HU218409B

HU218409B - Eljárás (S)-2-(3-benzoil-fenil)propionsav előállítására

Info

Publication number: HU218409B
Application number: HU9502560A
Authority: HU
Inventors: Julie Belinda Hazel Warneck; Richard Anthony Wisdom
Original assignee: Laboratorios Menarini S.A.
Priority date: 1993-03-03
Filing date: 1994-03-03
Publication date: 2000-08-28
Also published as: JPH08506718A; CA2157369C; ES2087046T1; AU6208194A; PL310434A1; HU9502560D0; ES2087046T3; SK104395A3; DK0693134T3; GR3024853T3; DE69403960D1; SK280049B6; FI954079A; NO953413D0; GB9304256D0; KR100308411B1; DE69403960T2; FI104327B; WO1994020633A1; HK1006469A1

Abstract

A találmány tárgya eljárás legalább 93% enantiomertöbbletű (S)-2-(3-benzoil-fenil)-propionsav előállítására 2-(3- benzoil-fenil)-propionsav valamely alkil-észtere enantiomerjeinek a keverékéből. Atalálmány szerint biokatalizátorként egy Ophiostoma nemzetségbetartozó mikroorganizmust alkalmaznak. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás (S)-2-(3-benzoil-fenil)-propionsav előállítására.

Számos 2-aril-propionsav jól ismert gyulladáscsökkentő hatóanyag. Ilyenek például az ibuprofen, naproxen és ketoprofen. E vegyületek királis jellegűek, és ma már jól megalapozott tény, hogy terápiás hatásuk túlnyomórészt az (S)-enantiomemek tulajdonítható.

A szennyező (R)-enantiomertől mentes (S)-enantiomer előállítására több módszer ismert. Ilyen eljárás például az aszimmetrikus kémiai szintézis, valamint a kémiai rezolválás, például a különböző, királis aminokkal alkotott diasztereomer sók elkülönítésére alkalmas kristályosítása.

Az elválasztás egy másik lehetősége a biokatalitikus módszer olyan biokatalizátor használatával, amely a 2-aril-propionsav valamely észterének hidrolízisét szelektíven katalizálja. Ha megfelelő sztereospecifitással rendelkező biokatalizátor áll rendelkezésre, akkor az egyik enantiomer reagálatlan észterét, valamint a másik enantiomemek megfelelő savat tartalmazó reakcióelegy kapható. Ezt követően a termék elkülönítése és kinyerése viszonylag könnyű. Az el nem reagált észter racemizálható, egy következő reakcióban ismét felhasználható, s ez biztosítja a racém szubsztrátum csaknem teljes konverzióját a kívánt egyedi enantiomer termékké.

Az EP-A-0 227 078 számú európai szabadalmi dokumentumban több extracelluláris (sejten kívüli), kereskedelmi forgalomból beszerezhető, mikrobákból származó lipáz alkalmazását közölték biokatalitikus rezolválás céljára. Általában azonban nagy mennyiségű enzim szükséges, és a reakció 2-6 napig tart. Az ilyen reakciók kivitelezése tehát költséges lenne. A legjobbnak talált enzimpor a Candida cylindraceából származik (amelyet Candida rugósa néven is ismernek); az EP-A-0 407 033 számú európai szabadalmi dokumentum szerint azonban kimutatták, hogy ez a készítmény - amellett, hogy aktivitása csekély - egynél több, észterázhatással rendelkező enzimet tartalmaz. Továbbá nagy enantiomer-többletű ketoprofen előállítása céljából ezt a készítményt meg kellett tisztítani.

Az EP-A-0 233 656 számú európai szabadalmi dokumentumban Bacillus thaiból származó észteráz gén izolálását és klónozását közölték. Kimutatták, hogy az enzim mind a naproxen, mind az ibuprofen etil- és metil-észterét szelektíven hidrolizálja, s így az észtereknek megfelelő (S)-enantiomer sav nyerhető. Kimutatták továbbá, hogy az enzim klónozásával nagyobb enantiomer-többletű terméket eredményező készítmény érhető el, ami más enzimek mellékhatásai minimálissá tételének az eredménye. A WO-A-9323547 számon közzétett nemzetközi PCT szabadalmi dokumentumban számos törzset írtak le, amelyek naproxen-észtereit szelektíven hordozó észterázt termelnek. A legkedvezőbb törzsnek a Zopfiella latipest találták, az ebből eredő észterázt klónozták.

