KR20060109105A - 옥플록사신 에스테르에 대한 광학선택적 리파제, 이를암호화하는 뉴클레오타이드 및 이를 이용하여레보플록사신을 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 옥플록사신 에스테르에 대한 광학선택적 리파제, 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 및 이를 이용하여 레보플록사신을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 광학선택적 리파제를 사용하여 옥플록사신으로부터 레보플록사신만을 생산하는 새로운 생촉매 (biocatalyst)로써 유용하게 사용되어질 것이고, 또한 상기 광학선택적 리파제를 재조합 기술을 이용하여 대량생산함으로써 의약품 산업에 크게 기여 할 것이다.

레보플록사신, 리파제, 광학 선택성, 촉매

Description

옥플록사신 에스테르에 대한 광학선택적 리파제, 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 및 이를 이용하여 레보플록사신을 제조하는 방법{OFLOXACIN ESTER-ENANTIOSELECTIVE LIPASE, NUCLEOTIDE ENCODING THE LIPASE, AND METHOD OF PRODUCING THE LEVOFLOXACIN}

도 1는 리파제가 트리아실글리세롤을 글리세롤과 지방산으로 가수분해하는 반응식을 나타내며,

도 2는 본 발명에 따른 오플록사신 에스테르-광학 선택성 리파제를 스크리닝하는 과정을 보여주는 모식도이고,

도 3는 본 발명에 따른 오플록사신 에스테르-광학 선택성 리파제 유전자의 클로닝과 서열분석 과정을 보여주는 모식도이고,

도 4는 리파제 생산 균주에 대한 PNPO 분석(2차 선별과정)결과를 나타내는 흡광도 그래프이고,

도 5는 본 발명에 따른 오플록사신 에스테르-광학 선택성 리파제 스크리닝을 위한 HPLC 결과를 나타내고,

도 6은 본 발명에 따른 Yarrowia lipolytica CL 180 세포의 SEM(Scanning electron microphotographs) 사진이고,

도 7은 본 발명에 따른 Yarrowia lipolytica CL 180 세포의 TEM( Transmission electron microphotographs) 사진이고,

도 8은 본 발명에 따른 Yarrowia lipolytica CL 180에서 추출된 게놈 DNA를 보여주는 전기영동 사진이고,

도 9는 본 발명의 일례에 따른 Yarrowia lipolytica CL 180 게놈 DNA 라이브러리의 제조를 나타내는 모식도이고,

도 10은 TBN 플레이트상에 리파제 생산균주를 배양하여 리파제 활성을 보여주는 사진이고,

도 11은 본 발명에 따른 오플록사신 프로필 에스테르-enantioselective lipase의 HPLC 분석결과를 나타내고,

도 12는 제한효소 처리에의한 플라스미드 DNA (pJTL180)의 분석결과를 나타내는 전기영동 사진이고,

도 13은 본 발명에 따른 Yarrowia lipolytica CL 180 리파제인 3.5kb DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열 및 유추 아미노산 서열을 나타내고,

도 14는 본 발명에 따른 Yarrowia lipolytica CL 180 lipase (YAR180Lip)와 Candida rugosa (CrugLip1, rugLip2), Geotrichum candidum (GcanLip1, GcanLip2), Geotrichum fermentans (GferLip1), 및 Yarrowia lipolytica (YARLip1, YARLip3)의 리파제 서열의 다중 서열 분석결과를 나타내고,

도 15는 본 발명에 따른 Yarrowia lipolytica CL 180 lipase의 발현정도와 시기를 나타내는 SDS-PAGE 분석결과이다.

본 발명은 오플록사신 알킬 에스테르 라세미체에 대한 광학선택적 리파제, 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 및 이를 이용하여 레보플록사신을 제조하는 방법에 관한 것이다.

리파제(glycerol ester hydrolase EC 3.1.1.3)은 자유 지방산과 글리세롤로부터 에스테르 결합을 합성하고 또는 이를 가수분해하며, 이들 반응식은 도 1에 나타내고 있다. 리파제는 리피드와 물의 계면에서 작용하는 serine hydrolase이다. 활성부위에 보존된 5개 아미노산으로 구성된 펩타이드(Gly-X-Ser-X-Gly)에 상기 세린이 존재하면, 상기 세린에 친핵성 공격을 하여 효과적으로 다양한 에스테르 결합을 가수분해한다.

리파제는 다양한 미생물, 예컨대 박테리아, 곰팡이, 및 효모 등이 생산하며, 리파제를 암호화하는 많은 유전자가 클로닝되었다. 박테리아의 리파제는 8개의 군으로 구분되며 특히 Pseudomonas속 균주의 리파제에 대해 광범위한 연구가 진행되어 왔다. 효모의 리파제는 Candida rugosa, Trichosporon fermentans 등이 있으며 기타 곰팡이 리파제로는 Geotrichum candidum, Rhizopus delemar, Thermomyces lanuginose 및 Rhizopus miehei등이 보고되고 있다. 상업적으로 이용가능한 미생물 리파제의 예를 아래 표 1에 나타내고 있다.

Origin	Organism producing lipase	Application
Yeast (Fungal)	Candida rugosa a	Organic synthesis
	Candida antarctica A/B	Organic synthesis
	Thermomyces lanuginosus b	Detergent
	Rhizomucor miehei	Food processing
Bacterial	Pseudomonas menodocina	Detergent
	Pseudomonas alcaligenes	Detergent
	Pseudomonas glumae	Detergent
	Bacillus pumilus	Detergent
	Burkholderia cepacia c	Organic synthesis
	Pseudomonas fluorescens	Organic synthesis, biotransformations, chemicals
	Pseudomonas sp.	Organic synthesis
	Chromobacterium viscosum d	Organic synthesis, biotransformations, chemicals
	Alcaligenes sp.	Organic synthesis, technical grade
	Achromobacter sp.	Technical grade

리파제는 가장 중요한 산업적 촉매로서 예를 들면, 식품, 화장품, 향수, 가죽, 종이, 제약산업, 및 세제 등의 분야에서 널리 사용되어 왔다. 상업적으로 유용한 리파제는 곰팡이와 박테리아에서 유래된 것이다. 특히 리파제는 유기 용매중에서도 여전히 활성을 유지하며, 통상 정확한 화학선택성(chemoselectivity), 위치선택성(regioselectivity), 광학선택성(enantioselectivity)을 가지져서, cofactor가 필요하지 않으며 부반응도 일으키지 않는다. 이러한 리파제의 특성으로 인해 다양한 생물공학적 분야 매우 중요한 촉매일 뿐만 아니라 유기 화학에서도 생촉매로서 유용한다. 또한 리파제는 광학적으로 순수한 화합물을 얻기 위해서 라세메이트 혼합물의 분리에도 사용된다.

