JPH03210183A - エステルヒドロラーゼ遺伝子の大腸菌内でのクローニング、発現、および配列決定 - Google Patents
エステルヒドロラーゼ遺伝子の大腸菌内でのクローニング、発現、および配列決定Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明ｔ’ｚエステルヒドロラーゼの製造に関する。
さらに詳しくは、本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆ
ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ （螢光菌） （ｔ） 工ｘ テ
ルヒ）’ Ｏラ’ｔ！’遺伝子を含有する組換え分子の
構築、ならびにクローン化ヒドロラーゼおよびその変異
体の大腸菌内での発生に関する。この方法で製造された
クローン化ヒドロラーゼｔＸ、Ｒ−、Ｅｌ−す７’ｏキ
センエステルを、鏡像異性特異的な様式で酵素的に加水
分解する方法にとくに有用であることが見出された。
ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ （螢光菌） （ｔ） 工ｘ テ
ルヒ）’ Ｏラ’ｔ！’遺伝子を含有する組換え分子の
構築、ならびにクローン化ヒドロラーゼおよびその変異
体の大腸菌内での発生に関する。この方法で製造された
クローン化ヒドロラーゼｔＸ、Ｒ−、Ｅｌ−す７’ｏキ
センエステルを、鏡像異性特異的な様式で酵素的に加水
分解する方法にとくに有用であることが見出された。
発明の背景
多数の微生物、ならびに数種の選ばれた市販リパーゼお
よびエステラーゼは、ナプロキセンエステルを、ある程
度の鏡像異性選択的に加水分解することが報告されてい
る（工ｒｉｕｃｈｉｊｉｍａ ＆ Ｋｅｉｙｕ：Ａｇｒ
、Ｂ１０１．Ｃｈｅｍ、、 ａｓ ： １３８９．１９
８１ ；Ｇｕ ラ： Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｓｔ
ｔ、、 ２７ ： １７６３ Ｃ１９８６）。しかしな
がら、ナプロキセンの製造におけるこれらの微生物筐た
に酵素の実際の応用は、絶対的な鏡像異性特異性の欠如
、および比較的に変換速度が低いことにより実用性がな
かった。
よびエステラーゼは、ナプロキセンエステルを、ある程
度の鏡像異性選択的に加水分解することが報告されてい
る（工ｒｉｕｃｈｉｊｉｍａ ＆ Ｋｅｉｙｕ：Ａｇｒ
、Ｂ１０１．Ｃｈｅｍ、、 ａｓ ： １３８９．１９
８１ ；Ｇｕ ラ： Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｓｔ
ｔ、、 ２７ ： １７６３ Ｃ１９８６）。しかしな
がら、ナプロキセンの製造におけるこれらの微生物筐た
に酵素の実際の応用は、絶対的な鏡像異性特異性の欠如
、および比較的に変換速度が低いことにより実用性がな
かった。
タトエば、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａａ ｆｌｌｕｏｒ８８
ｃ６１ｎｌｉの一夜培養でもラセミ体ナデａキセンエス
テルの８−ナプロキセンへの変換はきわめて低く、シか
も最終生成物の鏡像異性過剰率（θｅ）は９６％未満で
あることが明らかにされている（ヨーロッパ特許出願Ｅ
Ｐ （１２）３３６５６ ）。同様に、市販されている
酵素、 Ｃ！ａｎ（ｉｉｄａ ｃｙｌｌｎｄｒａｃｅａ
（７）リパーゼも、７−１＝ミ体ナプロキセンメチル
エステルをＳ−ナプロキセンに変換するには、２２′Ｃ
で数日を要する（ヨーロッパ特許出願ｖｐ （１２）２
７０７８ ）。
ｃ６１ｎｌｉの一夜培養でもラセミ体ナデａキセンエス
テルの８−ナプロキセンへの変換はきわめて低く、シか
も最終生成物の鏡像異性過剰率（θｅ）は９６％未満で
あることが明らかにされている（ヨーロッパ特許出願Ｅ
Ｐ （１２）３３６５６ ）。同様に、市販されている
酵素、 Ｃ！ａｎ（ｉｉｄａ ｃｙｌｌｎｄｒａｃｅａ
（７）リパーゼも、７−１＝ミ体ナプロキセンメチル
エステルをＳ−ナプロキセンに変換するには、２２′Ｃ
で数日を要する（ヨーロッパ特許出願ｖｐ （１２）２
７０７８ ）。
ヨー Ｃ２ツバ特許出願ＥＰ ０１９５７１７には、Ｃ
！ａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａからの市販リ
パーゼの利用が記載されていて、これによると主として
Ｓ型の、光学的に活性なα−アリールアルカン酸が製造
されるという。しかしながら、記載の方法を用いると、
Ｓ型の化合物を得るためには、鏡像異性型を分離する最
終処理工程が必要である。そして、ナプロキセンの製造
に使用した場合、ラセミエステルの変換は約３２’ｉと
報告されている。
！ａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａからの市販リ
パーゼの利用が記載されていて、これによると主として
Ｓ型の、光学的に活性なα−アリールアルカン酸が製造
されるという。しかしながら、記載の方法を用いると、
Ｓ型の化合物を得るためには、鏡像異性型を分離する最
終処理工程が必要である。そして、ナプロキセンの製造
に使用した場合、ラセミエステルの変換は約３２’ｉと
報告されている。
ヨーロッパ特許出願ｚｐ ［］ ２３３６５６には２−
アリールゾロピオン散の製造方法が記載されている。こ
の方法では、その低級アルキルエステルの２セミ混合物
を立体特異的Ｎ−加水分解する能力を有する微生物を使
用し、少なくとも８０重量係のＳ−コンフィギユレーシ
ョンを有する酸が杉皮される。
アリールゾロピオン散の製造方法が記載されている。こ
の方法では、その低級アルキルエステルの２セミ混合物
を立体特異的Ｎ−加水分解する能力を有する微生物を使
用し、少なくとも８０重量係のＳ−コンフィギユレーシ
ョンを有する酸が杉皮される。
ＥＰ Ｄ ２２７０７８には、微生物起源の細胞外リパ
ーゼを用いて、混合物からＳ−α−メチルアリール酢酸
を製造する方法が記載されている。
ーゼを用いて、混合物からＳ−α−メチルアリール酢酸
を製造する方法が記載されている。
Ｎａｋａｇａｗａら（ｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ９５
： １０４７ ＋１９８４）は、短鎖長のメチルエステ
ルの加水分離される細胞内酵素を報告している。この細
胞内エステラーゼは、既知の細胞外リパーゼとは、阻害
剤に対する感受性、分子量および基質特異性が異なって
いる。
： １０４７ ＋１９８４）は、短鎖長のメチルエステ
ルの加水分離される細胞内酵素を報告している。この細
胞内エステラーゼは、既知の細胞外リパーゼとは、阻害
剤に対する感受性、分子量および基質特異性が異なって
いる。
温度の上昇は、一般的に、酵素反応の速度を加速スる。
Ｒ−，８−ナプロキセンエステルの加水分解の場合には
、＠度の上昇で、固体のエステル基質をその液体型に変
換することもできる。したがって、この加水分解は、エ
ステルヒドロラーゼが耐えられる最高の温度で実施する
ことが望ましい。この目的から、加水分解過程において
高い熱安定性を示すエステルヒドロラーゼの開発が望ま
れる。
、＠度の上昇で、固体のエステル基質をその液体型に変
換することもできる。したがって、この加水分解は、エ
ステルヒドロラーゼが耐えられる最高の温度で実施する
ことが望ましい。この目的から、加水分解過程において
高い熱安定性を示すエステルヒドロラーゼの開発が望ま
れる。
発明の要約
カラ得られるエステルヒドロラーゼの遺伝子からなるＤ
ＮＡ分子であり、そのＤＮＡ分子の２．４ｋｂＨｉｎｄ
ｍフラグメントの内部にコードされるＤＮＡ分子であ
る。
ＮＡ分子であり、そのＤＮＡ分子の２．４ｋｂＨｉｎｄ
ｍフラグメントの内部にコードされるＤＮＡ分子であ
る。
本発明の他の態様は、標準エステルヒドロラーゼのアミ
ノ酸配列をコードする遺伝子である。
ノ酸配列をコードする遺伝子である。
本発明の他の態様は、融合エステルヒドロラーゼのアミ
ノ酸配列をコードする遺伝子である。
ノ酸配列をコードする遺伝子である。
本発明の他の態様は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａａ ｆｌｕ
ｏｒｅｓｃｅｎｓ。
ｏｒｅｓｃｅｎｓ。
５ｔｕｔＺθｒｉの群から選ばれる微生物宿主から得ら
れるエステルヒドロラーゼの遺伝子からなるＤＮＡ分子
である。
れるエステルヒドロラーゼの遺伝子からなるＤＮＡ分子
である。
本発明の他の態様は、ＤＮＡ分子であって、そのＤＮＡ
分子の２．４ ｋｂ Ｈｌｎｄ ｍ ７ ラグメント内
ニコードされ１．ＨＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｓ カらのクローン化エステルヒトａ２−
ゼの遺伝子、１には大腸菌内で機能する調節要素の下流
に位置されたその熱抵抗性変異体からなるＤＮＡ分子で
ある。
分子の２．４ ｋｂ Ｈｌｎｄ ｍ ７ ラグメント内
ニコードされ１．ＨＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｓ カらのクローン化エステルヒトａ２−
ゼの遺伝子、１には大腸菌内で機能する調節要素の下流
に位置されたその熱抵抗性変異体からなるＤＮＡ分子で
ある。
本発明の他の態様は、Ｐ、Ｓ−ナシａキセンアルキルエ
ステルの加水分解ｗ’ａｅ異性特異的に触媒させるため
にクローン化エステルヒドロラーゼを使用するナプロキ
センの製造方法である。この反応は、（ｉ）改良された
挙動％性を有するＰ８θＵａＯ−ｍＱｎａ８ ｆｘｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｓからのクローン化エステルヒドロラーゼ
を大腸菌内で生成させ、（ｉｔ）ナプロキセンエステル
混合物に、クローン化エステルヒトａラーゼを遊離の可
溶性酵素として箇たその固定化型として作用させ、（由
）Ｒ−、Ｓ−ナプロキセンエステルを加水分解し、つい
で（ＩＶ） ８−ナプロキセンを採集する工程からなる
。
ステルの加水分解ｗ’ａｅ異性特異的に触媒させるため
にクローン化エステルヒドロラーゼを使用するナプロキ
センの製造方法である。この反応は、（ｉ）改良された
挙動％性を有するＰ８θＵａＯ−ｍＱｎａ８ ｆｘｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｓからのクローン化エステルヒドロラーゼ
を大腸菌内で生成させ、（ｉｔ）ナプロキセンエステル
混合物に、クローン化エステルヒトａラーゼを遊離の可
溶性酵素として箇たその固定化型として作用させ、（由
）Ｒ−、Ｓ−ナプロキセンエステルを加水分解し、つい
で（ＩＶ） ８−ナプロキセンを採集する工程からなる
。
本発明の他の態様は、第１０図もしくは第１１図に示す
アミノ酸配列、または１種も異性体過剰率９７％以上の
アミノ酸が置換、付加もしくは欠失したその関連配列を
有し、Ｒ，８ナデａキセンエステルの８−ナプロキセン
エステルへの加水分解を鏡像異性体過剰率（ｅｅ） ９
７％以上で実施できるエステルヒドロラーゼである。
アミノ酸配列、または１種も異性体過剰率９７％以上の
アミノ酸が置換、付加もしくは欠失したその関連配列を
有し、Ｒ，８ナデａキセンエステルの８−ナプロキセン
エステルへの加水分解を鏡像異性体過剰率（ｅｅ） ９
７％以上で実施できるエステルヒドロラーゼである。
本発明の他の態様は、Ｒ，８−ナプロキセンエステルに
クローン化エステルヒドロラーゼヲ作用させて立体配置
特異的なＳ−ナプロキセンを得ることにより、Ｓ−ナプ
ロキセンまたにその医薬的に許容される塩を製造する方
法である。
クローン化エステルヒドロラーゼヲ作用させて立体配置
特異的なＳ−ナプロキセンを得ることにより、Ｓ−ナプ
ロキセンまたにその医薬的に許容される塩を製造する方
法である。
図面
第１図は、非変性ｒル上で分割されたクローン化エステ
ルヒドロラーゼの活性染色である。
ルヒドロラーゼの活性染色である。
第２図は、Ｐ、 ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ｘ ステル
ヒドロラーゼの熱安定性を示す。
ヒドロラーゼの熱安定性を示す。
第６図は、エステルヒドロラーゼの活性に対する界面活
性剤および純度の影響を示す。
性剤および純度の影響を示す。
第４図は、Ｐ、 ｆｌｕｏｒｓｓｃｅｎｓ 工ｘテルヒ
）”Ｏ；７−ゼのアミノ末端配列を示す。
）”Ｏ；７−ゼのアミノ末端配列を示す。
第５図はｐＰＦ −３Ａのプラスミド地図である。
第６図は、Ｓ−ナプロキセンエステルに対する選択性な
示すエステルヒトαラーゼの加水分解のグラフ表示であ
る。
示すエステルヒトαラーゼの加水分解のグラフ表示であ
る。
第７図は、ｐＰＦ−ＧＤ３ＡのＪａｃｚ−工ｘチルヒド
ロラーゼ融合連結部におけるヌクレオチドおよびアミノ
酸配列である。
ロラーゼ融合連結部におけるヌクレオチドおよびアミノ
酸配列である。
第８図は、エステラーゼ変異体の温度６０℃における熱
安定性である。
安定性である。
第９図は、ＰＦ−３Ａ中およびｐＰＦ−ＧＤ３Ａ中融合
蛋白質としてのｐ、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓエステルヒ
ドロ２−ゼのアミン末端配列の比較であ 第１０図は、標準エステルヒドロ２−ゼの完全ヌクレオ
チドおよびアミノ酸配列である。
蛋白質としてのｐ、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓエステルヒ
ドロ２−ゼのアミン末端配列の比較であ 第１０図は、標準エステルヒドロ２−ゼの完全ヌクレオ
チドおよびアミノ酸配列である。
第１１図は、融合エステルヒドロラーゼの完全ヌクレオ
チドおよびアミノ酸配列である。
チドおよびアミノ酸配列である。
発明の詳細な説明
本発明は、エステルヒドロラーゼを製造する手段である
。ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅａｃｅｎｓを
を用い、エステルヒドロラーゼ遺伝子を大腸菌にトラン
スホームした。形質転換大腸菌によって発現されたクロ
ーン化エステルヒドロラーゼ酵素は、８ｕｇｉｕｒａ
： Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂ１０ｐｈ７Ｂ、ａｃｔａ、
４８８ ：３５３（１９７７）；同誌、４８９ ： ２
６２（１９７７）およびＮａｋａｇａｗａ ：Ｊ、 Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、。
。ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅａｃｅｎｓを
を用い、エステルヒドロラーゼ遺伝子を大腸菌にトラン
スホームした。形質転換大腸菌によって発現されたクロ
ーン化エステルヒドロラーゼ酵素は、８ｕｇｉｕｒａ
： Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂ１０ｐｈ７Ｂ、ａｃｔａ、
４８８ ：３５３（１９７７）；同誌、４８９ ： ２
６２（１９７７）およびＮａｋａｇａｗａ ：Ｊ、 Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、。
９５：１０４７（１９８４）Ｋ以前に記載された酵素と
は明らかに異なっている。得られた発現クローン化エス
テルヒトαラーゼは、Ｓ−す７’ ａ キセノに対して
