KR102097720B1 - 마리노박터 리포리티쿠스 유래 지질분해효소 - Google Patents

마리노박터 리포리티쿠스 유래 지질분해효소 Download PDF

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Abstract

본 발명은 마리노박터 리포리티쿠스(Marinobacter lipolyticus) 유래 지질분해효소(lipase)에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 Marinobacter lipolyticus 유래 지질분해효소(LipA9), 상기 지질분해효소를 발현하는 재조합 미생물 및 이를 이용하여 지질분해효소를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 마리노박터 리포리티쿠스(Marinobacter lipolyticus) 유래 지질분해효소(LipA9)의 온도 및 pH 특성, 기질 특이성을 확인하였으며, 상기 지질분해효소를 가교결합시킨 고정화된 지질분해효소는 온도, pH 및 유기용매에 대한 안정성이 상당히 증가되고 원심분리로 쉽게 회수되면서 활성을 유지하였으므로, 산업적으로 유용하다.

Description

마리노박터 리포리티쿠스 유래 지질분해효소{Lipase from Marinobacter lipolyticus}
본 발명은 마리노박터 리포리티쿠스(Marinobacter lipolyticus) 유래 지질분해효소(lipase)에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 Marinobacter lipolyticus 유래 지질분해효소(LipA9), 상기 지질분해효소를 발현하는 재조합 미생물 및 이를 이용하여 지질분해효소를 제조하는 방법에 관한 것이다.
지방분해 효소(lipolytic enzyme)는 리파아제(지질분해효소, lipases; triacylglycerol acylhydrolase, EC 3.1.1.3) 및 카복실에스테라아제(carboxylesterases; carboxylester hydrolase, EC 3.1.1.1)의 2개의 그룹으로 나뉜다. 리파아제는 트리아실글리세롤(triacylglycerol)의 가수분해를 촉매하여 모노아실글리세롤(monoacylglycerol), 다이아실글리세롤(diacylglycerol), 지방산 및 글리세롤을 생성한다. 한편, 에스테라아제(에스터가수분해효소, esterase)는 카복실 에스터 분자의 에스테르 결합의 가수분해를 촉매하여 알코올 및 카복실산을 생성한다(Arpigny, K. L. and Jaeger, K. E. (1999). Bacterial lipolytic enzymes: classification and properties. Biochemical Journal, 343, 177-183.). 지방분해 효소는 보존된 모티프 및 구조적, 생물학적 특성에 따라 8개의 family로 분류된다. Family VIII esterase는 class C β-lactamase 및 penicillin-binding 단백질과 높은 서열 유사성을 보이나(Bornscheuer, U. T. (2002). Microbial carboxylesterases: Classification, properties and application in biocatalysis. FEMS Microbiology Reviews, 26, 73-81.), 대부분의 family VIII esterases는 β-lactam 기질에 대해 낮은 활성을 나타낸다(Petersen, E. I., et al., (2011). A novel esterase from Burkholderia gladioli which shows high deacetylation activity on cephalosporins is related to beta-lactamases and DD-peptidases. Journal of Biotechnology, 89, 11-25.). 대부분의 에스테라아제는 G-x-S-x-G 또는 G-D-S-L 모티프에서 catalytic Ser을 가지고 있는 반면, Family VIII esterase는 S-x-x-K 모티프에서 catalytic Ser을 갖는다(Rashamuse, K., et al., (2009). A novel family VIII carboxylesterase derived from a leachate metagenome library exhibits promiscuous β-lactamase activity on nitrocefin. Applied Microbiology and Biotechnology, 83, 491-500.). Family VIII esterases는 활성 부위에 두 개의 보존된 Tyr 잔기와 S-x-x-K 모티프를 가지고 있는 한편, 일부 에스테라아제(Arthrobacter globiformis의 EstAg 및 Mycobacterium tuberculosis의 LipL)는 오직 하나의 보존된 Tyr 잔기를 가지고 있다(Cao, J., et al., (2015). Identification and characterization of lipase activity and immunogenicity of LipL from Mycobacterium tuberculosis. PLoS ONE, 10, e0138151. https://doi. org/10.1371/journal.pone.0138151.).
지방분해 효소는 촉매 과정에서 보조인자가 필요하지 않다. 또한, 이들 효소는 기질의 탄소 사슬 길이에 따른 기질 특이성을 나타내며, 입체 선택성 및 위치 선택성을 갖는다. 따라서 이들 효소는 식품, 제지, 세제, 의약, 바이오디젤과 같은 다양한 산업 분야에서 사용된다(Jaeger, K. E. and Eggert, T. (2002). Lipases for biotechnology. Current Opinion in Biotechnology, 13, 390-397.). 그러나 산업 공정이 종종 극단적인 온도, pH 및 유기용매에서 수행되기 때문에, 일부 지방분해 효소의 낮은 열 안정성 및 유기용매 안정성은 그들의 산업적 적용을 제한한다(Perez, D., et al ., (2011). A novel halophilic lipase, LipBL, showing high efficiency in the production of eicosapentaenoic acid (EPA). PLoS ONE, 6, e23325. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0023325.).
단백질 공학 기술은 효소의 열 또는 유기용매 안정성을 증가시킬 수 있지만, 효소 안정성의 증가는 효소 활성의 감소를 유도하기도 한다(Dror, A., et al ., (2014). Protein engineering by random mutagenesis and structure-guided consensus of Geobacillus stearothermophilus lipase T6 for enhanced stability in methanol. Applied and Environmental Microbiology, 80, 1515-1527.). 또 다른 방법으로는 호극성균(extremophiles)으로부터 자연적으로 높은 안정성을 갖는 효소를 찾는 것이 있다(Niehaus, F., et al ., (1999). Extremophiles as a source of novel enzymes for industrial application. Applied Microbiology and Biotechnology, 51, 711-729.). 남극 해양은 저온 및 높은 염도로 인해 수분 활성이 낮은 극한의 환경이다. 저온성균(psychrophiles) 또는 호염균(halophiles)은 보통 낮은 용존 수분 활성 환경에 대한 생존 전략으로 매우 유연한 단백질을 가지고 있기 때문에, 유기용매에서도 매우 안정한 효소를 가지고 있다(Karan, R., Capes, M. D., and DasSarma, S. (2012). Function and biotechnology of extremophilic enzymes in low water activity. Aquatic BioSystems, 8, https://doi.org/10.1186/2046-9063-8-4.).
한편, 효소를 고정화하면 여러 번 회수할 수 있으며 유기용매, 고온 또는 극한 pH에서 효소의 안정성을 증가시킬 수 있다(Mateo, C., et al ., (2007). Improvement of enzyme activity, stability and selectivity via immobilization techniques. Enzyme and Microbial Technology, 40, 1451-1463.) 다양한 고정화 방법 중에서 cross-linked enzyme aggregate(CLEA) 방법은 간단하고 경제적이며, 어떠한 정제 단계도 필요로 하지 않는다. 또한 CLEA는 보통 비드(bead)-고정 효소보다 부피당 효소 활성이 높다(Han, J. Y. and Kim, H. K. (2011). Transesterification using the cross-linked enzyme aggregate of Photobacterium lipolyticum lipase M37. Journal of Microbiology and Biotechnology, 21, 1159-1165).
이에, 본 발명자들은 다양한 산업적 용도로 이용 가능한 지질분해효소를 제조하고자 예의 노력한 결과, 남극 로스해(Ross sea)에서 분리된 박테리아 균주를 스크리닝하여, 높은 지질분해 활성을 갖는 Marinobacter lipolyticus 27-A9 균주로부터 리파아제 유전자(lipA9)를 찾고 Escherichia coli에서 대량 생산하였다. 나아가 Marinobacter lipolyticus 유래 리파아제(LipA9)의 열 활성 및 유기용매 안정성을 포함한 생화학적 특성을 조사하였으며, 위치-지정 돌연변이를 통해 보존된 Ser, Lys 및 Tyr 잔기의 역할을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 마리노박터 리포리티쿠스(Marinobacter lipolyticus) 유래의 지질분해효소를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 지질분해효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용하여 지질분해효소를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 지질분해효소(lipase)를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 지질분해효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 유전자 또는 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하여 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 지질분해효소를 발현시키는 단계; 및 상기 발현된 지질분해효소를 회수하는 단계를 포함하는 지질분해효소의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서는 마리노박터 리포리티쿠스(Marinobacter lipolyticus) 유래 지질분해효소(LipA9)의 온도 및 pH 특성, 기질 특이성을 확인하였으며, 상기 지질분해효소를 가교결합시킨 고정화된 지질분해효소는 온도, pH 및 유기용매에 대한 안정성이 상당히 증가되고 원심분리로 쉽게 회수되면서 활성을 유지하였으므로, 산업적으로 유용하다.
