KR100354655B1 - 광학이성질체에 반응특이성을 지니는 신규의 바실러스푸밀러스(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ) 균주 ＢＲ060(ＫＣＣＭ 10184)와 이로부터 생산된 리파제, 이 리파제를코딩하는 ＤＮＡ로 형질전환시킨 대장균(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ) ｐＵＢＬ (ＫＣＣＭ10185) 및 그의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 광학이성질체에 반응특이성을 지니는 신규의 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus)BR060 균주 (KCCM 10184)와 이로부터 생산된 리파제, 이 리파제를 코딩하는 DNA로 형질전환시킨 대장균(Escherichia coli) pUBL (KCCM 10185) 및 그의 이용에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 광학활성 피리도 벤즈옥사진 유도체의 제조방법과 관련하여 (±)-9-할로게노-3-메틸-10(4-메틸-1-피페라지닐)-7-옥소-2,3-디히드로-7H-피리도〔1, 2, 3-데〕〔1, 4〕-벤즈옥사진-6-카르복실산 에스터의 에스터 부분을 효소적으로 비대칭가수분해하여 광학이성질체의 우(+)회전체나 좌(-)회전체를 제조하는데 유용하게 사용될 수 있는 반응특이성 리파제를 개발하기 위하여, 토양에 분포하는 균주 중 반응특이성이 우수한 균주를 선별한 후 동정하여 얻은 신균주 바실러스 푸밀러스 BR060 및 이로부터 리파제 유전자를 탐색, 클로닝하여 반응특이성 리파제를 암호화하고 있는 염기서열을 밝히고, 이를 보다 효율적 및 경제적으로 얻기 위하여 리파제-코딩 DNA를 이용하여 형질전환시킨Escherichia colipUBL (KCCM 10185)에 관한 것이다. 따라서, 이러한 본 발명에 따르면, (-)-9-할로게노-3-메틸-10(4-메틸-1-피페라지닐)-7-옥소-2,3-디히드로-7H-피리도〔1, 2, 3-데〕〔1, 4〕-벤즈옥사진-6-카르복실산을 보다 경제적이면서도 효율적으로 제조할 수 있는 효과가 있다.

Description

광학이성질체에 반응특이성을 지니는 신규의 바실러스 푸밀러스(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ) 균주 ＢＲ060 (ＫＣＣＭ 10184)와 이로부터 생산된 리파제, 이 리파제를 코딩하는 ＤＮＡ로 형질전환시킨 대장균 (Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ) ｐＵＢＬ (ＫＣＣＭ 10185) 및 그의 이용 {Novel Bacillus pumilus BR060 (KCCM 10184) with the particular reactivity to optical isomers and use thereof, lipase produced therefrom, Escherichia coli pUBL (KCCM 10185) transformed by DNA coding the lipase and use thereof}

본 발명은 광학이성질체에 반응특이성을 지니는 신규의 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus)균주 BR060(KCCM 10184)와 이로부터 생산된 리파제, 이 리파제를 코딩하는 DNA로 형질전환시킨 대장균(Eschrichia coli) pUBL(KCCM 10185) 및 그의 이용에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 광학활성 피리도 벤즈옥사진 유도체의 제조방법과 관련하여 (±)-9-할로게노-3-메틸-10(4-메틸-1-피페라지닐)-7-옥소-2,3-디히드로-7H-피리도〔1, 2, 3-데〕〔1, 4〕-벤즈옥사진-6-카르복실산 에스터의 에스터 부분을 효소적으로 비대칭가수분해하여 광학이성질체의 우(+)회전체나 좌(-)회전체를 제조하는데 유용하게 사용될 수 있는 반응특이성 신균주 바실러스 푸밀러스 BR060과 이로부터 생산된 리파제을 개발하고, 이를 보다 효율적 및 경제적으로 얻기 위하여 리파제-코딩 DNA를 이용하여 형질전환시킨 대장균(Eschrichia coli) pUBL(KCCM 10185)에 관한 것이다.