Quinolone계 항생제인 ofloxacin(9-fluoro-2,3-dihydro-3-methyl-10-[4-methyl-1- piperazinyl]-7-oxo-7H-pyrido[1,2,3-de]-1,4-benzoxazine-6-에스테르ic acid)은 (S)-ofloxacin (levofloxacin)과(R)-ofloxacin이 1:1로 혼합되어 있는 광학이성질체로서, 기존에 항생제 내성을 가지는 전염성 미생물에 대해 높은 항생효과를 보이는 것으로 알려져 있으며, 특히 levofloxacin이 rac-ofloxacin과 (R)- ofloxacin에 비해 항생효과가 탁월한 것으로 보고되었다. 렉보플록사신은 동물 및 박테리아로부터 유래되는 광학선택성 에스터라제를 이용하여 오플록사신 에스테르로부터 제조된다. 그 예로서는 돼지 간의 리파제는 라세믹 오플록사신 부틸 에스테르로부터 (S)-오플록사신 에스테르를 광학선택적으로 가수분해한다(Lee 등 Kor. J. Biotechnol. Bioeng. 15:313-317, 2000). 또한 Bacillus niacini EM001 에스터라제는 라세믹 오플록사신 프롤필 에스테르로부터 (R)-오플록사신을 광학 선택적으로 가수분해한다(Kim 등, J. Mol. Catal. B: Enzym. 27:237-241, 2004).

본 발명은 옥플록사신으로부터 레보플록사신만을 생산하는 새로운 생촉매 (biocatalyst)로써 유용하게 사용되고, 의약품 산업에 유용한 옥플록사신 에스테르에 대한 광학선택적 리파제, 이를 암호화하는 뉴클레오타이드, 이를 이용하여 레보플록사신을 제조하는 방법, 및 상기 리파제를 생산하는 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 (R),(S)-오플록사신 알킬 에스테르 혼합물로부터 (S)에난티오머의 에스테르 결합만을 선택적으로 분해하는 리파제에 관한 것이다.

본 발명은 (R),(S)-오플록사신 알킬 에스테르 혼합물로부터 (S)에난티오머의 에스테르 결합만을 선택적으로 분해하는 리파제를 암화화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.

본 발명은 (R),(S)-오플록사신 알킬 에스테르 혼합물로부터 (S)에난티오머만을 선택적으로 분해하는 리파제를 생산하는 균주에 관한 것이다.

본 발명은 (R),(S)-오플록사신 알킬 에스테르 혼합물로부터 (S)에난티오머만을 선택적으로 분해하는 리파제를 이용하여 레보플록사신을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 광학선택적 리파제는 Bacillus niacini EM001에 의 경우 (R)-오플록사신을 광학 선택적으로 가수분해하는 것인데 비해, (S)-오플록사신을 분해하는 특성을 가져 매우 유용하다. 또한 돼지 간의 리파제를 이용하는 기술은 sigma사에서 판매되는 기존의 효소를 이용한 것과는 전혀 다른 신규한 효모로부터 생산되는 신규 리파제로서, 효모를 이용한 다양한 생물공정 개발이 가능하고, 재조합 단백질과 형질전환 균주를 이용한 다양하고, 효율적인 생물공정 개발이 가능할 것이다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명에 따른 (R),(S)-오플록사신 알킬 에스테르 혼합물로부터 (S)에난티오머만을 선택적으로 분해하는 리파제는 SEQ ID NO:2 에 나타난 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드이고, 더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 리파제는 SEQ ID NO:1에 기재된 핵산서열에 의해 암호화되는 폴리펩타이드이다.

본 발명에 따른 리파제는 광학선택적으로 (S),(R)-오플록사신 프로필 에스 테르중에서 (S)-오플록사신 프로필 에스테르만을 특이적으로 분해하여, (S)-오플록사신 (레보플록사신)을 60% 의 ee_p (the enantiomeric excess of the product)로 생성하는 특이적 활성을 보이는 것으로서, 레보플록사신 생산에 산업적으로 유용한 특성을 함유하고 있다. 상기 (R),(S)-오플록사신 알킬 에스테르중 알킬은 프로필, 또는 부틸 등을 포함한다.

본 발명에 따른 리파제는 기존의 알려진 리파제와 서열을 비교하면, Yarrowia lipolytica 의 lipase Lip1 (32.73% identity), Yarrowia lipolytica 의 lipase Lip3(30.24% identity)를 포함하여 Candida rugosa의 lipase Lip1 (19.24% identity), Candida rugosa 의 lipase Lip2 (18.81% identity), Geotrichum candidum 의 lipase Lip1 (18.13% identity), Geotrichum candidum 의 lipase Lip2(17.25% identity), Geotrichum fermentans 의 lipase Lip1 (17.25% identity)와 30%이하의 상동성을 보여 신종 리파제임을 알 수 있다(도 14)

본 발명에 따른 리파제는 약 52KDa의 분자량을 가지며 작용 pH는 6.0-8.0이고는 작용온도는 약 30도 이다.

본 발명은 또한 상기 리파제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것으로서, SEQ ID NO:2에 나타낸 아미노산 서열을 암호화하는 핵산서열로 이루어지며, (R),(S)-오플록사신 알킬 에스테르 혼합물로부터 (S)-에난티오머의 에스테르 결합만을 광학선택적으로 분해하는 리파제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이고, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO:1에 나타낸 핵산서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이 드이다.

본 발명은 상기 리파제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 도입된 벡터에 관한 것이다. 본 발명에 적용가능한 벡터로는 각 숙주용으로 개발된 다양한 백터 및 프로모터등을 사용할 수 있다. 원색세포, 예컨대 대장균을 형질전환용 숙주로 하는 경우에는 lac, T7, ara, trc등 어떤 종류의 대장균 promoter를 이용한 발현 벡터를 이용하여 재조합 단백질 생산이 가능하다.

본 발명은 또한 상기 리파제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 도입된 벡터로 형질전환체에 관한 것이며, 상기 형질전화체는 원색세포, 진핵세포 또는 곤충일 수 있다. 상기 숙주의 예로는 대장균, 효모, bacillus, 방선균, 유산균, 및 곤충등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 형질전방법은 외래 유전자를 포함하는 벡터를 원핵세포를 형질전환하는 통상의 방법을 모두 사용가능한다.

본 발명은 또한 (R),(S)-오플록사신 알킬 에스테르 혼합물로부터 (S)-에난티오머의 에스테르 결합만을 광학선택적으로 분해하는 리파제를 생산하는 Yarrowia lipolytica 균주(KCTC 0533BP)에 관한 것이다. 본 발명의 균주는 Yarrowia lipolytica CL 180 으로 명명하였다. Yarrowia lipolytica CL 180균주를 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 주소를 둔 유전자은행에 기탁하였으며, 기탁번호는 KCTC 0533BP를 부여받았다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 리파제 pH 6.0-8.0에서 (R),(S)-오플록사신 알킬 에스테르 혼합물에 반응시켜 레보플록사신을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 리파제는 Yarrowia lipolytica 세포 배양물, 또는 리파제를 암호화하는 폴리 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포 배양물로부터 분리한 리파제 일 수 있다. 본 발명의 일례에서 상기 리파제를 생산하는 재조합 E.coli에서 리파제는 내포체 형태로 발현되며, 통상의 내포체 형태로 발현되는 수불용성 단백질의 분리 및 정제방법으로 리파제를 얻을 수 있다. 예컨데, 상기 형질전환 세포를 파쇄한 후 얻어진 수불용성 단백질을 우레아를 이용하여 refolding하고, 얻어진 상등액을 talon resin으로 붙이고, 300mM 이미다졸로 용출하여 재조합 단백질을 얻을 수 있다. 또한, 재조합 리파제 단백질을 분리를 용이하게 하기 위하여 다양한 affinity tag과 단백질 수용성에 도움을 주는 tag을 이용할 수 있다. 예컨대, His-taq, GST-tag, Flag-tag, MBP-tag, T7-tag, Trx, CBP-tag등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 통상의 재조합 단백질 제조방법, 이의 생산방법, 및 발현방법을 사용하여 본 발명에 따른 재조합 리파제 단백질을 생산 및 분리할 수 있다.