도 1은 염기 서열 및 삽입 DNA의 유전자 지도를 나타낸 것이다. 삽입 DNA는 7,124 bps로 구성되며, lipA9 유전자의 open reading frame은 빨간색으로 표시되었다.
도 2는 lipA9 유전자의 서열 및 아미노산 서열(GenBank accession number MG988389)을 나타낸 것이다. 보존된 S-x-x-K 및 G-x-S-x-G 서열이 밑줄로 표시되었으며, Thr2, Ser161, Leu176, Ser222 및 Asp234 아미노산 서열은 M. lipolytic SM-19의 아미노산 서열과 상이하다.
도 3은 LipBL 및 family VIII esterase 아미노산 서열 정렬(alignments)을 나타낸 것이다. 보존된 서열 Ser, Lys 및 Tyr 잔기는 박스로 표시되었으며, Family VIII esterases는 LipBL(Marinobacter lipolyticus, accession no. CBX87546), EstA3(uncultured bacterium, accession no. AAZ48934), EstC(uncultured bacterium, accession no. ACH88047), EstCE1(uncultured bacterium, accession no. AAY90130), EstM-N1(uncultured bacterium, accession no. AEA07653), EstM-N2(uncultured bacterium, accession no. AEA07655), EstU1(uncultured bacterium, accession no. AFU54388), Est-AG(Arthrobacter globiformis, accession no. AAA99492), EstB(Burkholderia gladioli, accession no. AAF59826), EstBL(Burkholderia cepacia, accession no. AAX78516) 및 LipL(Mycobacterium tuberculosis, accession no. CCE37008)로 대표된다.
도 4는 LipA9의 상동성 모델의 3차원 구조를 나타낸 것으로, 도 4A는 LipA9의 schematic 3D 구조, 도 4B 및 도 4C는 활성 부위 Ser72, Lys75, Tyr141 및 Tyr188의 측쇄이다.
도 5는 LipA9의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 것이다(Lane 1: protein size marker, Lane 2: 빈 벡터(pET22)를 포함하는 E. coli 세포의 세포 추출물(cell-free extract), Lane 3: LipA9를 발현하는 E. coli 세포의 불용성 분획, Lane 4: LipA9를 발현하는 E. coli 세포의 세포 추출물(cell-free extract), Lane 5: 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제된 LipA9, Lane 6: 겔 여과 크로마토그래피에 의해 정제된 LipA9).
도 6은 LipA9의 Native PAGE 및 zymogram 분석을 나타낸 것이다. (a)는 Native PAGE 분석(Lane 1: protein size marker, Lane 2: LipA9를 발현하는 E. coli 세포의 불용성 분획, Lane 3: LipA9를 발현하는 E. coli 세포의 세포 추출물(cell-free extract), Lane 4: 빈 벡터(pET22)를 포함하는 E. coli 세포의 세포 추출물(cell-free extract)), (b)는 LipA9의 Zymography이다(Lane 5: LipA9를 발현하는 E. coli 세포의 세포 추출물(cell-free extract), Lane 6: LipA9를 발현하는 E. coli 세포의 불용성 분획, Lane 7: 빈 벡터(pET22)를 포함하는 E. coli 세포의 세포 추출물(cell-free extract))이다.
도 7은 LipA9 및 LipA9CLEA의 기질 특이성 및 온도 및 pH의 영향을 나타낸 그래프이다. 도 7A는 다양한 p-NP esters에 대한 LipA9의 가수분해 활성, 도 7B는 다양한 triglycerides에 대한 LipA9의 가수분해 활성, 도 7C는 pH 8.0에서 측정된 온도당 활성, 도 7D는 37℃에서 측정된 pH당 활성, 도 7E는 배양 후 다양한 온도에서 측정된 잔존 활성, 도 7F는 배양 후 다양한 pH에서 측정된 잔존 활성을 나타낸 것이다. Open circle은 LipA9, closed circle은 LipA9CLEA이다.
도 8은 LipA9, LipA9CLEA 및 CalB의 유기용매 안정성을 나타낸 그래프이다. 도 8A는 25℃, 30 % 농도의 유기용매에서 효소를 배양한 후, 표준 조건 p-NPC assay에 의해 측정된 잔존 활성을 나타낸 것으로, 유기용매 안정성 실험은 4회 수행하여 평균 값을 측정하였고, 표준편차는 오차 막대로 표시하였으며, 괄호 안의 숫자는 log P 값을 의미한다. 25℃, 다양한 농도의 유기용매에서 LipA9(도 8B), LipA9CLEA(도 8C) 및 CalB(도 8D)를 배양한 후 측정된 잔존 활성을 나타내었다. Open circle은 DMSO, open square는 methanol, closed circle은 acetone, closed square는 2-propanol이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
남극 해양 환경은 유익한 특성, 즉, 극한의 물리적 및 화학적 조건에 대한 내성을 갖는 신규 지방분해 효소의 좋은 공급원이다. 본 발명자들은 남극 로스해(Ross sea)에서 분리된 Marinobacter lipolyticus 27-A9로부터 지방분해 효소인 LipA9를 발견했다. 정제된 LipA9는 현저한 유기용매 안정성 및 광범위한 pH 안정성을 나타냈다. LipA9는 catalytic 모티프로서 S-x-x-K 서열을 갖는 효소이고, 활성 부위 근처에 2개의 보존된 Tyr 잔기를 갖는다. Ser72와 Tyr188 사이의 수소 결합은 촉매 활성에 필수적이나, Lys75와 Tyr141 사이의 수소 결합은 보조적이다. 본 발명은 Tyr141 잔기의 역할을 밝혀 내고 LipA9가 catalytic triad를 가진 효소임을 시사하는 최초의 연구이다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 지질분해효소(lipase)에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열은 다음과 같다:
MTESKQVTGLSSGHLTHIEDHLDRRYIQPGKLPGALTLVARRGEIAYLKAQGLMDVERNKPVCRDTVFRIYSMTKPITSIAMMQLYEQGRFLLDDPVHKYIPAWKNLRVYNSGVYPNFLTTPATSTMTIRDLFTHMSGLTYGFMNRTNVDAAYRELKLDGSRNLTLEALVGHLAELPLEFSPGTAWNYSVSTDVLGYLVQLLADQPFDEYLREHIFEPLAMSDTGFHVRDDQLDRFAACYQYDPVDQFKLQDDPQTSPFRDKRRFLSGGGGLVSTIDDYFHFAQALCQGGEFGGRRIIGRKTLEFMRRNHLPGNQDLPGLSVGPFSETPYAGTGFGLGFSVKTDVAKSQINGSVGEYGWGGLASTNFIIDPVEELVVIFMTQLIPSSTYPIRQELRAIVNGALV (서열번호 1).
