CZ283262B6

CZ283262B6 - Způsob výroby převážně (S)-2-(3-benzoylfenyl) propionové kyseliny

Info

Publication number: CZ283262B6
Application number: CZ952133A
Authority: CZ
Inventors: Julie Belinda Hazel Warneck; Richard Anthony Wisdom
Original assignee: Laboratorios Menarini S.A.
Priority date: 1993-03-03
Filing date: 1994-03-03
Publication date: 1998-02-18
Also published as: JPH08506718A; CA2157369C; ES2087046T1; AU6208194A; PL310434A1; HU9502560D0; ES2087046T3; SK104395A3; DK0693134T3; GR3024853T3; DE69403960D1; SK280049B6; FI954079A; NO953413D0; GB9304256D0; KR100308411B1; DE69403960T2; FI104327B; WO1994020633A1; HK1006469A1

Abstract

Mikroorganismus rodu Ophiostoma nebo Ceratocystis, nebo látka, mající enzymovou aktivitu od něho odvozenou, se používá jako stereospecifické činidlo v biotransformační reakci k výrobě (S)-ketoprofenu ze směsi enantiomerů jeho esterů.ŕ

Description

(57) Anotace:

Mikroorganismus rodu Ophiostoma nebo Ceratocystis, nebo látka, mající enzymovou aktivitu od něho odvozenou, se používá jako stereospecifické činidlo v biotransformační reakci k výrobě (S)-ketoprofenu ze směsi enantiomerů jeho esterů.

CZ 283 262 B6

Způsob výroby převážně (S)-2-(3-benzoylfenyl)propionové kyseliny

Oblast techniky

Vynález se týká rozlišení arylalkanové kyseliny, zejména kyseliny 2-(3-benzoylfenyl)propionové, Ketoprofenu.

Dosavadní stav techniky

Množství 2-arylpropionových kyselin je dobře známo pro své protizánětlivé působení. K příkladům patří ibuprofen, naproxen a ketoprofen. Tyto sloučeniny jsou chirální a nyní je zjištěno, že jejich hlavní léčebná aktivita přísluší (S)-enantiomeru.

Dosud je známo několik metod k získání (S)-enantiomeru, který by neobsahoval (R)enantiomer. Patří k nim asymetrická chemická synthesa a chemické rozlišení, jako je stechiometrická krystalisace diastereomemích solí, tvořených různými chirálními aminy.

Jiný možný přístup je biokatalytický, za použití biokatalyzátoru k selektivní hydrolyse esteru 2arylpropionové kyseliny. Za předpokladu, že může být stanoven biokatalyzátor se správnou stereospecifitou, lze získat reakční směs, obsahující nezreagovaný ester jednoho enantiomeru a kyselý produkt druhého enantiomeru. Oddělení a získání produktu je pak poměrně snadné. Nezreagovaný ester může být racemizován a znovu použit k další reakci, čímž je zajištěna téměř úplná konverze racemického substrátu na požadovaný produkt jednoho enantiomeru.

EP-A-0227078 popisuje použití několika vněbuněčných (extracelulámích), komerčně dostupných mikrobiálních lipáz k takovému biokatalytickému rozlišení. Obecně jsou však vyžadována větší množství enzymu a reakce probíhá 2 až 6 dní. Provádění takových reakcí by proto bylo nákladné. Nej lepším enzymovým preparátem, který byl poznán, byl enzym z mikroorganismu Candida cylindracea (známého také jako Candida rugosa); avšak v EP-A-0407033 bylo prokázáno, že jeho přípravek, vykazující rovněž nízkou aktivitu, obsahoval více než jeden enzym s esterázovou aktivitou. K získání ketoprofenu s vysokou enzymovou účinností (ee) bylo nezbytné přípravek dále čistit.

