JPH07327692A - 光学活性β−ヒドロキシカルボン酸及びその対掌体エステルの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 β−ヒドロキシカルボン酸エステルのラセミ
体に、エステル結合を不斉加水分解する能力を有する微
生物の培養物、菌体又は菌体処理物を作用させることを
特徴とする光学活性β−ヒドロキシカルボン酸及びその
対掌体エステルの製造法。 【効果】 光学純度の高い光学活性β−ヒドロキシカル
ボン酸及びその対掌体エステルを効率よく生産すること
が可能である。生成したカルボン酸とエステルの分離、
精製も容易であり、工業的に有利な方法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、医薬、農薬等の有用な
合成中間体となる光学活性β−ヒドロキシカルボン酸及
びその対掌体エステルの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、医薬、農薬等の生理活性物質の合
成中間体としての光学活性体の需要が急速に高まってお
り、様々な手法を用いた光学活性体の合成研究が盛んに
行われている。脂肪族カルボン酸に属する光学活性β−
ヒドロキシカルボン酸及びその対掌体エステルは、分子
内に２種類の官能基を持ち、種々の光学活性物質へ誘導
可能である産業的に極めて有用な物質群である。

【０００３】従来、光学活性β−ヒドロキシカルボン酸
の製造法としては、化学的又は微生物的方法としてβ−
ケト酸エステルの不斉還元法、光学分割法、１，３−ジ
オールの酸化法、脂肪酸のβ−水酸化法、直接発酵法等
が報告されている。この中で、微生物の代謝経路を利用
した各種光学活性β−ヒドロキシカルボン酸の生産が、
工業的規模で実施されている（特公昭５９−２１５９９
号公報、特公昭５９−２１６００号公報、特公昭６０−
１６２３５号公報、特公昭６１−１２６７６号公報
等）。これらの微生物の代謝経路を利用した方法は、各
種脂肪酸、アルコールを原料として使用し、脂肪酸の主
代謝経路であるβ−酸化酵素系や、類縁の分岐状アミノ
酸代謝経路と共通すると思われる酵素系を利用するもの
である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前述し
た微生物の代謝経路を利用する方法においては、補酵素
の再生系が必要であり、エネルギー源としてＡＴＰが必
須となるため、代謝系を活性化するため、好気的条件下
にグルコース等のエネルギー源を補給しながら培養する
必要がある。従って、培養に時間がかかる、高濃度生産
が困難である、無菌状態が必要である、菌体の再利用が
困難である、といった問題点を有している。これらの問
題点を克服できるような光学活性β−ヒドロキシカルボ
ン酸及びその対掌体エステルの製造方法が望まれてい
た。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、前記課題
を解決するため鋭意検討した結果、β−ヒドロキシカル
ボン酸エステルのラセミ体に、エステル結合を不斉加水
分解する能力を有する微生物の培養物、菌体又は菌体処
理物を作用させることにより、光学純度の高い光学活性
β−ヒドロキシカルボン酸及びその対掌体エステルを効
率よく生産可能であることを見いだし、本発明を完成す
るに至った。

【０００６】即ち、本発明は、β−ヒドロキシカルボン
酸エステルのラセミ体に、エステル結合を不斉加水分解
する能力を有する微生物の培養物、菌体又は菌体処理物
を作用させることを特徴とする光学活性β−ヒドロキシ
カルボン酸及びその対掌体エステルの製造法である。本
発明において基質として使用可能なβ−ヒドロキシカル
ボン酸エステルとしては、例えば、次式（Ｉ）：

【０００７】

【化１】

【０００８】又は次式（II）：

【０００９】

【化２】

【００１０】（式中、Ｒ¹ 及びＲ² は、同一又は相異な
り、アルキル基を表す。）で示される化合物が挙げられ
る。β−ヒドロキシカルボン酸エステルとして前記式
（Ｉ）又は前記式（II）で示される化合物を用いた場
合、得られる光学活性β−ヒドロキシカルボン酸は、そ
れぞれ、次式（Ｉ’）：