A WO-A-9304189 számon közzétett nemzetközi PCT szabadalmi bejelentésben olyan Trichosporon specieshez tartozó mikroorganizmust ismertettek, amely képes a ketoprofen-etil-észter (S)-enantiomerjének szelektív hidrolízisére, s így 90%-nál nagyobb enantiomer-többletű (S)-sav kapható. E biotranszformációt katalizáló enzim intracelluláris (sejten belüli). Mivel stabilis, sejtmentes készítmények előállítása nehéznek bizonyult, nehéznek mutatkozott a biokatalitikus aktivitás fokozása a gén klónozása vagy klasszikus mutagenezis útján.

Mindezek alapján a találmány célja olyan biokatalizátor előállítása, amelynek aktivitása a ketoprofen különböző észtereivel szemben kedvező; megfelelő enantiomer-többletű ketoprofen-savterméket eredményez; és alkalmas lehet klónozásra és hiperexpresszióra (fokozott kifejezésre) - például E. coliban - a biokatalizátor költségeinek minimálissá tétele céljából.

A találmányt az alábbiakban foglaljuk össze.

Meglepő módon, különböző forrásokból származó mikroorganizmusok szűrővizsgálata azt mutatta, hogy az Ophiostoma novo-ulmi (amely Ceratocystis ulmi néven is ismert) ascomyceta mikroorganizmus a kívánt reakciókatalízisre alkalmas, intracelluláris hidrolizálóenzimet termel. További vizsgálatok igazolták, hogy - a WO-A-9304189 számon közzétett PCT nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt törzstől eltérően stabilis, sejtmentes aktivitást kaptunk, amely ennek alapján klónozásra alkalmas volt, és lehetségessé vált az alkalmazása sejtmentes biotranszformációkban. Az Ophiostoma novo-ulmi növényi patogén (kórokozó), amely virulens előidézője a „Dutch Elm” növényi betegségnek (legelőször Hollandiában megfigyelt szilfabetegség). Ismert, hogy ez a mikroorganizmus a kevésbé fertőző Ophiostoma ulmi és Ophiostoma piceae törzsek közeli rokona.

A találmányt megalapozó első felismerésünket követve azt találtuk, hogy más Ophioistoma novo-ulmi, Ophiostoma ulmi (esetenként Ceratocystis ulmi néven ismert) és Ophiostoma piceae (esetenként Ceratocystis piceai néven ismert) egyéb törzseiben is sztereospecifikus észteráz-enzimaktivitás mutatható ki; valamint az Egyesült Államok, Európa, a Közép-Kelet és Üzbegisztán különböző helyeiről származó izolátumokban is ugyanilyen enzimaktivitás figyelhető meg. Szűrővizsgálatnak vetettük alá továbbá a Ceratocystis sp. IMI-intézményből származó (Egham, Surrey, Egyesült Királyság), más törzseinek aktivitását is. Felismertük, hogy a C. coronata (például IMI 1765333), C. Ips (például IMI 2121114), C. tetropii (például IMI 212117), C. cainii (például IMI 176523), C. arborea (például IMI 176529) és C. stenoceras (például IMI 268494) törzsekben is megtalálható ez az aktivitás. Úgy látszik tehát, hogy ez az aktivitás a világ különböző helyeiről összegyűjtött, különböző Ceratocystis törzsek tartományában szélesen elterjedt.

A szűrővizsgálatnak alávetett, eredeti izolátum egy törzsét - amelyet e leírásban AJ3-nak jelölünk - az IMI-intézményben 1993. február 15-én IMI 356050 katalógusszám alatt a Budapesti Egyezmény kívánalmainak megfelelően letétbe helyeztük. Ez a törzs jó példát mutat az aktivitásra; mivel azonban ez az aktivitás rokon törzsek igen változatos fajtáiban is elterjedt, a találmány oltalmi köre nem korlátozódik ezekre a külön említett organizmusokra. A találmány továbbá az ilyen

HU 218 409 Β mikroorganizmusokból bármilyen alkalmas technológiai eljárással izolált enzimaktivitás alkalmazására is kiterjed.