본 발명이 일예에서, 본 발명에 따른 리파제 생성 균주 탐색은 3단계로 진행되었는데, 1차로 국내ㆍ외 다양한 시료로부터 리파아제 선택 배지 (Tributyrin)를 이용하여 리파아제 생산 균주를 순수분리하고, 2차로 이 균주가 가지는 리파아제가 오플록사신 에스테르를 가수분해하는지 여부를 p-nitrophenyl 오플록사신 (PNPO)을 이용하여 확인하였고, 마지막으로 오플록사신 프로필 에스테르를 기질로 광학선택성 (enantioselectivity)을 지닌 리파아제를 액체크로마토그래피에 의해 확인하였다. 이러한 탐색 과정을 통하여, 우리는 최종적으로 효모인 Yarrowia lipolytica CL 180 균주를 선택하였고, 이 리파아제의 특성을 파악하기 위하여 유전자 클로닝을 수행하였다. 유전자 클로닝은 Yarrowia lipolytica CL 180 균주로부 터 genomic DNA를 추출하고 pUC118 벡터를 이용하여 게놈 라이브러리를 구축한 후, 대장균 시스템을 이용하여 광학선택성 (enantioselectivity)을 지닌 리파아제 유전자를 확인하는 방법으로 진행하였다. 결과적으로, 우리는 총 12,000개의 형질전환체에서 한 개의 콜로니가 광학선택성 (enantioselectivity)을 가지고 있는 양성 플론임을 확인하였다. DNA 분석을 통하여 이 클론은 3.5 kb의 삽입 DNA를 가지는 것이 확인되었고, 염기서열 분석 결과로부터 예상되는 리파아제 유전자는 1,431개의 open reading frame (ORF)을 갖는 염기로 구성되어 있으며 476개의 아미노산을 암호화하고 있다는 것을 확인하였다. 실제로 그 예측되는 아미노산 서열은 리파아제의 conserved motifs를 가지고 있었고, carboxylesterase/lipase type B1 family의 리파아제라는 것을 확인하였다. 또한, 이 리파아제가 Yarrowia lipolytica CLIB99의 hypothetical protein과 매우 유사하다는 것인데, 이것은 이 리파아제가 아직 동정되지 않은 새로운 단백질이라는 것을 의미한다. 따라서, 이 광학선택적 리파아제가 최적화를 통해 대량으로 생산 되어진다면, 오플록사신으로부터 레보플록사신만을 생산하는 새로운 생촉매 (biocatalyst)로써 유용하게 사용되어질 것이고, 의약품 산업에 크게 기여 할 것이다.

하기 예시적인 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.

실시예 1: 오플록사신 에스테르에 대하여 광학 선택적인 리파아제 활성의 탐색

1-1 . 리파아제 생산 균주의 탐색

다양한 국내외 해양으로부터 채취된 시료를 멸균 해수에 넣어 현탁한 후, 기본배지 (3% Sea Salts)에 1% tributyrin (C4) 에멀젼이 첨가된 TBN agar plate에 도말하였다. TBN 아가 플레이트는 1% TBN을 0.1% Bacto yeast extract, 0.5% Bacto tryptone, 0.001% FePO₄ㆍ4H₂O, 3% sea salt가 혼합된 배지 1 L와 혼합하여 초음파 분쇄기를 이용해서 emulsion 한 후, 1.5% Bacto agar를 첨가하여 만들었다. 도말한 플레이트는 25℃ 에서 24시간 동안 배양하였고, tributyrin (C4)를 분해하여 투명환을 형성하는 균주를 1차 선택하였다. 마지막으로 16S rDNA분석을 통하여 리파아제 생산 균주를 최종 확인하였고, 이 균주들은 p-Nitrophenyl 오플록사신 가수분해를 위한 2차 탐색에 사용되었으며 이들 151개 균주를 다음 표 2에 나타냈다(표 2).

1-2. p -Nitrophenyl 오플록사신 (PNPO) 가수분해 활성 조사

오플록사신 에스테르를 가수분해 하는 리파아제 활성은 합성 기질인 p-Nitrophenyl 오플록사신 (PNPO)을 사용함으로써 조사되었다. 리파아제 활성은 PNPO로부터 분해되는 p-nitrophenol 의 양으로 측정 되었다. 상기 1차로 선택된 151rdml 리파아제 생산 균주를 modified ZoBell liquid medium에서 30ㅀC에서 24시간 배양하여 세포를 얻은 후, 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0)로 두 번 washing하였다. 리파아제 활성을 측정하기 위하여 cell (1 g)은 반응액 (0.01 ml of 10 mM PNPO in acetonitrile, 0.04 ml of ethanol, and 0.95 ml of 50 mM Tris-HCl buffer [pH 8.0])과 혼합하여 10분 동안 반응시키면서 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 상기 PNPO의 분해능을 확인한 결과, 3종의 균주(strain BS5, 180, GMD499)를 선택하였다(도 4). 도 4는 리파제 생성 미생물을 이용한 PNPO 분석결과를 나타내는 것으로서 3종의 균주(strain BS5, 180, GMD499)가 우수한 리파제 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

1-3. 오플록사신 에스테르에 대하여 광학선택적인 균주의 탐색

2차 탐색을 통하여 선별된 세가지 균주를 modified ZoBell liquid medium에서 30ㅀC 에서 24시간 동안 배양한 후, 전체 cell (10 g)을 얻었다. 효소 반응을 위해서 0.1M 인산완충용액을 제조하였으며 기질로는 (R),(S)-ofloxacin 프로필 에스테르를 사용하였다. 인산완충용액 10 ml에 10 mM의 ofloxacin 프로필 에스테르를 첨가한 뒤 20분간 초음파 분쇄하여 유화시켜 반응에 사용하였으며 전체 cell (10 g)을 넣어 효소 반응을 개시하였다. 효소 반응은 30ㅀC 에서 48시간 동안 수행한 후, 100ㅀC 끓는 물에 10분간 정치하여 효소의 반응을 정지시키고 동량의 methanol을 첨가한 뒤 vortexing하였으며 원심 분리하여 그 상등액을 회수하여 레보플록사신분석에 사용하였다. 분석은 Hewlett Packard-Model 1050 HPLC system을 사용하여 330 nm에서 측정하였으며 고정상으로 Shiseido사의 CAPCELL PAK C₁₈ (250 mm x 4.6 mm) column을 사용하였다. 그리고 이동상은 증류수와 methanol을 85:15로 혼합하여 9 mM의 L-isoleucine과 3 mM의 copper(II) sulfate pentahydrate를 첨가한 뒤 1.0 ml/min의 유속으로 분석하였다. 도 3에 ofloxacin 에스테르-enantioselective lipase 유전자의 cloning을 위한 도식도를 나타내고 있다.