EP-A-0233656 popisuje isolaci a klonování esterázového genu z Bacillus thai. U tohoto enzymu je prokázána selektivní hydrolýza ethyl- a methylesteru jak naproxenu, tak i ibuprofenu, poskytující (S)-kyseliny příslušných sloučenin. Rovněž je zde ukázáno, že klonováním enzymu vznikl přípravek, poskytující produkt s vyšší enzymovou účinností jako výsledek minimalizace jiných vedlejších aktivit enzymu.

WO-A-9323547 popisuje množství kmenů, produkujících rovněž esterázu, hydrolyzující selektivně estery naproxenu. Jako nejlepší byl označen kmen Zopfiella latipes, z něhož byla esteráza nakloňována.

WO-A-9304189 popisuje mikroorganismus rodu Trichosporon, schopný s enzymovou účinností větší než 90% selektivní hydrolýzy (S)-enantiomeru ethylketoprofenu za vzniku (S)-kyselého produktu. Enzym, který uskutečňuje tuto biotransformaci, je nitrobuněčný, intracelulámí. Zvýšit biokatalytickou aktivitu genovým klonováním nebo klasickou mutagenezi se ukázalo jako obtížné, neboť je obtížné získat stabilní preparáty, neobsahující buňky.

V pozadí tohoto vynálezu byla snaha získat biokatalyzátor s dobrou aktivitou vzhledem k různým ketoprofenovým esterům, poskytující s dobrou enzymovou účinností kyselý ketoprofenový

- 1 CZ 283262 B6 produkt a který by byl vhodný pro klonování a hyperexpresi, například v E. coli, k poskytnutí biokatalyzátoru, jehož nákladnost by byla udržována na minimu.

Podstata vynálezu

Přehledné testování (screening) široké škály mikroorganismů z různých zdrojů překvapivě ukázalo, že askomycéta Ophiostoma novo-ulmi (známá rovněž jako Ceratocystis ulmi) produkuje intracelulámí hydrolytický enzym, který může katalyzovat požadovanou reakci. Další testy ukázaly, že na rozdíl od kmene, popsaného ve WO-A-9304189, je možné získat stálou bezbuněčnou aktivitu, hodící se tedy pro klonování a možné použití v bezbuněčných biotransformacích. Ophiostoma novo-ulmi je rostlinný patogen, známý jako virulentní příčinné agens, vyvolávající holandskou elmskou nemoc. Známá je jeho blízká příbuznost s méně virulentními kmeny Ophiostoma ulmi a také s O. piceae.

Při rozvíjení tématiky prvotního objevu, podtrhujícího předkládaný vynález, bylo zjištěno, že stereospecifícká esterázová aktivita se v případě různých kmenů mikroorganismu Ophiostoma novo-ulmi vyskytuje u Ophiostoma ulmi (známého někdy rovněž jako Ceratocystis ulmi) a Ophiostoma piceae (známého někdy rovněž jako Ceratocystis piceae) a u isolátů, sebraných z různých míst v USA, Evropě, na Středním Východě a v Uzbekistánu. Kromě toho byly různé kmeny druhu Ceratocystis získány zIMI, Egham, Surrey, Velká Británie atestovány na přítomnost uvedené aktivity. Bylo zjištěno, že aktivita se vyskytuje rovněž u kmenů C. coronata (např. IMI 176533), C. ips (např. IMI 212114), C. tetropií (např. IMI 212117), C. cainii (např. IMI176523), C. arborea (např. IMI 176529) a C. stenoceras (např. IMI 268494). Zdá se tedy, že aktivita je široce rozšířena u škály různých kmenů Ceratocystis, získaných z různých míst světa.

Kmen původního testovaného izolátu, označovaný zde jako AJ3, byl v IMI uložen 15. února 1993 pod přírůstkovým číslem IMI 356050, za podmínek Budapešťské dohody. Tento kmen poskytuje dobrý příklad aktivity; avšak vzhledem k široce rozšířené povaze uvedené aktivity u rozmanitého množství příbuzných kmenů není úmyslem autorů omezit rozsah vynálezu na tento jediný mikroorganismus. Vynález je rozšířen také na použití enzymové aktivity, isolované z takových mikroorganismů jakoukoli vhodnou technikou.