A találmány szerint az Ophiostoma nemzetséghez tartozó mikroorganizmusok és azok enzimaktivitása felhasználható a ketoprofen racém alkil-észtereinek sztereoszelektív hidrolízisére, aminek útján lényegesen feldúsított (S)-enantiomer sav, például 93-96%-os, vagy még ennél is nagyobb enantiomer-többletű sav nyerhető; és visszamarad az (R)-enantiomerben feldúsult észter. E reakció az észter-enantiomerek bármely keverékével végrehajtható, jóllehet általában a racemátot alkalmazzuk. Az észter alkilcsoportja előnyösen 1-3 szénatomos. A reakciót előnyösen 8-11, még előnyösebben 9,5-10,5, legelőnyösebben körülbelül 10 pH-értéken végezzük. Általában valamilyen szerves oldószert, például ciklohexánt használunk.

A savterméknek észtertől való elkülönítésére standard kémiai eljárásokat alkalmazhatunk. Szükség esetén a sav optikai tisztasága királis amin, például (R)-ametil-benzil-amin alkalmazásával javítható. A visszamaradó, át nem alakult észter további felhasználás céljából racemizálható.

A találmányt az alábbi, nem korlátozó jellegű példákban részletesen ismertetjük.

1. példa

Racém ketoprofen-etil-észter biotranszformációja

AJ3 alkalmazásával

Az organizmus tenyésztéséhez az alábbi összetételű

közeget használjuk.
(NH₄)₂SO₄	0,5 g/1
MgSO₄.7H₂O	0,25 g/1
CaCl₂.2H₂O	0,1 g/1
KH₂PO₄	8,0 g/1
Élesztőkivonat	10,0 g/1
Glükóz	5,0 g/1
Nyomelemoldat	100 pl/l
pH (NaOH-dal beállítva)	6,5
A nyomelemoldat összetétele az alábbi:
CaCl₂.2H₂O	3,57 g/1
ZnO	2,0 g/1
CuC1₂.2H₂O	0,85 g/1
Na₂MoO₄.2H₂O	4,8 g/1
MnCl₂.4H₂O	2,0 g/1
FeCl₃.6H₂O	5,4 g/1
H₃BO₄	0,3 g/1
CoC1₂.6H₂O	2,4 g/1
HC1	250 ml/1
Az AJ3-sejteket malátakivonatos agarlemezről 30 ml tenyésztőközegbe oltjuk 250 ml-es terelőlemezes lombikban, majd 30 órán át 23 °C hőmérsékleten rázatjuk, és ezt követően 2,5 ml-t egy második, 250 ml-es, 30 ml közeget tartalmazó, terelőlemezes lombikba viszünk át. A tenyésztést 40 órán át rázás közben, 23 °Con végezzük, majd az így kapott elegyhez 20 g/1 koncentrációban racém ketoprofen-etil-észtert adunk. A bio-
transzformációt 120 órán	át hagyjuk végbemenni; ez
időpontban végzett HPLC-elemzés szerint a hozzáadott
észter 18,2%-a hidrolizál.	Az így kapott ketoprofen-

savtermék enantiomer-többletét 96%-nak találtuk az (S)-enantiomer javára.

2. példa

A szerves oldószer befolyása

Az 1. példában leírttal azonos tenyésztőközeggel, nyers enzimoldatot állítunk elő 6,0 pH-értékkel, glükóz nélkül. Az AJ3-sejteket 1 literes rázólombikban elhelyezett 100 ml közegre oltjuk, majd ezt a tenyészetet rázatás közben 48 órán át 30 °C-on tenyésztjük. Ezután 10 ml térfogatát 1 literes rázólombikban elhelyezett 90 ml Tris-közegbe visszük át, és rázatás közben 8 órán át 30 °C hőmérsékleten tovább tenyésztjük. Ennek a lombiknak a tartalmát használjuk egy 2,8 literes, laboratóriumi fermentorban elhelyezett, 1,5 liter közeget, 5 g/1 glükózt és 0,5 ml/1 szilikon/PPG-alapú habzásgátlót (XF0371, Ivanhoe Chemicals, III. USA) tartalmazó közeg oltására. A fermentort 48 órán át keverés közben, levegőzéssel működtetjük, mialatt a levegővel való telítettséget 50%-nál magasabb értéken, a hőmérsékletet 30 °C-on és a pH értékét 6,0-on tartjuk.

