KR910004804A - 대장균내의 에스테르 가수 분해 효소 유전자의 클로닝, 발현 및 서열화 - Google Patents

대장균내의 에스테르 가수 분해 효소 유전자의 클로닝, 발현 및 서열화 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

대장균내의 에스테르 가수 분해 효소 유전자의 클로닝, 발현 및 서열화
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제1도는 비변성 겔 상에 용해된 클론된 에스테르 가수 분해 효소의 활성 염색을 나타내고,
제2도는 슈도모나스 플루오레스센스(Pesudomonas fluorescens) 에스테르 가수분해 효소의 열 안정성을 나타내고,
제3도는 에스테르 가수 분해 효소 활성에 대한 세정제 및 순도의 효과를 나타낸다.

Claims (49)

  1. 슈도모나스 플루오레스센스(Pseudomonas fluorescens)로 부터 생성되고, DNA 분자의 2.4kb Hind Ⅲ 단편 내에서 암호화되는 에스테르 가수 분해 효소에 대한 유전자로 이루어진 DNA분자.
  2. 제1항에 있어서, 진정한 에스테르 가수 분해 효소의 발현에 대한 개시코돈이 GTG이지만, 발린(Val)이기 보다는 메티오닌(Met)으로서 번역되는,1Met-Gln-val-Gln-Gly-6Tyr-Phe-Asp-Leu-Arg-과 같은 N 말란 아미노산 서열을 갖는 진정한 에스테르 가수 분해 효소를 암호화하는 유전자로 이루어진 DNA분자.
  3. 제2항에 있어서, 대장균 내에서 클론되고 반현되는 DNA분자.
  4. 제2항에 있어서, 제10도에 나타낸 것과 같이 뉴클레오티드 서열 및 대응하는 아미노산 서열을 갖는 진정한 에스테르 가수 분해 효소를 암호화하는 DNA분자.
  5. 제1항에 있어서, 높은 열 안정성 및 S-나프록센 에스테르에 대한 거울상 특이성을 갖는 진정한 에스테르 가수 분해 효소를 암호화하는 DNA분자.
  6. 제5항에 있어서, R-, S-나프록센 에스테르를 가수 분해하여 S-나프룩센을 제조하는 R-, S-나트록센 에스테르 가수 분해 반응을 거울상 특이적으로 촉매할 수 있는 진정한 에스테르 가수 분해 효소를 암호화하는 DNA분자.
  7. 제6항에 있어서, S-나트록센을 97%이상의 에난티오머성 과량으로 형성시키는 DNA분자.
  8. 제5항에 있어서, 45℃-60℃의 온도에서 안정하고, 효소적으로 활성인 진정한 에스테르 가수 분해 효소를 암호화하는 DNA분자.
  9. 제8항에 있어서, 55℃의 온도에서 안정하고, 효소적으로 활성인 진정한 에스테르 가수 분해 효소를 암호화하는 DNA분자.
  10. 제10도에 나타낸 진정한 에스테르 가수 분해 효소에 대한 아미노산 서열을 암호화하는 유전자.
  11. 제10항에 있어서, 유전자에 의하여 암호화된 아미노산 서열이 제10도에 나타낸 진정한 에스테르 가수 분해 효소의 아미노산 서열과 75%이상의 유사성을 갖는 진정한 에스테르 가수 분해 효소의 유도체에 대한 아미노산 서열을 암호화하는 유전자.
  12. 제1항에 있어서, 상기 대장균 내에서의 클로닝을 이형 박테리아 촉진 유전자의 조절 하에 수행하는 것이 특징인 DNA분자.
  13. 제12항에 있어서, 상기 대장균 내에서의 클로닝을 클론된 에스테르 가수 분해 효소 유전자의 DNA서열로부터 상향으로 삽입된 lac 촉진 유전자의 조절하에서 수행하는 것이 특징인 DNA분자.
  14. 제12항에 있어서, 진정한 에스테르 가수 분해 효소 유전자의 제6위의 아미노산에 틀내에서 융합되는 lac촉진 유전자의 lac Z 부위를 진정한 에스테르 가수 분해 효소를 암호화하는 유전자와 융합시켜서 생성되는 Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Ser-Ser-Val-Pro-Tyr-Phe-Asp-Leu-Ary와 같은 N 말단 아미노산 서열을 갖는 융합된 에스테르 가수 분해 효소를 암호화하는 유전자로 이루어진 DNA분자.