Ve shodě s předkládaným vynálezem mohou být mikroorganismy rodu Ophiostoma a jejich enzymová aktivita použity ke stereoselektivnímu hydrolyzování racemického alkylesterů ketoprofenu, za vzniku kyseliny, zásadně obohacené (S)-enantiomerem, např. na 93 až 96 % přebytek enantiomeru či větší, při konverzi 15 až 25 %, a zbytkového esteru, obohaceného (R)enantiomerem. Reakce může probíhat v jakékoli směsi enantiomerů daného esteru, i když obvykle bývá směs racemátem. Alkylová skupina esteru je výhodně tvořena 1 až 3 atomy uhlíku. Reakce probíhá s výhodou při pH 8 až 11, lépe 9,5 až 10,5 a nejlépe při pH přibližně 10. Obvykle se používá organické rozpouštědlo, jako je cyklohexan.

K oddělení kyselého produktu od esteru se potom používá obvyklých chemických postupů. Pokud je to nezbytné, je možné zlepšit optickou čistotu kyseliny použitím chirálního aminu, jako je (R)-a-methylbenzylamin. Ester, který zbývá nezměněný, může být racemizován pro další použití.

-2 CZ 283262 B6

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady dokreslují vynález.

Příklad 1

Biologická transformace racemického ethylketoprofenu prostřednictvím AJ3

Pro růst organismu bylo použito následující médium:

(NH4)₂SO₄	(g/i)	0,5
MgSO₄.7H₂O	(g/i)	0,25
CaCl₂.2H₂O	(g/1)	0,1
KH₂PO₄	(g/i)	8,0
extrakt z kvasinek	(g/1)	10,0
glukóza	(g/1)	5,0
roztok stopových prvků	(μΐ/ΐ)	100

pH (s NaOH) 6,5

Použitý roztok stopových prvků obsahoval:

CaCl₂.2H₂O	(g/D	3,57
ZnO	(g/D	2,0
CuC1₂.2H₂O	(g/i)	0,85
Na₂MoO₄.2H₂O	(g/1)	4,8
MnCl₂.4H₂O	(g/1)	2,0
FeCl₃.6H₂O	(g/1)	5,4
h₃bo₄	(g/1)	0,3
CoCl₂.6H₂O	(g/1)	2,4
HC1	(ml/1)	250

Buňky AJ3 byly naočkovány z agarové plotny se sladovým výtažkem do 30 ml růstového média v 250 ml lahvi s přepážkami. Ta byla 30 hodin protřepávána při 23 °C a poté bylo 2,5 ml přeneseno do druhé 250 ml lahve s přepážkami, obsahující 30 ml média. Po dalším nárůstu, trvajícím při teplotě 23 °C a za protřepávání 40 hodin, byl k růstovému bujónu přidán racemický ethylketoprofen do koncentrace 20 g/1. Poté byla biotransformace ponechána probíhat 120 hodin, po níž analýza pomocí HPLC prokázala, že došlo k 18,2% hydrolýze přidaného esteru. Enantiomemí přebytek vzniklé ketoprofenové kyseliny činil 96 % ve prospěch (S)-enantiomeru.

Příklad 2

Vliv organického rozpouštědla

Za použití stejného růstového média jako v Příkladu 1, avšak o pH 6,0 a bez glukózy, byl připraven roztok surového enzymu. Buňky mikroorganismu AJ3 byly naočkovány do 100 ml média v třepací lahvi o objemu 1 1. Kultura byla za protřepávání pěstována 48 hodin při teplotě 30 °C, pak bylo 10 ml přeneseno do 90 ml čerstvě připraveného média v třepací lahvi o objemu 1 1 a pěstováno dalších 8 hodin za protřepávání při 30 °C. Tato láhev byla použita k naočkování laboratorního fermentoru o objemu 2,8 1, obsahujícího 1,5 1 média s glukózou (5 g/1) a soustavu (5 ml/1), tvořenou silikonem/protipěnícím činidlem na bázi PPG (XFO371, Ivanhoe Chemicals,

III., USA). Tento fermentor byl činný 48 hodin za míchání a aerace a byl řízen k udržování

DOT > 50% nasycení vzduchem, teploty 30 °C a pH 6,0.