A fermentálás befejezése után a sejteket centrifügálással összegyűjtjük, és az így kapott pelletet 10 tömeg/térfogat% koncentrációban (a sejtek nedves tömegére vonatkoztatva) lizáló (lízisre alkalmas) pufferoldatban, azaz 0,1 M nátrium-karbonátot tartalmazó, 5% Triton X-100 vizes oldatában ismét szuszpendáljuk. A lízist éjszakán át, rázatás közben 8 °C hőmérsékleten végezzük, majd az enzimaktivitást tartalmazó lizátumot a sejttöredékektől centrifügálással elkülönítjük.

A racém ketoprofen-etil-észtert négyféle oldószerben - toluolban, ciklohexánban, metanolban és metil-t-butiléterben (röviden MTBE) - 20 g/1 koncentrációban oldjuk. Ezekből az oldatokból üvegampullákban elhelyezett, 5 ml alikvot nyers enzimoldathoz 2 ml oldatot adunk. Egy üvegampullában előkészítjük a vizes biotranszformációt, amely - mint kontroll - 5 ml nyers enzimoldatot, 400 μΐ 50%-os racém ketoprofen-etil-észtert, 0,5 tömeg/térfogat% Tween 80 törzsoldatot és 2,5 tömeg/térfogat% Triton Χ-100-at tartalmaz. Valamennyi mintát 48 órán át 25 °C hőmérsékleten rázatással reagáltatjuk. A reakcióelegy vizes fázisának az elemzésével az

1. táblázatban bemutatott eredményekhez jutunk.

1. táblázat

Racém ketoprofen-etil-észter hidrolízise kétfázisú biotranszformációval

A minta oldószere	Savtermelés (mg/ml)	Konverzió (%)
Víz	2,3	6,2
Toluol	0,1	1,3
Ciklohexán	1,1	14,1
Metanol	0,4	4,6
MTBE	0,7	8,3

Megfigyelhető, hogy a biotranszformáció bizonyos mértékig végbemegy ciklohexán vagy MTBE mint ol3

HU 218 409 Β dószer jelenlétében, azonban toluol - ilyen körülmények között - igen erősen gátolja.

3. példa

Az alkilcsoport befolyása

A racém ketoprofen különböző észtereit 20 g/1 koncentrációban ciklohexánban oldjuk; e célra a metil-, etil-, η-propil-, η-butil-, n-pentil- vagy n-hexil-észtert alkalmazzuk. A metil-észter esetében szuszpenziót készítünk, mivel ez az észter ciklohexánban csak kevéssé oldódik.

A nyers enzimoldat 5 ml alikvot részleteihez üvegampullában a fenti, hatféle racém ketoprofen-észter-oldatok mindegyikének 2 ml-es térfogatát adjuk. Biotranszformációs, vizes kontrollt készítünk üvegampullában, amely 5 ml nyers enzimoldatból, 200 pl 50%-os racém ketoprofen-etil-észter-oldatból, 0,5% Tween 80 törzsoldatból és 2,5 tömeg/térfogat% Triton X-100-ból áll. A reakciókat 24 órán át 25 °C hőmérsékleten rázatással játszatjuk le. Ekkor a biotranszformációs reakciók vizes fázisának HPLC-elemzése a 2. táblázatban bemutatott eredményeket adja.

