로클로라이드 (화합물 E)로 탈보호시켰다.
상기 명시한 대로, 특허와 특허 출원을 비롯한 이로 제한되지 않는 본 명세서에 인용된 공보와 참고 문헌은, 각각의 개별적인 공보 또는 참고 문헌이 충분히 설명된 바와 같이 본원에 참고 문헌으로 포함된다고 구체적이고 개별적으로 지적한 것처럼, 인용된 전부분에서 전문이 참고로 포함된다. 본 출원이 우선권을 주장하는 임의의 특허 출원 또한 공보와 참고 문헌에 대하여 상기 기재한 바와 같이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 바람직한 실시양태를 강조하여 기재하였지만, 당업계의 일반 숙련자들에게는 바람직한 장치와 방법의 변형이 이용될 수 있다는 것과 본 발명이 본원에 명확하게 기재한 것과 다르게 실행될 수도 있다는 것이 명백할 것이다. 따라서, 본 발명은 하기의 청구항에 정의된 본 발명의 개념과 범위내에서 이루어지는 모든 변형을 포함한다.

Claims (20)

  1. 보호된 히드록시드 또는 아민을 보호기를 제거하는데 효과적인 효소와 접촉시키는 단계; 및
    아민을 회수하는 단계를 포함하는,
    화학식 ArC*(R)H-(CH2)n-O-C(=O)-의 기 [식 중, R은 H이거나 독립적으로 Ar과 같고, n은 0 또는 1 내지 4이고, Ar은 5 내지 6개의 고리 원자 및 O, N 또는 S 중에서 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 갖는 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 나타내고, 상기 Ar은 아미노, 알카노일옥시, 알콕시, 알킬, 알킬아미노, 알릴, 카르복시, 시클로알킬, 할로, 할로알킬, 히드록시, 히드록시알킬 또는 니트로로 치환될 수 있거나, (i) 추가의 아릴로 치환되지 않는 점을 제외하고는 독립적으로 Ar과 동일한 Ar*, (ii) Ar*-알킬- 또는 (iii) Ar*O- 중 하나 이하로 치환될 수 있고, R이 Ar일 때 C*에 인접한 Ar의 고리 원자는 -CH2-, -O-, -NH-, -S(O)q- 또는 -P(O)r- (q는 0 또는 1 내지 2이고, r은 0 또는 1 내지 2임)로 치환되어 R상의 상응하는 위치에 가교를 형성할 수 있음]로 보호된 히드록시드 또는 아민을 탈보호시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 보호기가 치환될 수 있는 페닐메틸옥시카르보닐기인 방법.
  3. 제1항에 있어서, R이 H일 때 n이 0인 방법.
  4. 제1항에 있어서, R이 Ar과 같을 경우 n이 1인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 효소가 스핑고모나스 파우시모빌리스 (Sphingomonas paucimobilis)로부터 수득되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 효소가 스핑고모나스 파우시모빌리스 균주 ATCC 202027로부터 수득되는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 보호된 화합물이 아민이고, 상기 아민이 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 4-히드록시프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌, 글리신, 세린, 호모세린, 트레오닌, 시스테인, 호모시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민, 아스파라긴산, 글루탐산, 리신, α-아미노-ε-카프로락탐(리신 락탐), ε-메틸리신, 오르니틴, 아르기닌, 히스티딘 또는 3-메틸히스티딘이거나, 그들의 알킬 부분이 히드록시 또는 알킬로, 아미노가 하나 이하의 알킬로, 또는 페닐 잔기가 알킬, 알카노일옥시, 알콕시, 아미노, 카르복시, 시클로알킬, 할로, 하이드록시, Ar*또는 Ar*O-로 치환된 것이거나, 아민 또는 카르복실산 잔기와의 탈수 반응에 의해 형성된 결합을 통하여, 또는 아민 잔기에서 형성되는 탄소-질소 결합에 의해 보다큰 분자의 부분을 형성하는 그들의 유도체인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 아민이 α-아미노-ε-카프로락탐 또는 α-아미노-δ,δ-디메틸-ε-카프로락탐, 또는 그의 유도체인 방법.