  15. 제12항에 있어서, 제11도에 나타낸 뉴클레오티드 서열 및 대응하는 아미노산 서열을 갖는 융합된 에스테르 가수 분해 효소를 암호화하는 DNA분자.
  16. 제1항에 있어서, 높은 열 안정성 및 S-나프록센 에스테르에 대한 거울상 특이성을 갖는 융합된 에스테르 가수 분해 효소를 암호화하는 DNA분자.
  17. 제16항에 있어서, R-, S-나프록센 에스테르의 가수 분해하여 S-나프록센을 제조하는 R-, S-나프록센의 가수분해 반응을 거울상 특이적으로 촉매할 수 있는 융합된 에스테르 가수 분해 효소를 암호화하는 DNA분자.
  18. 제17항에 있어서, S-나프록센을 97% 이상의 에난티오머성 과량으로 형성시키는 DNA분자.
  19. 제16항에 있어서, 45℃-60℃의 온도에서 안정하고, 효소적으로 활성인 융합된 에스테르 가수 분해 효소를 암호화하는 DNA분자.
  20. 제19항에 있어서, 55℃의 온도에서 안정하고, 효소적으로 활성인 융합된 에스테르 가수 분해 효소를 암호화하는 DNA분자.
  21. 제11도에 나타낸 융합된 에스테르 가수 분해 효소에 대한 아미노산 서열을 암호화하는 유전자.
  22. 제21항에 있어서, 유전자에 의하여 암호화된 아미노산 서열이 제11도에 나타낸 융합된 에스테르 가수 분해 효소의 아미노산 서열과 75% 이상의 유사성을 갖는 융합된 에스테르 가수 분해 효소의 유도체에 대한 아미노산 서열을 암호화하는 유전자.
  23. 제1항에 있어서, 진정한 에스테르 가수 분해 효소에 대한 서열이 돌연변이되어 발현된 효소에 온도 내성을 부여하는 온도 내성 에스테르 가수 분해 효소를 암호화하는 유전자로 이루어진 DNA분자.
  24. 제23항에 있어서, 대장균 내에서 클론되고 발현되는 DNA분자.
  25. 제23항에 있어서, 높은 열 안정성 및 S-나프록센 에스테르에 대한 거울상 특이성을 갖는 온도 내성 에스테르 가수 분해 효소를 암호화하는 DNA분자.
  26. 제25항에 있어서, R-, S-나트록센 에스테르의 가수 분해하여 S-나프록센을 제조하는 R-, S-나프록센 에스테르의 가수 분해 반응을 거울상 특이적으로 촉매할 수 있는 온도 내성 에스테르 가수 분해 효소를 암호화하는 DNA분자.
  27. 제26항에 있어서, S-나프록센을 97%이상의 에난티오머성 과량으로 형성시키는 DNA분자.
  28. 제26항에 있어서, 45℃-65℃의 온도에서 안정하고, 효소적으로 활성인 진정한 에스테르 가수 분해 효소를 암호화하는 DNA분자.
  29. 제28항에 있어서, 62℃의 온도에서 안정하고, 효소적으로 활성인 진정한 에스테르 가수 분해 효소를 암호화하는 DNA분자.
  30. 제1항에 있어서, 높은 열 안정성 및 S-나프록센 에스테르에 대한 거울상 특이성을 갖는 클론된 에스테르 가수 분해 효소를 암호화하는 DNA분자.
  31. 제30항에 있어서, 상기 클론된 에스테르 가수 분해 효소가 진정한 에스테르 가수 분해 효소, 융합된 에스테르 가수 분해 효소 또는 온도 내성 에스테르 가수 분해 효소로 되어 있는 군으로부터 선택된 것인 DNA분자.
  32. 제30항에 있어서, R-, S-나프록신 에스테르의 가수 분해하여 S-나프록센을 제조하는 R-, S-나프록센 에스테르의 가수 분해 반응을 거울상 특이적으로 촉매할 수 있는 콜론된 에스테르 가수 분해 효소를 암호화하는 DNA분자.
  33. 제32항에 있어서, S-나프록센을 97%이상의 에난티오머성 과량으로 형성시키는 DNA분자.
  34. 제30항에 있어서, 45℃-65℃의 온도에서 안정하고, 효소적으로 활성인 융합된 에스테르 가수 분해 효소를 암호화하는 DNA분자.