선택된 3개의 균주를 이용하여 (R),(S)-오플록사신 프로필 에스테르중 (S)-오플록사신 프로필 에스테르 만을 선택적으로 분해하는 enantioselectivity 능력을 test하기 위해 modified Zobell liquid로 배양하고 얻어진 균 체를 이용하여 HPLC 분석을 통해 enantioselectivity를 측정하였다. 최종적으로 균주 180은 (S)-오플록사신 프로필 에스테르를 선택적으로 분해하여 결과적으로 .60%의 ee_p(the enantiomeric excess of the product)로 (S)-오플록사신 (levoflaxacin)을 생성하는 것을 확인하였다 (도 5). 도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 3종 균주를 대상으로 HPLC분석을 통해 오플록사신 프로필 에스테르를 광학선택적으로 분해할 수 있는 지를 보여주는 도면으로서, 180균주에서 entantioselectivity가 확인되었다. 도 5에서 피크 1은 (S)-오플록사신(레보플록사신)을 나타내고, 피크 2는 (R)-오플록사신을 나타낸다.

실시예 2: 180균주의 동정

최종 선택된 오플록사신 에스테르- enantioselective 리파제 생성 균주를 동정하기 위해 ribosome DNA의 염기서열을 분석하였고, 그 결과 180 균주는 small subunit (SSU) rDNA의 DNA 염기 서열에 따라 yeast Yarrowia lipolytica 에 속하는 균주로 분류되였다. 180균주는 환경 분리주로서 small subunit (SSU) rDNA가 Yarrowia lipolytica 차이가 있어 Yarrowia lipolytica CL 180 으로 명명하였다.Yarrowia lipolytica CL 180균주를 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 주소를 둔 유전자은행에 기탁하였으며, 기탁번호는 KCTC 0533BP를 부여받았다.

본 발명에 따른 Yarrowia lipolytica CL 180 (KCTC 0533BP)는 반월공단에서 기름으로 오염된 토양에서 분리된 균주로서 세포의 SEM사진을 도 6에 나타냈으며, TEM사진을 도 7에 각각 나타냈다. 본 발명에 따른 유류분해능이 있는 Yarrowia lipolytica CL 180이 oflaxacin-에스테르에 대한 enantioselective 리파제 활성도 함유하고 있는 새로운 특성을 확인하였다.

실시예 3: 오플록사신 에스테르에 대하여 광학 선택성을 가지는 리파아제의 클로닝

2-1. 사용된 균주와 플라스미드

Yarrowia lipolytica CL 180 균주는 광학 선택성을 가지는 리파아제의 유전자 클로닝을 위하여 source로 사용되었다. E. coli DH5α 균주는 플라스미드 DNA의 형질전환을 위하여 사용되었다. 벡터pUC118 (HincII/BAP treated)는 클로닝과 DNA 시퀀싱을 위하여 사용되었다. 리파제 유전자 클로닝에 사용된 균주 및 플라스미드에 대해 하기 표 3에 정리하였다.

2-2. 배지와 배양 조건

Yarrowia lipolytica CL 180 균주와 E. coli DH5α 균주는 Luria-Bertani (LB) 배지 (0.5% NaCl, 1% Bacto yeast extract, 1% Bacto tryptone)를 사용하여 각각 30℃ 와 37℃ 에서 배양하였다. E. coli DH5α 균주는 경우에 따라 50 ug/ml ampicillin과 IPTG, 그리고 X-gal이 첨가된 배지에서 배양하였다. LB-TBN 고체 배지는 재조합 클론의 라이브러리 탐색을 위하여 제조되었다. LB-TBN 고체 배지를 제조하기 위하여 1% TBN 은 1 L의 LB 배지와 혼합되었고 TBN emulsion 위하여 sonication을 수행하였으며 1.5%의 Bacto agar를 첨가하였다.

2-3. 게놈 DNA 추출

Yarrowia lipolytica CL 180균주로부터 enantioselective하게 (S)-오플록사신 에스테르를 특이적으로 분해하여 (S)-오플록사신 (레보플록사신)을 생성하는 리파제 활성을 확인하였고, 그 단백질의 특성을 연구하고자 해당 유전자를 cloning하고자 하였다. Yarrowia lipolytica CL 180을 90 ml 배양하여 게놈 DNA 58.8 ug를 획득하였다.

Yarrowia lipolytica CL 180로부터 게놈 DNA의 추출은 Breeden lab()에 묘사된 방법에 의해 수행하였다. Yarrowia lipolytica CL 180의 5 ml 배양액을 원심 분리하여 cell을 얻은 뒤, 0.5 mm 사이즈의 glass beads를 포함하는 lysis buffer (100 mM Tris-HCl [pH 8.0], 50 mM EDTA [pH 8.0], 1% SDS)와 혼합하여 vortexing을 2 분간 수행하였다. 300 ul의 상등액을 회수하여 275 ul의 7 M ammonium acetate (pH 7.0)를 첨가하였다. 65ㅀC에서 5분간 방치한 후, 그 시료는 다시 얼음에 5분간 방치하였다. 500 ul의 chloroform을 첨가하여 원심 분리 후, DNA를 포함한 500 ul의 상등액은 1 ml의 isopropanol과 함께 -20ㅀC에서 침전되었다. 그 pellet을 70% (v/v) ethanol을 이용하여 washing 하였고, 건조 후에 50 ul TE buffer (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM EDTA [pH 8.0])에 현탁되었다. 추출된 DNA는 0.5% TAE gel을 이용하여 확인하였다(도 8). 도 8에는 Yarrowia lipolytica CL 180의 게놈 DNA 추출을 보여주는 전기영도 사진이며, 레인 1은 크기 마커인 ?? HindⅢ이고, 레인 2는 게놈 DNA of Yarrowia lipolytica CL 180 (147 ng/ul)을 나타낸다.

2-4. 게놈 라이브러리의 구축

Yarrowia lipolytica CL 180의 게놈 라이브러리는 pUC118 (HincII/BAP treated) 벡터에 의하여 구축되었다. Yarrowia lipolytica CL 180으로부터 게놈 DNA를 분리하여 nebulization으로 shearing한 후 2??5kb 크기의 DNA절편을 클로닝 벡터인 pUC118에 삽입한 후, E. coli DH5α competent cell에 heat shock 처리하여 형질전환하였다.