최근 생명공학의 발전과 더불어 식품, 의약품 및 섬유산업에 이르기까지 효소의 이용분야 뿐만 아니라 효소자원의 수요 또한 급격히 증가하고 있으며, 따라서다양한 생물로부터 새로운 많은 효소가 발견되고 있다. 그 중, 리파제는 에벨(Eberle; 1834)과 버나드(Bernard; 1856)에 의해서 췌장으로부터 처음 발견되었고, 그 후 아밀라제 및 프로타제와 함께 3대 소화효소로 널리 사용되어 왔으며, 의학, 생리학 및 효소생화학 등의 분야에서 폭넓게 연구되어 왔다. 리파제(EC 3.1.1.3, triacylglycerol acylhydrolase)의 생체내 주기능은 여러 가지 지방질의 가수분해이지만, 반응기에서의 효소반응 조건에 따라서, 그 역반응인 에스터 합성반응과 트랜스에스터화 반응 등을 촉매하는 특성을 갖고 있다. 현재까지 많은 종류의 리파제가 동물, 식물, 곰팡이 그리고 세균으로부터 발견되었는데, 그 중에서도 미생물(곰팡이 및 세균)이 생산하는 리파제가 다양한 기질 특이성, 내열성, 내알칼리성, 유기용매내성, 그리고 입체특이성 등의 특성을 갖고 있는 것으로 밝혀져서 산업적으로 널리 이용되고 있다. 그러나, 이 중 바실러스 리파제는 현재까지 주로 유화학(oleo-chemistry)과 낙농(dairy-based)산업에 이용되어 주로 세정제, 세제 및 표백제의 성분으로 사용하기 위한 것으로서 그 이용 범위가 한정되어 있었으며(특허공고 93-0700647), 이들의 광학활성 기질에 대한 선택적 반응특이성에 대한 능력은 검증된 바 없었다. 최근, 리파제에 대한 관심은 이들 효소를 생물공학적으로 다양하게 접목시키는 분야에 관심이 고조되고 있으며, 특히 생물의약분야에서 생체촉매로서 널리 활용되면서 그 중요성이 부각되고 있다.

이러한 생물의약분야 중에서 특히, 우수한 합성 항생제인 (±)-9-할로게노-3-메틸-10(4-메틸-1-피페라지닐)-7-옥소-2,3-디히드로-7H-피리도〔1, 2, 3-데〕〔1, 4〕-벤즈옥사진-6-카르복실산은 3 위치에 비대칭 탄소원자를 갖고 있는라세믹 화합물에의 응용이 연구되고 있다. 이 라세믹 화합물 중 좌회전성 이성질체는 항균력이 높을 뿐 아니라 물에 용해성이 높아 주사제로도 사용 가능성이 있는 등 그 효용성이 (±)-9-할로게노-3-메틸-10(4-메틸-1-피페라지닐)-7-옥소-2,3-디히드로-7H-피리도〔1, 2, 3-데〕〔1, 4〕-벤즈옥사진-6-카르복실산보다 뛰어난 항생제이다. 그런데, 이러한 광학이성질체의 제조방법으로서는 라세믹 중간체를 고압액체크로마토그래피(HPLC)로 분할하거나 광학분할제를 이용하여 분할하는 방법 등이 있었으나 이들 방법은 분리정제 공정의 복잡성과 환경오염 물질의 다량 배출 및 제조상의 비 효율성으로 인한 생산단가의 상승등의 문제점을 지니고 있었다.