高い鏡像異性特異性を示すことが見出されに０同じ鏡像
異性特異性をもち、熱安定性が改良されたエステルヒト
αラーゼの変異体も生成された。
は明らかに異なっている。得られた発現クローン化エス
テルヒトαラーゼは、Ｓ−す７’ ａ キセノに対して
高い鏡像異性特異性を示すことが見出されに０同じ鏡像
異性特異性をもち、熱安定性が改良されたエステルヒト
αラーゼの変異体も生成された。
さらに説明を進める前に、以下の用語について定義する
。
。
「クローン化エステルヒトａラーセ」ハ、エステルヒト
αラーゼの遺伝子を適当な発現系にクロ−ニングして得
られたエステルヒドロラーゼ酵素を意味する。クローン
化ヒドロラーゼエステルは、「標準エステルヒドロラー
ゼ」、「融合エステルヒドロラーゼ」またに「熱抵抗性
エステルヒドロラーゼ」のいずれであってもよい。単数
形で用いられても複数形で用いられても、クローン化エ
ステルヒドロラーゼは、群としてまたは個々に特定され
たこれらの酵素を指すものである。
αラーゼの遺伝子を適当な発現系にクロ−ニングして得
られたエステルヒドロラーゼ酵素を意味する。クローン
化ヒドロラーゼエステルは、「標準エステルヒドロラー
ゼ」、「融合エステルヒドロラーゼ」またに「熱抵抗性
エステルヒドロラーゼ」のいずれであってもよい。単数
形で用いられても複数形で用いられても、クローン化エ
ステルヒドロラーゼは、群としてまたは個々に特定され
たこれらの酵素を指すものである。
「標準エステルヒドロラーゼ」は、通常はバリンに用い
られろコドンによってコードされているＮ末端にメチオ
ニンン有し、欠失または突然変異のない ｐ、ｆｌｕｏ
ｒθ５ｃｅｎｅのｒツムから得られる完全スクレオチド
配列を有するクローン化エステルヒドロラーゼを意味す
る。
られろコドンによってコードされているＮ末端にメチオ
ニンン有し、欠失または突然変異のない ｐ、ｆｌｕｏ
ｒθ５ｃｅｎｅのｒツムから得られる完全スクレオチド
配列を有するクローン化エステルヒドロラーゼを意味す
る。
「融合エステルヒドロラーゼ」は、エステルヒドロラー
ゼの標準配列のすべてまたは一部と異種蛋白質の間の融
合蛋白質として発現される配列を有するりα−ン化エス
テルヒトａラーゼを意味する。
ゼの標準配列のすべてまたは一部と異種蛋白質の間の融
合蛋白質として発現される配列を有するりα−ン化エス
テルヒトａラーゼを意味する。
「熱抵抗性エステルヒドロラーゼは、標準エステルヒド
ロラーゼのクローン化変異体を意味し、このエステルヒ
ドロラーゼの変異型は高温に対して抵抗性である。熱抵
抗性エステルヒドロラーゼは、標準エステルヒドロラー
ゼと少なくとも７５僑のアミノ酸配列ホモロシーを有す
る。
ロラーゼのクローン化変異体を意味し、このエステルヒ
ドロラーゼの変異型は高温に対して抵抗性である。熱抵
抗性エステルヒドロラーゼは、標準エステルヒドロラー
ゼと少なくとも７５僑のアミノ酸配列ホモロシーを有す
る。
クローン化エステルヒドロラーゼの「誘導体」は、アミ
ノ酸付加、欠失または置換によって標準エステルヒドロ
ラーゼとは異なるが、標準エステルヒドロラーゼと少な
くとも７５％のアミノ酸配列ホモロジーを有し、標準エ
ステルヒドロラーゼとほぼ同じ活性を示すクローン化エ
ステルヒドロラーゼを意味する。
ノ酸付加、欠失または置換によって標準エステルヒドロ
ラーゼとは異なるが、標準エステルヒドロラーゼと少な
くとも７５％のアミノ酸配列ホモロジーを有し、標準エ
ステルヒドロラーゼとほぼ同じ活性を示すクローン化エ
ステルヒドロラーゼを意味する。
「調節領域」は、発現制御配列、たとえば転写および翻
訳に必要なプロモーターおよびリポソーム結合部位を意
味する。
訳に必要なプロモーターおよびリポソーム結合部位を意
味する。
クローン化エステルヒドロラーゼは、Ｒ，８−ｆｆＣｌ
キセンエステル’？１’８−ナプロキセンに変換する能
力を有する。このエステルヒドロラーゼは、Ｓ−ナプロ
キセンへの′ａ＠異性選択的加水分解の原因となる特徴
的なＮ末端アミノ酸配列を有する。
キセンエステル’？１’８−ナプロキセンに変換する能
力を有する。このエステルヒドロラーゼは、Ｓ−ナプロ
キセンへの′ａ＠異性選択的加水分解の原因となる特徴
的なＮ末端アミノ酸配列を有する。
「Ｒ９５−ナプロキセンエステル」の語ハ、２−（６′
−メトキシ−２′−す７チル）プロピオン酸のエステル
のＲ−および！３−ａｓ異性体の様々の比での混合物を
意味する。この語はまた、ナシクキセンに変換可能なナ
ゾロキセン前駆体のエステルも包含するものである。
−メトキシ−２′−す７チル）プロピオン酸のエステル
のＲ−および！３−ａｓ異性体の様々の比での混合物を
意味する。この語はまた、ナシクキセンに変換可能なナ
ゾロキセン前駆体のエステルも包含するものである。
ナゾロキセンは、化学名２−（６′−メトキシ−２′−
す７チル）プロピオン酸の、公知の抗炎症剤であり、２
種の光学異性体として存在できる。ナゾロキセンは、ｃ
ａｈｎ−工ｎｇｏ１ｄ−ＰｒｅｌＯｇの不斉配位の規則
に従えばＳ−鏡像異性体であり、その光学的対掌体、Ｒ
−鏡像異性体よりも実質的に高い生物学的活性を示すこ
とが認められている。
す７チル）プロピオン酸の、公知の抗炎症剤であり、２
種の光学異性体として存在できる。ナゾロキセンは、ｃ
ａｈｎ−工ｎｇｏ１ｄ−ＰｒｅｌＯｇの不斉配位の規則
に従えばＳ−鏡像異性体であり、その光学的対掌体、Ｒ
−鏡像異性体よりも実質的に高い生物学的活性を示すこ
とが認められている。
Ｒ，８−ナプロキセンのエステル部分は、一般的に、炭
素原子１〜１２個を有する直鎖状、分岐状または脂環式
アルキル基からなり、それはフェニルまたは１個もしく
は２個以上の電子吸引基たトエハハロ、ニドａ、シアノ
、ヒドロキシ、Ｃエル４アルコキシ、Ｃ１〜４アルキル
チオ、もしくは−Ｃ（０）Ｒ１Ｃ式中、Ｒ１は０１〜４
アルキル、０３〜６シクロアルキル、ヒドロキシ、ｃｌ
−Ｃ４フルコキシ、０３〜６シクロアルコキシ、フェノ
キシ、ベンシルオキシ、ＮＲ”Ｒ” （式中 Ｒ２およ
びＲ３は互いに独立ＫＨ，（４〜４アルキル、０３〜Ｃ
６シクａアルキルであるか、または両者で窒素とともに
５もしくは６員環を形成し、この環にはＯ，ＮＥＩもし
くはト（０１〜４アルキル）から選ばれるヘテロ基を包
含していてもよい）、１′ｒ−は−ＯＭ （Ｍはアルカ
リ金属である）である〕によって置換されていてもよ１
ゝ。
素原子１〜１２個を有する直鎖状、分岐状または脂環式
アルキル基からなり、それはフェニルまたは１個もしく
は２個以上の電子吸引基たトエハハロ、ニドａ、シアノ
、ヒドロキシ、Ｃエル４アルコキシ、Ｃ１〜４アルキル
チオ、もしくは−Ｃ（０）Ｒ１Ｃ式中、Ｒ１は０１〜４
アルキル、０３〜６シクロアルキル、ヒドロキシ、ｃｌ
−Ｃ４フルコキシ、０３〜６シクロアルコキシ、フェノ
キシ、ベンシルオキシ、ＮＲ”Ｒ” （式中 Ｒ２およ
びＲ３は互いに独立ＫＨ，（４〜４アルキル、０３〜Ｃ
６シクａアルキルであるか、または両者で窒素とともに
５もしくは６員環を形成し、この環にはＯ，ＮＥＩもし
くはト（０１〜４アルキル）から選ばれるヘテロ基を包
含していてもよい）、１′ｒ−は−ＯＭ （Ｍはアルカ
リ金属である）である〕によって置換されていてもよ１
ゝ。
電子吸引基が存在する場合には、Ｒ基の安定性と調和し
て、Ｒ基のαまたはβ位にあることが好ましい。Ｒ基が
電子吸引基を含んでいるエステルは、一般にＲ基が置換
されていない場合に比べてより急速に加水分解されるの
で、活性化エステルと呼ばれる。
て、Ｒ基のαまたはβ位にあることが好ましい。Ｒ基が
電子吸引基を含んでいるエステルは、一般にＲ基が置換
されていない場合に比べてより急速に加水分解されるの
で、活性化エステルと呼ばれる。
アルキル基只の特定の例には、メチル、エチル、ブチル
、ヘキシル、オクチル、ドデシル、ペンシル、２−クロ
ロエチル、２．２．２−）リクｃＩロエチル、２−フル
オロエチル、２，２．２−）すフルオロエチル、２−ブ
ロモエチル、シアノメチル、２−二トロプロピル、カル
ボエトキシメチル、メトキシメチル、２−ヒドロキシ−
１，２−ジメトキシカルボニルエチル、２−ヒドロキシ
−１゜２−ジェトキシカルボニルエチル等がある。
、ヘキシル、オクチル、ドデシル、ペンシル、２−クロ
ロエチル、２．２．２−）リクｃＩロエチル、２−フル
オロエチル、２，２．２−）すフルオロエチル、２−ブ
ロモエチル、シアノメチル、２−二トロプロピル、カル
ボエトキシメチル、メトキシメチル、２−ヒドロキシ−
１，２−ジメトキシカルボニルエチル、２−ヒドロキシ
−１゜２−ジェトキシカルボニルエチル等がある。
鏡像異性選択的加水分解によって生じるＳ−酸がナプロ
キセンの前駆体、たとえば、＜Ｂ）−５−ハｃ１−６−
メドキシーα−メチル−２−す７タレン酢酸、（Ｓ）−
６−ヒドａキシ−α−メチル−２−ナフタレン酢酸また
は（８） −５−へロー６−ヒドロキシーα−メチル−
２−す７タレン酢酸である場合には、このような前駆体
はヨーロッパ公告特許出願９５９０１号（１９８３）に
記載の方法でナプロキセンに変換することができる。バ
チルス、シュードモナス、アルトロバクター ケヵビお
よびストレプトマイセス属に属する広範囲の微生物がＲ
，Ｓ−ナプロキセンを立体異性選択的に加水分解して、
Ｓ〜ナシａキセンを生成できることは、以前に報告され
ている（ヨーロッパ特許出願ｚｐ （１２）３３６５６
号参照）。
キセンの前駆体、たとえば、＜Ｂ）−５−ハｃ１−６−
メドキシーα−メチル−２−す７タレン酢酸、（Ｓ）−
６−ヒドａキシ−α−メチル−２−ナフタレン酢酸また
は（８） −５−へロー６−ヒドロキシーα−メチル−
２−す７タレン酢酸である場合には、このような前駆体
はヨーロッパ公告特許出願９５９０１号（１９８３）に
記載の方法でナプロキセンに変換することができる。バ
チルス、シュードモナス、アルトロバクター ケヵビお
よびストレプトマイセス属に属する広範囲の微生物がＲ
，Ｓ−ナプロキセンを立体異性選択的に加水分解して、
Ｓ〜ナシａキセンを生成できることは、以前に報告され
ている（ヨーロッパ特許出願ｚｐ （１２）３３６５６
号参照）。
全微生物またを工分解微生物の使用に対する変法とし【
、全微生物から誘導された微生物酵素を用いる方法があ
る。しかしながら、このような方法は、明確な結果を与
えない。たとえば、Ｐｓｅｕｄｏ−ｍｏｎａｓ ｆｌｕ
ｏｒｅａｃｅｎｓからの市販酵素プレバレージョンは、
Ｒ，８−ナプロキセンエステルを鏡像異性特異的な様式
で効率的に加水分解することを工できなかった。これは
、大部分の微生物が多種のリパーゼまたはエステラーゼ
をコードする多数の遺伝子を含んでいて、その中の一部
が特定の適用に有用な所望の特異性をもっているという
事実を示すものである。そこで、所望の特性をもつ微生
物から酵素を、微生物の基質選択性を無視しては、同定
、単離できる可能性は予測できない。実際、所望の特性
を示す酵素の探索とその質的な精製が必要で、ついで現
実の工業的な関連でのその有用性が評価できる。多くの
場合、生産過程においてそれを実用的にするためＫは、
所望の酵素に付加的な化学的１′ｒ−は遺伝子的修飾を
行うことが必要になる。この適用が、ダラム陰性菌、ｐ
ｓｅｕａｏｍｏ−ｎａｇ ｆｅｕｏｒｅｓｃｅｎｓから
の新規なクローン化エステルヒトａラーゼに表れている
。このクローン化エステルヒトａラーゼは、同じ種から
の既知のリパーゼおよびエステラーゼとは構造および酵
素特性のいずれの点でも異なることが見出された。関連
エステルヒドロラーゼは、同じ属の他の種、たとえばＰ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａおよびｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｔｕｔｚθｒ１からもクローン化
された。本発明の好ましい実施態様においては、約４５
℃で長い半減期を有するクローン化酵素をさらに突然変
異させて、熱安定性が改善された酵素を生成させた。突
然変異させたクローン化酵素は、好１しくに４５〜６５
℃、とくに好ましくは６２℃で安定である。
、全微生物から誘導された微生物酵素を用いる方法があ
る。しかしながら、このような方法は、明確な結果を与
えない。たとえば、Ｐｓｅｕｄｏ−ｍｏｎａｓ ｆｌｕ
ｏｒｅａｃｅｎｓからの市販酵素プレバレージョンは、
Ｒ，８−ナプロキセンエステルを鏡像異性特異的な様式
で効率的に加水分解することを工できなかった。これは
、大部分の微生物が多種のリパーゼまたはエステラーゼ
をコードする多数の遺伝子を含んでいて、その中の一部
が特定の適用に有用な所望の特異性をもっているという
事実を示すものである。そこで、所望の特性をもつ微生
物から酵素を、微生物の基質選択性を無視しては、同定
、単離できる可能性は予測できない。実際、所望の特性
を示す酵素の探索とその質的な精製が必要で、ついで現
実の工業的な関連でのその有用性が評価できる。多くの
場合、生産過程においてそれを実用的にするためＫは、
所望の酵素に付加的な化学的１′ｒ−は遺伝子的修飾を
行うことが必要になる。この適用が、ダラム陰性菌、ｐ
ｓｅｕａｏｍｏ−ｎａｇ ｆｅｕｏｒｅｓｃｅｎｓから
の新規なクローン化エステルヒトａラーゼに表れている
。このクローン化エステルヒトａラーゼは、同じ種から
の既知のリパーゼおよびエステラーゼとは構造および酵
素特性のいずれの点でも異なることが見出された。関連
エステルヒドロラーゼは、同じ属の他の種、たとえばＰ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａおよびｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｔｕｔｚθｒ１からもクローン化
された。本発明の好ましい実施態様においては、約４５
℃で長い半減期を有するクローン化酵素をさらに突然変
異させて、熱安定性が改善された酵素を生成させた。突
然変異させたクローン化酵素は、好１しくに４５〜６５
℃、とくに好ましくは６２℃で安定である。
ステルヒドロラーゼ遺伝子の分子クローニングは、標準
的な分子りａ−ニング技術（たとえば、Ｍａｎｉａｔｉ
ｓら： Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ
ＬａｂＯｒａ−ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、
Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂＯｒａｔＯ
ｒ７ ｐｒｅａｔｉ、 １９８９参照）を用いて行つた
。Ｄ Ｎ Ａ ＆Ｘ Ｐ、ｆｌｕｏｒｅａｃｅｎｓ
（ムＴｏｅす１７５５０）から調製し、制限酵素で部分
切断した。部分ＤＮＡ消化物を、りｏ−＝ングデラスミ
ドとしての使用に適当なたとえばｐｒ：ＩＣ１９等の酵
素切断ＤＮＡとりｒ−トさせ、検出可能な基礎エステラ
ーゼ活性を欠く大腸菌株にトランスホームした。
的な分子りａ−ニング技術（たとえば、Ｍａｎｉａｔｉ
ｓら： Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ
ＬａｂＯｒａ−ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、
Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂＯｒａｔＯ
ｒ７ ｐｒｅａｔｉ、 １９８９参照）を用いて行つた
。Ｄ Ｎ Ａ ＆Ｘ Ｐ、ｆｌｕｏｒｅａｃｅｎｓ
（ムＴｏｅす１７５５０）から調製し、制限酵素で部分