2. táblázat

Racém ketoprofen-észterek hidrolízise kétfázisú biotranszformációval

Ketoprofen-észter	Savtermelés (mg/ml)	Konverzió (%)	Enantiomcr- többlet (S)-enantiomer (%)
Vizes kontroll	4,6	22,9	90
Metil-észter	1,7	42,3	90
Etil-észter	1,1	27,5	100
n-Propil-észter	1,0	25,6	86
n-Butil-észter	0,3	8,0	N/D
n-Pentil-észter	0,18	4,4	N/D
n-Hexil-észter	0,09	2,3	N/D

N/D: a csekély savtermelés miatt nem határoztuk meg

4. példa

AJ3 lizátumának az előállítása

Az AJ3 lizátumot az alábbi módszerrel növeljük 500 literes méretre.

Az AJ3 lizátumot - mint az 1. példában leírtuk 1 literes terelőlemezes lombikban 100 ml közegre oltjuk (lásd az 1. példát). Ezt követően az elegyet 48 órán át 25 °C hőmérsékleten körforgással rázzuk [300 rpm (percenkénti fordulatszám), 25 mm rázási szélesség], majd ebből 1 ml térfogatot három, egyenként 100 ml közeget tartalmazó 1 literes terelőlemezes lombikba viszünk át. A tenyészeteket további 48 órán át azonos körülmények között növesztjük, majd 500 liter közeget tartalmazó 750 literes fermentorba oltjuk. A fermentorban az alábbi közeget alkalmazzuk:

MgSO₄.7H₂O 0,4 g/1

CaCl₂.2H₂O 0,1 g/1

KH₂PO₄ 8,0 g/1

Élesztőkivonat 30,0 g/1

Nyomelemoldat 200 pg/l (mint

1. példában)

Habzásgátló (XFO-371) 0,5 ml/1 pH (NaOH-dal beállítva) 6,0

Ezt a közeget 121 °C hőmérsékleten 50 percig sterilizáljuk, majd 15 liter 50 tömeg/térfogat%-os, steril glükózoldatot adunk hozzá.

Szabályozott feltételek: 25 °C hőmérséklet; pH=6,0 (foszforsav vagy nátrium-hidroxid hozzáadásával); levegővel való telítettség legalább 50%; a keverést és levegőztetést is szabályozzuk.

órás tenyésztés után a sejteket kezeléssel in situ elöljük, és a lízist elősegítjük. Ezt úgy érjük el, hogy a hőmérsékletet 15 °C-ra csökkentjük, és nátrium-hidroxid hozzáadásával a pH értékét 10-re állítjuk. 50 perces kezelés után a fermentációs folyadékot foszforsavval ismét pH 7-re állítjuk, és a sejteket folyamatos centrifugálással összegyűjtjük. Az összegyűjtött sejteket különböző tartóedényekbe osztjuk, és felhasználásig -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

A mélyhűtött (fagyasztott) sejteket felengedni hagyjuk, és 25 tömeg/térfogat%-os koncentrációban (a nedves sejttömegre vonatkoztatva) 6,5 pH-értéken 50 mM KH₂PO₄-oldatban ismét szuszpendáljuk. 30 perces keverés után a sejteket centrifugálással összegyűjtjük, utána a sejteket 25 tömeg/térfogat%-os koncentrációban (a nedves sejttömegre vonatkoztatva) lízishez alkalmas pufferoldatban (0,3 M Na₂CO₃, pH=10,5) ismét szuszpendáljuk. A lízist másnapig végezzük 4 °C hőmérsékleten keverés közben, majd a lizátumot centrifugálással derítve, a sejttörmeléket a felülúszótól elkülönítjük. Az enzimoldat (azaz a lizátum felül úszó része) aktivitását standard biotranszformációs körülmények alkalmazásával határozzuk meg, a következőképpen: 1 ml enzimoldatot 0,1 M Na₂CO₃-tal megfelelően hígítva; pH = 10,0; 40 pl 50%-os racém ketoprofen-etil-észter-oldat; 0-5% Tween 80 törzsoldat; 2,5 tömeg/térfogat% Triton X-100. A biotranszformációkat 20 ml térfogatú, zárt üvegampullákban 1 órán át rázatással 25 °C hőmérsékleten végezzük. Az aktivitást U/ml-ben fejezzük ki, ahol 1 egység (U) azt jelenti, hogy óránként 25 °C hőmérsékleten 1 mg ketoprofensav termelődik. Az enzimoldatokat célszerűen úgy hígítjuk, hogy a mért aktivitás az 1-5 U/ml tartományba essék.