Po zkončení fermentace byly buňky shromážděny odstředěním a pelet byl znovu naředěn na 10% (hmotnost/objem, na základě hmotnosti vlhkých buněk) lyzačním pufrem tj. 0,1 M uhličitanem sodným v 5% vodném roztoku Tritonu X-100. Lyžování buněk bylo prováděno přes noc při 8 °C za protřepávání a poté byl lyzát, obsahující enzymovou aktivitu oddělen od zbytků buněk odstředěním.

Racemický ethylketoprofen byl rozpuštěn v každém ze 4 organických rozpouštědel: toluenu, cyklohexanu, methanolu a MTBE (methyl-t-butyletheru) v koncentraci 20 g/1. 2 ml každého z těchto roztoků byly přidány k 5 ml alikvotním částem surového enzymového roztoku ve skleněných lahvičkách. Do skleněné lahvičky byl připraven rovněž kontrolní vodný biotransformační roztok, obsahující 5 ml surového enzymového roztoku, 400 μΐ 50% racemického ethylketoprofenu, 0,5 % hm./obj. zásobní roztok Tween 80 a 2,5 % (hm./obj.) Tritonu X-100. Všechny vzorky byly ponechány reagovat za protřepávání 48 hodin při 25 °C. Analýzou vodné fáze každé z reakčních směsí byly získány výsledky, uvedené v Tabulce 1.

Tabulka 1:

Hydrolýza racemického ethylketoprofenu ve dvoufázových biotransformačních vzorcích

rozpouštědlo vzorku	vytvořená kyselina (mg/ml’¹)	konverze (%)
vodné	2,3	6,2
toluen	0,1	1,3
cyklohexan	1,1	14,1
methanol	0,4	4,6
MTBE	0,7	8,3

Je zřejmé, že biotransformace pracuje v přítomnosti cyklohexanu nabo MTBE jako rozpouštědel do určitého rozsahu, je ale za stejných podmínek dosti silně inhibována toluenem.

Příklad 3

Vliv alkylové skupiny

Různé estery racemického ketoprofenu byly rozpuštěny v koncentraci 20 g/1 v cyklohexanu. Použitými estery byly methyl, ethyl, n-propyl, n-butyl, n-pentyl a n-hexyl. V případě methylesteru byla vzhledem k nízké rozpustnosti esteru v cyklohexanu připravena suspenze.

K 5 ml alikvotním částem roztoku surového enzymu ve skleněných lahvičkách byly přidány 2 ml každého ze šesti dříve uvedených roztoků racemického esteru ketoprofenu. Do skleněné lahvičky byl rovněž připraven vodný biotransformační vzorek, obsahující 5 ml roztoku surového enzymu, 200 μΐ 50 % racemického ethylketoprofenu, 0,5 % zásobní roztok Tweenu 80 a 2,5% (hm./obj.) Tritonu X-100. Reakce probíhala za protřepávání 24 hodin při 25 °C. Výsledky anylýzy vodné fáze každého z biotransformačních vzorků pomocí HPLC jsou uvedeny v Tabulce 2.