切断した。部分ＤＮＡ消化物を、りｏ−＝ングデラスミ
ドとしての使用に適当なたとえばｐｒ：ＩＣ１９等の酵
素切断ＤＮＡとりｒ−トさせ、検出可能な基礎エステラ
ーゼ活性を欠く大腸菌株にトランスホームした。
他の宿主生物たとえばＢ、５ｕｂｔｉｌｆｓも使用でき
るが、クローン化酵素の産生に第一に選択される生物は
大腸菌である。クローニングおよび発現は大腸菌内で速
やかに達成され、高レベルの遺伝子発現が一般的である
。さらに、大腸菌内での産生は、大規模な発酵および蛋
白質精製のためのスケールアップが容易な系を与える。
るが、クローン化酵素の産生に第一に選択される生物は
大腸菌である。クローニングおよび発現は大腸菌内で速
やかに達成され、高レベルの遺伝子発現が一般的である
。さらに、大腸菌内での産生は、大規模な発酵および蛋
白質精製のためのスケールアップが容易な系を与える。
最初の１ ｎａ １ ｔｕでのエステル分解活性のスク
リーニングには、基質としてβ〜ナフチル酢酸エステル
を使用した。Ｒ−８−ナプロキセンエステルを基質とし
て用いた場合、様々なシュードモナス種からのエステラ
ーゼ陽性クローンのある組合せが活性を示し、鏡像異性
特異性が証明された。
リーニングには、基質としてβ〜ナフチル酢酸エステル
を使用した。Ｒ−８−ナプロキセンエステルを基質とし
て用いた場合、様々なシュードモナス種からのエステラ
ーゼ陽性クローンのある組合せが活性を示し、鏡像異性
特異性が証明された。
とくに、ナプロキセンエステルの１９−’Ｊ７；：）’
ｊ、Ｒ−異性体をエステルヒドロラーゼ陽性クローンに
与えた場合には、多数のクローンが８−ナプロキセンエ
ステルに対する強い選択性を示した。Ｉ）Ｎム交差ハイ
ブリダイゼーション実際では、エステルヒドロラーゼ遺
伝子が他のシュードモナス種中に高度に保存されている
ことが示され声。
ｊ、Ｒ−異性体をエステルヒドロラーゼ陽性クローンに
与えた場合には、多数のクローンが８−ナプロキセンエ
ステルに対する強い選択性を示した。Ｉ）Ｎム交差ハイ
ブリダイゼーション実際では、エステルヒドロラーゼ遺
伝子が他のシュードモナス種中に高度に保存されている
ことが示され声。
本発明の一実施態様では、例１に記載した操作を用いて
同定されたＰ、 ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからの陽性エ
ステルヒドロラーゼクローンを選択して、さらに特性づ
けおよび検討を行った。このような同定されたクローン
のひとつから標準的な技術を用いてプラスミドＤＮＡを
製造した。ＤＮＡ挿入体は４６５キロ塩基（ｋｂ）の長
さを持つことがわかった。
同定されたＰ、 ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからの陽性エ
ステルヒドロラーゼクローンを選択して、さらに特性づ
けおよび検討を行った。このような同定されたクローン
のひとつから標準的な技術を用いてプラスミドＤＮＡを
製造した。ＤＮＡ挿入体は４６５キロ塩基（ｋｂ）の長
さを持つことがわかった。
例２に記載したようなサブクローニング実験により、エ
ステラーゼ遺伝子は２．４ ｋｂ ａｔｎｄ ■−ｙ
−）グメント内にコードされていたことが示された。
ステラーゼ遺伝子は２．４ ｋｂ ａｔｎｄ ■−ｙ
−）グメント内にコードされていたことが示された。
この実験ではまた、Ｐ、 ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ 工
ｘ ７− Ａ／ ヒドロラーゼ遺伝子の大腸菌内での発
現は、それ自身の内因性プロモーターではなくて、ＪＩ
ＬＯオペロンの大腸菌プロモーター（ｊａｃ Ｐ−０）
によって駆動されたことが示唆された。２．４ ｋｂ
Ｈｌｎｄ ｇ１フラグメントを精製し、クローニングプ
ラスミドたとえばｐσＣ１８およびｐＵＣｊ １９ （
Ｙａｎｉａｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら：Ｇｅｎｅ、 ３３
： １ ［１３，１９８５）中に再クローニングすると
、すべてのエステラーゼ陽性クローンにはそのＤＮＡが
ｐσＣのｊａｃプロモーターの転写開始に関して同じ方
向性で挿入された。これらの結果は、２．４ ｋｂ Ｐ
、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｇ Ｄ Ｎ Ａはシュードモナ
スのプロモーターを欠くか、または存在しても内因性プ
ロモーターは大腸菌内では機能しなかったことを示唆し
た。さらにその後の研究で、使用されたプロモーターは
実際、大腸菌プロモーターであることが示された。本発
明の実施に際し使用できる他の大腸菌プロモーターには
、たとえ−ゼのその他の特性の研究には、エステルヒド
ロラーゼの発現に対するイソゾロビルチオ−がラクトシ
ト（工ＰＴＧ）の影響の検討が包含された。
ｘ ７− Ａ／ ヒドロラーゼ遺伝子の大腸菌内での発
現は、それ自身の内因性プロモーターではなくて、ＪＩ
ＬＯオペロンの大腸菌プロモーター（ｊａｃ Ｐ−０）
によって駆動されたことが示唆された。２．４ ｋｂ
Ｈｌｎｄ ｇ１フラグメントを精製し、クローニングプ
ラスミドたとえばｐσＣ１８およびｐＵＣｊ １９ （
Ｙａｎｉａｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら：Ｇｅｎｅ、 ３３
： １ ［１３，１９８５）中に再クローニングすると
、すべてのエステラーゼ陽性クローンにはそのＤＮＡが
ｐσＣのｊａｃプロモーターの転写開始に関して同じ方
向性で挿入された。これらの結果は、２．４ ｋｂ Ｐ
、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｇ Ｄ Ｎ Ａはシュードモナ
スのプロモーターを欠くか、または存在しても内因性プ
ロモーターは大腸菌内では機能しなかったことを示唆し
た。さらにその後の研究で、使用されたプロモーターは
実際、大腸菌プロモーターであることが示された。本発
明の実施に際し使用できる他の大腸菌プロモーターには
、たとえ−ゼのその他の特性の研究には、エステルヒド
ロラーゼの発現に対するイソゾロビルチオ−がラクトシ
ト（工ＰＴＧ）の影響の検討が包含された。
ＩＰＴＧは大腸菌内でラクトース（ハリオペロンの転写
を誘導することが知られている。他の誘導機構も本発明
の実施に使用することができ、それは発現系に用いられ
たプロモーターに依存するものと思われる。
を誘導することが知られている。他の誘導機構も本発明
の実施に使用することができ、それは発現系に用いられ
たプロモーターに依存するものと思われる。
本発明の細菌培養の誘導は工ＰＴＧによって有意に誘導
された。培養を工ＰＴＧで誘導した場合には、エステル
分解活性が６〜５倍に増大した。対照および誘導培養か
らの蛋白物抽出物を５Ｄ８−ポリアクリルアミドダル（
すなわち、変性系で）分析したときは、約３６キロダル
トン（ｋＤ）の蛋白質が観察された。その後の、エステ
ルヒドロラーゼ遺伝子およびその蛋白生成物のヌクレオ
チドおよびアミノ酸配列決定を含む研究では、蛋白質は
４２ ｋＤに近い分子量計算値をもつことが示唆されて
いる。測定のための一義的手段として物理的測定法を用
いる場合、分子量測定値がこのように変動することは珍
しイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｆ２ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
。
された。培養を工ＰＴＧで誘導した場合には、エステル
分解活性が６〜５倍に増大した。対照および誘導培養か
らの蛋白物抽出物を５Ｄ８−ポリアクリルアミドダル（
すなわち、変性系で）分析したときは、約３６キロダル
トン（ｋＤ）の蛋白質が観察された。その後の、エステ
ルヒドロラーゼ遺伝子およびその蛋白生成物のヌクレオ
チドおよびアミノ酸配列決定を含む研究では、蛋白質は
４２ ｋＤに近い分子量計算値をもつことが示唆されて
いる。測定のための一義的手段として物理的測定法を用
いる場合、分子量測定値がこのように変動することは珍
しイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｆ２ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
。
１０４巻、０部、Ｗ、 Ｂ、 Ｊａｋｏｂｙ編）。
クローン化エステルヒドロラーゼおよび他の市販シュー
ドモナスリパーゼの非変性系での活性染色により、クロ
ーン化エステルヒドロラーゼのヒドロラーゼ活性が証明
されたが、一方、本発明のクローン化エステルヒドロラ
ーゼは市販のシュードモナス酵素とは明らかに異なるこ
とが示された（第１図）。すなわち、非変性ｒル系を用
いた初期実験では、クローン化エステルヒトｏラーゼ酵
素は、他の既知市販シュードモナスリパーゼとは異なる
非変性系での移動パターンを示した（第１図）。
ドモナスリパーゼの非変性系での活性染色により、クロ
ーン化エステルヒドロラーゼのヒドロラーゼ活性が証明
されたが、一方、本発明のクローン化エステルヒドロラ
ーゼは市販のシュードモナス酵素とは明らかに異なるこ
とが示された（第１図）。すなわち、非変性ｒル系を用
いた初期実験では、クローン化エステルヒトｏラーゼ酵
素は、他の既知市販シュードモナスリパーゼとは異なる
非変性系での移動パターンを示した（第１図）。
市販の酵素は、それらが高温で使用できる程度に限界が
ある。高い熱安定性を示すクローン化エステルヒドロラ
ーゼの使用は、ナプロキセンエステルを加水分解する過
程においてはとくに望１し一ゝ。
ある。高い熱安定性を示すクローン化エステルヒドロラ
ーゼの使用は、ナプロキセンエステルを加水分解する過
程においてはとくに望１し一ゝ。
酵素触媒化学反応の経済性、すなわち連続法また＋Ｓバ
ッチ法のいずれで使用できるかは、触媒として活性な酵
素の寿命に大きく依存する。酵素の不活性化の最も一般
的な原因は熱不活性化であるから、熱安定性の増大はバ
イオ触媒の寿命を延長するように作用し、これによって
全過程の経済性が改善される。
ッチ法のいずれで使用できるかは、触媒として活性な酵
素の寿命に大きく依存する。酵素の不活性化の最も一般
的な原因は熱不活性化であるから、熱安定性の増大はバ
イオ触媒の寿命を延長するように作用し、これによって
全過程の経済性が改善される。
さらに、酵素反応の速度は反応温度に依存する。
熱安定性を示す酵素は高い温度で反応を進めることが可
能であり、これによって反応速度が回速され、単位時間
の生産量が増加する。Ｒ−、Ｓ−ナプロキセンエステル
の加水分解の場合、高温は固体エステル基質をその熔融
型に移行させろこともあって、固体粒子径のコントロー
ルの重要性を低下させる。
能であり、これによって反応速度が回速され、単位時間
の生産量が増加する。Ｒ−、Ｓ−ナプロキセンエステル
の加水分解の場合、高温は固体エステル基質をその熔融
型に移行させろこともあって、固体粒子径のコントロー
ルの重要性を低下させる。
は、標準エステルヒドロラーゼ’に４５℃〜５５°Ｃの
間で５°Ｃ間隔でインキュベートし、ついで残存する活
性をアッセイした。第２図には、標準エステルヒドロラ
ーゼの半減期を示す。５５′Ｃにおいて約９０分、４５
〜５０℃において約４時間である。さらに研究を行い、
標準エステルヒドロラーゼを工、６０℃〜６０°Ｃの範
囲で、好１しくに４５℃〜５５℃で活性であることが明
らかにされ１こ。
間で５°Ｃ間隔でインキュベートし、ついで残存する活
性をアッセイした。第２図には、標準エステルヒドロラ
ーゼの半減期を示す。５５′Ｃにおいて約９０分、４５
〜５０℃において約４時間である。さらに研究を行い、
標準エステルヒドロラーゼを工、６０℃〜６０°Ｃの範
囲で、好１しくに４５℃〜５５℃で活性であることが明
らかにされ１こ。
熱抵抗性エステルヒドロラーゼについての類似の研究に
より、熱抵抗性エステルヒドロラーゼは３０℃〜６５℃
の範囲で、好ましくは４５℃〜６５°Ｃ１とくに好１し
くは６２℃で活性であることが明らかにされた。
より、熱抵抗性エステルヒドロラーゼは３０℃〜６５℃
の範囲で、好ましくは４５℃〜６５°Ｃ１とくに好１し
くは６２℃で活性であることが明らかにされた。
本発明の実施に際しては、標準エステルヒドロラーゼの
熱安定性についてさらに評価を行った。
熱安定性についてさらに評価を行った。
−８，５，５０℃における標準エステルヒドロラーゼの
半減期は少なくとも６時間でありに。標準エステルヒド
ロラーゼの鏡像異性特異性も、酵素の粗製または精製プ
レバレージョンと基質としてＲ−８−ナプロキセンエチ
ルエステルを用いて、６７℃および５０℃の両者で評価
した。粗製および精製両酵素とも、両＠度において、高
い鏡像異性体過剰率（θθ〉９７％）の８−ナプロキセ
ンを生成した。
半減期は少なくとも６時間でありに。標準エステルヒド
ロラーゼの鏡像異性特異性も、酵素の粗製または精製プ
レバレージョンと基質としてＲ−８−ナプロキセンエチ
ルエステルを用いて、６７℃および５０℃の両者で評価
した。粗製および精製両酵素とも、両＠度において、高
い鏡像異性体過剰率（θθ〉９７％）の８−ナプロキセ
ンを生成した。
多くのエステルヒドロラーゼ、とくに旧来エステラーゼ
と呼ばれてきた酵素は、至適活性のために界面活性剤の
添２７０を必要とする。製造過程における界面活性剤の
使用は経費がかかり、しかもその除去に付加的な処理技
術、装置および労力を要する。多くの界面活性剤がエス
テラーゼの基質としても動き、たとえば大豆油または７
ｗｅｅｎ −８０はある稲のエステラーゼの基質である
。界面活性剤の加水分解は１に、望筐しくない夾雑物の
混入を生じる。したがって、エステル分解を、界面活性
剤を必要としないで実施できることは、きわめて望まし
い特性である。
と呼ばれてきた酵素は、至適活性のために界面活性剤の
添２７０を必要とする。製造過程における界面活性剤の
使用は経費がかかり、しかもその除去に付加的な処理技
術、装置および労力を要する。多くの界面活性剤がエス
テラーゼの基質としても動き、たとえば大豆油または７
ｗｅｅｎ −８０はある稲のエステラーゼの基質である
。界面活性剤の加水分解は１に、望筐しくない夾雑物の
混入を生じる。したがって、エステル分解を、界面活性
剤を必要としないで実施できることは、きわめて望まし
い特性である。
本発明のｐ、 ｆ１ｕｏｒｅｓｃｅｎｓエステルヒドロ
ラーゼが完全な活性を発揮するために界面活性剤を必要
とするか否かを調べるために、Ｒ，Ｓ−ナプロキセンエ
チルエステルの加水分解乞、５０℃にオイて、界面活性
剤または大豆油の存在下または非存ルヒドａラーゼが界
面活性剤の存在ＴＫも非存在下にも同等に活性であって
、大豆油やその他の界面活性剤の必要はないことを示し
た（第６図）。
ラーゼが完全な活性を発揮するために界面活性剤を必要
とするか否かを調べるために、Ｒ，Ｓ−ナプロキセンエ
チルエステルの加水分解乞、５０℃にオイて、界面活性
剤または大豆油の存在下または非存ルヒドａラーゼが界
面活性剤の存在ＴＫも非存在下にも同等に活性であって
、大豆油やその他の界面活性剤の必要はないことを示し
た（第６図）。
本発明の好ましい実施態様においては、精製クローン化
エステルヒドロラーゼは、界面活性剤たとえばＴＷθｏ
ｎ −３Ｑを卯えても加えなくても１５０°Ｃ，５時間
で３０．ＳＪ／−ｏＲ，ｓ−ナプロキセンエチルエステ
ルを完全に加水分解し、一方、生成物の鏡像異性体過剰