추출된 게놈 DNA를 이용하여 게놈 라이브러리탐색 방법을 이용하여 cloning 하고자 하였으며, nebulizer를 사용하여 게놈 DNA를 무작위적으로 잘라서 약 2-5 kb의 크기의 DNA 단편들을 low melting temperature agarose gel로 분리하였다. 분리된 단편을 end-repairing 하여 blunt end로 만들었고, 만들어진 blunt-ended DNA는 pUC118의 HincII site에 ligation 하였다. 결과적으로 얻어진 플라스미드를 E. coli DH5α에 형질전환하여 게놈 라이브러리를 구축하였다 (도. 9). 얻어진 형질전환체를 ampicillin, IPTG, X-gal를 포함한 LB-TBN 고체배지에 포말하여, 전체 12,000개의 콜로니 중 DNA가 함유된 흰색 콜로니를 선태하였고, 그 중 TBN 분해활성을 보인 콜로니를 최종선택하였고, 해당 형질전환체에 함유된 플라스미드를 pJTL180으로 명명하였다(도 9). 도 9에는 상기 게놈 라이브러리의 구축과정을 보여주는 모식도로서, (a) 무작위적으로 잘린 Yarrowia lipolytica CL 180의 게놈 DNA이고, (b) pUC118 클로닝 벡터이고, (c) Yarrowia lipolytica CL 180 리파제를 함유하고 있는 pJTL180 플라스미드 DNA의 제한효소 지도를 나타낸다.

2-5. Yarrowia lipolytica CL 180의 게놈 라이브러리로부터 광학선택적 리파아제 탐색

E. coli DH5α 형질전환체를 50 ug/ml의 ampicillin, 0.1 M IPTG, 그리고 50 mg/ml X-gal을 포함하는 LB-TBN 고체배지에 도말하여 37ㅀC에서 48 시간 동안 배양한 후, 기질을 분해하여 투명환을 생성하는 흰색 콜로니를 선별하였다. TBN 플레이트상의 리파제 활성을 도 10에 나타냈으며, 콜로니 주변에 할로를 형성한 것으로부터 상기 형질전환체가 리파제 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

선별된 클론을 50 ug/ml의 암피실린과 0.1 M IPTG가 함유된 LB 배지에서 24 시간 배양한 후, 원심 분리하여 전체 cell을 얻었다. 이 cell을 기질인 (R),(S)-오플록사신 프로필 에스테르와 반응시킨 후에 HPLC방법으로 최종적으로 (R),(S)-오플록사신 프로필 에스테르의 (S)-enantiomer를 광학 선택적으로 가수분해 할 수 있는지 확인하였다. HPLC 분석 결과를 도 11에 나타냈으며, E. coli DH5α (pJTL180)는 환경분리주 Yarrowia lipolytica CL 180와 마찬가지로 enantioselective하게 (S)-오플록사신 프로필 에스테르를 선택적으로 분해하여 60% 의 ee_p (the enantiomeric excess of the product)로 (S)-오플록사신 (레보플록사신)을 생성할 수 있었다. 도 11에서 (a)는 HPLC diagram of enantioselectivity using lipase from Yarrowia lipolytica CL 180 야생균주에서 얻어진 리파제를 이용한 광학선택성을 보여주는 HPLC 결과이고, (b)는 본 실시예에서 제조된 형질전환체인 E. coli DH5α (pJTL180)에서 얻어진 리파제를 이용한 광학선택성을 보여조는 HPLC 결과이고, (a) 및 (b)에서 피크 1은 (S)-오플록사신 (레보플록사신)이고, 피크 2는 (R)-오플록사신이다.

2-6. cloning 된 리파제 유전자 특성 분석

상기에서 선택된 pJTL180 플라스미드를 특성분석을 위해 분리하였고, 제한효소로 처리하여 약 3.5 kb 크기의 절편을 획득하였으며 도 12에 제한효소를 처리하여 얻어진 pJTL180 플라스미드의 단편의 전기영동 사진을 나타내며, 도 12에서 레인1은 크기마커로서 1kb DNA ladder이고, 레인 2는 절단되지 않은 플라스미드 pJTL180의 DNA이고, 레인 2은 BamH1 /Hind III를 처리하여 선형화된 pJTL180의 DNA를 나타낸다.

상기에서 획득된 3.5 kb를 primer walking방법을 이용하여 전체 DNA 염기서열을 결정하였다. 3.5 kb의 DNA 단편 시퀀스는 클로닝 벡터인 pUC118의 sequencing 용 primer인 M13R primer와 M13F primer을 이용하여 primer walking 방법으로 확인되었다. 상기 3.5 kb DNA 단편 서열분석에 사용된 프라이머를 하기 표 4에 나타냈다. 표 4에서 프라이머는 순차적으로 SEQ ID NO: 3 내지 10으로 서열목록에 나타냈다.

시퀀싱 data 분석은 벡터 NTI sequence analysis software package (base-calling, sequencing assembly, and finishing editing software)가 사용되었고, Deduced amino acid sequence는 protein homology와 domain composition 분석을 위하여 complete nonredundant protein sequence database (NCBI)를 이용하였다. Potential signal peptides는 SignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) program을 이용하였고, Transmembrane segment search 는 TmPred at ISREC (http://www.ch.embnet.org/embnet-test/software/TMPRED_form.html) web site를 이용하였다. Protein sequences의 비교는 CLUSTALW program을 이용하였다.

얻어진 3.5 kb의 염기서열 분석 결과 1,431 bp로 구성된 open reading frame (ORF)를 확인하였다. 확인된 ORF는 52% G+C 로 구성되어 있었다.

분석결과 예측된 ORF는 476 아미노산으로 구성된 52 kDa의 단백질에 대한 정보를 함유하고 있는 것으로 분석되었다. 시작 codon은 ATG였고, TAG로 stop되었다. A potential ribosome binding site (CACCATG)가 시작 ATG codon으로부터 7 bp 앞쪽에서 발견되었다 (도 13). 도 13은 클로닝된 3.5 kb 염기서열 및 정보분석을 나타내는 것으로서, 프로모터 부위와 (TATA box) 리보좀 binding site (RBS)는 box와 밑줄로 표시되었으며, 활성에 필수적인 Ser, Asp, His를 box로 표시하였고, 활성 active site를 dotted line으로 표기하였고, Stop codon은 asterisk으로 표기하였고, trans-membrane helix는 염기서열아래 a dotted line으로 표기하였다.

SignalP 분석결과 세포외로 secretion 되기 위한 signal sequence는 발견되지 않았다. Kyte-Dolittle plot 분석 결과 대상 단백질은 아마도 membrane에 부착하기 위한 두 부분의 hydrophobic spans (V⁹⁸-S¹¹⁴, G²⁰⁸-L²³¹)을 함유하고 있는 것으로 사료되었다. 단백질 서열중 cell attachment motif R³⁴⁵G³⁴⁶D³⁴⁷ 의 존재는 이러한 사실을 뒷받침해준다 (D'Souza등, Trends Biochem. Sci. 16:246-250, 1991).

함유된 단백질 정보의 분석결과 type B1 carboxylesterase/lipase family에 30%이하의 상동성을 나타내었고, serine hydrolase와 type B1 carboxylesterase/lipase family의 active site에 일반적으로 conserve 되어 있는 GES ¹⁸⁹SG motif (Gly-X-Ser-X-Gly)가 발견되었다. 또한 리파제 활성에 필수적인 the triad serine, aspartate, histidine가 단백질 서열로부터 분석되었다 (S¹⁸⁹, E³⁰², H³⁸⁷,Fig. 13). 이러한 사실로부터 리파제 활성에 필요한 필수적인 서열은 보존되어 있지만 기존의 알려진 리파제와는 상당히 다른 신종의 리파제로 확인하였다.