-4CZ 283262 B6

Tabulka 2:

Hydrolýza racemických ketoprofenových esterů ve dvoufázových biotransformačních vzorcích

ketoprofenový ester	vytvořená kyselina (mg.mr¹)	konverze (%)	EE, enzymová účinnost (%(S)-enantiomeru)
vodná kontrola	4,6	22,9	90
methyl	1,7	42,3	90
ethyl	1,1	27,5	100
n-propyl	1,0	25,6	86
n-butyl	0,3	8,0	nestanoveno
n-pentyl	0,18	4,4	nestanoveno
n-hexyl	0,09	2,3	nestanoveno

nestanoveno = nebylo možné stanovit vzhledem k malému množství nashromážděné kyseliny

Příklad 4 ío Příprava lyzátu AJ3

Lyzát AJ3 byl pěstován do rozsahu 500 litrů za použiti dále uvedené metodologie

AJ3 byl naočkován do 100 ml média (jako v Příkladu 1) v přepážkové lahvi o objemu 1 1. Po 15 napěstování mikroorganismu za 48 hodin při 25 °C a rotačním protřepávání (300 ot. za minutu, výkyv 25 mm), byl 1 ml přenesen do každé ze tří jednolitrových přepážkových lahví, obsahujících po 100 ml média. Kultury pak byly pěstovány za obdobných podmínek dalších 48 hodin, spojeny a použity k naočkování 750 litrového fermentoru, obsahujícího 500 1 média.

Použito bylo následujícího média:

MgSO₄.7H₂O	(g/i)	0,4
CaCl₂.2H₂O	(g/i)	0,1
kh₂po₄	(g/i)	8,0
extrakt z kvasinek	(g/1)	30,0
roztok stopových prvků	(μΐ/ΐ)	200 (jako v Příkladu 1)
protipěnivé činidlo FXO 371	(ml/1)	0,5
pH (sNaOH)		6,0

Médium bylo před přidáním 15 1 50 % (hm./obj.) sterilního roztoku glukózy po dobu 50 minut sterilizováno při 121 °C.

Kontrolní podmínky zahrnovaly: teplotu 25 °C, pH 6,0 při přídavku kyseliny fosforečné nebo hydroxidu sodného a DOT > 50 % nasycení vzduchem, dosažené promícháváním a řízeným 35 provzdušňováním.

Po 64 hodinách růstu byly buňky in šitu (na místě) ovlivněny tak, aby došlo k jejich usmrcení a nápomoci jejich lyže. Toho bylo dosaženo poklesem teploty na 15 °C a přídavkem hydroxidu sodného, upravujícího pH na 10,0. Po 50 minutách takového působení bylo pH živného bujónu 40 upraveno pomocí kyseliny fosforečné opět na hodnotu 7,0 a buňky byly odděleny v kontinuální odstředivce. Získané buňky byly rozděleny do různých zásobníků a skladovány až do použití při -20 °C.

-5CZ 283262 B6

Zamražené buňky byly rozmraženy a naředěny na 25% suspenzi (hmotn./objem, na základě hmotnosti vlhkých buněk) 50 mM roztokem KH₂PO₄ o pH 6,5. Po 30 minutách míchání byly buňky shromážděny odstředěním. Poté byly znovu suspendovány na 25 % (hm./obj., na základě hmotnosti vlhkých buněk) v lyzačním pufru, tj. 0,3 M Na₂CO₃ opH 10,5. Lyže probíhala přes noc při 4 °C za míchání a poté byl lyzát vyčeřen odstředěním k oddělení zlomků buněk ze supematantu. V roztoku enzymu, tj. supematantu lyzátu, byla stanovována aktivita za použití standardních podmínek biotransformace, kterými se rozumí 1 ml enzymového roztoku, vhodně naředěného 0,1 M Na₂CO₃ o pH 10,0, 40 μΐ 50% racemického ethylketoprofenu, 0 - 5% zásobní roztok Tweenu 80 a 2,5% (hmotn./obj.) Tritonu X-100. Biotransformace byly prováděny v uzavřených skleněných lahvičkách o objemu 20 ml, za protřepávání, po 1 hodinu při teplotě 25 °C. Aktivita je vyjádřena v jednotkách U/ml, kdy jedna jednotka (U) = 1 mg ketoprofenové kyseliny, vzniklé za 1 hodinu při 25 °C. Enzymové roztoky byly považovány za vhodně naředěné, pokud se naměřená aktivita pohybovala v rozmezí od 1 do 5 U/ml.