  9. 히드록시드 또는 아민이 화학식 ArC*(R)H-(CH2)n-O-C(=O)-의 기 [식 중, R은 H이거나 독립적으로 Ar과 같고, n은 0 또는 1 내지 4이고, Ar은 5 내지 6개의 고리 원자 및 O, N 또는 S 중에서 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 갖는 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 나타내고, 상기 Ar은 아미노, 알카노일옥시, 알콕시, 알킬, 알킬아미노, 알릴, 카르복시, 시클로알킬, 할로, 할로알킬, 히드록시, 히드록시알킬 또는 니트로로 치환될 수 있거나, (i) 추가의 아릴로 치환되지 않는 점을 제외하고는 독립적으로 Ar과 동일한 Ar*, (ii) Ar*-알킬- 또는 (iii) Ar*O- 중 하나 이하로 치환될 수 있고, R이 Ar일 때 C*에 인접한 Ar의 고리 원자는 -CH2-, -O-, -NH-, -S(O)q- 또는 -P(O)r- (q는 0 또는 1 내지 2이고, r은 0 또는 1 내지 2임)로 치환되어 R상의 상응하는 위치에 가교를 형성할 수 있음]로 보호된 화합물의 유도체를 제공하는 단계;
    보호된 화합물을 보호기를 제거하는데 효과적인 효소와 접촉시키는 단계; 및
    원하는 거울상 이성질체가 거울상 이성질체적으로 강화된 조성물에서 화합물또는 그의 보호된 유도체를 단리시키는 단계를 포함하는,
    키랄 탄소에 직접적으로 결합된 히드록실 또는 아미노 잔기를 갖는 화합물의 라세미 혼합물을 분할하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 보호기가 치환될 수 있는 페닐메틸옥시카르보닐기인 방법.
  11. 화학식 ArC*(R)H-(CH2)n-O-C(=O)-의 기 [식 중, R은 H이거나 독립적으로 Ar과 같고, n은 0 또는 1 내지 4이고, Ar은 5 내지 6개의 고리 원자 및 O, N 또는 S 중에서 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 갖는 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 나타내고, 상기 Ar은 아미노, 알카노일옥시, 알콕시, 알킬, 알킬아미노, 알릴, 카르복시, 시클로알킬, 할로, 할로알킬, 히드록시, 히드록시알킬 또는 니트로로 치환될 수 있거나, (i) 추가의 아릴로 치환되지 않는 점을 제외하고는 독립적으로 Ar과 동일한 Ar*, (ii) Ar*-알킬- 또는 (iii) Ar*O- 중 하나 이하로 치환될 수 있고, R이 Ar일 때 C*에 인접한 Ar의 고리 원자는 -CH2-, -O-, -NH-, -S(O)q- 또는 -P(O)r- (q는 0 또는 1 내지 2이고, r은 0 또는 1 내지 2임)로 치환되어 R상의 상응하는 위치에 가교를 형성할 수 있음]로 보호된 아민 화합물을 증식 선택적 양으로 함유한 배지에서 예기된 박테리아를 증식시키는 단계; 및
    상기 배지에서 증식한 박테리아를 단리시키는 단계를 포함하는,
    보호기를 제거하는데 효과적인 효소를 생산하는 박테리아를 단리시키는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 박테리아를 보호기로 보호된 아민과 함께 인큐베이션하고, 보호된 아민의 유리 아민으로의 전환을 모니터링함으로써 효소의 유효성을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 카바메이트 보호기가 치환될 수 있는 페닐메틸옥시카르보닐기인 방법.
  14. 다른 아민 또는 다른 보호기를 사용하여 제11항의 방법으로 단리한 두가지 이상의 박테리아 단리체의 집합물.
  15. 제1항에 있어서, 접촉에 의해 하기의 반응이 일어나는 방법.
    (식 중, Pr은 ArC*(R)H-(CH2)n-O-C(=O)-임)
  16. 제15항에 있어서, 상기 반응이
    인 방법.
    (식 중, CBZ-는 N-카르보벤질옥시임)
  17. 제1항에 있어서, 접촉에 의해 하기의 반응이 일어나는 방법.
    (식 중, Pr은 ArC*(R)H-(CH2)n-O-C(=O)-임)
  18. 제17항에 있어서, 상기 반응이
    인 방법.
    (식 중, CBZ-는 N-카르보벤질옥시임)
  19. 제1항에 있어서, 접촉에 의해 하기의 반응이 일어나는 방법.
    (식 중, Pr은 ArC*(R)H-(CH2)n-O-C(=O)-임)
  20. 제19항에 있어서, 상기 반응이
    인 방법.
    (식 중, CBZ-는 N-카르보벤질옥시임)
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