기존의 알려진 단백질과 연관성을 살펴보기 위해 BLAST homology search를 실시한 결과, 기능이 알려지지 않고, 단백질에 대한 정보를 함유할 것으로 추정된 새로운 유전자와 유사성을 나타내었다. 최근 진행되고 있는 Yarrowia lipolytica CLIB99 의 genomic 결과 발견된 hypothetical protein 과 99% identity를 보였지만 (표 5), Yarrowia 와 candida를 포함한 이미 알려진 다른 균주의 type B1 carboxylesterase/lipase family와 비교한 결과 기존의 알려진 Yarrowia lipolytica 의 lipase Lip1 (32.73% identity), Yarrowia lipolytica 의 lipase Lip3(30.24% identity)를 포함하여 Candida rugosa의 lipase Lip1 (19.24% identity), Candida rugosa 의 lipase Lip2 (18.81% identity), Geotrichum candidum 의 lipase Lip1 (18.13% identity), Geotrichum candidum 의 lipase Lip2(17.25% identity), Geotrichum fermentans 의 lipase Lip1 (17.25% identity)와 30%이하의 상동성을 보여 신종 리파제로서 확정하였다(도 14, shows a multiple alignment).

Yarrowia lipolytica 180 리파제 유전자에 대한 블라스트 서치

Protein	Source	Identities(%)	Positives(%)	Score(bits) /E-value
Hypothetical protein	Yarrowia lipolytica CLIB99	474/476 (99)	475/476 (99)	978 /0
Hypothetical protein	Yarrowia lipolytica CLIB99	232/470 (49)	320/470 (68)	495 /e-139
YlLIP1	Yarrowia lipolytica CLIB99	168/498 (33)	262/498 (52)	269 /1e-70
Lipase I protein	Yarrowia lipolytica JM12	167/499 (33)	260/499 (52)	268 /3e-70
YlLIP3 Carboxylesterase/ lipase type B	Yarrowia lipolytica CLIB99 Yarrowia lipolytica INAG135668	151/446 (33)	226/446 (50)	218 /2e-55
Hypothetical protein	Aspergillus nidulans FGSC A4	121/450 (26)	203/450 (45)	129 /2e-28

도 14는 다중 염기서열 비교결과를 나타내는 것으로서 본 발명의 Yarrowia lipolytica CL 180 lipase (YAR180Lip)와, Candida rugosa (CrugLip1, CrugLip2), Geotrichum candidum (GcanLip1, GcanLip2), Geotrichum fermentans (GferLip1), and Yarrowia lipolytica (YARLip1, YARLip3)의 리파제와 다중 염기서열을 비교한 것으로서, 동일 아미노산은 별표로 표기하고 동종의 아미노산은 점(dot)으로 표기하였고, 갭은 dash로 나타내고, oxyanion hole site (a)과 활성 active site serine (b)은 box로 나타내었다.

또한 cloning 된 Yarrowia lipolytica CL 180 리파제는 지금까지 보고된 리파제와는 상당히 다른 신종의 리파제인 동시에, enantioselective하게 (S), (R)- 오플록사신 프로필 에스테르중 (S)-오플록사신 프로필 에스테르를 특이적으로 분해하여, (S)-오플록사신 (레보플록사신)을 60% 의 ee_p (the enantiomeric excess of the product)로 생성하는 특이적 활성을 보이는 레보플록사신 생산에 산업적으로 유용한 특성을 함유하고 있다.

실시예 3: cloning 된 리파제의 발현 및 재조합 단백질 분석

3.1 사용 균주 및 유전자 운반체

Cloning된 (S)-오플록사신 프로필 에스테르의 선택적 활성을 보인 리파제의 발현을 통한 재조합 단백질의 조제와 대량생산을 위하여, 발현 벡터로는 pET24a를, 숙주세포로는 E. coli DH5α, E. coli BL21 (DE3)RP 를 사용하였다.

3.2 DNA의 조작

제한 효소의 처리는 DNA 를 적절한 완충용액에 녹이고 제조 회사의 지시에 따라 반응시키고 65℃ 에서 10분간 열처리하거나, EDTA를 첨가하여 반응을 중지시킨다. 제한효소로 절단한 DNA 절편의 회수는 DNA 절편분리 kit (Qiagen, Co.)를 사용하며, 플라스미드는 플라스미드 miniprep (Qiagen, co.)을 사용하였으며 대부분의 DNA 조작방법은 Maniatis 등(1989)의 표준방법을 이용한다.

3.3 Expression system 확립

pET24a의 NdeI, SalI site에 NdeI, SalIsite를 포함하는 primer를 제작하였다.

정방향 P1: 5'- CGACCCGGCATATGACTACAATTAACTCGAAAGCACTCAATG - 3'(SEQ ID NO: 11)

역방향 P2: 5' - CTCCACATGTCGACCATAGCCCACTCTCCAGCAGGAGT - 3'(SEQ ID NO:12)

리파제 유전자의 ORF를 포함한 pJTL180을 이용하여 Ex-taq polymerase (Takara, Co.)를 이용하여 PCR을 수행하였다. Ligation한 후, DH5α에 형질전환 하여 candiate를 얻고, 이로부터 DNA 플라스미드 prep하여 이를 sequencing하여 mutation이나, frame shift가 일어나지 않은 완전한 DNA가 cloning되었음을 확인한다. 이후 BL21(DE3)RP 균주에 형질전환 하여 expression 하였다.

3.4 재조합 단백질의 생산

pET24a에 cloning된 리파제 유전자의 expression을 위해 LB medium에 Kanamycin (50 ug/ml)이 첨가된 medium에서 seed culture 한 후 동일한 main medium에 1% 접종하여 3시간 배양 후 IPTG를 최종 1mM의 농도로 첨가하여 발현하였다. 발현정도와 시기를 분석하기 위해 1시간 마다 sampling하여 SDS-PAGE로 분석하였다. 발현결과를 도 15에 나타냈으며, 도 15에 나타낸 바와 같이 pET24a 에 의해 발현된 재조합 단백질은 성공적으로 잘 발현되었음을 알 수 있다. 도 15에서 레인 1은 SDS-PAGE 표준물질, 레인 2는 E. coli BL21 세포 추출물이고, 레인 3은 IPTG로 발현을 유도하지 않은 세포 추출물이고, 레인 4는 IPTG로 발현을 유도하지 않은 세포 추출물이고, 레인 5는 수용성 분획이고, 도 6은 불용성 분획을 나타낸다.

발현이 확인된 콜로니를 대량배양하여 재조합 단백질을 분리하기 전, soluble fraction, inclusion body, periplasmic region중의 어느곳으로 생산되는 지를 확인하였고 이는 pET system의 protocol에 따랐다.

3.5 재조합 단백질의 분리

다량의 리파제를 분리하기 위하여 E. coli에서의 expression system을 이용하였다. 순수분리의 용이를 위해 His-Tag이라는 oligopeptide를 접합시켰고, His tag 분리는 Talon resin (Clontech, Co.)를 이용하여 분리하였다.