率（θｅ）は９７．５％以上に維持された。これに反し
、例６、第１表に示すように、他の市販シュドモナスリ
パーゼには、このような条件下でＲ−、Ｓ−ナプロキセ
ンエチルエステルに活性を示すものはなかった。
エステルヒドロラーゼは、界面活性剤たとえばＴＷθｏ
ｎ −３Ｑを卯えても加えなくても１５０°Ｃ，５時間
で３０．ＳＪ／−ｏＲ，ｓ−ナプロキセンエチルエステ
ルを完全に加水分解し、一方、生成物の鏡像異性体過剰
率（θｅ）は９７．５％以上に維持された。これに反し
、例６、第１表に示すように、他の市販シュドモナスリ
パーゼには、このような条件下でＲ−、Ｓ−ナプロキセ
ンエチルエステルに活性を示すものはなかった。
本発明のクローン化エステルヒドロラーゼは、大腸菌細
胞溶解物から、様々な標準的蛋白質精製技術、たとえば
、アフィニティー イオン変換、サイズ排除または疎水
クロマトグラフィーを用いて、容易に精製することがで
きる。このような精製技術で回収された活性酵素は、硫
酸アンモニウムを用いて、マタは別法としてスクロース
の存在下におけろ凍結乾燥によって濃縮することができ
る。
胞溶解物から、様々な標準的蛋白質精製技術、たとえば
、アフィニティー イオン変換、サイズ排除または疎水
クロマトグラフィーを用いて、容易に精製することがで
きる。このような精製技術で回収された活性酵素は、硫
酸アンモニウムを用いて、マタは別法としてスクロース
の存在下におけろ凍結乾燥によって濃縮することができ
る。
製造および精製工程の例の概略を示せば、（ｉ）形質転
換大腸菌細胞のＬ塔中で増殖し、工ＰＴＧで誘導し、（
ｎ）培養体を遠心分離によって収穫し、＜ｉｉ＞細胞ベ
レットを緩衝液に再懸濁し、ついで細胞を崩壊させ、（
１ｖ）細胞分解物を遠心分離し、（Ｖ） ａ胞溶解物を
二工程クロマトグラフィーカラムに通して酵素精放する
各工程からなる方法を挙げることができる。
換大腸菌細胞のＬ塔中で増殖し、工ＰＴＧで誘導し、（
ｎ）培養体を遠心分離によって収穫し、＜ｉｉ＞細胞ベ
レットを緩衝液に再懸濁し、ついで細胞を崩壊させ、（
１ｖ）細胞分解物を遠心分離し、（Ｖ） ａ胞溶解物を
二工程クロマトグラフィーカラムに通して酵素精放する
各工程からなる方法を挙げることができる。
本発明のクローン化エステルの特性をさらに調べるため
に、標準エステルヒドロラーゼおよび融合エステルヒド
ロラーゼのＤＮＡおよびアミノ酸配列を決定した。蛋白
質およびＤＮＡ配列を比較すると（第４図）、エステル
ヒドロラーゼ遺伝子の翻訳開始部位はｊａｃ Ｐ−０か
ら少なくとも４５０塩基対（ｂｐ）下流にあることを示
している。標準エステルヒドロラーゼはシグナル配列を
もたないようである。また、翻訳開始部位としてのＡＴ
Ｇ（Ｍθｔ）コドンの代わりにＧ Ｔ Ｇ （Ｖａｌ）
を使用する。
に、標準エステルヒドロラーゼおよび融合エステルヒド
ロラーゼのＤＮＡおよびアミノ酸配列を決定した。蛋白
質およびＤＮＡ配列を比較すると（第４図）、エステル
ヒドロラーゼ遺伝子の翻訳開始部位はｊａｃ Ｐ−０か
ら少なくとも４５０塩基対（ｂｐ）下流にあることを示
している。標準エステルヒドロラーゼはシグナル配列を
もたないようである。また、翻訳開始部位としてのＡＴ
Ｇ（Ｍθｔ）コドンの代わりにＧ Ｔ Ｇ （Ｖａｌ）
を使用する。
シャインダルガノ配列、すなわちリポソーム結合部位は
ＧＴＧ開始コドンからヌクレオチド７個上流に確認され
た。標準エステルヒドロラーゼは、以下のＮ末端配列： Ｍθｔ−Ｇｊｎ−Ｖａｊ−ＧＪｎ−ＧＪ７−Ｔｈｒ−Ｐ
ｂｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｙ有することが見出さ
れ、これはヌクレオチド配列：５’ ＧＴＧＣＡＧＧＴ
ＴＯＡＧＧＧＴＴＡＴＴＴＯＧＡＴＣＴＴＯＧＣｉ３’
によってコードされていることが明らかにされた。
ＧＴＧ開始コドンからヌクレオチド７個上流に確認され
た。標準エステルヒドロラーゼは、以下のＮ末端配列： Ｍθｔ−Ｇｊｎ−Ｖａｊ−ＧＪｎ−ＧＪ７−Ｔｈｒ−Ｐ
ｂｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｙ有することが見出さ
れ、これはヌクレオチド配列：５’ ＧＴＧＣＡＧＧＴ
ＴＯＡＧＧＧＴＴＡＴＴＴＯＧＡＴＣＴＴＯＧＣｉ３’
によってコードされていることが明らかにされた。
３８２個のアミノ酸長を有する標準エステルヒドロラー
ゼの全配列が決定された（第１０図）。
ゼの全配列が決定された（第１０図）。
エステルヒドロラーゼ遺伝子の最初の５個のＮ末端アき
ノ酸を、μ五ｚ、Ｊ−ａｃオペａンのβ−がラクトシダ
ーゼ遺伝子の最初の１１個のアミノ酸で置換すると、融
合エステルヒドロラーゼと呼ぶ融合蛋白質が生属し、こ
れは完全な酵素活性を維持した。この結果は、独立Ｋ、
クローン化エステルヒドロラーゼ遺伝子について決定さ
れたＤＮＡ配列の適当な翻訳読み取り枠を確立した。
ノ酸を、μ五ｚ、Ｊ−ａｃオペａンのβ−がラクトシダ
ーゼ遺伝子の最初の１１個のアミノ酸で置換すると、融
合エステルヒドロラーゼと呼ぶ融合蛋白質が生属し、こ
れは完全な酵素活性を維持した。この結果は、独立Ｋ、
クローン化エステルヒドロラーゼ遺伝子について決定さ
れたＤＮＡ配列の適当な翻訳読み取り枠を確立した。
、Ｌユ９ｚと、ｐＰＦ−ＧＤ３ム由米のエステルヒドロ
２−ゼ遺伝子との融合によって生じたクローン化エステ
ルヒドロラーゼについてさらに検討したところ、活性エ
ステルヒドロラーゼはＪａｃ Ｚと標準エステルヒドロ
ラーゼの導伝の融合体から発現できることが示された。
２−ゼ遺伝子との融合によって生じたクローン化エステ
ルヒドロラーゼについてさらに検討したところ、活性エ
ステルヒドロラーゼはＪａｃ Ｚと標準エステルヒドロ
ラーゼの導伝の融合体から発現できることが示された。
すなわち、ｊａｃ Ｚを直接、第６番目のＰ、 ｆｌｕ
ｏｒｅａｃｅｎａアミノ１！１！ （Ｔ７ｒ）とインフ
レームに連結すると、プロモーターをエステルヒドロラ
ーゼ遺伝子と分離している約４５０塩基対か失われて、
活性クローン化エステルヒドロラーゼが発現できること
が明らかにされた（第９図）。
ｏｒｅａｃｅｎａアミノ１！１！ （Ｔ７ｒ）とインフ
レームに連結すると、プロモーターをエステルヒドロラ
ーゼ遺伝子と分離している約４５０塩基対か失われて、
活性クローン化エステルヒドロラーゼが発現できること
が明らかにされた（第９図）。
６８６個のアミノ酸からなるこの融合エステルヒドロラ
ーゼの全配列が決定された（第１１図）。
ーゼの全配列が決定された（第１１図）。
この配列のＮ末端部分は、ｊａｃ Ｚ ｔ’コードする
９個のアミノ酸が、活性融合エステルヒドロラーゼの発
現に必要な最小配列として確立され−ｒ１１３４個の塩
基対にインフレームに融合している。生成した１１６１
個の塩基対（第１１図）は、活性融合エステルヒドロラ
ーゼの発現に必要な見掛ケの最小配列を示している（さ
らに完全な配列決定実験の説明は、例５および６参照）
。
９個のアミノ酸が、活性融合エステルヒドロラーゼの発
現に必要な最小配列として確立され−ｒ１１３４個の塩
基対にインフレームに融合している。生成した１１６１
個の塩基対（第１１図）は、活性融合エステルヒドロラ
ーゼの発現に必要な見掛ケの最小配列を示している（さ
らに完全な配列決定実験の説明は、例５および６参照）
。
酵素の安定化のためには、遺伝子修飾（蛋白質工学）の
ほか（、酵素を化学的に修飾することもできる。この例
としては、アルキル化もしくはアシル化による次面アミ
ノ基の修飾（Ｔｏｒｃｈｉｌｌｉｎ ：Ｂｉｏｃｈｉｍ
、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、 ５６７ ： １
ｅ １９７９ ）−分子内架橋（Ｔｏｒｃｈｉｌｌｉｎ
： Ｂｉｏｃｈｉｍ、 ＢｉＯｐｈ７ｇ。
ほか（、酵素を化学的に修飾することもできる。この例
としては、アルキル化もしくはアシル化による次面アミ
ノ基の修飾（Ｔｏｒｃｈｉｌｌｉｎ ：Ｂｉｏｃｈｉｍ
、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、 ５６７ ： １
ｅ １９７９ ）−分子内架橋（Ｔｏｒｃｈｉｌｌｉｎ
： Ｂｉｏｃｈｉｍ、 ＢｉＯｐｈ７ｇ。
Ａｃｔａ、 ５５２ ： ２７７、１９７７ ）１ｙ＝
は多様なアプローチ１ｆｔ含む酵素の固定化［ｃｈｔｂ
ａｔａ ： ＪｏＭｏｌ。
は多様なアプローチ１ｆｔ含む酵素の固定化［ｃｈｔｂ
ａｔａ ： ＪｏＭｏｌ。
ｑａｔａＬ、 ６３ （総説版） −１９８６ｘ Ｔｒ
θｖａｎ ：工ｍｍｏｂｉｌｉｚｅ（ｌ Ｋｎｇｙｍ
ｅａ ： Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄＡ
ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ、 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ。
θｖａｎ ：工ｍｍｏｂｉｌｉｚｅ（ｌ Ｋｎｇｙｍ
ｅａ ： Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄＡ
ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ、 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ。
Ｃｈｉｃｈｓｓｔｅｒ、σに、１９８０）がある。
Ｐ、 ｆｌｕｏｒｅａｃｅｎｓクローン化エステルヒド
ロラーゼの、ナプロキセンの実際の工業的製造への使用
は、多くのフォーマットで実施することができる。
ロラーゼの、ナプロキセンの実際の工業的製造への使用
は、多くのフォーマットで実施することができる。
たとえば、酵素は連続的に攪拌したタンク反応器に添加
することができる。また、酵素を膜上に固定化してもよ
い。い、ずれの場合も、適当なＲ−８−ナプロキセンエ
ステル基質（通常は低級アルキルエステル、たとえばメ
チル、エチル、インプロビルエステル）がスラリーとし
て、連続的に反応器中に導入される。クローン化エステ
ルヒドロラーゼの酵素反応器における実際の滞留時間は
、基質の注入速度と最終生成物の除去速匿の両者に依存
する。本発明の酵素加水分解は、連続的にまたはバッチ
方式で行われる。標準エステルヒトミラーぜを使用する
場合は、反応は一般的に３０〜６０℃、好ましくは４５
〜５５℃の温度で行われる。前述の熱抵抗性エステルヒ
ドロラーゼを使用する場合は、さらに高い反応温度を使
用できる。
することができる。また、酵素を膜上に固定化してもよ
い。い、ずれの場合も、適当なＲ−８−ナプロキセンエ
ステル基質（通常は低級アルキルエステル、たとえばメ
チル、エチル、インプロビルエステル）がスラリーとし
て、連続的に反応器中に導入される。クローン化エステ
ルヒドロラーゼの酵素反応器における実際の滞留時間は
、基質の注入速度と最終生成物の除去速匿の両者に依存
する。本発明の酵素加水分解は、連続的にまたはバッチ
方式で行われる。標準エステルヒトミラーぜを使用する
場合は、反応は一般的に３０〜６０℃、好ましくは４５
〜５５℃の温度で行われる。前述の熱抵抗性エステルヒ
ドロラーゼを使用する場合は、さらに高い反応温度を使
用できる。
反３７°ａトコールに標準エステルヒドロラーゼを使用
する場合には、インキュベーション温度は４５〜５５℃
とすることが最も好１しく、適当なＰ）（（８，０〜９
．５ ）に維持する７、：めＫＫＯＥＩがａｍされる。
する場合には、インキュベーション温度は４５〜５５℃
とすることが最も好１しく、適当なＰ）（（８，０〜９
．５ ）に維持する７、：めＫＫＯＥＩがａｍされる。
もちろん多くの他の塩基も適当である。
エステル加水分解の生成物、Ｓ−ナプロキセン塩は、様
々な！％足の分子量カットオフ値を有する一連の濾過膜
を通して工程の流れから除去するのが好ましい。これに
より、未反応エステル基質またはクローン化エステルヒ
ドロラーゼの最終生成物への混入が回避される。ついで
、最終生成物は結晶化によってさらＶｃｎ製される。未
反応Ｒ−エステルならびに残留したＳ−エステル鏡像異
性体は、別個の反応器を通して再還流し、ここで両者を
化学的ニラセミ化する。得られたナプロキセンエステル
の５０−５０ラセミ体混合物、ならびに新たなＲ−８−
ナプロキセンエステルは、再びバイオリアクターに導入
し、処理サイクルが反復される。
々な！％足の分子量カットオフ値を有する一連の濾過膜
を通して工程の流れから除去するのが好ましい。これに
より、未反応エステル基質またはクローン化エステルヒ
ドロラーゼの最終生成物への混入が回避される。ついで
、最終生成物は結晶化によってさらＶｃｎ製される。未
反応Ｒ−エステルならびに残留したＳ−エステル鏡像異
性体は、別個の反応器を通して再還流し、ここで両者を
化学的ニラセミ化する。得られたナプロキセンエステル
の５０−５０ラセミ体混合物、ならびに新たなＲ−８−
ナプロキセンエステルは、再びバイオリアクターに導入
し、処理サイクルが反復される。
ナプロキセンエステルの加水分解反応の成績を改善する
ためには、加水分解速度、立体異性特異性および熱安定
性の点での挙動特性が改善されたＰ、 ｆｌｏｒｅｓｃ
ｅｎｓ ｘ ｘチルヒドロラーゼ変異体を開発すること
が望ましい。とくに、加水分解反応を５５℃またはそれ
以上の温度で実施できる熱に安定なクローン化エステル
ヒトαラーゼの開発がきわめて望筐しい。
ためには、加水分解速度、立体異性特異性および熱安定
性の点での挙動特性が改善されたＰ、 ｆｌｏｒｅｓｃ
ｅｎｓ ｘ ｘチルヒドロラーゼ変異体を開発すること
が望ましい。とくに、加水分解反応を５５℃またはそれ
以上の温度で実施できる熱に安定なクローン化エステル
ヒトαラーゼの開発がきわめて望筐しい。
突然変異実験は、もつと熱に安定なＰ、 ｆｌｕｏｒｅ
−ｓｃｅｎｓエステルヒドロラーゼ遺伝子の開発を意図
して行われた。クローン化エステルと）”ｏラ−（／遺
伝子は、突然変異実験を単純化するためと、酵素検定を
一定時間内に多数実施できるように、バクテリオファー
ジＭ １３− ｍｐ １９ （Ｍｅｓｓｉｎｇ ：Ｇｅ
ｎｅ、 １９ ： ２６９．１９８２ ）中に移入Ｌｍ
。
−ｓｃｅｎｓエステルヒドロラーゼ遺伝子の開発を意図
して行われた。クローン化エステルと）”ｏラ−（／遺
伝子は、突然変異実験を単純化するためと、酵素検定を
一定時間内に多数実施できるように、バクテリオファー
ジＭ １３− ｍｐ １９ （Ｍｅｓｓｉｎｇ ：Ｇｅ
ｎｅ、 １９ ： ２６９．１９８２ ）中に移入Ｌｍ
。
すなわち、測子ものファージプラークがエステルヒドロ
ラーゼのオーバーレイアッセイにより、寒天板上でスク
リーニングできる（ Ｈ１ｇｒｅｄ＆５ｐｉｚｉｚｅｎ
： Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 ｉ １４ ：
１１８４ 。
ラーゼのオーバーレイアッセイにより、寒天板上でスク
リーニングできる（ Ｈ１ｇｒｅｄ＆５ｐｉｚｉｚｅｎ
： Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 ｉ １４ ：
１１８４ 。
１９７３）。Ｍ１３７アージ感染細胞は数滴のりａロホ
ルムの添加で容易に溶解させることができる。これによ
り、細菌細胞のベレット化や超音波処理に頼ることなく
、多数の蛋白質抽出液を作成することが可能になる。エ
ステルヒドロラーゼ遺伝子を含有する組換えＭ１６７ア
ージをヒドロキシルアミンで突然変異させた場合は、多
数の熱抵抗性変異体が生成した。化学的突然変異杉皮の