따라서, 이러한 문제점을 해결하기 위한 환경친화적이고 효과적인 제조 방법으로서 (±)-9-할로게노-3-메틸 -10(4-메틸-1-피페라지닐)-7-옥소-2,3-디히드로-7H-피리도〔1, 2, 3-데〕〔1, 4〕-벤즈옥사진-6-카르복실산 에스터를 원료로 생체 촉매인 효소를 이용한 이성체 분할을 통한 생물전환방법이 개발되었다(출원번호 99-7183). 즉, (±)- 에스터를 리파제를 이용한 선택적 분해과정을 통해 9-할로게노-3-메틸-10(4-메틸-1-피페라지닐)-7-옥소 -2,3-디히드로-7H-피리도〔1, 2, 3-데〕〔1, 4〕-벤즈옥사진-6-카르복실산의 좌(-)회전성 이성질체만을 제조하는 것이다. 이 과정에서 좌(-)회전성 이성질체의 에스터 부분만 선택적으로 분해하는 것이 9-할로게노-3-메틸-10(4-메틸-1-피페라지닐)-7-옥소-2,3-디히드로-7H-피리도〔1, 2, 3-데〕〔1, 4〕-벤즈옥사진-6-카르복실산의 좌회전성 이성질체를 경제적이면서 효율적으로 생산하는데 가장 중요한 요소이며, 따라서 이 단계에 사용될 수 있는효소로서 생산비용이 저렴하며 광학이성질체에 대한 선택성과 반응성이 우수한 리파제의 확보가 절실히 요구된다.

산업적 이용을 위한 효소의 개발 생산에는 미생물이 주로 이용되고 있으며, 그 이유는 비교적 생장속도가 빨라 짧은 시간내에 값싼 원료배지로써 목적으로 하는 효소의 생산효율을 높일 수 있고, 또한 배양기법의 응용에 따라서는 다양한 변이 균주의 개발이 가능하여 효소를 대량으로 생산할 수 있기 때문이다.

따라서, 앞으로 생물전환방법을 이용하여 광학활성 피리도 벤즈옥사진 유도체를 제조하기 위해서는 기질에 대한 우수한 광학선택성과 반응성을 갖는 새로운 세균성 리파제의 개발 필요성이 지대한 실정이었다.

이에, 본 발명자들은 광학활성 피리도 벤즈옥사진 유도체의 제조방법과 관련하여 (±)-9-할로게노-3-메틸-10(4-메틸-1-피페라지닐)-7-옥소-2,3-디히드로-7H-피리도〔1, 2, 3-데〕〔1, 4〕-벤즈옥사진-6-카르복실산 에스터의 에스터 부분을 효소적으로 비대칭가수분해하여 광학이성질체의 좌(-)회전체 또는 우(+)회전체의 한쪽 형태만을 정제하는 데 효과적으로 이용될 수 있는 균주 및 효소를 개발하기 위하여 토양 미생물로부터 기질에 선택성을 지닌 리파제를 생산하는 데 가장 적합한 균주로 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) BR060균을 분리 동정하였으며, 이 균주로부터 기질에 선택성을 지닌 리파제 및 이를 보다 효율적이고 경제적으로 생산하기 위하여 이를 코딩하는 유전자를 탐색하여 대장균에 클로닝함으로써 본 발명을완성하였다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 신규 미생물 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) BR060(KCCM 10184)를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 균주로부터 생산되는 리파제를 코딩하는 하기의 서열 번호 1로 표시되는 DNA 염기서열을 포함한다.

그리고, 본 발명은 하기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 리파제를 포함한다.

또한, 본 발명은 하기의 서열 번호 1로 표시되는 DNA 염기서열을 포함하는 플라스미드 pUBL과 이를 이용해 형질전환된 재조합 대장균(Echerichia coli) pUBL을 포함한다.

마지막으로, 본 발명은 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus)BR060 또는 제 5 항의 대장균(E. coli) pUBL의 배양액을 이용하여 (±)-9-할로게노-3-메틸-10(4-메틸-1-피페라지닐)-7-옥소-2,3-디히드로-7H-피리도〔1, 2, 3-데〕〔1, 4〕-벤즈옥사진-6-카르복실산 에스터의 에스터 부분을 효소적으로 비대칭 가수분해하는 과정을 포함하는 광학활성 피리도 벤즈옥사진 유도체의 제조방법을 포함한다.

도 1은 신균주 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus)BR060의 게놈 DNA를 이용한 중합효소 연쇄반응 생성물을 0.8% 아가로스겔에 전기영동한 사진이고,

도 2는 신균주 바실러스 푸밀러스 BR060로부터 생산된 리파제를 포함한 플라스미드 pUBL의 유전자지도이다.

도 3은 리파제의 열 안정성 곡선이고,

도 4는 리파제의 pH 안정성 곡선이다.