본 발명에 있어서, 상기 지질분해효소는 마리노박터 리포리티쿠스(Marinobacter lipolyticus) 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 남극 로스해(Ross sea)에서 분리된 Marinobacter lipolyticus 27-A9의 genomic DNA를 이용하여 형질전환된 지방분해성 Escherichia coli 콜로니를 확인하였다. DNA 서열 분석으로 지방분해 효소 유전자의 open reading frame(ORF)을 밝혀냈으며, 상기 유전자는 분자량이 45,247 Da인 404개의 아미노산 단백질(LipA9)을 번역한다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 지질분해효소를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 서열번호 2의 염기 서열은 다음과 같다:
ATGACGGAATCGAAACAGGTCACCGGCCTTTCATCAGGCCACCTTACTCACATTGAAGACCATCTTGACCGCCGCTATATCCAGCCGGGGAAATTGCCCGGGGCGCTGACTCTGGTGGCCCGACGTGGGGAAATTGCCTATCTGAAAGCTCAGGGGCTGATGGATGTGGAGCGCAACAAGCCGGTCTGCCGGGATACGGTGTTCCGCATTTATTCCATGACCAAGCCTATTACGTCCATCGCCATGATGCAGCTCTATGAGCAGGGGCGGTTTTTGCTGGATGATCCGGTACACAAGTACATTCCGGCCTGGAAGAACCTGCGGGTTTACAACAGTGGTGTCTATCCCAACTTCCTGACCACACCTGCAACCAGCACCATGACCATTCGCGACCTGTTCACCCACATGTCAGGCCTGACCTATGGGTTCATGAACCGCACCAACGTTGACGCCGCCTATCGGGAGCTGAAGCTGGATGGCAGCCGGAATCTGACACTGGAAGCGCTGGTCGGTCATCTGGCGGAACTGCCGCTGGAGTTCTCACCGGGTACCGCCTGGAACTATTCGGTCAGCACGGATGTGCTGGGGTATCTGGTGCAGTTGCTGGCTGATCAGCCGTTTGATGAGTATCTGCGCGAGCATATCTTTGAACCATTGGCCATGTCCGACACCGGCTTCCATGTTCGTGACGATCAGCTCGACCGTTTCGCCGCCTGCTATCAGTACGATCCGGTCGACCAGTTCAAGCTGCAGGACGATCCGCAGACCTCCCCTTTCCGGGACAAAAGGAGGTTTCTGTCTGGTGGCGGCGGGCTGGTTTCCACCATTGACGATTATTTCCACTTTGCCCAGGCACTCTGTCAGGGTGGCGAGTTTGGCGGGCGGCGGATTATTGGCCGAAAGACTCTGGAATTCATGCGTCGCAATCATCTACCCGGCAATCAGGACCTGCCTGGCCTTTCCGTCGGTCCGTTCAGCGAAACACCTTATGCCGGGACCGGCTTCGGGCTGGGCTTTTCGGTAAAGACTGACGTCGCCAAATCCCAGATCAACGGCTCGGTCGGCGAGTATGGTTGGGGTGGCCTGGCCAGCACCAACTTTATTATCGATCCGGTGGAGGAACTGGTGGTGATTTTCATGACGCAACTGATCCCCTCCTCGACCTACCCGATCCGTCAGGAATTGCGGGCGATTGTGAATGGGGCGTTGGTCTAG (서열번호 2).
본 발명의 일 실시예에서, 높은 지방분해 활성을 나타내는 Marinobacter lipolyticus 27-A9로부터 shotgun 클로닝 방법으로 lipase 유전자(lipA9)를 분리하고, LipA9를 E. coli 세포에서 발현시켰다(KCTC 13607BP).
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 지질분해효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 지질분해효소를 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 E. coli BL21(DE3)인 것이며, 가장 바람직하게는 KCTC 13607BP 균주인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 KCTC 13607BP 균주는 2018년 8월 2일에 기탁되었다.
본 발명에 있어서, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환 되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, "플라스미드" 및 “벡터”는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션할 수 있다.
라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 본 발명에 있어서, 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 E. coli XL-1Blue(Stratagene), E. coli DH5α , E. coli JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E.coli X1776, E. coli BL21 등을 포함한다. 그러나 FMB101 , NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera) 등이 또한 사용될 수 있다. 상기 E. coli에 덧붙여, 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있다.
원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현벡터가 사용될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합 벡터 내에 포함되게 된다.
상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.
물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 미생물을 배양하여 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 지질분해효소를 발현시키는 단계; 및 상기 발현된 지질분해효소를 회수하는 단계를 포함하는 지질분해효소의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 발현된 지질분해효소의 회수는 반응 결과물(cell-free extract)로부터 분리함으로써 이루어지는데, 예시적으로 분자량 및/또는 친화성 차이를 이용하는 정제방법, 즉, 겔 여과 크로마토그래피법, 멤브레인 분리법, 컬럼 크로마토그래피법, 고속액체크로마토그래피법 및 이온 교환 크로마토그래피법 등을 이용하여 정제하여 수득할 수 있다. 더욱 바람직하게는 침전시킨 후 음이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 통해 활성 지질분해효소를 정제할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 재조합 지질분해효소 LipA9는 E. coli BL21(DE3) 세포에서 발현되었으며, 음이온 교환 및 겔 여과 크로마토그래피에 의해 정제되었다. LipA9의 k cat/K m는 175 s- 1μM-1이며, 최적 온도 및 pH는 각각 70℃ 및 pH 8.0이다. 또한, LipA9는 기질로서 짧은 아실 사슬 길이의 p-nitrophenyl ester 및 triglyceride를 선호하는 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, LipA9는 매우 높은 유기용매 안정성을 가졌으며, 몇 가지 일반적인 유기용매에 대해서는 최대 90% 농도까지 안정하였다.
유기용매 배지는 일반적으로 비극성 기질의 용해도를 증가시켜, 생산물 회수를 촉진하고 부작용을 감소시킨다. 또한 가수분해 반응의 열역학적 평형 반전으로 에스테르화(esterification), 에스테르 교환반응(transesterification) 및 알코올분해(alcoholysis)를 촉매할 수 있다(Dachuria, V., et al ., (2016). Organic solvent-tolerant, cold-adapted lipases PML and LipS exhibit increased conformational flexibility in polar organic solvents. Journal of Molecular Catalysis B Enzymatics, 131, 73-78.). 따라서, LipA9의 높은 유기용매 안정성은 다양한 산업 분야에 있어 유리한 특성이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 지질분해효소를 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)와 혼합하여 가교결합시킨 고정화된 지질분해효소에 관한 것이다.
효소의 안정성을 향상시키고 반복 사용할 수 있도록 고정화할 수 있다. Cross-linked enzyme aggregate(CLEA) 방법은 가교결합법의 일종으로 가교제를 사용하여 효소 내의 Lysine 잔기를 공유결합 시킴으로써 안정성을 증대시키는 방법이다.
본 발명에 있어서, 상기 CLEA로 고정화된 지질분해효소는 그 자체가 지질분해 활성을 지닌 가교형 효소 집합체를 의미한다. 본 발명의 일 실시예에서, 고정 후 지질분해효소의 기질 특이성은 변하지 않으나, 열 안정성, pH 안정성 및 유기용매 안정성이 증가하였다. 또한, 원심분리로 쉽게 회수되었으며, 4회 재사용 후 활성이 약 50%까지 유지되었다.
본 발명의 일 실시예에서, 세포 추출액에서 지질분해효소(LipA9)를 선택적으로 침전시킨 후, 가교제로 glutaraldehyde(25mM의 최종 농도)를 첨가하여 교반시켜 가교형 효소 집합체(cross-linked enzyme aggregates)인 LipA9CLEA를 제조하였다.
본 발명의 일 실시예에서, LipA9의 서열 분석을 통해, LipA9가 family VIII esterases와 같이 S-x-x-K 모티프에서 catalytic Ser72 및 Lys75를 포함하는 것을 확인하였다. 상동성 모델링(Homology modeling) 및 위치-지정 돌연변이(site-directed mutagenesis) 연구를 통해 Tyr141 및 Tyr188 잔기가 보존된 모티프 근처에 위치하고, 촉매 활성에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다.
본 발명은 M. lipolyticus 지질분해효소의 발현, 특성 분석, Cross-linked Enzyme Aggregated 고정화를 바탕으로 산업적으로 활용 가능성을 제시하며, LipA9의 Tyr141 잔기의 역할을 밝혀 내고 LipA9가 catalytic triad를 가진 효소임을 시사하는 최초의 보고이다.
지질분해효소는 세제 혹은 토양과 폐수 정화 등에 첨가제로 다양하게 사용될 수 있기 때문에 특히 주목을 받고 있다. 본 발명에 따른 LipA9 및 LipA9CLEA의 물리·화학적 특성 규명, 발현 균주, 최적 온도 및 pH 등을 바탕으로 LipA9의 산업적 응용을 위해서는 우선 대량생산 기술 개발이 요구되며, 이를 통해 다양한 분야로의 적용이 가능하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 실험 재료 및 시약
Acetonitrile, 1-butanol, 2-butanone, 1,2-dimethoxyethane, 2-propanol, propionitrile, glutaraldehyde, ampicillin, tributyrin(TBN), tricaprylin(TCN), olive oil, p-nitrophenol, p-nitrophenyl(p-NP) acetate(C2), p-NP butyrate(C4), p-NP caprylate(C8), p-NP caprate(C10), p-NP laurate(C12) 및 Candida antartica lipase B (CalB)는 Sigma Aldrich Co. (USA)에서 구입하였다. Dimethyl sulfoxide(DMSO) 및 acetone은 Junsei Co. (Japan)에서 구입하였으며, p-NP caproate(C6)는 Tokyo Chemical Industry Co. (Japan)에서 구입하였다. Methanol 및 ethanol은 Merck Chemical Co. (Germany)에서 구입하였으며, β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)는 Duchefa Biochemie B.V. Co. (Netherlands)에서 구입하였다. Marine broth 배지는 Becton, Dickinson and Co. (USA)에서 구입하였으며, diethyl ether는 DC Chemical Co. (Korea)에서 구입하였다.