ほかの他の形式の突然変異形成には、熱安定性を増大さ
せるための（Ｍａｔｔｈｅｗｓ ： Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、 ２６ ：６８８５．１９８７ ）、特定部
位の突然変異形成（Ｓｍｉｔｈ ： Ａｎｎ、 Ｒｅｖ
、 Ｇｅｎｅｔ、、 １９ ： Ａ ２３ 。
ルムの添加で容易に溶解させることができる。これによ
り、細菌細胞のベレット化や超音波処理に頼ることなく
、多数の蛋白質抽出液を作成することが可能になる。エ
ステルヒドロラーゼ遺伝子を含有する組換えＭ１６７ア
ージをヒドロキシルアミンで突然変異させた場合は、多
数の熱抵抗性変異体が生成した。化学的突然変異杉皮の
ほかの他の形式の突然変異形成には、熱安定性を増大さ
せるための（Ｍａｔｔｈｅｗｓ ： Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、 ２６ ：６８８５．１９８７ ）、特定部
位の突然変異形成（Ｓｍｉｔｈ ： Ａｎｎ、 Ｒｅｖ
、 Ｇｅｎｅｔ、、 １９ ： Ａ ２３ 。
１９８５ ）等があり、これらの方法は本技術分野の熟
練者にはよく知られている。
練者にはよく知られている。
上述のようにして形成された、熱抵抗性エステルヒドロ
ラーゼと呼ばれる、変異体から回収されるエステルヒド
ロラーゼは、上述のように６５℃までの熱処理後におけ
る残存酵素活性の増加を示した。
ラーゼと呼ばれる、変異体から回収されるエステルヒド
ロラーゼは、上述のように６５℃までの熱処理後におけ
る残存酵素活性の増加を示した。
例
以下の実施例は、本発明を例示するものであって、本発
明を限定するものではない。クローニング実験に使用し
た酵素は、市販品を入手し、製造業者の指示書にほぼ従
って使用した。とくに指示のない限り、ＤＮム製造、制
限酵素による切断、すｒ−ジョンおよび形質転換は、Ｍ
ａｎｉａｔｉａら（前出）の記載にほぼ従って実施した
。
明を限定するものではない。クローニング実験に使用し
た酵素は、市販品を入手し、製造業者の指示書にほぼ従
って使用した。とくに指示のない限り、ＤＮム製造、制
限酵素による切断、すｒ−ジョンおよび形質転換は、Ｍ
ａｎｉａｔｉａら（前出）の記載にほぼ従って実施した
。
Ｐｓａｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅａｃｅｎｓ （
ＡＴＣＣφ１７５５０）ＤＮＡを、８ａｕ ３ムで部分
消化、Ｂａｎ Ｈ工切断ｐＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ−
Ｐｅｒｒｏｎら：前出）ＤＮＡにりｒ−）した。リゾ−
ジョン混合物を大腸菌３Ｍ１０９中に導入した（Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ ：前出）。トランスホーマントを、軟寒天オ
ーバーレイアッセイを用いてエステルヒドロラーゼ活性
についてスクリーニングしくＨｌｇｅｒｄ ＆ Ｓｐｉ
ｚｉｇｅｎ ：前出）、多数のトランスホーマントが陽
性を示した。略述すると、β−ナフチル酢酸エステルと
７アストプルーを含む低融点アガロースを細菌コロニー
上に広げた。エステルヒドロラーゼ陽性クローンによつ
て放出されたβ−す７トールがファストデル−と反応す
ると青色の発色が起こる。
ＡＴＣＣφ１７５５０）ＤＮＡを、８ａｕ ３ムで部分
消化、Ｂａｎ Ｈ工切断ｐＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ−
Ｐｅｒｒｏｎら：前出）ＤＮＡにりｒ−）した。リゾ−
ジョン混合物を大腸菌３Ｍ１０９中に導入した（Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ ：前出）。トランスホーマントを、軟寒天オ
ーバーレイアッセイを用いてエステルヒドロラーゼ活性
についてスクリーニングしくＨｌｇｅｒｄ ＆ Ｓｐｉ
ｚｉｇｅｎ ：前出）、多数のトランスホーマントが陽
性を示した。略述すると、β−ナフチル酢酸エステルと
７アストプルーを含む低融点アガロースを細菌コロニー
上に広げた。エステルヒドロラーゼ陽性クローンによつ
て放出されたβ−す７トールがファストデル−と反応す
ると青色の発色が起こる。
陽性クローンを次に、ナシａキセンメチルエステルのＲ
−またはＳ−異性体（１ｑ／−大豆油）を補充し７：Ｌ
培地（１０ｊＪ／ｌ ）リプトン、５ｇ／ｊ酵母エキス
および１０ 、！９ ／／ Ｎａ（Ｊ）上で一夜増殖さ
せた。培養培地（各１−）を、１−飽和硫酸アンモニウ
ム、５０μｍの濃リン酸および１．５−濃厚酢酸エチル
で抽出した（ ｙ、 ７．Ｂａｋｅｒ。
−またはＳ−異性体（１ｑ／−大豆油）を補充し７：Ｌ
培地（１０ｊＪ／ｌ ）リプトン、５ｇ／ｊ酵母エキス
および１０ 、！９ ／／ Ｎａ（Ｊ）上で一夜増殖さ
せた。培養培地（各１−）を、１−飽和硫酸アンモニウ
ム、５０μｍの濃リン酸および１．５−濃厚酢酸エチル
で抽出した（ ｙ、 ７．Ｂａｋｅｒ。
Ｐｈｉｌｌｌｐ８ｂｕｒｇ、 ＮＪ） 。遠心分離で相
分離し、有機相を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プ
レート上で分析し７．：、ＴＬＯプレー）４１３回１０
０％ヘキサンを流して展開して大豆油を除き、つ−・で
１回９５％ｃａ２ｃｚ２．５優メタノールおよび肌０５
囁水酸化アンモニウムで展開してナプロキセンをそのエ
ステルから分離する。多数のクローンが８−ナプロキセ
ンに対して強い選択性を示した。ｐＰ？−３Ａと命名し
た陽性クローンのひとつをさらに分析した。
分離し、有機相を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プ
レート上で分析し７．：、ＴＬＯプレー）４１３回１０
０％ヘキサンを流して展開して大豆油を除き、つ−・で
１回９５％ｃａ２ｃｚ２．５優メタノールおよび肌０５
囁水酸化アンモニウムで展開してナプロキセンをそのエ
ステルから分離する。多数のクローンが８−ナプロキセ
ンに対して強い選択性を示した。ｐＰ？−３Ａと命名し
た陽性クローンのひとつをさらに分析した。
伝子の特性
プラスミドｐＰ？ −３Ａ （第５図）は４．５ ｋｂ
のＤＮＡ挿入体を有する。このプラスミドをもつ大腸菌
のサンプルは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔ
ｕｒｅｑｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＯＣ）に寄託され
、記号ＡＴＯＣφ６８０８３が与えられている。
のＤＮＡ挿入体を有する。このプラスミドをもつ大腸菌
のサンプルは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔ
ｕｒｅｑｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＯＣ）に寄託され
、記号ＡＴＯＣφ６８０８３が与えられている。
サブクローニング実験により、標準エステルヒドロラー
ゼ遺伝子は２．４ ｋｂ Ｈｌｎｄ ■フラグメント内
にコードされていることが明らかにされた。プラスミド
ｐＰＩＦ−３Ａ ＤＮＡをｕｉｎｄｌ［で切断し、Ｈ
ｌｎｄ Ｈ［で切断し７：ｐ［７Ｃ１８ｔ’ｓ：＆Ｘｐ
（１２）１９ベクターＤＮＡにりｒ−トした。陽性エス
テルヒドロラーゼクローンは例１の記載に従って同定し
た。
ゼ遺伝子は２．４ ｋｂ Ｈｌｎｄ ■フラグメント内
にコードされていることが明らかにされた。プラスミド
ｐＰＩＦ−３Ａ ＤＮＡをｕｉｎｄｌ［で切断し、Ｈ
ｌｎｄ Ｈ［で切断し７：ｐ［７Ｃ１８ｔ’ｓ：＆Ｘｐ
（１２）１９ベクターＤＮＡにりｒ−トした。陽性エス
テルヒドロラーゼクローンは例１の記載に従って同定し
た。
プラスミドＤＮＡを陽性クローンかも調製して、数種の
制限酵素を用いて詳細に性質を調べた。
制限酵素を用いて詳細に性質を調べた。
ｐ［Ｔｃ １８およびｐｆｆｏ １９ Ｋ Ｍけルヒド
ｏ９−ゼ活性の発現は、すべてその方向に依存すること
が明らかにされ、内因性シュードモナスプロモーターが
あっても大腸菌内では機能しないことを下した。
ｏ９−ゼ活性の発現は、すべてその方向に依存すること
が明らかにされ、内因性シュードモナスプロモーターが
あっても大腸菌内では機能しないことを下した。
プラスミドｐＵ０１８中にクローン化されたエステルヒ
ドロラーゼ陽性クローンのひとつ’ＩＪＩ’ ｐＰＩＦ
−１８−１と命名した。さらに欠失試験によって、エ
ステルヒドロラーゼ遺伝子の位置力２．４ ｋｂＨｌｎ
（ｌ ［［フラグメント内に正確に確立された。
ドロラーゼ陽性クローンのひとつ’ＩＪＩ’ ｐＰＩＦ
−１８−１と命名した。さらに欠失試験によって、エ
ステルヒドロラーゼ遺伝子の位置力２．４ ｋｂＨｌｎ
（ｌ ［［フラグメント内に正確に確立された。
例３． ｐＰＩＦ−３Ａからのエステルヒドロラーゼ
の特性 ｐＰ？ −３Ａ ’ｌ’もつ大腸菌細胞から粗蛋白質抽
出物を調製し、立体異性特異的なエステル分解活性を検
定した。主として、ｐＰＩＦ −３Ａの一夜細菌培養液
（１，５／）をベレット化し、Ｔｒｉｓ Ｈｗ ＊ ｐ
Ｈ８，０，１００−中への再懸濁を行った。超音波処理
後に、抽出液を低速遠心分離（１２，０００Ｘｇ）で澄
明にし、上溝を回収した。ナプロキセンのＲ−およびＳ
−メチルエステル（２０■／−）をそれぞれの粗蛋白質
抽出物に加えた。第６図には加水分解結果を示すが、こ
れはＳ−ナプロキセンエステルに対するｐＰＩＦ −３
Ａの強い選択性を証明した。
の特性 ｐＰ？ −３Ａ ’ｌ’もつ大腸菌細胞から粗蛋白質抽
出物を調製し、立体異性特異的なエステル分解活性を検
定した。主として、ｐＰＩＦ −３Ａの一夜細菌培養液
（１，５／）をベレット化し、Ｔｒｉｓ Ｈｗ ＊ ｐ
Ｈ８，０，１００−中への再懸濁を行った。超音波処理
後に、抽出液を低速遠心分離（１２，０００Ｘｇ）で澄
明にし、上溝を回収した。ナプロキセンのＲ−およびＳ
−メチルエステル（２０■／−）をそれぞれの粗蛋白質
抽出物に加えた。第６図には加水分解結果を示すが、こ
れはＳ−ナプロキセンエステルに対するｐＰＩＦ −３
Ａの強い選択性を証明した。
ｐＰ？ −３Ａをもつ大腸菌細胞によって生成される標
準エステルヒドロラーゼのレベルは、大腸菌オペロンの
インデューサー、イソプロピルチオ−ガラクトシド（Ｉ
Ｐ’ｒＧ）の添加によって修飾できりＯ細菌培養液を工
ＰＴＧ （Ｉ ＲＩＭ ）で誘導した場合、エステル分
解活性の少なくとも６倍の上昇が観察された。
準エステルヒドロラーゼのレベルは、大腸菌オペロンの
インデューサー、イソプロピルチオ−ガラクトシド（Ｉ
Ｐ’ｒＧ）の添加によって修飾できりＯ細菌培養液を工
ＰＴＧ （Ｉ ＲＩＭ ）で誘導した場合、エステル分
解活性の少なくとも６倍の上昇が観察された。
Ｐ、 ｆｌｕｏｒｅａｃｅｎｓ ｘ ｘチルヒトミ９−
ゼの精製サンプルの調製には、ｐＰ？ −３ムを保留す
る大腸菌細胞なＬ培地中で増殖させ、１ｍＭ工ＰＴＧで
誘導した。誘導５時間後に、培養液（１０１）を遠心分
離で収穫した。ペレツ）’＆２ ／の緩衝液中に溶解し
、Ｇａｕｌｉｎ崩壊器を用いて崩壊させた。細胞溶解物
を次に遠心分離し、上清を、予め５ＣｍＭＴｒｉ８−
ＨＣｊ 、 ｐＨ９で平衡化しｆ＝ ＤＥＡＦｊ−８ｅ
ｐｈａＱｅＬカラム上に負荷した。カラムを直線塩勾配
（５０ｍＷ Ｔｒｉ８− Ｅｌ（Ｊ 、 ｐ）１９中０
〜０．５ Ｍ Ｎａ１ｌ）で溶出した。活性分画（０，
６〜０．４ Ｍ Ｎ＆α）をプールし、７０％飽和硫酸
アンモニウムで沈殿させた。遠心分離後、ペレットｙｙ
５０ ＩｎＭＴｒｌａ −ａａｔ ＋ ｐ’ ９−１
５〇−中に溶解し、Ｇ−１００Ｐル濾過カラムに適用し
に０見掛けの分子量３ Ｑ ｋＤで溶出した活性標準エ
ステルヒドロラーゼを回収し、濃縮しｒ、： （ｆｉ酸
アンモニウム沈殿または凍結乾燥）。精製酵素サンプル
のＢＤＢ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動では、約３
３ ｋＤに主バンドが認められた。
ゼの精製サンプルの調製には、ｐＰ？ −３ムを保留す
る大腸菌細胞なＬ培地中で増殖させ、１ｍＭ工ＰＴＧで
誘導した。誘導５時間後に、培養液（１０１）を遠心分
離で収穫した。ペレツ）’＆２ ／の緩衝液中に溶解し
、Ｇａｕｌｉｎ崩壊器を用いて崩壊させた。細胞溶解物
を次に遠心分離し、上清を、予め５ＣｍＭＴｒｉ８−
ＨＣｊ 、 ｐＨ９で平衡化しｆ＝ ＤＥＡＦｊ−８ｅ
ｐｈａＱｅＬカラム上に負荷した。カラムを直線塩勾配
（５０ｍＷ Ｔｒｉ８− Ｅｌ（Ｊ 、 ｐ）１９中０
〜０．５ Ｍ Ｎａ１ｌ）で溶出した。活性分画（０，
６〜０．４ Ｍ Ｎ＆α）をプールし、７０％飽和硫酸
アンモニウムで沈殿させた。遠心分離後、ペレットｙｙ
５０ ＩｎＭＴｒｌａ −ａａｔ ＋ ｐ’ ９−１
５〇−中に溶解し、Ｇ−１００Ｐル濾過カラムに適用し
に０見掛けの分子量３ Ｑ ｋＤで溶出した活性標準エ
ステルヒドロラーゼを回収し、濃縮しｒ、： （ｆｉ酸
アンモニウム沈殿または凍結乾燥）。精製酵素サンプル
のＢＤＢ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動では、約３
３ ｋＤに主バンドが認められた。
クローン化エステルヒドロラーゼおよび他の市販Ｐ、
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓリパーゼ［Ａｍａｎｏ ： Ｐ
、 ｆｌｕｏ−ｒｅｅｃｅｎｇから誘導されたリパーゼ
Ｐ ” Ａｍａｎｏ”ＰＲ−１３およびシュードモナス
種から誘導されたリパーゼＡＫｗＡＩ！ＩａｎＯ”−Ｐ
Ｒ−１４； Ｆｌｕｋａ ： シュードモナス種（ＥＣ
３，１，１，３４）（９００４−（１２）−８）および
Ｐ、ｆｌｕｏｒｅａｃｅｎｓ（ＥＣ３，１，１，３）（
９００１−６２−１）からのリポ蛋白質リパーゼ； Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＭＩＬｎｎ−ｈｅｌｍ ：シュー
ドモナス種からのリパーゼ（トリアジルグリセロールア
シルヒドロラーゼ、 ＩＣ６，１，１，６）およびＳｉ
ｇｍａ ： −／ ニードモナス種からの■型（Ｌ９５
１８）］の活性染色を、非変性ポリアクリルアミドデル
上で分割して行ったところ、クローン化エステルヒドロ
ラーゼは、他のシュードモナス酵素とは、非変性ｒル系
における分画移動において明らかに相違していた（第１
図）。
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓリパーゼ［Ａｍａｎｏ ： Ｐ
、 ｆｌｕｏ−ｒｅｅｃｅｎｇから誘導されたリパーゼ
Ｐ ” Ａｍａｎｏ”ＰＲ−１３およびシュードモナス
種から誘導されたリパーゼＡＫｗＡＩ！ＩａｎＯ”−Ｐ
Ｒ−１４； Ｆｌｕｋａ ： シュードモナス種（ＥＣ
３，１，１，３４）（９００４−（１２）−８）および
Ｐ、ｆｌｕｏｒｅａｃｅｎｓ（ＥＣ３，１，１，３）（
９００１−６２−１）からのリポ蛋白質リパーゼ； Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＭＩＬｎｎ−ｈｅｌｍ ：シュー
ドモナス種からのリパーゼ（トリアジルグリセロールア
シルヒドロラーゼ、 ＩＣ６，１，１，６）およびＳｉ
ｇｍａ ： −／ ニードモナス種からの■型（Ｌ９５
１８）］の活性染色を、非変性ポリアクリルアミドデル
上で分割して行ったところ、クローン化エステルヒドロ