【００１１】

【化３】

【００１２】又は次式（II’）：

【００１３】

【化４】

【００１４】（式中、Ｒ¹ は前記と同義である。）で示
される化合物である。前記式において、Ｒ¹ 又はＲ² で
表されるアルキル基としては、好ましくは炭素数１〜６
のアルキル基、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピ
ル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、
sec-ブチル基、ｔ−ブチル基が挙げられる。

【００１５】前記式（Ｉ）で示されるβ−ヒドロキシカ
ルボン酸エステルとしては、例えばβ−ヒドロキシイソ
酪酸メチル（３−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸
メチル）が挙げられる。前記式（II）で示されるβ−ヒ
ドロキシカルボン酸エステルとしては、例えばは、β−
ヒドロキシ酪酸メチル、β−ヒドロキシ吉草酸メチル、
β−ヒドロキシイソカプロン酸メチルが挙げられる。

【００１６】本発明で用いる微生物は、β−ヒドロキシ
カルボン酸エステルのラセミ体を不斉加水分解する能力
を有するものであれば特に制限はない。代表的なものと
して、シュードモナス（Pseudomonas)属、ロードコッカ
ス（Rhodococcus)属又はエセリキア（Escherichia)属に
属する微生物が挙げられる。具体的には、シュードモナ
ス・プチダ（Pseudomonas putida)MR-2068(FERM BP-384
6)、ロードコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus er
ythropolis)IFO 12320、ロードコッカス・エリスロポリ
ス（Rhodococcus erythropolis)IFO 12538、エセリキア
・コリ（Escherichia coli)MR-2103(FERM BP-3835)が挙
げられる。エセリキア・コリ（Escherichia coli)MR-21
03(FERM BP-3835)は、シュードモナス・プチダ（Pseudo
monas putida)MR-2068(FERM BP-3846)由来のエステラー
ゼ遺伝子で形質転換された株である。

【００１７】本発明で用いる微生物の培養は、液体培地
でも固体培地でも行うことができる。培地としては、微
生物が通常資化しうる炭素源、窒素源、ビタミン、ミネ
ラル等の成分を適宜配合したものが用いられる。微生物
の加水分解能を向上させるため、培地にエステルを少量
添加することも可能である。培養は微生物が生育可能で
ある温度、ｐＨで行われるが、使用する菌株の最適培養
条件で行うことが好ましい。微生物の生育を促進させる
ため、通気攪拌を行ってもよい。

【００１８】加水分解反応を行うに際しては、培養の開
始時又は途中で培地にエステルを添加してもよく、予め
微生物を培養した後、培養液にエステルを添加してもよ
い。また増殖した微生物の菌体を遠心分離等により採取
し、これをエステルを含む反応媒体に加えてもよい。菌
体としては、アセトン、トルエン等で処理した菌体を用
いてもよい。

【００１９】また、菌体の代わりに、培養液等の培養
物、菌体破砕物、菌体抽出物、粗酵素、精製酵素等の菌
体処理物を用いてもよく、更に、酵素又は微生物を適当
な担体に固定化し、反応を行った後に回収再利用するこ
とも可能である。反応媒体としては、例えばイオン交換
水、緩衝液が用いられる。反応媒体又は培養液中のエス
テル濃度としては、0.１〜50重量％が好ましく、更に好
ましくは５〜30重量％である。メタノール、アセトン、
界面活性剤等を反応系に添加することも可能である。反
応液のｐＨは、２〜11、好ましくは５〜８の範囲であ
る。反応が進行するに従い生成したカルボン酸により反
応液のｐＨが低下してくるが、この場合は適当な中和剤
で最適ｐＨに維持することが好ましい。反応温度は５〜
70℃が好ましく、30〜60℃が更に好ましい。

【００２０】このようにして、β−ヒドロキシカルボン
酸エステルのラセミ体に、エステル結合を不斉加水分解
する能力を有する微生物の培養物、菌体又は菌体処理物
を作用させることにより、光学活性β−ヒドロキシカル
ボン酸及びその対掌体エステルを製造することができ
る。生成物の分離精製は、酢酸エチル、クロロホルム、
エーテル等の有機溶媒による抽出等により、容易に行う
ことができる。