실시예 2: 지방분해 효소 생성 균주 분리
분리된 남극 세균 균주(Ross sea, 73°29'S, 172°00'E, depth 20m) 중 고체 배지에서 지방분해 활성을 보이는 박테리아를 선별하기 위해 TBN-Marine agar 배지를 준비 하였다. TBN emulsion은 Waring blender에서 TBN과 gum Arabic 용액(200mM NaCl, 10mM CaCl2 및 5% gum Arabic)을 1:9의 비율로 2분간 유화시켜 만들었다. TBN emulsion및 marine agar 배지를 1:9의 비율로 혼합하여 TBN marine agar 배지를 제조하였다. 박테리아 균주를 15℃에서 72시간 동안 TBN marine agar 배지에서 배양하여, 투명환(halo)을 형성하는 콜로니를 스크리닝하였다.
M. lipolyticus의 균주(27-A9)가 TBN-marine agar 배지에서 가장 큰 투명환을 형성했다.
실시예 3 지방분해 효소 유전자 클로닝과 서열분석
Marinobacter lipolyticus 27-A9로부터 chromosomal DNA를 추출하고, HindⅢ를 처리하여 M. lipolyticus 27-A9 염색체의 shotgun 라이브러리를 구축하였다. DNA 단편을 pUC19-HindⅢ 벡터에 연결시키고, E. coli XL1-Blue에 형질전환 시켰다. 형질전환체를 ampicillin(100 μg/ml)을 포함하는 TBN-LB agar 배지에 도말하고 37℃에서 배양하여, 투명환을 형성하는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니로부터 재조합 플라스미드(pUCML)를 추출하고, 삽입 DNA 서열을 분석하였다. DNA, 아미노산 서열 분석 및 데이터베이스 검색에는 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 BLAST가 사용되었다. 다중 서열 정렬은 DNA STAR ClustalW 방법을 이용하여 수행되었다. 본 발명자들은 GenBank(accession number MG988389)에 서열 데이터를 제출했다.
TBN-LB agar 배지에 투명환을 형성하는 형질전환체를 선택하고, 재조합 플라스미드(pUCML)의 삽입 DNA(7,124bp) 서열을 분석한 결과를 도 1에 나타내었다. 서열 분석 결과, 삽입 DNA는 지방분해 효소의 open reading frame(ORF)을 가지고 있음이 밝혀졌다. ORF(lipA9)는 1,215bp로 구성되어 있으며, M. lipolyticus SM-19의 lipBL 유전자와 97% 상동성을 보였다. lipA9 유전자는 45,247Da의 분자량을 갖는 LipA9 단백질 및 LipBL과 5개의 아미노산 차이를 갖는 404개의 아미노산을 코딩한다. LipBL 효소는 이전에 발견되었지만, 상세한 특성은 아직 밝혀지지 않았다. LipA9의 1차 구조는 보존된 G-x-S-x-G 모티프에 상응하는 G-L-S321-V-G 서열 및 보존된 S-x-x-K 모티프에 상응하는 S72-M-T-K75 서열을 갖는다(도 2).
실시예 4: LipA9의 상동성 모델링 ( Homology modeling )
LipA9의 아미노산 서열을 SWISS-MODEL homology modeling 서버 (https://swissmodel.expasy.org)에 입력하여 상동성 모델링 연구를 진행하였다. 상동성 모델은 metagenome의 esterase EstU(PDB code: 4ivi)에 기초하여 구성되었다(Jeon, J. H., et al ., (2011). Novel metagenome-derived carboxylesterase that hydrolyzes β-lactam antibiotics. Applied and Environmental Microbiology, 77, 7830-7836.). LipA9와 EstU의 서열 동일성은 39.9%이다. 상동성 구조를 분석하기 전에 상동성 모델의 측쇄는 100 ps 동안 분자 역학 이후에 rms < 0.1 kcal mol-1 Å-1로 최소화되었다. 최소화 및 분자 역학은 SYBYL-X modeling package 2.1.1(Certara)을 이용하여 수행되었다. 효소의 원자 유형 평가를 위해 AMBER99 force field(Cornell, et al ., (1995) Second generation force field for the simulation of proteins, nucleic acids, and organic molecules. Journal of the American Chemical Society, 117, 5179-5197.)를 이용하였다. AMBER7 FF99 방법을 사용하여 효소에 대한 부분 전하를 계산하였다. 모든 계산에 8Å의 비결합 cutoff 거리 및 거리-의존 dielectric function가 사용되었다. 에너지 최소화는 Powell minimizer로 수행되었다. 에너지 최소화 모델은 ProSA, VERIFY 3D 및 ERRAT로 평가되었다.
LipA9가 VIII esterase family에 속하는 것을 BLAST search(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)를 통해 확인했다. 상기 family와의 서열 정렬(sequence alignment)에 의해 LipA9가 보존된 S-x-x-K 모티프로 S72-M-T-K75 서열을 갖는 것을 알 수 있다(도 3). 상기 모티프는 catalytic dyad(Ser-Lys)을 형성할 수 있다. 보존된 Ser72는 기질 에스테르 결합을 공격하는 촉매 잔기로서 작용하고, 보존된 Lys75는 촉매성 Ser의 hydroxyl기에 양성자 수용체 또는 공여체로서 작용함으로써 염기성 잔기로서 작용한다(Wagner, U. G., et al ., (2002). EstB from Burkholderia gladioli: a novel esterase with a beta-lactamase fold reveals steric factors to discriminate between esterolytic and beta-lactam cleaving activity. Protein Science, 11, 467-478.). LipA9는 또한 일반적인 가수분해 효소의 보존된 G-x-S-x-G 모티프에 상응하는 G319-L-S321-V-G333 서열을 갖는다. 그러나 상기 모티프의 Ser 잔기는 family VIII esterase의 촉매 활성에 작용하지 않는 것으로 밝혀졌다(Perez, D., et al ., (2012). Identification of amino acids involved in the hydrolytic activity of lipase LipBL from Marinobacter lipolyticus. Microbiology, 158, 2192-2203.)
일반적인 catalytic triad(Ser-His-Asp)에서 His는 염기성 잔기이며 aspartic acid와 수소 결합을 형성한다. 이는 회전을 제한하고, His 양전하를 안정화하여, His의 측쇄를 정렬시킴으로써, His와 Ser 사이의 양성자 교환을 돕는다(Stryer, L., et al ., (2002). Catalytic strategies. Biochemistry (5th ed.). San Francisco: W.H. Freeman. ISBN 0-7167-4955-6.). 그러나, catalytic dyad(Ser-Lys)에는 그러한 수소 결합이 없으며, Lys의 측쇄는 His와 같은 고리 구조가 아니므로, 질소 주변의 자유 수소는 Ser과의 수소 결합을 통해 양성자 교환을 방해할 수 있다. 따라서 본 발명자들은 catalytic dyad가 수소 결합을 통해 Lys 잔기를 안정화시키는 아미노산을 가지고 있다는 가설을 세웠다. LipA9의 3차원 구조 상동성 모델은 metagenome(PDB code: 4ivi)의 esterase EstU를 템플릿으로 사용하여 만들었다. 상동성 모델을 통해 LipA9가 3Å 거리 내에 위치시킴으로써 Lys75와 수소 결합할 수 있는 Tyr141 및 Tyr188을 갖는 것을 확인하였다(도 4).
ProSA(Wiederstein, M. and Sippl, M. J. (2007) ProSA-web: interactive web service for the recognition of errors in three-dimensional structures of proteins. Nucleic Acids Research, 35, W407-W410.), VERIFY 3D(L
Figure 112018099187131-pat00001
thy, R., et al., (1992) Assessment of protein models with three-dimensional profiles. Nature, 356, 83-85.) 및 ERRAT(Colovos, C. and Yeates, T. O. (1993) Verification of protein structures: patterns of nonbonded atomic interactions. Protein Science , 2, 1511-1519.)를 사용하여 생성된 모델을 평가하였다(표 1).