본 발명은 상술한 실시예에 한정되지 않으며, 첨부된 특허청구범위에 의해 정해지는 본 발명의 기술적 사상 내에서 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 많은 변형이 가능함은 물론이다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 광학선택적 리파아제가 최적화를 통해 대량으로 생산 되어진다면, 옥플록사신으로부터 레보플록사신만을 생산하는 새로운 생촉매 (biocatalyst)로써 유용하게 사용되어질 것이고, 의약품 산업에 크게 기여 할 것이다.

<110> KORDI <120> FLOXACIN ESTER-ENANTIOSELECTIVE LIPASE, NUCLEOTIDE ENCODING THE LIPASE, AND METHOD OF PRODUCING THE LEVOFLOXACIN <130> DPP20050934KR <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1431 <212> DNA <213> Yarrowia lipolyltica <220> <221> CDS <222> (1)..(1428) <400> 1 atg act aca att aac tcg aaa gca ctc aat ggc tct ttt gag gga gtc 48 Met Thr Thr Ile Asn Ser Lys Ala Leu Asn Gly Ser Phe Glu Gly Val 1 5 10 15 ccc att ggg gag acc atc cag tgg aag aac gtt ctg tac gcc gat gtc 96 Pro Ile Gly Glu Thr Ile Gln Trp Lys Asn Val Leu Tyr Ala Asp Val 20 25 30 aag cac cgg ttt gct cct cct att ctc aag act gac ttt gag gga aag 144 Lys His Arg Phe Ala Pro Pro Ile Leu Lys Thr Asp Phe Glu Gly Lys 35 40 45 acc atc gac tgt acc gaa gac gga tac gat tgt ccc cag ctg ccc aac 192 Thr Ile Asp Cys Thr Glu Asp Gly Tyr Asp Cys Pro Gln Leu Pro Asn 50 55 60 aaa cac gat atg cac gat ggc gag tac aag agc gac gag ctt ctg tgc 240 Lys His Asp Met His Asp Gly Glu Tyr Lys Ser Asp Glu Leu Leu Cys 65 70 75 80 acc aac ctg cgg atc gtg aag ccc aag ggc gac ttc aag cac ccc ctt 288 Thr Asn Leu Arg Ile Val Lys Pro Lys Gly Asp Phe Lys His Pro Leu 85 90 95 ccc gtc tac ttg tac atc cac gga ggt gcc aac ttg gtt gga aac att 336 Pro Val Tyr Leu Tyr Ile His Gly Gly Ala Asn Leu Val Gly Asn Ile 100 105 110 tac agc aag cga acc gat cct act ccg ttt gtg gag cac tct gct gca 384 Tyr Ser Lys Arg Thr Asp Pro Thr Pro Phe Val Glu His Ser Ala Ala 115 120 125 atc ggc aag cct gtc atc atg gtt gtc att gag tat cga ctc ggt atg 432 Ile Gly Lys Pro Val Ile Met Val Val Ile Glu Tyr Arg Leu Gly Met 130 135 140 ctt ggt tac tcc acc tcc aag gat gga aag ggt aac tgg ggt ctg cga 480 Leu Gly Tyr Ser Thr Ser Lys Asp Gly Lys Gly Asn Trp Gly Leu Arg 145 150 155 160 gac cag tgg act tca gtt cag tgg gtt aac aag ttc att ggt gaa ttt 528 Asp Gln Trp Thr Ser Val Gln Trp Val Asn Lys Phe Ile Gly Glu Phe 165 170 175 gga gga gac tct cag cga gtg act gtt gga gga gag tct tct ggc tca 576 Gly Gly Asp Ser Gln Arg Val Thr Val Gly Gly Glu Ser Ser Gly Ser 180 185 190 att ggt gtc cac gct ctt gtt ctg aag gac ggc ctc gag cac cat ggc 624 Ile Gly Val His Ala Leu Val Leu Lys Asp Gly Leu Glu His His Gly 195 200 205 gtt atc agc cga gcc ttc atg tct tcc gga tct ctg ggc tgt ttc cct 672 Val Ile Ser Arg Ala Phe Met Ser Ser Gly Ser Leu Gly Cys Phe Pro 210 215 220 cct ctt ccg gtt gct tat ctt gat act tac cga gcc aag gct gct aag 720 Pro Leu Pro Val Ala Tyr Leu Asp Thr Tyr Arg Ala Lys Ala Ala Lys 225 230 235 240 gag ctt ggt gtt gaa gag gcg gat ctc gat gac cct acc aag gtc cct 768 Glu Leu Gly Val Glu Glu Ala Asp Leu Asp Asp Pro Thr Lys Val Pro 245 250 255 ccc tac gct ctc gtc acg gcc gga ttc aag atc gaa tac ccc ttt ggc 816 Pro Tyr Ala Leu Val Thr Ala Gly Phe Lys Ile Glu Tyr Pro Phe Gly 260 265 270 ttc tat gct tac gat gac ttt ttg cct gac aac ctg ctg caa gcc att 864 Phe Tyr Ala Tyr Asp Asp Phe Leu Pro Asp Asn Leu Leu Gln Ala Ile 275 280 285 ccc aag ctc aga acc gct ctt gtc tcc gac aac gac tat gag ggt tct 912 Pro Lys Leu Arg Thr Ala Leu Val Ser Asp Asn Asp Tyr Glu Gly Ser 290 295 300 cta ttt gtg aag cga gtg gtg cca cct gcc gag atc gaa cct ctt ctc 960 Leu Phe Val Lys Arg Val Val Pro Pro Ala Glu Ile Glu Pro Leu Leu 305 310 315 320 aac tcc tcc gag acc gga aag aag gtc aag gat atc tac agc atc ttg 1008 Asn Ser Ser Glu Thr Gly Lys Lys Val Lys Asp Ile Tyr Ser Ile Leu 325 330 335 acc ggt gcc gag gtg tgc aag ttc cga gga gat agt ttc ttt gtc gtg 1056 Thr Gly Ala Glu Val Cys Lys Phe Arg Gly Asp Ser Phe Phe Val Val 340 345 350 tct aac gca gag cta ctc ggc caa ctg gaa aag gga ggt gtt gac gtc 1104 Ser Asn Ala Glu Leu Leu Gly Gln Leu Glu Lys Gly Gly Val Asp Val 355 360 365 tac cga cag ttc ttc gac cag gtt gat ccc ttt gac cct tct ctt agg 1152 Tyr Arg Gln Phe Phe Asp Gln Val Asp Pro Phe Asp Pro Ser Leu Arg 370 375 380 gcc cgt cat gct gtc gat ctt gtc ttc atg tgg aaa tgt ctt ccc aac 1200 Ala Arg His Ala Val Asp Leu Val Phe Met Trp Lys Cys Leu Pro Asn 385 390 395 400 ctc cct gag tgg gcc atc gaa ctg gcc aac aag tac cag acc aac ctg 1248 Leu Pro Glu Trp Ala Ile Glu Leu Ala Asn Lys Tyr Gln Thr Asn Leu 405 410 415 atc aag ttc gtc tac gat gag tct ccc tgg ccc tcc gat gag gtt gcc 1296 Ile Lys Phe Val Tyr Asp Glu Ser Pro Trp Pro Ser Asp Glu Val Ala 420 425 430 ctt gtt gga aac aag acc atc aag tac ggt cat tac aac cct cga aag 1344 Leu Val Gly Asn Lys Thr Ile Lys Tyr Gly His Tyr Asn Pro Arg Lys 435 440 445 ctg gca gag aag ctg ctt gac ctc gac ctc aag gag att cga aag ctt 1392 Leu Ala Glu Lys Leu Leu Asp Leu Asp Leu Lys Glu Ile Arg Lys Leu 450 455 460 gga gag gat ctc act cct gct gga gag tgg gct atg ta g 1431 Gly Glu Asp Leu Thr Pro Ala Gly Glu Trp Ala Met 465 470 475 <210> 2 <211> 476 <212> PRT <213> Yarrowia lipolyltica <400> 2 Met Thr Thr Ile Asn Ser Lys Ala Leu Asn Gly Ser Phe Glu Gly Val 1 5 10 15 Pro Ile Gly Glu Thr Ile Gln Trp Lys Asn Val Leu Tyr Ala Asp Val 20 25 30 Lys His Arg Phe Ala Pro Pro Ile Leu Lys Thr Asp Phe Glu Gly Lys 35 40 45 Thr Ile Asp Cys Thr Glu Asp Gly Tyr Asp Cys Pro Gln Leu Pro Asn 50 55 60 Lys His Asp Met His Asp Gly Glu Tyr Lys Ser Asp Glu Leu Leu Cys 65 70 75 80 Thr Asn Leu Arg Ile Val Lys Pro Lys Gly Asp Phe Lys His Pro Leu 85 90 95 Pro Val Tyr Leu Tyr Ile His Gly Gly Ala Asn Leu Val Gly Asn Ile 100 105 110 Tyr Ser Lys Arg Thr Asp Pro Thr Pro Phe Val Glu His Ser Ala Ala 115 120 125 Ile Gly Lys Pro Val Ile Met Val Val Ile Glu Tyr Arg Leu Gly Met 130 135 140 Leu Gly Tyr Ser Thr Ser Lys Asp Gly Lys Gly Asn Trp Gly Leu Arg 145 150 155 160 Asp Gln Trp Thr Ser Val Gln Trp Val Asn Lys Phe Ile Gly Glu Phe 165 170 175 Gly Gly Asp Ser Gln Arg Val Thr Val Gly Gly Glu Ser Ser Gly Ser 180 185 190 Ile Gly Val His Ala Leu Val Leu Lys Asp Gly Leu Glu His His Gly 195 200 205 Val Ile Ser Arg Ala Phe Met Ser Ser Gly Ser Leu Gly Cys Phe Pro 210 215 220 Pro Leu Pro Val Ala Tyr Leu Asp Thr Tyr Arg Ala Lys Ala Ala Lys 225 230 235 240 Glu Leu Gly Val Glu Glu Ala Asp Leu Asp Asp Pro Thr Lys Val Pro 245 250 255 Pro Tyr Ala Leu Val Thr Ala Gly Phe Lys Ile Glu Tyr Pro Phe Gly 260 265 270 Phe Tyr Ala Tyr Asp Asp Phe Leu Pro Asp Asn Leu Leu Gln Ala Ile 275 280 285 Pro Lys Leu Arg Thr Ala Leu Val Ser Asp Asn Asp Tyr Glu Gly Ser 290 295 300 Leu Phe Val Lys Arg Val Val Pro Pro Ala Glu Ile Glu Pro Leu Leu 305 310 315 320 Asn Ser Ser Glu Thr Gly Lys Lys Val Lys Asp Ile Tyr Ser Ile Leu 325 330 335 Thr Gly Ala Glu Val Cys Lys Phe Arg Gly Asp Ser Phe Phe Val Val 340 345 350 Ser Asn Ala Glu Leu Leu Gly Gln Leu Glu Lys Gly Gly Val Asp Val 355 360 365 Tyr Arg Gln Phe Phe Asp Gln Val Asp Pro Phe Asp Pro Ser Leu Arg 370 375 380 Ala Arg His Ala Val Asp Leu Val Phe Met Trp Lys Cys Leu Pro Asn 385 390 395 400 Leu Pro Glu Trp Ala Ile Glu Leu Ala Asn Lys Tyr Gln Thr Asn Leu 405 410 415 Ile Lys Phe Val Tyr Asp Glu Ser Pro Trp Pro Ser Asp Glu Val Ala 420 425 430 Leu Val Gly Asn Lys Thr Ile Lys Tyr Gly His Tyr Asn Pro Arg Lys 435 440 445 Leu Ala Glu Lys Leu Leu Asp Leu Asp Leu Lys Glu Ile Arg Lys Leu 450 455 460 Gly Glu Asp Leu Thr Pro Ala Gly Glu Trp Ala Met 465 470 475 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13F(Universal) <400> 3 ggaaacagct atgaccatga ttac 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13R (Universal) <400> 4 gacgttgtaa aacgacggcc agt 23 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13F1 <400> 5 accggtcaag atgctgtaga tatc 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13R1 <400> 6 tcggaaagga gatgtaacgt ctga 24 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13F2 <400> 7 agagtctcct ccaaattcac caatg 25 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13R2 <400> 8 tcactccagc tacagtacag taca 24 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13F3 <400> 9 gagccattga gtgctttcga gttaa 25 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13R3 <400> 10 ttgcgcgtct cttagacaga agat 24 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P1 <400> 11 cgacccggca tatgactaca attaactcga aagcactcaa tg 42 <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2 <400> 12 ctccacatgt cgaccatagc ccactctcca gcaggagt 38