50% zásobní roztok racemického ethylketoprofenu byl připravován následovně: 25 g racemického ethylketoprofenu a 0,25 g Tweenu 80 se přidalo do 10 ml destilované vody a vzniklá směs se dezintegrovala ultrazvukem (sonikovala) 5 minut (při amplitudě 15 mikrometrů, v cyklech 10 sekund sonikace/10 sekund prodleva). Pak byl objem doplněn destilovanou vodou na 50 ml. Zásobní roztok byl sterilizován v autoklávu a poskytnut k dlouhodobému skladování. Typická aktivita lyzátu byla 1,5 U/ml.

Příklad 5

Isolace a vyčištění složky s hydrolytickou aktivitou

Vyčeřený lyzát (Příklad 4) byl dialyzačně ultrafiltrován proti destilované vodě (Amicon DC2 ultrafiltrační jednotkou, používající patrony z dutých vláken k oddělení částic o molekulové hmotnosti do 30 000), dokud vodivost lyzátu nedosáhla vodivosti 20 mM pufru Na₂CO₃ o pH 9,2 (pufru A). Pak byl roztok 4-5 násobně zahuštěn a obvykle obsahoval > 90 % aktivity. Enzymová aktivita byla v kádince (béči) přenesena na předem ekvilibrovanou QA52 aniontovou výměnnou pryskyřici (Pharmacia) na 1 hodinu při laboratorní teplotě, při zatížení 7 - 10 U aktivity na ml vlhkého gelu QA52. Gel, nesoucí aktivitu, byl zformován ve sloupec (kolonu) při lineární rychlosti toku 200 mm/h. Následně byla prováděna chromatografie při 4 °C.

Sloupec byl promýván pufrem A až k zisku základní hodnoty. Eluce se prováděla za použití gradientu, tvořeného 0 - 0,5 M NaCl v pufru A, o objemu desetinásobku sloupce a zachycovány byly podíly (frakce), odpovídající 1/35 objemu tohoto gradientu. Obvykle získaný profil eluce je znázorněn v Tabulce 3.

-6CZ 283262 B6

Tabulka 3: Eluční profil prvního průchodu chromatografickým sloupcem QA52

Podíl (frakce)	celková aktivita (U)	výtěžek
PLNICÍ TOK	99	-
PROSTŘEDNICTVÍM	0	0
PROMÝVÁNÍ	0	0
1	0	0
5	0,3	0,3
6	2,0	2,0
7	6,6	6,7
8	19,5	19,7
9	22,2	22,4
10	10,0	10,1
11	2,5	2,5
13	1,0	1,0
17	0,3	0,3

Aktivita byla eluována v koncentračním rozmezí NaCI 0,12 - 0,18 M. Podíly 7-10 (včetně) byly spojeny, aby poskytly:

výtěžek aktivity spojených podílů = 63,5 % výtěžek bílkovin spojených podílů = 15,8 %

Spojená aktivita byla zahuštěna za použití membrány YM 30 v ultrafiltrační jednotce s míchanou komůrkou (AMICON) bez ztráty aktivity a dialyzována vůči pufru A, dokud nebylo dosaženo vodivosti 3,2 až 3,6 mS. Poté byla opětně chromatografována na pryskyřici QA52. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 4.

Tabulka 4: Eluční profil druhého průchodu chromatografickým sloupcem QA52

Podíl (frakce)	celková aktivita (U)	výtěžek
PLNICÍ TOK	3111
PROSTŘEDNICTVÍM	0	0
PROMÝVÁNÍ	0	0
13	60	1,9
14	193	6,2
15	407	13,1
16	828	26,6
17	890	28,6
18	445	14,3
19	152	4,9
20	81	2,6

Při tomto druhém průchodu byla aktivita eluována v rozmezí koncentrace NaCI od 0,2 do 0,25 M NaCI. Podíly 15 až 17 (včetně) byly spojeny. Ve spojeném vzorku byla stanovena aktivita a obsah bílkovin.