ProSA, VERIFY3D 및 ERRAT를 이용한 상동성 모델 평가
ProSA VERIFY 3D ERRAT
LipA9 model z-score compatibiliy score (%)a quality factor
-9.59 95.70% 83.679
aPercentage(%)는 평균3D-1D score = 0.2의 잔기를 의미한다. 80% 이상의 잔기가 3D-1D profile에서 scored = 0.2를 가져야 한다.
ProSA(Protein Structure Analysis)는 단백질 구조가 유사한 크기의 단백질에 대한 score 범위 내에 있는지를 추정하는 데 사용되는 z-score를 제공한다. 상동성 모델에 대한 ProSA 분석은 -9.59의 z-score값을 나타내며, 이는 유사한 크기를 갖는 단백질의 crystal 또는 NMR 구조에서 발견되는 z-score의 범위 내에 있다. 모델 전체 품질을 평가하기 위해 VERIFY 3D 프로그램을 사용하였다. VERIFY 3D 프로그램은 structural class를 assigning하여 잔기와 그들의 자체 아미노산 서열의 호환성을 분석한다. 상동성 모델의 VERIFY 3D 분석을 통해 모델의 95.7% 잔기가 평균 3D-1D score = 0.2인 것으로 나타났다. 이러한 결과는 모델이 서열-구조 호환성 측면에서 일관성을 나타냄을 의미한다. 또한 모델의 전반적인 품질을 평가하기 위해 ERRAT 분석도 수행되었다. 전체 quality factor가 70 이상인 구조는 신뢰성 있는 구조로 간주된다(Rouached, H. et al ., (2005) Structural and Functional Analysis of the C-terminal STAS (Sulfate Transporter and Anti-sigma Antagonist) Domain of the Arabidopsis thaliana Sulfate Transporter SULTR1.2. The Journal of Biological Chemistry , 280, 15976-15983.). ERRAT 분석에 따른 전체 quality factor는 83.679이며, 이는 모델 구조 잔기의 83.679%가 95% rejection limit 아래로 떨어짐을 의미한다. Rejection level의 잔기는 모델 구조의 표면에 위치한다.
실시예 5: 리파아제 유전자( lipA9 ) 발현
pUCML의 lipA9 유전자는 LipA9-F/LipA9-R 프라이머를 이용한 PCR로 증폭시켰다(표 2).
lipA9-특이적 프라이머
Sequence 5'→3' 서열번호 Tm(℃)
lipA9-F GATCATATGACGGAATCGAAACAGGTC 3 55.9
lipA9-R GATAAGCTTCTAGACCAACGCCCCATTCAC 4 59.8
T m은 프라이머의 융해 온도이며, 밑줄은 NdeI 및 HindⅢ의 engineered restriction 부분이다.
PCR 산물을 pGEM-T 벡터에 삽입하고, 재조합 플라스미드를 E. coli XL1-Blue에 형질전환시켰다. 재조합 플라스미드의 NdeI과 HindⅢ 절단에 의해 얻어진 lipA9 유전자를 pET22 벡터에 삽입하고, 재조합 플라스미드(pET22-lipA9)를 E. coli BL21(DE3)에 형질전환시켰다. 형질전환된 E. coli BL21(DE3)을 흡광도(OD600nm)가 0.5가 될 때까지 37℃에서 ampicillin(100㎍/ml)이 포함된 LB 배지에 배양하고, 0.01mM IPTG를 첨가하여 추가로 20℃에서 20시간 동안 배양하였다. 원심분리(12,000×g, 10분)로 배양된 세포를 모으고, 세포 펠렛을 50mM potassium phosphate(pH 8.0)에 현탁시켰다. 초음파 분쇄기로 세포를 파쇄하고 원심분리(12,000×g, 10분)하여, 세포 추출물(cell-free extract)을 얻었다.
실시예 6: LipA9의 분리 및 정제
LipA9의 생화학적 성질을 조사하기 위해, lipA9 유전자를 재조합 플라스미드(pET22-lipA9)에 sub cloning하여 T7 promoter 하에서 발현시켰다. SDS-PAGE 결과를 통해 LipA9가 분리되었음을 확인하였으며, 분리된 LipA9를 이용해서 효소특성 연구를 수행하였다.
대부분의 LipA9 효소는 수용성 형태로 발현되었으며(도 5의 lane 4), p-NPC 방법에 의한 세포 추출물(cell-free extracts)의 활성은 97.4U/mg이었다(표 3).
LipA9의 정제
Step Total protein(mg) Total activity(U) Specific activity(U/mg) Yield
(%)		 Purification fold
Cell-free extract 153 14,900 97.4 100 1
AIEC 23.3 13,500 579 90.6 5.95
GPC 5.58 5,050 905 33.9 9.29
LipA9의 기능적 발현은 TBN-지모 그람(zymogram) 분석(도 6)에 의해 확인되었다.
등전점(pI 6.19)에 기초하여 LipA9가 pH 7.7에서 음이온 교환 컬럼에 결합할 수 있을 것으로 예상했다. 0.2μm cellulose acetate syringe filter(Whatman, Maidstone, UK)를 통해 세포 추출물을 여과시킨 다음, 25mM Tris-HCl(pH 7.7)에서 Hitrap? Q FF anion exchange column(5ml, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)을 장착한 FPLC에 로딩하였다. 결합되지 않은 단백질을 용리시킨 후, 25mM Tris-HCl(pH 7.7) 버퍼를 0-0.5M NaCl의 선형 구배로 흘려 지방분해 활성을 갖는 분획을 수득하였다. 활성 분획은 579U/mg의 활성을 보였다.
활성 분획을 수집하여 centrifugal filtration apparatus(Vivaspin 2; GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) 로 농축시킨 뒤, gel permeation column(SuperoseTM 12 10/300 GL; GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)을 장착한 FPLC에 로딩하여 용출시켰다. SDS-PAGE는 LipA9가 균질하게 정제되었음을 보여 주었다(도 5의 lane 6). 정제된 LipA9는 905U/mg의 활성을 보였다(도 6). 정제 수율 및 fold는 각각 33.9% 및 9.29%이었다(표 3).
실시예 7: LipA9 CLEA ( LipA9 Cross - Linked Enzyme Aggregates )의 제조
세포 추출물에 ammonium sulfate를 30% 포화되도록 4℃에서 첨가하였다. 원심분리(12,000×g, 10분)를 통해 상층액을 수득하고, ammonium sulfate를 70% 포화되도록 첨가하였다. 침전된 단백질 용액에 가교제인 glutaraldehyde를 25mM의 최종 농도로 첨가하고, 혼합물을 4℃에서 20시간 동안 배양하여 응집된 단백질을 가교 결합시켰다. 원심분리 후, 상층액을 제거하고, 펠렛(LipA9CLEA)을 100mM phosphate buffer(pH 8.0)로 2회 세척하여 잔류 glutaraldehyde를 제거하였다. LipA9CLEA를 동일한 buffer로 현탁시키고, 4℃에서 보관하였다.
LipA9CLEA는 상기 설명된 바와 같이, ammonium sulfate 침전 후, glutaraldehyde cross-linking에 의해 제조되었다. LipA9CLEA의 활성은 116U/㎎이고, 고정화 수율은 33.8%이며, 활성 유지율은 40.3%이었다. 이러한 효소 활성의 감소는 침전시의 효소 손실과 기질의 공유 가교 결합(covalent cross-linking) 및 확산 제한에 따른 효소 불활성화와 관련된 것일 수 있다. 고정화된 효소 매트릭스의 경계층 부근의 기질 농도는 외부 확산 효과(external diffusion effect)에 의해 낮아진다. 또한 내부 확산 효과(internal diffusion effect)에 의해 효소 집합체 내부의 기질 농도도 낮아진다(Tischer, W. and Kasche, V. (1999). Immobilized enzymes: crystals or carriers? Trends in Biotechnology, 17, 326-335.).
LipA9는 404개의 아미노산 잔기 중 13개의 Lys(3.2%) 및 26개의 Arg 잔기(6.4%)를 가지므로, 고정화 수율 및 활성 유지는 다소 높은 것으로 보인다. LipA9의 상동성 모델에 따르면, 대부분의 Lys 및 Arg 잔기는 단백질 표면에 위치하므로, 이들은 가교 결합에 사용될 수 있다.