Az 50%-os racém ketoprofen-etil-észter törzsoldatot a következőképpen készítjük: 10 ml desztillált vízhez 25 g racém ketoprofen-etil-észtert és 0,25 g Tween 80-at adunk, majd a keveréket 5 percig ultrahanggal kezeljük (15 pm amplitúdó, 10 másodperces bekapcsolási és 10 másodperces kikapcsolási ciklussal). Ezután a térfogatot desztillált vízzel 50 ml-re töltjük, és a törzsoldatot autoklávban sterilizáljuk. így hosszabb időn át tárolható.

A lizátumok aktivitása általában 1,5 U/ml-nek adódott.

5. példa

Hidrolitikus aktivitású enzimtermék elkülönítése és tisztítása

HU 218 409 Β pott oldatot QA52 gyantán ismét kromatografálva a

4. táblázatban bemutatott eredményekhez jutunk.

A 4. példában előállított, derített lizátumot desztillált vízzel szemben dializáljuk (dialízissel szűrjük) (Amicon DC2 ultraszűrő egység, 30 000 molekulatömeg-mérethatárú üreges rosttöltettel), amíg a lizátum vezetőképessége egy 20 mM Na₂CO₃-ot tartalmazó,

9,2 pH-értékű pufferoldat („A” puffer) vezetőképességét el nem éri. Ezután az oldatot negyedére-ötödére tömény ítj ük, ekkor általában a kezdeti aktivitásnak több mint 90%-a megmarad. Az enzimaktivitással bíró terméket (enzimterméket) 1 órán át környezeti hőmérsékleten, tételenként, előzőleg egyensúlyba hozott QA52 anioncserélő gyantára helyezzük (beszerzési helye: Pharmacia); 7-10 U enzimaktivitást töltünk rá a nedves QA52 gél 1 ml-ére vonatkoztatva. A töltött gélt oszlopba helyezzük 200 mm/óra lineáris áramlási sebesség mellett. Ezt követően a kromatográfiát 4 °C hőmérsékleten hajtjuk végre.

Az oszlopot az „A” pufferoldattal alapszintig mossuk. Gradiens eluálást végzünk az oszlop térfogatának tízszeresében vett, 0-0,5 M nátrium-kloridot tartalmazó „A” pufferoldattal; a gradiens térfogat 1/35 részének megfelelő térfogatú frakciókat veszünk. Az így nyert eluálás általános profilját a 3. táblázatban szemléltetjük.

3. táblázat

A QA52-n végzett kromatográfia első fokozatának elúciós profilja

Frakció	Összes aktivitás (U)	Hozam
Töltet	99	-
Átfolyás (átáramlás)	0	0
Mosás	0	0
1.	0	0
5.	0,3	0,3
6.	2,0	2,0
7.	6,6	6,7
8.	19,5	19,7
9.	22,2	22,4
10.	10,0	10,1
11.	2,5	2,5
13.	1,0	1,0
17.	0,3	0,3

Az aktív anyagot a 0,12-0,18 M koncentrációban konyhasót tartalmazó pufferoldattal eluáljuk.

A 7-10. frakciókat egyesítettük, s így az egyesített frakció aktivitásának hozama 63,5%-nak, az egyesített frakció fehérjehozama 15,8%-nak adódott.

Az egyesített frakciót - amely az aktivitást tartalmazza - YM 30 membrán alkalmazásával, keverőcellás ultraszűrő egység (AMICON) használatával aktivitási veszteség nélkül töményítjük, és az „A” pufferoldattal szemben dializáljuk, amíg vezetőképességének az értéke a 3,2-3,6 mS értéket el nem éri. Az így ka4. táblázat

A QA52-n végzett kromatográfia második fokozatának elúciós profilja

Frakció	Összes aktivitás (U)	Hozam (%)
Töltet	3111	-
Átfolyás (átáramlás)	0	0
Mosás	0	0
13.	60	1,9
14.	193	6,2
15.	407	13,1
16.	828	26,6
17.	890	28,6
18.	445	14,3
19.	152	4,9
20.	81	2,6

Ebben a második fokozatban az aktív anyagot a 0,2-0,25 M koncentrációban konyhasót tartalmazó pufferoldattal eluáljuk.