ラーゼは、他のシュードモナス酵素とは、非変性ｒル系
における分画移動において明らかに相違していた（第１
図）。
標準エステルヒドロラーゼの熱安定性は、酵素を４０℃
〜５５℃の間、５℃間隔でインキエベートし、ついで残
存活性をアッセイして測定した。
〜５５℃の間、５℃間隔でインキエベートし、ついで残
存活性をアッセイして測定した。
第２図は、この酵素の半減期が５０’Ｏで４時間以上で
あることを示している。
あることを示している。
クローン化エステルヒドロラーゼは、粗製または精製型
のいずれにおいても、完全な活性の発現に界面活性剤を
必要としない（第３図）。３０ｑ／ｌのナシクキセンエ
チルエステル濃度で、精製クローン化エステルヒトａ２
−ゼは、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ １ｋｍ加しても添加し
なくても、存在する基質のすべてを５０℃５時間で完全
に加水分解し、一方、９７．５％以上の高いｅθが維持
された。第１表に示すように他の市販シュードモナスリ
パーゼはいずれも、これらの条件下にはナプロキセンエ
チルエステルに対し活性を示さなかった。
のいずれにおいても、完全な活性の発現に界面活性剤を
必要としない（第３図）。３０ｑ／ｌのナシクキセンエ
チルエステル濃度で、精製クローン化エステルヒトａ２
−ゼは、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ １ｋｍ加しても添加し
なくても、存在する基質のすべてを５０℃５時間で完全
に加水分解し、一方、９７．５％以上の高いｅθが維持
された。第１表に示すように他の市販シュードモナスリ
パーゼはいずれも、これらの条件下にはナプロキセンエ
チルエステルに対し活性を示さなかった。
第１激
基質レヘル：Ｒ−８−ナプロキセンエチルエステル（１
０ｑ／ｍ ） 反応容量：０．５ｍ 反応温［：５０℃ 反応時間：１時間 生成物分析： ａｐｂｃ 酵素 加水
分解囁Ｆｌｕｋａ（ＥＣ５，１，１，３４）（Ｐ、種）
０．０３５Ｆｌｕｋａ （ＥＣふ１．
１．３）（ｐ、 ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ） ０
．０５Ｓｉｇｍａ（ｐ、種）
０．０９ＡｍａｎＯＡＫ （Ｐ、種） クローン化エステルヒドロラーゼ ０．０６ ６．４０ 酵素の単位は販売者のスペックに基づいて同等である 例４． Ｎ末端アミノ酸配列決定 ｐＰＰ −３Ａからのクローン化エステルヒドロラーゼ
のＮ末端アミノ酸配列は、微量配列決定法を用いて決定
された。とくに、例３に従って製造された酵素の精製プ
レバレージョンを８ＤＢ−ポリアクリルアミドデル上で
電気泳動した。分割された蛋白質バンドをついで、工Ｉ
ｎｍ０ｂｕｌＯｎ フィルター（Ｍｉ’１ｌｉｐＯｒｅ
ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、 Ｍｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、
［Ｔ８Ａ）上で電気プロットし、興味ある蛋白質バン
ドを切り取り、標準微量配列決定法に付した（Ｍａｔｓ
ｕｄｉｒａ：、Ｔ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、ｅ ２６２
： １００３５．１９８７）。
０ｑ／ｍ ） 反応容量：０．５ｍ 反応温［：５０℃ 反応時間：１時間 生成物分析： ａｐｂｃ 酵素 加水
分解囁Ｆｌｕｋａ（ＥＣ５，１，１，３４）（Ｐ、種）
０．０３５Ｆｌｕｋａ （ＥＣふ１．
１．３）（ｐ、 ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ） ０
．０５Ｓｉｇｍａ（ｐ、種）
０．０９ＡｍａｎＯＡＫ （Ｐ、種） クローン化エステルヒドロラーゼ ０．０６ ６．４０ 酵素の単位は販売者のスペックに基づいて同等である 例４． Ｎ末端アミノ酸配列決定 ｐＰＰ −３Ａからのクローン化エステルヒドロラーゼ
のＮ末端アミノ酸配列は、微量配列決定法を用いて決定
された。とくに、例３に従って製造された酵素の精製プ
レバレージョンを８ＤＢ−ポリアクリルアミドデル上で
電気泳動した。分割された蛋白質バンドをついで、工Ｉ
ｎｍ０ｂｕｌＯｎ フィルター（Ｍｉ’１ｌｉｐＯｒｅ
ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、 Ｍｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、
［Ｔ８Ａ）上で電気プロットし、興味ある蛋白質バン
ドを切り取り、標準微量配列決定法に付した（Ｍａｔｓ
ｕｄｉｒａ：、Ｔ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、ｅ ２６２
： １００３５．１９８７）。
次に生成物を、Ｈｕｎｋａｐｅ ｌｌｉ ｅｒら： Ｈ
ｅｔｈ、Ｅｎｇ、ｓ９） ：３９９（１９８３）に記載
された方法を用い、自動気相マイクロシクエンサー上で
分析しに０クローン化Ｐ、ｆｌｕｏｒθ８Ｃθｎ８エス
テルヒドロラーゼは以下のＮ末端配列 Ｍｅ ｔ −ＧＪ−ｕ−Ｖａｊ−Ｇｊｎ−ＧＪ７− Ｔ
ｒｙ−Ｐｈｅ−Ａｌｐ−、［ｅｕ−Ａｒｇ −を有する
ことが明らかにされた（第４図）。
ｅｔｈ、Ｅｎｇ、ｓ９） ：３９９（１９８３）に記載
された方法を用い、自動気相マイクロシクエンサー上で
分析しに０クローン化Ｐ、ｆｌｕｏｒθ８Ｃθｎ８エス
テルヒドロラーゼは以下のＮ末端配列 Ｍｅ ｔ −ＧＪ−ｕ−Ｖａｊ−Ｇｊｎ−ＧＪ７− Ｔ
ｒｙ−Ｐｈｅ−Ａｌｐ−、［ｅｕ−Ａｒｇ −を有する
ことが明らかにされた（第４図）。
同時にｐＰ？ −１８−１の２．４ ｋｂ Ｈｌｎｄ
ｐｌ挿入体のＤＮＡ配列も、Ｓａｎｇｅｒ ： Ｐｒｏ
ｃ、Ｈａｔｅ、Ａｃａｄ、 ８ｃｉ。
ｐｌ挿入体のＤＮＡ配列も、Ｓａｎｇｅｒ ： Ｐｒｏ
ｃ、Ｈａｔｅ、Ａｃａｄ、 ８ｃｉ。
ＵＳＡ、 ７４ ： ５４６３ （１９７７）に記載さ
れたジデオキシ配列決定法を用いて決定された。６つの
読み取り枠中のＤＮＡの翻訳は、次のヌクレオチド鎖 ５’ ＧＴＧＣ！ＡＧＧＴＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴＴＴＣ
ＧＡＴＣＴＴＯＧＣ３’によって行われることが確認さ
れた。これが１０個の上記Ｎ末端アミノ酸配列をコード
する（第４図参照）。エステルヒドロラーゼ遺伝子はシ
グナル配列をもＴこないようで、それは翻訳開始のＡＴ
Ｇ（Ｍｅｔ） ［代えてＧＴＧ：ｆｆトン（通常はＶａ
ｊ ）を利用することは注目すべきである。シャインデ
ルガフ様配列（リポソーム結合部位）はＧＴＧ開始コド
ンの７ヌクレオテド上流に確認された。
れたジデオキシ配列決定法を用いて決定された。６つの
読み取り枠中のＤＮＡの翻訳は、次のヌクレオチド鎖 ５’ ＧＴＧＣ！ＡＧＧＴＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴＴＴＣ
ＧＡＴＣＴＴＯＧＣ３’によって行われることが確認さ
れた。これが１０個の上記Ｎ末端アミノ酸配列をコード
する（第４図参照）。エステルヒドロラーゼ遺伝子はシ
グナル配列をもＴこないようで、それは翻訳開始のＡＴ
Ｇ（Ｍｅｔ） ［代えてＧＴＧ：ｆｆトン（通常はＶａ
ｊ ）を利用することは注目すべきである。シャインデ
ルガフ様配列（リポソーム結合部位）はＧＴＧ開始コド
ンの７ヌクレオテド上流に確認された。
最初の実験では、アミン末端から５番目のアミノ酸の標
準エステルヒドロラーゼ遺伝子内に１個のＭｂＯＩＩ部
位が同定された。ＭｂＯＩＩＩＣよる２、４ｋｂＨ１ｎ
ｃｌ Ｉｌ［Ｄ Ｎ Ａフラグメントの切断で約１１０
０塩基対のＤＮＡフラグメントが放出された。Ｍｌ）０
■フラグメントは、予めｓｍａ ■で切断し７：ｐ［Ｔ
Ｃ１８中にクローン化された。ｐｐＦ−ＧＤ３Ａ３と命
名された陽性エステルヒドロ２−ゼクローンが同定され
、そのプラスミドＤＮＡが製造され、配列決定された。
準エステルヒドロラーゼ遺伝子内に１個のＭｂＯＩＩ部
位が同定された。ＭｂＯＩＩＩＣよる２、４ｋｂＨ１ｎ
ｃｌ Ｉｌ［Ｄ Ｎ Ａフラグメントの切断で約１１０
０塩基対のＤＮＡフラグメントが放出された。Ｍｌ）０
■フラグメントは、予めｓｍａ ■で切断し７：ｐ［Ｔ
Ｃ１８中にクローン化された。ｐｐＦ−ＧＤ３Ａ３と命
名された陽性エステルヒドロ２−ゼクローンが同定され
、そのプラスミドＤＮＡが製造され、配列決定された。
第７図には、ｚａｃｚ−エステルヒドロラーゼ融合接合
部周辺のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。この
融合エステルヒドロラーゼを用いた研究から、クローン
化エステルヒドロラーゼの最初の数個のアミノ酸はなく
てもよく、またクローン化エステルヒドロラーゼ遺伝子
の前述の翻訳読み取り枠が実際に正しかったことが証明
された。
部周辺のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。この
融合エステルヒドロラーゼを用いた研究から、クローン
化エステルヒドロラーゼの最初の数個のアミノ酸はなく
てもよく、またクローン化エステルヒドロラーゼ遺伝子
の前述の翻訳読み取り枠が実際に正しかったことが証明
された。
５′−カルボキシルコード領域の範囲を一方向性の先端
切断によって決定した。クローン化エステルヒドロラー
ゼのカルボキシル部分のコード領域を、８ａ工部位の近
位下流から開始し、エキソヌクレアーゼ■を用いて消化
した（ＭＩＬｎｉａｔｉｌｉ 、前出）。
切断によって決定した。クローン化エステルヒドロラー
ゼのカルボキシル部分のコード領域を、８ａ工部位の近
位下流から開始し、エキソヌクレアーゼ■を用いて消化
した（ＭＩＬｎｉａｔｉｌｉ 、前出）。
略述すれば、ｐＰＦ −Ｇ Ｄ ３ Ａからのエステラ
ーゼＤＮＡ５０μｇ＆２５０単位のＢａｊ ｚ酵素で消
化し、ついで２００率位のＳｐｈ工（Ｎｅｗ ＥｒＬｇ
ｌａｎｄＢｉｏｌａｌ）ｓ、 Ｂｅｖｅｒｌ乙ＭＡ）で
消化した。１０μｇＢａｄ工Ｓｐｈ Ｉ処理ＤＮＡを、
６０μｍの消化緩衝液中３７℃において、エキソヌクレ
アーゼ［１４単位で処理した。１分間隔で８００ ｎｇ
のサンプルを取り出し、氷上で冷却し、フェノール−〇
ＦＩＣｊ３抽出し、エタノールで沈殿させた。各８００
μｍのサンプルＹ ＭｕｎｇＢθａｎヌクレアーゼ緩衝
液（ＢｉＯｌａｂりの１Ｄｐｌ容量中に３［］℃で６０
分間再懸濁した。酵素の濃縮および希釈に用いた緩衝液
は、製造業者の推薦する操作に従った。サンプル（エフ
エノール−ＣＨＣ２３で抽出し、エタノールで沈殿させ
た（Ｍａｎｉａｔｉ町前出）。
ーゼＤＮＡ５０μｇ＆２５０単位のＢａｊ ｚ酵素で消
化し、ついで２００率位のＳｐｈ工（Ｎｅｗ ＥｒＬｇ
ｌａｎｄＢｉｏｌａｌ）ｓ、 Ｂｅｖｅｒｌ乙ＭＡ）で
消化した。１０μｇＢａｄ工Ｓｐｈ Ｉ処理ＤＮＡを、
６０μｍの消化緩衝液中３７℃において、エキソヌクレ
アーゼ［１４単位で処理した。１分間隔で８００ ｎｇ
のサンプルを取り出し、氷上で冷却し、フェノール−〇
ＦＩＣｊ３抽出し、エタノールで沈殿させた。各８００
μｍのサンプルＹ ＭｕｎｇＢθａｎヌクレアーゼ緩衝
液（ＢｉＯｌａｂりの１Ｄｐｌ容量中に３［］℃で６０
分間再懸濁した。酵素の濃縮および希釈に用いた緩衝液
は、製造業者の推薦する操作に従った。サンプル（エフ
エノール−ＣＨＣ２３で抽出し、エタノールで沈殿させ
た（Ｍａｎｉａｔｉ町前出）。
１．２および３分エキソヌクレアーゼ■処理時点でのサ
ンプルそれぞれ４００ ｎｇを集めた。新しいプラント
末端挿入体２ ａ ｏ ｎｇ ’ｉ、２１μノのプラン
ト末端りが−ゼ緩衝液（Ｍａｎｉａｔｉｓ、前出）中、
２Ｗｅｉｓｓ率位１７）Ｔ４ＤＮムリが−ゼ（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｔｍ、西独）を用い、アン
バー停止終結リンカ−（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、 Ｐｉｓ
ｃａｔａｗａｙ、 ＮＪ）５００μｇｌｃ１１４℃で一
夜、リゾートさせた。
ンプルそれぞれ４００ ｎｇを集めた。新しいプラント
末端挿入体２ ａ ｏ ｎｇ ’ｉ、２１μノのプラン
ト末端りが−ゼ緩衝液（Ｍａｎｉａｔｉｓ、前出）中、
２Ｗｅｉｓｓ率位１７）Ｔ４ＤＮムリが−ゼ（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｔｍ、西独）を用い、アン
バー停止終結リンカ−（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、 Ｐｉｓ
ｃａｔａｗａｙ、 ＮＪ）５００μｇｌｃ１１４℃で一
夜、リゾートさせた。
−夜インキユベートしたのち、すｒ−ジョン混合物を、
計６０単位のＸｂａ工により、６７℃で４．５時間消化
した。処理サンプルを、８ｅｐｈｒａｃｒｙｌＳ−４０
０カラＡ （Ｐｒｏｍｅｇａ、 ＭａｄｉａＯｎ、 Ｗ
工）上で精製した。ついでサンプル６００μノの粘着末
端リゾ−ジョン緩衝液（Ｍａｎｉａｔｉｓ ：前出）中
、０．１ｗｅｉｓｓ単位の７４ Ｄ Ｎ Ａリガーｒｚ
用い、１４℃で４時間反応させて再び環化した。１５μ
ｍの再環化ＤＮＡを用い１００μＬの大腸菌コービーテ
ン ト Ｊ Ｍ １ ０ ９ ｍ ｍ （８ｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ、 ＬａＪＯ１１ａ＊ ＯＡ）をト
ランスホームし、ｘｇａ１工ＰＴＧ Ａｍｐ ＬＢプレ
ート上で平板培養した。
計６０単位のＸｂａ工により、６７℃で４．５時間消化
した。処理サンプルを、８ｅｐｈｒａｃｒｙｌＳ−４０
０カラＡ （Ｐｒｏｍｅｇａ、 ＭａｄｉａＯｎ、 Ｗ
工）上で精製した。ついでサンプル６００μノの粘着末
端リゾ−ジョン緩衝液（Ｍａｎｉａｔｉｓ ：前出）中
、０．１ｗｅｉｓｓ単位の７４ Ｄ Ｎ Ａリガーｒｚ
用い、１４℃で４時間反応させて再び環化した。１５μ
ｍの再環化ＤＮＡを用い１００μＬの大腸菌コービーテ
ン ト Ｊ Ｍ １ ０ ９ ｍ ｍ （８ｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ、 ＬａＪＯ１１ａ＊ ＯＡ）をト
ランスホームし、ｘｇａ１工ＰＴＧ Ａｍｐ ＬＢプレ
ート上で平板培養した。
融合エステルヒドロラーゼ陰性クローンの分析により、
最小２４個までのヌクレオチドヲ５′末端から１）Ｐ
１１１５１ （第１１図参照）のＴＧム停止コドン１で
を除去すると、クローン化遺伝子が不活性化することが
示された。
最小２４個までのヌクレオチドヲ５′末端から１）Ｐ
１１１５１ （第１１図参照）のＴＧム停止コドン１で
を除去すると、クローン化遺伝子が不活性化することが
示された。
例の決定
クローン化エステルヒドロラーゼ（融合エステルヒドａ
ラーゼおよび標準エステルヒドロラーゼ）のＤＮＡ配列
は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔａ標準 ３７３
Ａ自動ＤＮＡシクエンサ−（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅ標準工ｎｃ、。
ラーゼおよび標準エステルヒドロラーゼ）のＤＮＡ配列
は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔａ標準 ３７３