실시예 8: LipA9의 기질 특이성
LipA9의 기질 특이성을 확인하기 위해, p-NP acetate(C2), p-NP butyrate(C4), p-NP caproate(C6), p-NP caprylate(C8), p-NP caprate(C10) 및 p-NP laurate (C12)를 포함하는 다양한 탄소수의 p-NP esters를 기질로 이용하여 가수분해 활성을 측정하였다.
상이한 지방산 조성(TBN, TCN, 올리브 오일)을 갖는 triacylglycerol에 대한 LipA9의 기질 특이성을 pH-stat 방법을 사용하여 측정하였다. 1% 기질과 1% gum Arabic을 함유하는 기질 emulsion에 10mM NaOH 수용액을 첨가하여 pH를 8.0으로 조정하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 3분 동안 배양하고, 반응 시간 동안의 지방산 생성 속도를 718 Titrino pH titrator(Metrohm, Switzerland)로 측정하였다. 효소 활성 1 unit은 1분당 1μmol의 지방산을 생산하는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.
LipA9는 다양한 p-NP esters 및 triglycerides를 가수분해하였다. 그 중 p-NP caproate(C6)와 TBN이 가장 빠르게 가수분해되었다(도 7A 및 도 7B). 일반적으로 리파아제는 =8 carbon atoms의 acyl chain length를 갖는 triglyceride를 가수분해하는 반면, 카복실에스테라아제는 <8 carbon atoms의 acyl chain length를 가수분해한다(Jaeger, K. E., Dijkstra, B. E., and Reetz, M. T. (1999). Bacterial biocatalysts: molecular biology, three-dimensional structures, and biotechnological applications of lipases. Annual Review of Microbiology, 53, 315-351.). 이러한 특징에 따르면, LipA9는 단쇄 지방산에 대한 기질 선호도를 갖는 리파아제이다.
실시예 9: LipA9 , LipA9 CLEA 의 지질분해 활성 분석
LipA9 및 LipA9CLEA의 활성은 다양한 온도 및 pH에서 측정되었다. 반응 혼합물(1ml)은 10μl의 10mM p-NPC(p-nitrophenyl caproate dissolved in acetonitrile), 40μl 에탄올, 950μl의 50mM potassium phosphate buffer(pH 8.0) 및 적절한 양의 효소로 구성되었다. 반응 혼합물을 37℃에서 3분간 배양하고, 생성된 p-nitrophenol의 양을 OD405nm 측정을 통해 정량화 하였다(Han, J. Y. and Kim, H. K. (2011). Transesterification using the cross-linked enzyme aggregate of Photobacterium lipolyticum lipase M37. Journal of Microbiology and Biotechnology, 21, 1159-1165.). 효소 활성 1 unit은 1분당 1μmol의 p-nitrophenol을 생산하는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.
다양한 온도(10-80℃)에서 p-NPC 방법으로 효소 활성을 측정하여, LipA9 및 LipA9CLEA의 최적 온도를 결정하였다. 최적 pH를 확인하기 위해, 다음과 같은 buffer가 사용되었다: 50mM Glycine-HCl(pH 2.5-3.5), 50mM acetic acid/sodium acetate(pH 4.0-5.5), 50mM KH2PO4/K2HPO4(pH 6.0-8.0), 50mM Tris-HCl(pH 8.5), 50mM Na2CO3/NaHCO3(pH 9.0-10.5), 50mM NaHCO3/NaOH(pH 11.0) 및 50mM KCl/NaOH(pH 12.0-13.0). 기질로서 p-NP caprylate를 사용하고, 잔존 활성을 다양한 pH(6-10.5)에서 표준 조건 하에 측정하였다.
LipA9는 남극 해양 박테리아에서 분리되었지만, 70℃까지 활성이 증가하였다(도 7C). 활성화 에너지는 7.41 kcal mol-1로 계산되었는데, 이는 중온성(mesophilic) 효소와 유사하다(Kulakova, L., et al ., (2004). Cold-active esterase from Psychrobacter sp. Ant300: gene cloning, characterization, and the effects of Gly->Pro substitution near the active site on its catalytic activity and stability. Biochimica et Biophysica Acta, 1696, 59-65.). LipA9CLEA는 온도 프로파일에 대하여 매우 유사한 활성을 보였다.
LipA9는 pH 8.0에서 최대 활성을 보였다(도 7D). 효소 활성은 중성 pH 영역에서 급격히 감소하는 반면, pH 10.5까지 알칼리 pH 영역에서는 서서히 감소했다. LipA9CLEA는 알칼리성 pH에서 더 높은 활성을 보였다. 이는 LipA9가 알칼리성 효소이며, 가교 결합에 의한 고정화가 특히 알칼리성 pH 영역에서 효소 안정성을 증가시켰음을 나타낸다.
실시예 10: LipA9 , LipA9 CLEA 의 안정성에 대한 온도 및 pH의 영향
온도에 대한 안정성을 확인하기 위해, LipA9와 LipA9CLEA를 다양한 온도(10-70℃)에서 1시간 동안 배양하고 잔존 활성을 표준 조건 하에서 측정하였다. pH 안정성을 확인하기 위해, LipA9와 LipA9CLEA를 다양한 pH(2.5-13.0)에서 30분 동안 배양하고 잔존 활성을 표준 조건 하에서 측정하였다. 다음과 같은 buffer가 사용되었다: 50mM Glycine-HCl(pH 2.5-3.5), 50mM acetic acid/sodium acetate(pH 4.0-5.5), 50mM KH2PO4/K2HPO4(pH 6.0-8.0), 50mM Tris-HCl(pH 8.5), 50mM Na2CO3/NaHCO3(pH 9.0-10.5), 50mM NaHCO3/NaOH(pH 11.0) 및 50mM KCl/NaOH(pH 12.0-13.0). 기질로서 p-NP caprylate를 사용하고, 잔존 활성을 다양한 pH(6-10.5)에서 표준 조건 하에 측정하였다.
LipA9는 60℃까지 약 90%의 잔존 활성을 유지하였고, 70℃에서 거의 모든 활성을 잃은 반면, LipA9CLEA는 50℃ 이상에서 안정성이 감소하였다(도 7E). 효소가 가교 결합을 통해 고정화될 때 구조적 강성이 증가하기 때문에 열 안정성은 일반적으로 증가한다(Velasco-Lozano, S., et al., (2015). Cross-linked enzyme aggregated (CLEA) in enzyme improvement-a review. Biocatalysis, 1, 166-177.). 그러나 LipA9CLEA의 경우 구조적 강성은 증가하지만 열 안정성은 감소했다. 분자 내 비공유 결합의 수와 위치는 대부분의 단백질의 열 안정성을 결정하는 데 중요한 요소이다. 이와 관련하여, LipA9의 Lys 및 Arg 잔기 사이의 가교 결합은 분자 내 이온 결합의 일부를 방해하여, 열 안정성을 감소시킬 수 있다. 상동성 모델에 따르면, LipA9는 가교 결합 전에 약 14개의 이온 결합을 가지며, LipA9CLEA에서 일부는 가교 결합에 의해 파괴된 것으로 보인다.
LipA9 및 LipA9CLEA를 pH 2.5-13.0 및 25℃에서 30분 동안 배양하고, 잔존 활성을 p-NPC 분석으로 측정하였다. LipA9는 pH 5.0-10.0 사이에서 넓은 안정성을 보였으며, LipA9CLEA는 pH 12.0까지 알칼리성 pH에서 안정성이 향상되었다(도 7F).
실시예 11: LipA9 , LipA9 CLEA 및 CalB의 유기용매에 대한 안정성 비교
유기용매는 수소 결합과 소수성 상호 작용을 방해하여 단백질 변성(denaturation)을 일으킨다. 일반적으로 친수성 유기용매는 단백질 표면에서 물 분자를 제거하고 단백질 코어에 침투하기 때문에, 단백질 변성을 일으키기 쉽다(Kumar, A., Dhar, K., Kanwar, S. S., and Arora, P. K. (2016). Lipase catalysis in organic solvents: advantages and applications. Biological Procedures Online, 18, https://doi.org/10.1186/s12575-016-0033-2.). 저온성균(psychrophile)과 호염균(halophile)은 낮은 수분 활성 환경에 대한 생존 전략으로 안정한 효소를 가지고 있다.