A 15-17. frakciókat egyesítettük, és egy mintájában az aktivitást és a fehérjetartalmat meghatároztuk.

Aktivitás: 27,8 U/ml

Összes aktivitás: 2599 U

Az összes aktivitás hozama: 83,5%

Fehéije (a biuretmódszerrel mérve): 1,34 mg/ml

Összes fehérje: 125 mg

Az összes fehérjehozam: 5,5%

Az egyesített frakciót Pharmacia MONO P HR 5/5 előre betöltött FPLC anioncserélő gyanta használatával tovább tisztítjuk, a következő kromatográfiás körülmények között:

Kis sótartalmú pufferoldat: 20 mM etanolaminHC1, pH=9,0; nagy sótartalmú pufferoldat: 20 mM etanolamin-HCl plusz 0,3 M nátrium-klorid, pH=9,0; áramlási sebesség: 1 ml/perc.

A gradiens profilja Idő NaCl-koncentráció

0-5. perc : 0 M 5-7. perc : 0-0,1 M 7-20. perc: 0,1-0, 3 M

20-22. perc : 0,3 M

22- 23. perc : 0,3-0 M

23- 25. perc : 0 M

A minta térfogata: 1 ml

Frakciótérfogat: 1 ml

A második fokozatú QA52 kromatográfiából származó, egyesített frakciókat 30 000 molekulatömeg-mérethatárú ultraszűrő membránon a tizedére töményítjük, és az így kapott koncentrátumot a kis sótartalmú pufferoldattal Pharmacia G-25 PD10 gélszűrő oszlop alkalmazásával HPLC céljára sómentesítjük. A HPLCoszlopra tételenként megközelítőleg 5 mg összes fehérjét töltünk. így az 5. táblázatban látható elúciós profilt kapjuk.

HU 218 409 Β

5. táblázat

A mono P anioncserélő HPLC során kapott elúciós profil

Frakció (perc)	Aktivitás (U/ml)	Hozam (%)
Töltet	104,0	-
8.	5,7	5,5
9.	63,8	61,3
10.	28,3	27,2
11.	7,5	7,2
12.	1,9	1,8
13.	0,0	0,0

A 9. és 10. frakciókat egyesítve az összes aktivitásra vonatkoztatott hozam 88,5%-nak adódik. Az egyesített aktív anyagot méretkizáró HPLC-módszerrel tovább tisztítjuk.

A soron következő elkülönítés céljára 30 cm χ 7,8 mm méretű Analgel-TSK G3000 SWXL méretkizáró HPLC-oszlopot alkalmazunk az alábbi kromatográfiás körülményekkel:

Pufferoldat: 0,1 M K₂HPO₄ 20 mM Na₂EDTA, pH=7,0

Áramlási sebesség: 0,4 ml/perc

A minta térfogata: 200 μΐ

Frakciótérfogat: 400 μΐ

A MONO P ioncserélő HPLC-folyamatból származó, egyesített frakciót 1,5-szeresére töményítjük egy 10 000 molekulatömeg-mérethatárú ultraszűrő membrán használatával. A betöményített mintát méretkizáró HPLC pufferoldattal sómentesítjük Pharmacia G25 pdlO oszlopon. így a 6. táblázatban bemutatott elúciós profil alakul ki.

6. táblázat

Méretkizáró HPLC-eljárással kapott elúciós profil

Frakció (perc)	Aktivitás (U/ml)	Hozam (%)
Töltet	131,0	-
17,5	0,0	0
18,5	0,0	0
19,5	1,5	2,3
20,5	13,3	20,3
21,5	7,5	11,5
22,5	2,6	4,0
23,5	0,8	1,2

Saját A73 jelű racém ketoprofen-etil-észter észterázunk molekulatömegét az SDS-PAGE (nátriumdodecil-szulfát-poliakrilamid gél elektroforézis) módszerrel mértük. Előre kialakított, 12%-os homogén SDS-PAGE minigélt (BDH) alkalmaztunk, amelyet a fehérjék molekulatömegének standard jelzőivel (D1SC) előzőleg megfestettünk, a molekulatömegek összehasonlítása céljából. A kifejlesztéshez pufferoldatként Electrograd Buffer TTS (BDH) puffért alkalmaztunk.