specifická aktivita = 27,8 U.mf¹ celková aktivita = 2599 U celkový výtěžek aktivity = 83,5 %

- 7 CZ 283262 B6 sp. obsah bílkovin (biuretová metoda) = 1,34 mg-ml'¹ celkový obsah bílkovin = 125 mg celkový výtěžek bílkovin = 5,5 %

Spojené podíly byly dále čištěny za použití MONO P HR 5/5 předem upravené aniontově výměnné FPLC firmy Pharmacia. Chromatografické podmínky byly následovně:

pufr s nízkým obsahem solí pufr s vysokým obsahem solí průtoková rychlost = 20 mM ethanolamin-HCI o pH 9,0 = 20 mM ethanolamin-HCI + 0,3 M NaCl o pH 9,0 = 1 ml/min

Profil gradientu:

čas

0-5 min

5-7 min

7-20 min

20-22 min

22- 23 min

23- 25 min koncentrace NaCl

0M

0-0,1 M

0,1-0,3 M

0,3 M

0,3-0 M 0M objem vzorku = 1 ml objem podílu = 1 ml

Spojené podíly z druhého průchodu chromatografickým sloupcem QA52 byly desetinásobně zahuštěny pomocí ultrafiltrační membrány, oddělující molekulovou hmotnost 30 000 a výsledný koncentrát byl zbaven solí v pufru pro HPLC o nízkém obsahu solí za použití gelového 25 filtračního sloupce Pharmacia G-25 PD 10. Na HPLC sloupec bylo při jednom běhu naneseno přibližně 5 mg celkových bílkovin. Získaný eluční profil je znázorněn dále v Tabulce 5:

Tabulka 5: Eluční profil při použití MONO P aniontově výměnné HPLC

podíly (v minutách)	aktivita (U.mr¹)	výtěžek (%)
nanesení vzorku	104,0
8	5,7	5,5
9	63,8	61,3
10	28,3	27,2
11	7,5	7,2
12	1,9	1,8
13	0,0	0,0

Podíly 9 a 10 byly spojeny k poskytnutí výtěžku celkové aktivity ve výši 88,5 %. Tato spojená aktivita pak byla dále čištěna pomocí HPLC na gelovém sítě (limitujícím velikost částic).

Pro následující separaci bylo použito sloupce pro HPLC Analgel-TSK G3000 SWXL 30 cm x

7,8 mm, limitujícího velikost částic. Chromatografické podmínky byly následovně:

pufr průtoková rychlost objem vzorku objem podílu = 0,1 M K₂HPO₄ + 20 mM Na₂EDTA pH 7,0 = 0,4 mimin'' = 200 μΐ = 400 μΐ

Spojené podíly z MONO P iontově výměnné HPLC byly zahuštěny l,5násobně pomocí ultrafiltrační membrány, oddělující molekulovou hmotnost 10 000 a výsledný koncentrát byl

-8CZ 283262 B6 zbaven solí v pufru pro gelovou HPLC za použití sloupce G-25 PD 10. Získán byl následující eluční profil (Tabulka 6).

Tabulka 6: Eluční profil gelové HPLC

podíly (v minutách)	aktivita (U.ml'¹)	výtěžek (%)
nanesení vzorku	131,0	-
17,5	0,0	0
18,5	0,0	0
19,5	1,5	2,3
20,5	13,3	20,3
21,5	7,5	11,5
22,5	2,6	4,0
23,5	0,8	1,2

Odhad molekulové hmotnosti racemické ketoprofenové esterázy z AJ3 byl učiněn pomocí SDSPAGE (elektroforézy v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsíranu sodného). Použit byl prefabrikovaný 12% homogenní SDS-PAGE mini-gel (firmy BDH) a předem zabarvené bílkovinné standardní markéry molekulové hmotnosti (firmy BISC) k porovnání molekulových hmotností. Jako pufr byl aplikován pufr Elektrograd TTS (firmy BDH).