LipA9 및 LipA9CLEA의 유기용매에 대한 안정성을 측정하고 CalB lipase(434U/mg protein)와 비교하기 위해, DMSO, methanol, acetonitrile, ethanol, acetone, 1, 2-dimethoxyethane, 2-propanol, propionitrile, 2-butanone, 1-butanol 및 diethyl ether를 사용하였다. LipA9, LipA9CLEA 및 CalB 효소의 단백질 농도는 각각 0.3, 7.4 및 0.3mg/ml이었다. 각 효소를 25℃에서 30분 동안 다양한 농도의 유기용매에 배양하고, 상대적 잔존 활성을 표준 조건 하에서 p-NPC 방법으로 측정하였다. 상기 3가지 효소를 30% 농도의 다양한 일반적인 유기용매(LogP range(-0.3 to 0.89))에서 배양한 후, 잔존 활성을 p-NPC 분석으로 측정하였다. 그 다음, 0-95% 농도의 일반적인 극성 유기용매(DMSO, 메탄올, 아세톤 및 2-프로판올)에서 배양하고 잔존 활성을 측정했다.
LipA9, LipA9CLEA 및 CalB는 30% 농도의 대부분의 유기용매에 대해 높은 안정성을 보였다(도 8A). 극성 유기용매의 경우, CalB는 최대 20% 메탄올, 30% 아세톤 및 2-프로판올에 대해 약 90%의 잔존 활성을 보였다(도 8D). 한편, LipA9는 최대 50% DMSO 및 메탄올, 70% 아세톤 및 2-프로판올에 대해 약 90%의 잔존 활성을 보였다(도 8B). 이는 남극 미생물로부터 분리된 LipA9가 유기용매 안정성이 높은 효소라는 것을 최초로 밝혀낸 것이다. LipA9CLEA는 LipA9와 비교하여 유기용매 안정성이 감소하였으나, CalB lipase 보다 높은 안정성을 보였다(도 8C).
실시예 12: LipA9 CLEA ( LipA9 Cross - Linked Enzyme Aggregates )의 회수
회수 실험은 LipA9CLEA를 사용하여 수행되었다. 첫 번째 반응에서 LipA9CLEA를 사용한 후 12,000×g에서 5분간 원심분리하여 회수하였다. 상층액을 제거하고, 펠렛을 50mM potassium phosphate buffer(pH 8.0)에 현탁하여 같은 부피로 하였다. LipA9CLEA를 두 번째 반응에 사용하고, 위 사이클을 반복하였다.
CLEA는 물과 유기용매에서 불용성 효소 응집체이다. 따라서 쉽게 부유시킬 수 있다. 이러한 특성으로 인해, 생체촉매로 사용할 수 있으며, 원심분리로 쉽게 회수할 수 있다. 효소 반응 후 LipA9CLEA를 회수하고, 잔존 활성을 측정하여 회수율을 측정하였다. 4회 반복 후, 잔존 활성은 약 50%로 관찰되었다. 보다 효율적인 산업적 적용을 위해서는 회수율 증가를 위한 CLEA 제조 공정 최적화가 필요하다.
실시예 13: Ser 72 , Lys 75 , Tyr 141 및 Tyr 188 의 위치-지정 돌연변이( Site -Directed Mutagenesis )
pfu DNA polymerase를 이용한 quick change PCR 방법(Agilent Technologies, California, USA)을 사용하여 S72A, K75H, Y141F, Y188F 및 Y141F-Y188F 변이체를 만들었다. 재조합 플라스미드(pET-22-lipA9)를 주형 DNA로, 상보적 돌연변이성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하였다(표 4).
lipA9-특이적 프라이머 및 상보적 돌연변이성 올리고뉴클레오타이드
Sequence 5'→3' 서열번호 Tm(℃)
lipA9-F GATCATATGACGGAATCGAAACAGGTC 3 55.9
lipA9-R GATAAGCTTCTAGACCAACGCCCCATTCAC 4 59.8
S72A-F GTGTTCCGCATTTATGCCATGACCAAGCCTATT 5 76.7
S72A-R AATAGGCTTGGTCATGGCATAAATGCGGAACAC 6 76.7
K75H-F CGCATTTATTCCATGACCCATCCTATTACGTCCATCGCC 7 79.0
K75H-R GGCGATGGACGTAATAGGATGGGTCATGGAATAAATGCG 8 79.0
Y141F-F ATGTCAGGCCTGACCTTTGGGTTCATGAACCGC 9 80.4
Y141F-R GCGGTTCATGAACCCAAAGGTCAGGCCTGACAT 10 80.4
Y188F-F GGTACCGCCTGGAACTTTTCGGTCAGCACGGAT 11 81.6
Y188F-R ATCCGTGCTGACCGAAAAGTTCCAGGCGGTACC 12 81.6
T m은 프라이머의 융해 온도이며, 밑줄은 NdeI 및 HindⅢ의 engineered restriction 부분이고, 굵은 글씨는 변이된 코돈에 해당하는 서열이다.
PCR 반응 후, 혼합물을 DpnI을 이용하여 제한효소로 분해하여 메틸화 주형 DNA를 제거한 후, E. coli XL10-Gold에 형질전환시켰다. 뉴클레오타이드 치환은 DNA sequencing에 의해 확인되었다.
S72A, K75H, Y141F, Y188F 및 Y141F-Y188F 돌연변이체를 위치-지정 돌연변이로 제조하고, 촉매 활성에 대한 보존된 Ser, Lys 및 Tyr 잔기의 역할을 결정하기 위해 효소 반응 속도론(enzyme kinetics)이 수행되었다(표 5).
야생형 LipA9 및 유도된 돌연변이체의 활성 및 동역학 파라미터의 비교
Constructs Relative activity (%)a K M (μM) k cat (s-1) k cat/K M
(s-1 μM-1)
Wild type 100 4.05±0.33 708±32.3 175
S72A <1 nd nd nd
K75H <1 nd nd nd
Y141F 22.1 5.43±0.2 155±1.51 28.5
Y188F <1 nd nd nd
Y141F-Y188F <1 nd nd nd
a는 표준 조건에서 p-NPC 분석에 의해 측정한 활성을 의미하며, nd는 측정되지 않음(not determined)을 의미한다.
S72A와 K75H는 이전 연구(Perez, D., et al ., (2012). Identification of amino acids involved in the hydrolytic activity of lipase LipBL from Marinobacter lipolyticus. Microbiology, 158, 2192-2203.)에서와 같이 아무런 활성도 보이지 않았다. Y188F 및 Y141F-Y188F는 완전히 활성을 상실한 반면, Y141F는 22.1%의 상대적 활성을 나타냈다. S-x-x-K 모티프를 갖는 family VIII esterase 및 class C β-lactamase에 대한 이전 연구들에 의해 Tyr188과 같은 잔기가 Lys75와 같은 양성자 수용체 또는 공여자로서 작용할 수 있다고 보고되었다(Oefner, C., et al ., (1990). Refined crystal structure of beta-lactamase from Citrobacter freundii indicates a mechanism for beta-lactam hydrolysis. Nature, 343, 284-288.). 즉, Tyr188과 Ser72의 수소 결합은 촉매 활성에 필수적이며, Ser72 잔기를 안정화시켜3차 구조에서 Lys75와 양성자 교환을 가능하게 하는 위치를 만든다. Human kidney type glutaminase(KGA)는 family VIII esterase와 동일한 S-x-x-K 모티프를 가지고 있다(Thangavelu, K., et al., (2012). Structural basis for the allosteric inhibitory mechanism of human kidney-type glutaminase (KGA) and its regulation by Raf-Mek-Erk signaling in cancer cell metabolism. Proceedings of National Academy of Sciences USA, 109, 7705-7710.). 이 경우, Tyr188과 같은 잔기는 catalytic Ser과 수소 결합을 형성하지만, catalytic Lys과는 수소 결합을 형성하지 않는다. Lys, Ser 및 Tyr 사이의 3개의 수소 결합이 모두 촉매 활성에 필수적이라면 KGA는 가수분해 활성을 나타내지 않을 것이다. 따라서, Lys과 Tyr 사이의 수소 결합은 촉매 활성을 보조하지만, Ser과 Tyr 사이의 수소 결합은 촉매 활성에 필수적이다.