Az elektroforézist állandó feszültségen (200 V) és állandó határárammal (gélenként 40 mA) hajtjuk végre, amíg a kék festékanyag frontja a gélen teljesen át nem halad. A fehérjét Coomassie Blue festékanyaggal tettük láthatóvá.

Az észteráznak megfelelő fehérje sávját aktív és inaktív minták fehérjesávjaival összehasonlítva azonosítottuk. Az aktív fehérje és a fehérjestandardok viszonylagos vándorlási távolságainak összehasonlítása alapján az új, tisztított, denaturált fehérje molekulatömege kissé nagyobb, mint a 32 500 dalton molekulatömegű jelzőanyagé.

6. példa

A pH befolyása a hidrolitikus aktivitásra

A biotranszformáció pH-profilját a fentebb leírt, egyesített anyag alkalmazásával, négyhavi, -20 °C-on végzett tárolás után vizsgáltuk. Egy alikvot részt szobahőmérsékleten felengedni hagytunk, majd tízszeres mennyiségű desztillált vízzel hígítottuk (így hígított enzimoldatot kaptunk). Az alább felsorolt sók felhasználásával 1,1 M puffer-törzsoldatokat állítottunk elő az alábbi pH-értékkel (a pH értékét szükség szerint nátriumhidroxid vagy sósav hozzáadásával állítottuk be):

PH

6,0 NaH₂PO₄

7,0 NaH₂PO₄

8,0 NaH₂PO₄

9,0 glicin-HCl

10,0 glicin-HCl

11,0 Na₂HPO₄

A biotranszfomációs reakciókat zárt üvegampullákban végeztük, amint következik:

ml hígított enzimoldat;

100 μΐ megfelelő pH-értékű, 1,1 M puffer-törzsoldat;

μΐ 50%-os racém ketoprofen-etil-észter törzsoldat;

2,5 tömeg/térfogat% Triton X-100

12,0 pH-értéken végzett biotranszformáció esetében 11,0 pH-értékű reakcióelegyhez közvetlenül 1 M nátrium-hidroxid-oldatot adunk, amíg a pH helyes értékét el nem érjük. Az összes biotranszformációt kétszeres ismétlésben, 1 órán át 25 °C hőmérsékleten rázás közben végezzük. A reakciók fő eredményeit a 7. táblázatban szemléltetjük. A maximális aktivitást 10-es pH alkalmazásakor észleltük.

7. táblázat

Az AJ3-mal végzett biotranszformáció pH-profilja

Biotranszformáció- pH	Aktivitás (U/ml)	Normalizált hozam (%)
6	1,32	27,6
7	1,97	41,2
8	2,47	51,7
9	2,95	61,7

HU 218 409 Β

7. táblázat (folytatás)

Biotranszformáció-	Aktivitás	Normalizált hozam
pH	(U/ml)	(%)
10	4,78	100,0
11	2,35	49,2
12	0,36	7,5

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás legalább 93% enantiomer-többletű (S)-2(3-benzoil-fenil)-propionsav előállítására 2-(3-benzoilfenilj-propionsav valamely alkil-észtere enantiomerjeinek a keverékéből, azzal jellemezve, hogy biokatalizátorként egy Ophiostoma nemzetségbe tartozó mikroorganizmust alkalmazunk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (S)-2-(3-benzoil-fenil)-propionsavat 15-25% konverzióval állítjuk elő.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 5 hogy biokatalizátorként az Ophiostoma novo-ulmi IMI

356050 mikroorganizmust alkalmazzuk.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy alkil-észterként 1-3 szénatomos alkil-észtert alkalmazunk.

10
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy alkil-észterként etil-észtert alkalmazunk.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakciót 8-11 pH-értéken hajtjuk végre.

15 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakciót 9,5-10,5 pH-tartományban hajtjuk végre.