Claims (10)

1. SEQ ID NO:2에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지며, (R),(S)-오플록사신 알킬 에스테르 혼합물로부터 (S)-에난티오머의 에스테르 결합만을 광학선택적으로 분해하는 리파제.
2. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:1에 나타낸 핵산서열에 의해 암호화되는 펩타이드인 리파제.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 (R),(S)-오플록사신 알킬 에스테르중 알킬은 프로필, 또는 부틸인 리파제.
4. SEQ ID NO:2에 나타낸 아미노산 서열을 암호화하는 핵산서열로 이루어지며, (R),(S)-오플록사신 알킬 에스테르 혼합물로부터 (S)-에난티오머의 에스테르 결합만을 광학선택적으로 분해하는 리파제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
5. 제 4 항에 있어서, SEQ ID NO:1에 나타낸 핵산서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드.
6. (R),(S)-오플록사신 알킬 에스테르 혼합물로부터 (S)-에난티오머의 에스테르 결합만을 광학선택적으로 분해하는 리파제를 생산하는 Yarrowia lipolytica 균주(KCTC 0533BP).
7. 제 4항 또는 제5항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
8. 제 4항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 형질전환된 원핵세포.
9. 제1항에 따른 리파제를 pH는 6.0-8.0에서 (R),(S)-오플록사신 알킬 에스테르 혼합물에 반응시켜 레보플록사신을 제조하는 방법.
10. 제 9항에 있어서, 상기 리파제는 제 6항의 Yarrowia lipolytica 세포 배양물, 또는 제 8항의 형질전환된 세포 배양물로부터 분리한 리파제인 것인 방법.

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