* 도면 부호의 설명 *

1 : 1Kb의 ladder 표지(marker)

2-4 : 신균주 바실러스 푸밀러스 BR060의 게놈 DNA를 이용한 중합효소 연쇄반응 생성물

552 : 중합효소 연쇄반응 생성물의 염기수를 각각 나타낸다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 광학이성질체를 갖는 광학활성 피리도 벤즈옥사진 유도체의 제조방법과 관련하여 (±)-9-할로게노-3-메틸-10(4-메틸-1-피페라지닐)-7-옥소-2,3-디히드로-7H-피리도〔1, 2, 3-데〕〔1, 4〕-벤즈옥사진-6-카르복실산 에스터의 에스터 부분을 효소적으로 비대칭 가수분해하는 리파제를 갖고 있는 신규균주의 탐색 뿐만 아니라 동시에 상기 균주로부터 리파제를 코딩하는 유전자를 찾아내어 대장균에 형질전환시킴으로써 이를 효율적이고 경제적으로 얻을 수 있는 균주에 관한 것이다.

이를 단계별로 설명하면 다음과 같다.

[바실러스 푸밀러스 BR060의 탐색]

본 실험에서 사용한 균주는 퀴놀론계 항생제의 종류인 오플록사신을 에스터 화합물로 만들어 이를 기질로 이용하여 반응을 살핀 다음 동정하였다. 오플록사신의 에스터 화합물에 관한 제조 방법은 이미 널리 알려진 방법으로 특허 99-7183에 따랐다.

토양미생물로부터 분리된 각 균주들은 최소액체배지에 각각 접종하고, 30℃에서 1일간 배양한 후에 원심분리하여 상등액을 제거한 다음 균체를 기질에 넣어, 30℃에서 250rpm으로 흔들어주며 8일간 반응시켰다. 이때, 기질은 50 mM 소디움-인산 완충액(pH6.8)에 넣어 현탁시킨 후 100 ㎕씩 사용하였다. 균주에 기질에 광학선택성을 지니는 리파제의 포함여부에 대한 반응을 확인하는 방법으로는 박층크로마토그래피를 사용하였다. 즉, 효소가 작용하여 에스터부분을 가수분해시키면 그 생성물이 기질인 오플록사신 에스터화합물보다 이동거리가 짧다는 원리를 이용하였다. 박층크로마토그래피의 용매로는 클로로포름 : 메탄올 : 14% 암모니아수 =10 : 5 : 1 의 비율로 사용되었다. 시료는 각 균주의 반응액으로부터 30 ㎕씩을 취하여 메탄올을 동량 섞어 기질을 용해시킨 후 원심분리하여 상등액의 2 ㎕씩만을 박층크로마토그래피에 적용하여 254 nm의 자외부 흡수로 검출 분석하였다. 이 결과, 몇가지 균주에서 오플록사신의 에스터화합물의 에스터가 가수분해된 생성물이 생겼으며 이들을 선택하여 고압액체크로마토그래피로 각 균주에서 나온 효소들이 광학선택성을 갖고 있는지를 확인하였다. 시료는 각 균주의 반응액으로부터 30 ㎕씩을 채취하여 메탄올을 동량 섞어 기질을 용해시킨 후 원심분리하여 상등액의 10 ㎕씩만을 고압액체크로마토그래피에 적용하였다. 고압액체크로마토그래피의 이동상 용매로는 0.01 M L-이소루이신과 0.005 M 황산구리가 용해된 수용액/메틸알콜 비가 6/1 용적비이고, 컬럼은 실리카겔 C18, 5 ㎛, 4.6×250 mm을 사용하였고, 용매흐름속도 1.0 ml/min, 검출은 330 nm의 자외부 흡수로 분석할 때 좌(-)회전성체의 머무름 시간이 우(+)회전성체보다 빠른 원리를 이용하여 확인하였다. 이 결과 나타난 면적비로 볼 때 좌(-)회전성체 : 우(+)회전성체 = 9 : 1로 80%의 ee값을 갖고 있는 균주가 확인되었으며, 이 균주를 BR060이라 명칭하였다.