Ａ自動ＤＮＡシクエンサ−（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅ標準工ｎｃ、。
１Ｆｏｓｔｅｒ ０１ｔ７． ＯＡ）を用い、販売者が
推薦する２つの別の操作によって得られた。シクエンサ
ーは、ゾデオキシシクエンシング反応からの螢光標識Ｄ
ＮＡ分子を、分離、検出、同定するものである。
推薦する２つの別の操作によって得られた。シクエンサ
ーは、ゾデオキシシクエンシング反応からの螢光標識Ｄ
ＮＡ分子を、分離、検出、同定するものである。
第一のシクエンシング操作には、ＡｐｐｌｉθｄＢｉＯ
ｓｙｓｔｅｍのニーデーマニュアルに示されているＴａ
ｑポリメラーゼ７°ｃ２トコールを使用した。この操作
は、色素標識プライマーを用い、主としてクローニング
ベクター（プラスミドＰＴＴＯ１Ｂ ）に最も近いＤＮ
Ａ配列を決定するために使用した。
ｓｙｓｔｅｍのニーデーマニュアルに示されているＴａ
ｑポリメラーゼ７°ｃ２トコールを使用した。この操作
は、色素標識プライマーを用い、主としてクローニング
ベクター（プラスミドＰＴＴＯ１Ｂ ）に最も近いＤＮ
Ａ配列を決定するために使用した。
第二の操作は、ｌｉ’ｒｐｔツクスｆｔ１μ！ではなく
１．５μノを用いた以外は販売者によって記載された二
本鎖サイクリング操作にほぼ従った。Ｔａｑポリメラー
ゼ配列決定操作の結果に基づく配列の合成オリデヌクレ
オチドを二本鎖サイクリング操作のプライマーとして使
用した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＦＯＲ）＆工、Ｐｅｒ
ｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ ＤＮＡ’ｊ’ｈｅｒ
ｍａｌ Ｑｙｃｌｅｒ （）ｉｏｒＷａ８に、 ＣＴ）
Ｋより、製造業者によって特定された条件、すなわち
９８℃１秒、６０℃２分の３０工程サイクルを用いて実
施した。
１．５μノを用いた以外は販売者によって記載された二
本鎖サイクリング操作にほぼ従った。Ｔａｑポリメラー
ゼ配列決定操作の結果に基づく配列の合成オリデヌクレ
オチドを二本鎖サイクリング操作のプライマーとして使
用した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＦＯＲ）＆工、Ｐｅｒ
ｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ ＤＮＡ’ｊ’ｈｅｒ
ｍａｌ Ｑｙｃｌｅｒ （）ｉｏｒＷａ８に、 ＣＴ）
Ｋより、製造業者によって特定された条件、すなわち
９８℃１秒、６０℃２分の３０工程サイクルを用いて実
施した。
伸長生成物の精製は、ムｐｐ１４６ｄ Ｂｌｏｓｙｓｉ
ｔｅｍ、工ｎｃ。
ｔｅｍ、工ｎｃ。
のプロトコールに従い、５０８θｐｈａｄｅｘスピンカ
ラＡ （ＢｉｏＲａｄ、 Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、 Ｃムン
を用いて行った。
ラＡ （ＢｉｏＲａｄ、 Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、 Ｃムン
を用いて行った。
続いてエタノール沈殿を行った。ＰＣＲ生成物は、Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍａ ３７５ムシクエン
サーに負荷した。
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍａ ３７５ムシクエン
サーに負荷した。
この操作を用いて、標準エステルヒトｃｘ９−ゼ（第１
０図）および融合エステルヒドロラーゼ（第１１図）の
全配列が決定された。
０図）および融合エステルヒドロラーゼ（第１１図）の
全配列が決定された。
性質を検討した限りの、公知の市販リパーゼの大部分は
、その基質結合領域に、一致するアミノ酸配列Ｇノｙ−
ｘ−８ｏｒ−Ｘ−Ｇｊ７ ’に含有する（ＢＯ８１：Ｌ
ｉｐｉａ８．２３ ： ７０１ 、１９８８ ）。この
一致したアミノ酸配列は、注目すべきことに、Ｐ、ｆｌ
ｕｏ−ｒｅｓｃｅｎｓクローン化エステルヒドロラーゼ
には存在しない。クローン化エステルヒドロラーゼが効
率的なリパーゼであるか否かｔ／ｖ４べるため、リパー
ゼアッセイキット（１３１ｇｌｌｌａ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ、 Ｓｔ、ＬＯｕｌｇ。
、その基質結合領域に、一致するアミノ酸配列Ｇノｙ−
ｘ−８ｏｒ−Ｘ−Ｇｊ７ ’に含有する（ＢＯ８１：Ｌ
ｉｐｉａ８．２３ ： ７０１ 、１９８８ ）。この
一致したアミノ酸配列は、注目すべきことに、Ｐ、ｆｌ
ｕｏ−ｒｅｓｃｅｎｓクローン化エステルヒドロラーゼ
には存在しない。クローン化エステルヒドロラーゼが効
率的なリパーゼであるか否かｔ／ｖ４べるため、リパー
ゼアッセイキット（１３１ｇｌｌｌａ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ、 Ｓｔ、ＬＯｕｌｇ。
ＭＯ）を用いて、酵素のリパーゼ活性を検定した。
この検定はＦｉｅｒｅｃｋの方法（Ｃｈｉｎ、 Ｃｈｅ
ｍ、ムｅｔａ。
ｍ、ムｅｔａ。
１３：３５２．１９６６）Ｋ基づくもので、検定の基質
としてオリーブ油を使用する。結束束は第２艮に示す。
としてオリーブ油を使用する。結束束は第２艮に示す。
第２表
酵素
Ｆｌｕｋａ（ＥＣ′５％１．１．３）（Ｐ、 ｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｓ）Ｓｉｇｍａ（ｐ０種） Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｃ，ｃｙｌ
ｉｎｄｒａｃｅａ）ＡｒｎａｎＯリパーゼＰ （Ｐ、
ｆ １ｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ）Ａｍａｎｏ ＡＫ （Ｐ
＋種） クローン化エステルニドａラーゼ 加水分解単位 ５ ８ 〉８５ ８ ８ 酵素の単位は販売者のスペックに基づいて同等である。
ｒｅｓｃｅｎｓ）Ｓｉｇｍａ（ｐ０種） Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｃ，ｃｙｌ
ｉｎｄｒａｃｅａ）ＡｒｎａｎＯリパーゼＰ （Ｐ、
ｆ １ｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ）Ａｍａｎｏ ＡＫ （Ｐ
＋種） クローン化エステルニドａラーゼ 加水分解単位 ５ ８ 〉８５ ８ ８ 酵素の単位は販売者のスペックに基づいて同等である。
加水分解単位は、販売者のプロトコール（８１ｇｍａＣ
ｈｅｍｉｃａｌ、 ８ｔ、 Ｌｏｕｉｓ、 ＭＯ）に従
い、８１ｇＩｎａ−７１０ｔｚ単位として表示する。
ｈｅｍｉｃａｌ、 ８ｔ、 Ｌｏｕｉｓ、 ＭＯ）に従
い、８１ｇＩｎａ−７１０ｔｚ単位として表示する。
これらの結果は、例３に掲げた結果を確証し、クローン
化エステルヒドロラーゼが既知の市販酵素とは異なるも
のであることを証明している。
化エステルヒドロラーゼが既知の市販酵素とは異なるも
のであることを証明している。
ノー
ｐ、ｍｅｎｄｏｃｉｎａ （Ｓｅｃφ３−１８（１）お
よび−＆−ｓｔｕｔｇｅｒｉ （ムＴＣＯす１７５８８
）からのエステルヒドロ２−ゼ陽性クローンは、例１に
記載したようにして構築し、同定した。選択されたエス
テルヒドロラーゼクローンによって産生されるエステル
ヒドロラーゼは、ナプロキセンエステルを立体異性特異
的な方式で加水分解することが見出された。サデンデロ
ットハイプリダイゼーショ／（８ｏｕｔｈｅｒｎ ：
、ｙ、ｍｏｌ、Ｂｔｏｌ、、 ９８ ： ５０３ ｍ１
９７５）を用い、これらの２種からのエステルヒドロラ
ーゼ遺伝子は、Ｐ、 ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎａから単離
された標準エステルヒドロラーゼ遺伝子と高いホモミジ
ーをボした。
よび−＆−ｓｔｕｔｇｅｒｉ （ムＴＣＯす１７５８８
）からのエステルヒドロ２−ゼ陽性クローンは、例１に
記載したようにして構築し、同定した。選択されたエス
テルヒドロラーゼクローンによって産生されるエステル
ヒドロラーゼは、ナプロキセンエステルを立体異性特異
的な方式で加水分解することが見出された。サデンデロ
ットハイプリダイゼーショ／（８ｏｕｔｈｅｒｎ ：
、ｙ、ｍｏｌ、Ｂｔｏｌ、、 ９８ ： ５０３ ｍ１
９７５）を用い、これらの２種からのエステルヒドロラ
ーゼ遺伝子は、Ｐ、 ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎａから単離
された標準エステルヒドロラーゼ遺伝子と高いホモミジ
ーをボした。
例９ エステルヒドロラーゼ遺伝子の突然変異ｐＰＩＦ
−３Ａの２．４ ｋｂ Ｈｌｎｄ ＩＩＩ ７９グ、
％７トＹＭ １３ ｍｐ １９中にクローン化した（Ｍ
ａｎｉａｔｉａら：前出参照）。エステルヒドロラーゼ
陽性ファージプラークを、例１に記載した軟寒天オーバ
ーレイ検定ン用いて同定した。高力価ファージ株を岨換
えファージのひとつから調製し、Ｍ１３−ｐＦｌｏ−２
と命名した。３ Ｘ Ｉ Ｑ２ｐｆｕのＭ１３−１）Ｆ
ＩＯ−２をヒドロキシルアミン（０，２５Ｍ ）によっ
て８時間処理して、突然変異を誘発した。ついで変異し
たファージを希釈し、軟寒天中に包埋した大腸菌ローン
上にプレートした。６７゛Ｃで一夜増殖しにのち、寒天
板をフォイルで包み、６７°、５５゜および６０℃のオ
ープン中に置いた。６時間インキュベートシタのち、プ
レートラ回収し、残存エステラーゼ活性１ｆ！：測定し
た。これは、例１に記載したように、ファストブルーと
β−ナフチル酢酸エステルを含有するアガロースでファ
ージプラークを覆って実施した。かなりの酵素活性が維
持されている７アージプラークを採取し、増殖させた。
−３Ａの２．４ ｋｂ Ｈｌｎｄ ＩＩＩ ７９グ、
％７トＹＭ １３ ｍｐ １９中にクローン化した（Ｍ
ａｎｉａｔｉａら：前出参照）。エステルヒドロラーゼ
陽性ファージプラークを、例１に記載した軟寒天オーバ
ーレイ検定ン用いて同定した。高力価ファージ株を岨換
えファージのひとつから調製し、Ｍ１３−ｐＦｌｏ−２
と命名した。３ Ｘ Ｉ Ｑ２ｐｆｕのＭ１３−１）Ｆ
ＩＯ−２をヒドロキシルアミン（０，２５Ｍ ）によっ
て８時間処理して、突然変異を誘発した。ついで変異し
たファージを希釈し、軟寒天中に包埋した大腸菌ローン
上にプレートした。６７゛Ｃで一夜増殖しにのち、寒天
板をフォイルで包み、６７°、５５゜および６０℃のオ
ープン中に置いた。６時間インキュベートシタのち、プ
レートラ回収し、残存エステラーゼ活性１ｆ！：測定し
た。これは、例１に記載したように、ファストブルーと
β−ナフチル酢酸エステルを含有するアガロースでファ
ージプラークを覆って実施した。かなりの酵素活性が維
持されている７アージプラークを採取し、増殖させた。
Ｍ１３−ＰＮ２ムおよびＭ１３−ＰＦ５ムと命名したこ
れらの中の２種についてさらに性質を調べた。Ｍ１３−
ＰＦ２Ａおよび５ムのＨｌｎｄ ■挿入体をプラスミド
ｐσＣ１８に再び導入した。ｐＰＦ −２ＡおよびｐＰ
Ｆ −５Ａと命名された子孫のクローンも、５５℃およ
び６０℃で３時間インキュベートしたのち、良好なエス
テルヒドロラーゼ活性を同様に維持していた。蛋白質抽
出物を調製し、熱抵抗性エステルヒドロラーゼの熱安定
性を例２と同様にして評価した。第８図に示すように、
ｐＰＦ −２ＡおよびｐＰＦ −５Ａの半減期は一６０
℃において、それらの野生型母系１）ＰＦ −１８−Ｉ
ＶＣ比して実質的に延長された。
れらの中の２種についてさらに性質を調べた。Ｍ１３−
ＰＦ２Ａおよび５ムのＨｌｎｄ ■挿入体をプラスミド
ｐσＣ１８に再び導入した。ｐＰＦ −２ＡおよびｐＰ
Ｆ −５Ａと命名された子孫のクローンも、５５℃およ
び６０℃で３時間インキュベートしたのち、良好なエス
テルヒドロラーゼ活性を同様に維持していた。蛋白質抽
出物を調製し、熱抵抗性エステルヒドロラーゼの熱安定
性を例２と同様にして評価した。第８図に示すように、
ｐＰＦ −２ＡおよびｐＰＦ −５Ａの半減期は一６０
℃において、それらの野生型母系１）ＰＦ −１８−Ｉ
ＶＣ比して実質的に延長された。
Ｐ、Ｓ−ナプロキセンのエチル筐にはメチルエステルを
微粉化し、水に懸濁しく５０〜２００ｙ／ｌ）、これに
クローン化エステルヒドロラーゼ５０〜２５０率位／！
！エステル１ｋａｍした。非イオン界面活性剤を０．１
〜２．０％の濃度になるように卯えて、エステルの分散
を助けることもできる。
微粉化し、水に懸濁しく５０〜２００ｙ／ｌ）、これに
クローン化エステルヒドロラーゼ５０〜２５０率位／！
！エステル１ｋａｍした。非イオン界面活性剤を０．１
〜２．０％の濃度になるように卯えて、エステルの分散
を助けることもできる。
反応混合物を６５〜４５℃の＠度に保持した。−は塩基
の添００により、６〜１０の範囲に維持した。
の添００により、６〜１０の範囲に維持した。
塩基の取り込みマタハ反応混合物のクロマトグラフィー
分析でモニタリングして、反応の完結を調べた。反応が
塩基の取り込みによって完結したとみなされたとき（４
〜４８時間）、未反応エステルを濾過して除き、ナプロ
キセンをその塩として含有する濾液を酸で処理し、濾過
した。Ｓ−ナプロキセンを集め、マススペクトル、高速
液体りａマドグラフィー（ＨＰＬ（！ ）およびこの種
の容認されている分析法を用いて、純度および立体特異
特異性を分析した。濾過したナプロキセン（工所望によ
りさらに精製することができる。
分析でモニタリングして、反応の完結を調べた。反応が
塩基の取り込みによって完結したとみなされたとき（４
〜４８時間）、未反応エステルを濾過して除き、ナプロ
キセンをその塩として含有する濾液を酸で処理し、濾過
した。Ｓ−ナプロキセンを集め、マススペクトル、高速
液体りａマドグラフィー（ＨＰＬ（！ ）およびこの種
の容認されている分析法を用いて、純度および立体特異
特異性を分析した。濾過したナプロキセン（工所望によ
りさらに精製することができる。
以上の説明および実施例は、本発明ｔ１その好ましい態
様を含めて完全に開示するためのものである。分子生物
学、蛋白質化学、生化学的操作技術および関連科学分野
の通常の熟練者に自明な改変は本発明の請求範囲に包含
されるものである。
様を含めて完全に開示するためのものである。分子生物
学、蛋白質化学、生化学的操作技術および関連科学分野
の通常の熟練者に自明な改変は本発明の請求範囲に包含
されるものである。
第１図は、非変性ｒル上で分割されたクローン化エステ
ルヒドロラーゼの活性染色である。 第２図は、ｐ、 ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ｘ Ｘ ？
ルヒ）’ ａ ニア−ぜの熱安定性を示すグラフであ
る。 第３図は、エステルヒドロラーゼの活性に対する界面活
性剤および酵素純度の影響を示すグラフである。 第４図は、ｐ、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ｘ ｘチルヒ
ドロラーゼのアミノ末端配列である。 第５図はｐＰＦ −３Ａのプラスミド地図である。 第６図は、Ｓ−ナプロキセンエステルに対する選択性を
示すエステルヒドロラーゼの加水分解のグラフである。 第７図は、ｐＰＦ −ＧＤ３Ａ ノｊａｃ Ｚ −エス
テルヒドロラーゼとの融合連結部におけるヌクレオチド
およびアミノ酸配列である。 第８図は、エステラーゼ変異体の熱安定性を示すグラフ