Tyr188과 같은 잔기는 모든 family VIII esterase에 존재하지만, Tyr141과 같은 잔기는 몇몇 family VIII esterase에 존재하지 않는다. A. globiformis의 EstAg와 M. tuberculosis의 LipL에는 Tyr141에 상응하는 것이 없다. Tyr141과 같은 잔기는 EstAg과 LipL의 촉매 활성에 절대적으로 필수적인 것은 아니기 때문에, 진화 과정에서 제거될 수 있다고 추정한다. Tyr188은 촉매 활성에 절대적으로 필수적이므로, LipA9는 catalytic dyad(Ser-Lys) 대신 catalytic triad(Lys-Ser-Tyr)를 갖는 효소임을 시사한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 생물자원센터 KCTC13607BP 20180802
<110> Korea Institute of Ocean Science and Technology <120> Lipase from Marinobacter lipolyticus <130> P18-B179 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 404 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Marinobacter lipolyticus LipA9 <400> 1 Met Thr Glu Ser Lys Gln Val Thr Gly Leu Ser Ser Gly His Leu Thr 1 5 10 15 His Ile Glu Asp His Leu Asp Arg Arg Tyr Ile Gln Pro Gly Lys Leu 20 25 30 Pro Gly Ala Leu Thr Leu Val Ala Arg Arg Gly Glu Ile Ala Tyr Leu 35 40 45 Lys Ala Gln Gly Leu Met Asp Val Glu Arg Asn Lys Pro Val Cys Arg 50 55 60 Asp Thr Val Phe Arg Ile Tyr Ser Met Thr Lys Pro Ile Thr Ser Ile 65 70 75 80 Ala Met Met Gln Leu Tyr Glu Gln Gly Arg Phe Leu Leu Asp Asp Pro 85 90 95 Val His Lys Tyr Ile Pro Ala Trp Lys Asn Leu Arg Val Tyr Asn Ser 100 105 110 Gly Val Tyr Pro Asn Phe Leu Thr Thr Pro Ala Thr Ser Thr Met Thr 115 120 125 Ile Arg Asp Leu Phe Thr His Met Ser Gly Leu Thr Tyr Gly Phe Met 130 135 140 Asn Arg Thr Asn Val Asp Ala Ala Tyr Arg Glu Leu Lys Leu Asp Gly 145 150 155 160 Ser Arg Asn Leu Thr Leu Glu Ala Leu Val Gly His Leu Ala Glu Leu 165 170 175 Pro Leu Glu Phe Ser Pro Gly Thr Ala Trp Asn Tyr Ser Val Ser Thr 180 185 190 Asp Val Leu Gly Tyr Leu Val Gln Leu Leu Ala Asp Gln Pro Phe Asp 195 200 205 Glu Tyr Leu Arg Glu His Ile Phe Glu Pro Leu Ala Met Ser Asp Thr 210 215 220 Gly Phe His Val Arg Asp Asp Gln Leu Asp Arg Phe Ala Ala Cys Tyr 225 230 235 240 Gln Tyr Asp Pro Val Asp Gln Phe Lys Leu Gln Asp Asp Pro Gln Thr 245 250 255 Ser Pro Phe Arg Asp Lys Arg Arg Phe Leu Ser Gly Gly Gly Gly Leu 260 265 270 Val Ser Thr Ile Asp Asp Tyr Phe His Phe Ala Gln Ala Leu Cys Gln 275 280 285 Gly Gly Glu Phe Gly Gly Arg Arg Ile Ile Gly Arg Lys Thr Leu Glu 290 295 300 Phe Met Arg Arg Asn His Leu Pro Gly Asn Gln Asp Leu Pro Gly Leu 305 310 315 320 Ser Val Gly Pro Phe Ser Glu Thr Pro Tyr Ala Gly Thr Gly Phe Gly 325 330 335 Leu Gly Phe Ser Val Lys Thr Asp Val Ala Lys Ser Gln Ile Asn Gly 340 345 350 Ser Val Gly Glu Tyr Gly Trp Gly Gly Leu Ala Ser Thr Asn Phe Ile 355 360 365 Ile Asp Pro Val Glu Glu Leu Val Val Ile Phe Met Thr Gln Leu Ile 370 375 380 Pro Ser Ser Thr Tyr Pro Ile Arg Gln Glu Leu Arg Ala Ile Val Asn 385 390 395 400 Gly Ala Leu Val <210> 2 <211> 1215 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Marinobacter lipolyticus LipA9 <400> 2 atgacggaat cgaaacaggt caccggcctt tcatcaggcc accttactca cattgaagac 60 catcttgacc gccgctatat ccagccgggg aaattgcccg gggcgctgac tctggtggcc 120 cgacgtgggg aaattgccta tctgaaagct caggggctga tggatgtgga gcgcaacaag 180 ccggtctgcc gggatacggt gttccgcatt tattccatga ccaagcctat tacgtccatc 240 gccatgatgc agctctatga gcaggggcgg tttttgctgg atgatccggt acacaagtac 300 attccggcct ggaagaacct gcgggtttac aacagtggtg tctatcccaa cttcctgacc 360 acacctgcaa ccagcaccat gaccattcgc gacctgttca cccacatgtc aggcctgacc 420 tatgggttca tgaaccgcac caacgttgac gccgcctatc gggagctgaa gctggatggc 480 agccggaatc tgacactgga agcgctggtc ggtcatctgg cggaactgcc gctggagttc 540 tcaccgggta ccgcctggaa ctattcggtc agcacggatg tgctggggta tctggtgcag 600 ttgctggctg atcagccgtt tgatgagtat ctgcgcgagc atatctttga accattggcc 660 atgtccgaca ccggcttcca tgttcgtgac gatcagctcg accgtttcgc cgcctgctat 720 cagtacgatc cggtcgacca gttcaagctg caggacgatc cgcagacctc ccctttccgg 780 gacaaaagga ggtttctgtc tggtggcggc gggctggttt ccaccattga cgattatttc 840 cactttgccc aggcactctg tcagggtggc gagtttggcg ggcggcggat tattggccga 900 aagactctgg aattcatgcg tcgcaatcat ctacccggca atcaggacct gcctggcctt 960 tccgtcggtc cgttcagcga aacaccttat gccgggaccg gcttcgggct gggcttttcg 1020 gtaaagactg acgtcgccaa atcccagatc aacggctcgg tcggcgagta tggttggggt 1080 ggcctggcca gcaccaactt tattatcgat ccggtggagg aactggtggt gattttcatg 1140 acgcaactga tcccctcctc gacctacccg atccgtcagg aattgcgggc gattgtgaat 1200 ggggcgttgg tctag 1215 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipA9-F primer <400> 3 gatcatatga cggaatcgaa acaggtc 27 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipA9-R primer <400> 4 gataagcttc tagaccaacg ccccattcac 30 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S72A-F primer <400> 5 gtgttccgca tttatgccat gaccaagcct att 33 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S72A-R primer <400> 6 aataggcttg gtcatggcat aaatgcggaa cac 33 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K75H-F primer <400> 7 cgcatttatt ccatgaccca tcctattacg tccatcgcc 39 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K75H-R primer <400> 8 ggcgatggac gtaataggat gggtcatgga ataaatgcg 39 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y141F-F primer <400> 9 atgtcaggcc tgacctttgg gttcatgaac cgc 33 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y141F-R primer <400> 10 gcggttcatg aacccaaagg tcaggcctga cat 33 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y188F-F primer <400> 11 ggtaccgcct ggaacttttc ggtcagcacg gat 33 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y188F-R primer <400> 12 atccgtgctg accgaaaagt tccaggcggt acc 33

Claims (9)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 마리노박터 리포리티쿠스(Marinobacter lipolyticus) 27-A9 유래 지질분해효소(lipase).
  2. 삭제
  3. 제1항의 지질분해효소(lipase)를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 유전자.
  4. 삭제
  5. 제3항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  6. 제3항의 유전자 또는 제5항의 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  8. 제6항의 재조합 미생물을 배양하여 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 지질분해효소를 발현시키는 단계; 및 상기 발현된 지질분해효소를 회수하는 단계를 포함하는 지질분해효소의 제조방법.
  9. 제1항의 지질분해효소를 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)와 혼합하여 가교결합시킨 고정화된 지질분해효소.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20100131075A (ko) * 2009-06-05 2010-12-15 가톨릭대학교 산학협력단 생물학적 촉매를 고정화하는 방법 및 이의 응용

Patent Citations (1)

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