하기 표 1 에서 토양미생물의 (±)-9-할로게노-3-메틸-10(4-메틸-1-피페라지닐)-7-옥소-2,3-디히드로-7H-피리도〔1, 2, 3-데〕〔1, 4〕-벤즈옥사진-6-카르복실산 에스터에 대한 반응 특이성을 나타내었다.

[동정 및 명명]

동정한 균주 BR060을 분석하기 위하여 생명공학연구소에 의뢰한 결과 다음과 같다.

1) API 키트(kit) : 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus)와 99.9%의 높은 상동성을 나타내었다.

2) 균체지방산 조성의 분석 : 이소-C15:0(62.12%), ante이소-C15:0 (18.73%)가 주요 성분으로 검출되었으며, 이는Bacillus속의 주요 특징과 일치하였다.

3) 16S rDNA 서열(sequencing) :Bacillus pumilus의 표준균주와 99.7%의 높은 상동성을 나타내었다.

따라서 현재 세균 분류학 분야에서 DNA-DNA상동성이 종수준의 동정에서 가장중요한 기준이 되지만, 현재의 결과 분석으로부터 BR060을 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus)로 동정하여도 큰 무리가 없을 것이라는 결론을 얻었다.

상기의 바실러스 푸밀러스 BR060은, 2000년 4월 6일 한국종균협회 산하 미생물보존센타(Korean Culture Center of Microorganisms; KCCM)에 기탁하였다(KCCM 10184).

[BR060으로부터의 리파제(BL) 탐색 및 클로닝]

(1) BR060의 게놈 DNA 정제

BR060 균주를 하룻밤 동안 50 ml LB배지에서 액체 배양하여 퀴아젠사 의 게노믹 팁(Qiagen Genomic-tips)를 사용하여 퀴아젠사의 방법에 따라 정제하였다.

(2) 시발체(primer)의 결정

리파제(BL)의 서브클로닝에 사용될 시발체의 설계는, 지금까지 염기 서열이 알려진 바실러스 푸밀러스의 염기서열을 참조하여, 다음과 같이 설계하였다(서열번호 3, 서열번호 4).

5-l(순방향시발체);

5’-CAT-ATG-GCT-GAG-CAT-AAT-CCG-GTT- 3’

3-l(역방향시발체);

5’-TTA-ATT-CGT-ATT-TTG-TCC-TCC-GCC- 3’

(3) 리파제(BL) 코딩 유전자의 증폭

정제된 게놈 DNA를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 주형 40 ng에 10X 반응 완충액(500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8.3, 15 mM MgSO4) 5 ㎕, dNTP 200 μM, 서열 번호 3 과 서열 번호 4 에 나타난 상기의 시발체(5-l, 3-l) 각각 0.2 μM, Vent중합효소 2.5 U(promega사)를 넣고 멸균된 증류수를 가하여 95℃에서 1분, 58℃에서 1분, 72℃에서 1분씩 30회 반응을 수행하였다. 그런 다음, 중합효소 연쇄반응물을 0.8% 아가로스겔에서 전기영동한 결과 도 1에 나타낸 바와 같이 552bp의 주된 생성물을 확인할 수 있었다.

(4) 리파제(BL) 코딩 유전자의 서브클로닝

상기에서 증폭된 중합효소 반응을 서브클로닝하기 위해 0.8% 아가로즈겔에서 전기영동한 후 진클린(Geneclean)키트(BIO 101, U.S.A)를 사용하여 용출하였다. 즉 겔로부터 분리하고 6몰 NaI용액을 가하여 55℃에서 5분간 겔을 녹인 후, 여기에 10 ㎕ 글래스 밀크(Glass milk)를 넣어 상온에서 10분간 비드에 DNA를 흡착시켰다. 12,000rpm에서 원심분리한 후, 결과된 침전물을 회수하고 400 ㎕ 완충액으로 3회 세척한 후 멸균된 증류수 10 ㎕를 넣어 상온에서 5분간 방치시킨 후 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 DNA는 전기영동하여 DNA농도를 확인하였다. 이때, 클로닝 벡터는 pUC18/smaⅠ-벡터(amershampharmacia사)를 사용하였다.