  35. 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 멘도시나(Pseudomonas mendocina) 및 슈도모나스 스튜체리(Pseudomonas Stutzeri)로 되어 있는 군으로부터 선택된 미생물 숙주로부터 얻어지는 에스테르 가수 분해 효소에 대한 유전자로 이루어진 DNA분자.
  36. 제35항에 있어서, 45℃-65℃의 온도 범위에서 안정하고, 활성인 클론된 에스테르 가수분해 효소를 암호화하는 DNA분자.
  37. 미생물 숙주인 슈도모나스 플루오레센스로부터 얻어지고, DNA분자의 2.4Kb Hind Ⅲ 단편 또는 그의 온도 내성 변형체 내에서 대장균 내에서 기능성이 있는 조절 성분들에 하향으로 암호화되는 클론된 에스테르 가수분해 효소에 대한 유전자로 이루어진 DNA분자.
  38. 제37항에 있어서, 상기 대장균 내에서의 클로닝이 이형 박테리아 촉진 유전자의 조절하에 수행되는 것이 특징인 DNA분자.
  39. 제38항에 있어서, 상기 대장균 내에서의 클로닝이 클론된 에스테르 가수 분해 효소 유전자의 DNA 서열로 부터 상향으로 삽입된 lac 촉진 유전자의 조절하에 수행되는 것이 특징인 DNA분자.
  40. (1)개선된 성능 특성을 갖는 슈도모나스 플루오레센스로부터 클론된 에스테르 가수 분해 효소를 대장균내에서 제조하고, (2)클론된 에스테르 가수 분해 효소를 유리된 용해성 효소 또는 그의 고착성 형태로서 R-, S-나프록센 에스테르에 제공하고, (3)R-, S-나프록센 에스테르를 가수 분해하고, (4)S-나프록센을 모아 클론된 에스테르 가수분해 효소를 R-, S-나프록센 알킬 에스테르의 가수분해를 거울상 특징적으로 촉매하는데 사용하는 것이 특징인 S-나프록센의 제조 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 클론된 에스테르 가수 분해 효소가 진정한 에스테르 가수 분해 효소, 융합된 에스테르 가수 분해 효소 또는 온도 내성 에스테르 가수 분해 효소로 되어 있는 군으로부터 선택되는 것이 특징인 방법.
  42. 제40항에 있어서, 상기 클론된 에스테르 가수 분해 효소가 가수분해 반응의 속도 및 거울상 특이성을 조절하는 것이 특징인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 클론된 에스테르 가수분해 효소가 30℃-65℃의 온도 범위에서 가수분해를 촉진시키는 것이 특징인 방법.
  44. 제42항에 있어서, 클론된 에스테르 가수 분해 효소를 사용하는 나프록센 알킬에스테르의 가수 분해가 S-나프록센을 97%이상의 에난티오머성 과량으로 생산하는 것이 특징인 방법.
  45. 제10도에 나타낸 아미노산 서열 또는 이와 관련된 하나 또는 그 이상의 아미노산들을 치환, 부가 또는 탈리시킴으로써 얻어지는 서열을 갖고, R-, S-나프록센 에스테르를 가수분해하여 97%이상의 에난티오머성 과량(ee)으로 S-나프록센을 얻을 수 있는 에스테르 가수 분해 효소.
  46. 제10도에 나타낸 것과 같은 아미노산 서열 또는 이와 관련된 하나 또는 그 이상의 아미노산들을 치환, 부가 또는 탈리시킴으로써 얻어지는 서열을 갖고, R,S 나프록센 에스테르를 가수분해하여 97%이상의 에난티오머성과량(ee)으로 S-나프록센을 얻을 수 있는 에스테르 가수 분해 효소.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 에스테르 가수 분해 효소가 30℃-65℃범위의 온도에서 가수분해 반응을 촉매화하는 것이 특징인 에스테르 가수분해 효소.
  48. R-, S-나프록센 에스테르를 제45항 또는 제46항의 에스테르 가수 분해 효소의 작용하에 둠으로써 S-나프록센을 얻는 것이 특징인 S-나프록센 또는 그의 제약상 허용되는 염의 제조 방법.
  49. R-, S-나프록센 알킬 에스테르를 97%이상의 에난티오머성 과량으로 S-나프록센을 형성하기에 충분한 시간 동안 제45항 또는 제46항의 에스테르 가수 분해 효소와 반응시키고 생성된 나프록신을 수득하는 것이 특징인 R-, S-나프탈렌 알킬 에스테르로부터 S-나프록센을 제조하는 방법.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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