Elektroforéza probíhala při stálém napětí (200 V) a omezeném proudu (40 mA na gel), dokud modře zabarvené čelo neprošlo ke konci gelu. Bílkoviny byly zviditelněny barvením pomocí Coomassie Blue.

Pruh bílkoviny, odpovídající esteráze, byl stanoven srovnáním s pruhy bílkoviny v aktivních a neaktivních vzorcích. Srovnáním poměrných migračních vzdáleností aktivní bílkoviny a bílkovinných standardů bylo zjištěno, že nově vyčištěná denaturovaná bílkovina měla molekulovou hmotnost slabě vyšší než markér o hmotnosti 32 500 Da.

Příklad 6

Vliv pH na hydrolytickou aktivitu

Profil pH při biotransformaci byl testován za použití výše popsaného spojeného materiálu následně po 4 měsících skladování při -20 °C. Alikvotní část byla rozmražena při laboratorní teplotě a desetinásobně naředěna destilovanou vodou (zředěný enzymový roztok). Zásobní roztoky 1,1 M pufru o následujících hodnotách pH byly připraveny za použití uvedených (pH bylo upraveno podle potřeby hydroxidem sodným nebo kyselinou chlorovodíkovou);

pH 6,0 pH 7,0 pH 8,0 pH 9,0 pH 10,0 pH 11,0

NaH₂PO₄

NaH₂PO₄glycin-HCl glycin-HCl

Na₂HPO₄

Biotransformační reakce byly prováděny v utěsněných lahvičkách následovně:

ml zředěného enzymového roztoku

100 μΐ odpovídajícího zásobního roztoku 1,1 M pH pufru μΐ 50% zásobního roztoku racemického ethylketoprofenu

2,5% (hm./obj.) Triton X-100

-9CZ 283262 B6

Pro biotransformaci při pH 12,0 byl přidáván 1 M roztok NaOH přímo k reakční směsi opH 11,0, dokud nebylo získáno požadované pH. Všechny biotransformace byly prováděny dvojmo a reakce probíhaly 1 hodinu za protřepávání při 25 °C. Hlavní výsledky reakcí jsou uvedeny v Tabulce 7. Maximální aktivita byla nalezena při pH 10.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby převážně (S)-2-(3-benzoylfenyl)propionové kyseliny, vyznačující se t í m , že vychází ze směsi enantiomerů alkylesterů 2-(3-benzoylfenyl)propionové kyseliny a zahrnuje použití, jako biokatalyzátoru, mikroorganismu rodu Ophiostoma nebo Ceratocystis, nebo látky, mající od něho odvozenou enzymovou aktivitu.
2. Způsob výroby převážně (S)-2-(3-benzoylfenyl)propionové kyseliny podle nároku 1, vyznačující se tím, že poskytuje kyselinu (S)-2-(3-benzoylfenyl)propionovou v nejméně 93% přebytku uvedeného enantiomerů, při 15 až 25% konverzi.
3. Způsob výroby převážně (S)-2-(3-benzoylfenyl)propionové kyseliny podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že biokatalyzátorem je mikroorganismus Ophiostoma novoulmi, IMI356050.
4. Způsob výroby převážně (S)-2-(3-benzoylfenyl)propionové kyseliny podle nároku 3, vyznačující se tím, že alkylester má 1 až 3 atomy uhlíku.
5. Způsob výroby převážně (S)-2-(3-benzoylfenyl)propionové kyseliny podle nároku 4, vyznačující se tím, že alkylesterem je ethylester.
6. Způsob výroby převážně (S)-2-(3-benzoylfenyl)propionové kyseliny podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že reakce se provádí při pH 8 až 11.
7. Způsob výroby převážně (S)-2-(3-benzoylfenyl)propionové kyseliny podle kteréhokoli^ z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že reakce se provádí při pH 9,5 až 10,5.