【００２１】

【実施例】以下、本発明を実施例により更に詳しく説明
するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではな
い。 （実施例１） β−ヒドロキシカルボン酸エステルのラ
セミ体を不斉加水分解する能力を有する微生物のスクリ
ーニング法 50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5) に１％(w/w) 濃度の
(Ｒ) −（−）−３−ヒドロキシ−２−メチルプロピオ
ン酸メチル（和光純薬社製) 又は（Ｓ）−（＋）−３−
ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸メチル（和光純薬
社製) 及び0.01％(w/w) のブロモクレゾールパープルを
添加し、基質溶液とした。各種保存菌株をＬＢ培地（１
％ポリペプトン、0.5 ％酵母エキス、0.5 ％ NaCl ）で
培養し、遠心分離により集菌した。得られた菌体を１ml
の (Ｒ) 体又は（Ｓ）体を含む基質溶液に懸濁し、30℃
にて８時間酵素反応を行った。反応終了後、ブロモクレ
ゾールパープル（pH指示薬）の色調を青色から黄色に変
化させる能力を有するものを加水分解能力を有する株と
した。そのなかで（Ｒ）体又は（Ｓ）体のみを加水分解
するものを不斉加水分解能を有する株とした。

【００２２】スクリーニング結果を表１に示す。

【００２３】

【表１】

【００２４】（実施例２） 光学活性β−ヒドロキシイ
ソ酪酸及びその対掌体エステルの製造 エセリキア・コリ（Escherichia coli)MR-2103(FERM BP
-3835)を50μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地（１％
ポリペプトン、0.5 ％酵母エキス、0.5 ％ NaCl ）50ml
に植菌し、37℃で20時間振盪培養した。培養終了後、培
養液を遠心分離し、得られた菌体の全量をイオン交換水
で洗浄した後、50mM燐酸緩衝液(pH7.0)50mlに懸濁し
た。この菌体懸濁液に、（±）−β−ヒドロキシイソ酪
酸メチル５g を加え、30℃で24時間反応させた。この
間、反応液のｐＨは、10％ NaOH 水溶液を用いて7.0 に
調整した。反応終了後、遠心分離により菌体を除き、β
−ヒドロキシイソ酪酸メチルを酢酸エチルで抽出した。
次いで、水相のｐＨを希硫酸で2.0 に下げた後、水相中
のβ−ヒドロキシイソ酪酸を酢酸エチルで抽出した。各
抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、溶媒を蒸
発除去した。得られたβ−ヒドロキシイソ酪酸メチル及
びβ−ヒドロキシイソ酪酸の比旋光度を測定した（PM10
1 型旋光度計、ユニオン技研社製) 。測定結果及び収量
を表２に示す。この結果より、光学活性β−ヒドロキシ
イソ酪酸及び対掌体エステルが生成していることがわか
る。

【００２５】

【表２】

【００２６】

【発明の効果】本発明の製造方法により、光学純度の高
い光学活性β−ヒドロキシカルボン酸及びその対掌体エ
ステルを効率よく生産することが可能である。生成した
カルボン酸とエステルの分離、精製も容易であり、工業
的に有利な方法である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 古林 祥正 広島県大竹市御幸町20番１号 三菱レイヨ ン株式会社中央研究所内 (72)発明者 崎前 明宏 広島県大竹市御幸町20番１号 三菱レイヨ ン株式会社中央研究所内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 β−ヒドロキシカルボン酸エステルのラ
   セミ体に、エステル結合を不斉加水分解する能力を有す
   る微生物の培養物、菌体又は菌体処理物を作用させるこ
   とを特徴とする光学活性β−ヒドロキシカルボン酸及び
   その対掌体エステルの製造法。
2. 【請求項２】 エステル結合を不斉加水分解する能力を
   有する微生物がシュードモナス（Pseudomonas)属、ロー
   ドコッカス（Rhodococcus)属又はエセリキア（Escheric
   hia)属に属する微生物であることを特徴とする請求項１
   記載の光学活性β−ヒドロキシカルボン酸及びその対掌
   体エステルの製造法。
3. 【請求項３】 エステル結合を不斉加水分解する能力を
   有する微生物が、エステル結合を不斉加水分解する酵素
   をコードする遺伝子により形質転換された遺伝子操作微
   生物であることを特徴とする請求項１記載の光学活性β
   −ヒドロキシカルボン酸及びその対掌体エステルの製造
   法。