である。 第９図は、ｐｌＦ −３Ａ中およびｐＰＦ−ＧＤ３Ａ中
融合蛋白質としてのＰ、 ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎθエス
テルヒトａラーゼのアミノ末端配列の比較図である。 第１０図は、標準エステルヒドロラーゼの全ヌクレオチ
ドおよびアミノ酸配夕１ｊである。 第１１図は、融合エステルヒドロラーゼの全ヌクレオチ
ドおよびアミノ酸配列である。
ルヒドロラーゼの活性染色である。 第２図は、ｐ、 ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ｘ Ｘ ？
ルヒ）’ ａ ニア−ぜの熱安定性を示すグラフであ
る。 第３図は、エステルヒドロラーゼの活性に対する界面活
性剤および酵素純度の影響を示すグラフである。 第４図は、ｐ、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ｘ ｘチルヒ
ドロラーゼのアミノ末端配列である。 第５図はｐＰＦ −３Ａのプラスミド地図である。 第６図は、Ｓ−ナプロキセンエステルに対する選択性を
示すエステルヒドロラーゼの加水分解のグラフである。 第７図は、ｐＰＦ −ＧＤ３Ａ ノｊａｃ Ｚ −エス
テルヒドロラーゼとの融合連結部におけるヌクレオチド
およびアミノ酸配列である。 第８図は、エステラーゼ変異体の熱安定性を示すグラフ
である。 第９図は、ｐｌＦ −３Ａ中およびｐＰＦ−ＧＤ３Ａ中
融合蛋白質としてのＰ、 ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎθエス
テルヒトａラーゼのアミノ末端配列の比較図である。 第１０図は、標準エステルヒドロラーゼの全ヌクレオチ
ドおよびアミノ酸配夕１ｊである。 第１１図は、融合エステルヒドロラーゼの全ヌクレオチ
ドおよびアミノ酸配列である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ
から得られるエステルヒドロラーゼの遺伝子からなるＤ
ＮＡ分子であつて、そのエステルヒドロラーゼがそのＤ
ＮＡ分子の２．４ｋｂＨｉｎｄIIIフラグメント内にコ
ードされているＤＮＡ分子 （２）以下のＮ末端アミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 を有する標準エステルヒドロラーゼをコードする遺伝子
（この場合、標準エステルヒドロラーゼの発現のための
開始コドンはＧＴＧであるが、バリン（Ｖａｌ）ではな
くメチオニン（Ｍｅｔ）として翻訳される）からなる請
求項（１）記載のＤＮＡ分子 （３）大腸菌内でクローン化され、発現される請求項（
２）記載のＤＮＡ分子 （４）第１０図に示したヌクレオチド配列を有し、第１
０図のアミノ酸配列に相当する標準エステルヒドロラー
ゼをコードする請求項（２）記載のＤＮＡ分子 （５）高度の熱安定性とＳ−ナプロキセンエステルに対
する鏡像異性特異性を有する標準エステルヒドロラーゼ
をコードする請求項（１）記載のＤＮＡ分子 （６）Ｒ−，Ｓ−ナプロキセンエステルの加水分解を鏡
像異性特異的に触媒してＳ−ナプロキセンを生成させる
ことができる標準エステルヒドロラーゼをコードする請
求項（５）記載のＤＮＡ分子 （７）Ｓ−ナプロキセンを鏡像異性体過剰率９７％以上
で生成させる請求項（６）記載のＤＮＡ分子 （８）４５℃〜６０℃の温度で安定であり、酵素的に活
性な標準エステルヒドロラーゼをコードする請求項（５
）記載のＤＮＡ分子 （９）５５℃で安定であり、酵素的に活性な標準エステ
ルヒドロラーゼをコードする請求項（８）記載のＤＮＡ
分子 （１０）第１０図に示した標準エステルヒドロラーゼの
アミノ酸配列をコードする遺伝子（１１）標準エステル
ヒドロラーゼの誘導体のアミノ酸配列をコードする遺伝
子であつて、その遺伝子によつてコードされるアミノ酸
配列は第１０図に示す標準エステルヒドロラーゼのアミ
ノ酸配列と少なくとも７５％のホモロジーを有する請求
項（１０）記載の遺伝子 （１２）大腸菌へのクローニングは異種細菌プロモーの
制御下に行われる請求項（１）記載のＤＮＡ分子 （１３）大腸菌へのクローニングは、クローン化された
エステルヒドロラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列の上流に挿入
された￥ｌａｃ￥プロモーターの制御下に行われる請求
項（１２）記載のＤＮＡ分子 （１４）以下のＮ末端アミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 を有する融合エステルヒドロラーゼをコードする遺伝子
からなり、￥ｌａｃ￥プロモーターの￥ｌａｃ￥Ｚ部分
と標準エステルヒドロラーゼをコードする遺伝子の融合
によつて生じ、この場合￥ｌａｃ￥Ｚは標準エステルヒ
ドロラーゼ遺伝子の６番目のアミノ酸のフレーム中に融
合される請求項（１２）記載のＤＮＡ分子 （１５）第１１図に示したヌクレオチド配列を有し、第
１１図のアミノ酸配列に相当する融合エステルヒドロラ
ーゼをコードする請求項（１２）記載のＤＮＡ分子 （１６）高度な熱安定性とＳ−ナプロキセンエステルに
対して鏡像異性特異性を有する融合エステルヒドロラー
ゼをコードする請求項（１）記載のＤＮＡ分子 （１７）Ｒ−，Ｓ−ナプロキセンエステルの加水分解を
鏡像異性特異的に触媒してＳ−ナプロキセンを生成させ
ることができる融合エステルヒドロラーゼをコードする
請求項（１６）記載のＤＮＡ分子 （１８）Ｓ−ナプロキセンを鏡像異性体過剰率９７％以
上で生成させる請求項（１７）記載のＤＮＡ分子 （１９）４５℃〜６０℃の温度で安定であつて酵素的に
活性な融合エステルヒドロラーゼをコードする請求項（
１６）記載のＤＮＡ分子 （２０）５５℃で安定であつて酵素的に活性な融合エス
テルヒドロラーゼをコードする請求項（１９）記載のＤ
ＮＡ分子 （２１）第１１図に示す融合エステルヒドロラーゼのア
ミノ酸配列をコードする遺伝子 （２２）融合エステルヒドロラーゼの誘導体のアミノ酸
配列をコードする遺伝子であつて、その遺伝子によつて
コードされるアミノ酸配列は第１１図に示す融合エステ
ルヒドロラーゼのアミノ酸配列と少なくとも７５％のホ
モロジーを有する請求項（２１）記載の遺伝子 （２３）標準エステルヒドロラーゼの配列が発現した酵
素に熱抵抗性が付与されるように突然変異した熱抵抗性
エステルヒドロラーゼをコードする遺伝子からなる請求
項（１）記載のＤＮＡ分子 （２４）大腸菌内でクローン化され、発現される請求項
（２３）記載のＤＮＡ分子 （２５）高度な熱安定性とＳ−ナプロキセンエステルに
対する鏡像異性特異性を有する熱抵抗性エステルヒドロ
ラーゼをコードする請求項（２３）記載のＤＮＡ分子 （２６）Ｒ−，Ｓ−ナプロキセンの加水分解を鏡像異性
特異的に触媒してＳ−ナプロキセンを生成させることが
できる熱抵抗性エステルヒドロラーゼをコードする請求
項（２５）記載のＤＮＡ分子 （２７）Ｓ−ナプロキセンを鏡像異性体過剰率９７％以
上で生成させる請求項（２６）記載のＤＮＡ分子（２８
）４５℃〜６０℃の温度で安定であつて酵素的に活性な
熱抵抗性エステルヒドロラーゼをコードする請求項（２
６）記載のＤＮＡ分子 （２９）６２℃で安定であつて酵素的に活性な熱抵抗性
エステルヒドロラーゼをコードする請求項（２８）記載
のＤＮＡ分子 （３０）高度な熱安定性とＳ−ナプロキセンエステルに
対する鏡像異性特異性を有するクローン化エステルヒド
ロラーゼをコードする請求項（１）記載のＤＮＡ分子 （３１）クローン化エステルヒドロラーゼは、標準エス
テルヒドロラーゼ、融合エステルヒドロラーゼまたは熱
抵抗性エステルヒドロラーゼからなる群より選ばれる請
求項（３０）記載のＤＮＡ分子（３２）Ｒ−，Ｓ−ナプ
ロキセンエステルの加水分解を鏡像異性特異的に触媒し
てＳ−ナプロキセンを生成させることができるクローン
化エステルヒドロラーゼをコードする請求項（３０）記
載のＤＮＡ分子（３３）Ｓ−ナプロキセンを鏡像異性体
過剰率９７％以上で生成させる請求項（３２）記載のＤ
ＮＡ分子（３４）４５〜６５℃の温度で安定で活性なク
ローン化エステルヒドロラーゼをコードする請求項（３
０）記載のＤＮＡ分子 （３５）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍｅｎｄｏｃｉｎａおよび
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｔｕｔｚｅｒｉからなる群よ
り選ばれる微生物宿主から得られるエステルヒドロラー
ゼの遺伝子からなるＤＮＡ分子 （３６）４５℃〜６５℃の温度において安定で活性なク
ローン化エステルヒドロラーゼをコードする請求項（３
５）記載のＤＮＡ分子 （３７）微生物宿主Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｎｓから得られるクローン化エステルヒドロラ
ーゼからなるＤＮＡ分子であつてそのＤＮＡ分子の２．
４ｋｂＨｉｎｄIIIフラグメント内にコードされるか、
またはその熱抵抗性変異体であつて大腸菌内で機能する
調整要素の下流にコードされるＤＮＡ分子（３８）大腸
菌内へのクローニングは異種細菌プロモーターの制御下
に行われる請求項（３７）記載のＤＮＡ分子 （３９）大腸内へのクローニングは、クローン化エステ
ルヒドロラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列の上流に挿入された
￥ｌａｃ￥プロモーターの制御下に行われる請求項（３
８）記載のＤＮＡ分子 （４０）Ｒ，Ｓ−ナプロキセンアルキルエステルの加水
分解を鏡像異性特異的に触媒するためにクローン化エス
テルヒドロラーゼを使用するＳ−ナプロキセンの製造方
法において、（ｉ）挙動特性が改善されたＰｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのクローン化エ
ステルヒドロラーゼを大腸菌内で生成させ、（ｉｉ）こ
のクローン化エステルヒドロラーゼを遊離の可溶性酵素
としてまたはその固定化型としてＲ−，Ｓ−ナプロキセ
ンエステルに作用させ、（ｉｉｉ）Ｒ−，Ｓ−ナプロキ
センエステルを加水分解し、ついで（ｉｖ）Ｓ−ナプロ
キセンを採集する方法 （４１）クローン化エステルヒドロラーゼは、標準エス
テルヒドロラーゼ、融合エステルヒドロラーゼまたは熱
抵抗性エステルヒドロラーゼからなる群より選ばれる請
求項（４０）記載の方法 （４２）クローン化エステルヒドロラーゼは、加水分解
反応の速度および鏡像異性特異性を制御する請求項（４
０）記載の方法 （４３）クローン化エステルヒドロラーゼは、３０℃〜
５０℃の温度範囲で加水分解反応を触媒する請求項（４
２）記載の方法 （４４）クローン化エステルヒドロラーゼを用いるナプ
ロキセンアルキルエステルの加水分解は、鏡像異性体過
剰率９７％以上のＳ−ナプキセンを生成する請求項（４
２）記載の方法 （４５）第１０図に示すアミノ酸配列、または１種もし
くは２種以上のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失した
その関連配列を有し、Ｒ，ＳナプロキセンエステルのＳ
−ナプロキセンへの加水分解を鏡像異性体過剰率（ｅｅ
）９７％以上で実施できるエステルヒドロラーゼ （４６）第１１図に示すアミノ酸配列、または１種もし
くは２種以上のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失した
その関連配列を有し、Ｒ，ＳナプロキセンエステルのＳ
−ナプロキセンへの加水分解を鏡像異性体過剰率（ｅｅ
）９７％以上で実施できるエステルヒドロラーゼ （４７）エステルヒドロラーゼは３０℃〜６５℃の温度
範囲で加水分解反応を触媒する請求項（４５）または（
４６）のいずれかに記載のエステルヒドロラーゼ（４８
）Ｒ，Ｓナプロキセンエステルを請求項（４５）または
（４６）のいずれかに記載のエステルヒドロラーゼの作
用に付してＳ−ナプロキセンを得る、Ｓ−ナプロキセン
またはその医薬的に許容される塩の製造方法 （４９）Ｒ，Ｓ−ナプロキセンアルキルエステルからＳ
−ナプロキセンを製造するにあたり、Ｒ，Ｓ−ナプロキ
センアルキルエステルを請求項（４５）または（４６）
のいずれかに記載のエステルヒドロラーゼと鏡像異性体
過剰率９７％以上のＳ−ナプロキセンが形成するのに十
分な時間反応させ、ついで生成したナプロキセンを採集
する方法
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US39810289A | 1989-08-24 | 1989-08-24 | |
| US398102 | 1989-08-24 | ||
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| US562491 | 1990-08-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03210183A true JPH03210183A (ja) | 1991-09-13 |
Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2224169A Pending JPH03210183A (ja) | 1989-08-24 | 1990-08-24 | エステルヒドロラーゼ遺伝子の大腸菌内でのクローニング、発現、および配列決定 |
Country Status (6)
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|---|---|
| EP (1) | EP0414247A3 (ja) |
| JP (1) | JPH03210183A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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-
1990
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- 1990-08-23 KR KR1019900013220A patent/KR910004804A/ko not_active Application Discontinuation
- 1990-08-23 EP EP19900116180 patent/EP0414247A3/en not_active Withdrawn
- 1990-08-24 JP JP2224169A patent/JPH03210183A/ja active Pending
Also Published As
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| EP0414247A2 (en) | 1991-02-27 |
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| HU905291D0 (en) | 1991-02-28 |
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| HUT62037A (en) | 1993-03-29 |
| IL95468A0 (en) | 1991-06-30 |
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