상기에서 준비된 DNA와 클로닝 벡터를 라이게이션(ligation)하기 위하여 반응산물을 콤피턴트 세포(대장균 Top10 : invitrogen사) 50 ㎕ 와 섞어서 얼음에서30분간 정치시키고, 42℃에서 40초간 열처리하여 벡터를 콤피턴트 세포내로 삽입한 후, LB배지 400 ㎕를 가하여 37℃에서 1시간 배양하였다.

(5) 서브클로닝 균주의 선별

알파-컴플리멘테이션(α-complementation)에 의한 흰색 콜로니를 선별하기 위하여 0.1 M IPTG(Isopropyl-thio-β-D-galactosidase)용액 20 ㎕와 X-gal 용액 30 ㎕를 섞어서 엠피실린이 50 ㎍/㎖ 함유된 LB플레이트에 도말하여 37℃에서 16시간 배양하였다. 이들 콜로니로부터 클론을 확인하기 위해 배양된 플레이트로부터 흰색 콜로니를 선별하여 멸균된 증류수 30 ㎕에 넣어 현탁(suspension)하였다. 현탁된 콜로니 용액을 주형으로 하여 주형 10 ㎕에 10X 반응 완충액 (500 mM KCL, 100 mM Tris-HCL, pH 8.3, 15 mM MgCl2) 5 ㎕, dNTP 200 μM, 상기한 시발체(3-l)와 pUC vector에 함유되어 있는 M13 서열의 시발체를 각각 0.2 μM, Taq중합효소 2.5 U(promega사)를 넣고 멸균된 증류수를 가하여 95℃에서 2분간 미리 세포를 완전히 깬 다음, 95℃에서 1분, 58℃에서 1분, 72℃에서 1분씩 30회 반응을 수행하였다. 그런 다음, 중합효소 연쇄반응물을 0.8% 아가로스겔에서 전기영동한 결과 도 1 에 나타낸 바와 같이 552bp의 생성물을 만든 콜로니를 확인하여 현탁된 콜로니용액을 LB 배지에 엠피실린(Ampicillin)을 넣고 접종하여 하룻밤 배양한 후 세포를 저장하고 DNA를 정제하였다. DNA의 정제는 퀴아젠(Qiagen)사의 컬럼을 사용하였다.

(6) 재조합균주 pUBL의 광학활성 피리도 벤즈옥사진 유도체에 대한 활성

재조합균주 pUBL을 최소액체배지에 각각 접종하고, 37℃에서 1일간 배양한 후에 원심분리하여 상등액을 12시간 반응시켰다. 이때, 기질광학활성 피리도 벤즈옥사진 유도체인 (±)-9-할로게노-3-메틸-10(4-메틸-1-피페라지닐)-7-옥소-2,3-디히드로-7H-피리도〔1, 2, 3-데〕〔1, 4〕-벤즈옥사진-6-카르복실산 에스터는 0.1%의 농도로 50 mM 소디움-인산 완충액(pH 6.8)에 넣어 현탁시킨 후 100 ㎕씩 사용하였다. 광학선택성의 반응여부는 고압액체크로마토그래피로 확인하였다. 시료는 pUBL균주의 반응액으로부터 30 ㎕씩을 채취하여 메탄올을 동량 섞어 기질을 용해시킨 후 원심분리하여 상등액의 10 ㎕만을 고압액체크로마토그래피에 적용하였다. 고압액체크로마토그래피의 이동상 용매로는 0.01 M L-이소루이신과 0.005 M 황산구리가 용해된 수용액/메틸알콜 비가 6/1 용적비이고, 컬럼은 실리카겔 C18, 5 ㎛, 4.6×250 mm을 사용하였고, 용매흐름속도 1.0 ml/min, 검출은 330 nm의 자외부 흡수로 분석할 때 좌회전성(-)체의 머무름 시간이 우회전성(+)체보다 빠른 원리를 이용하여 확인하였다. 이 결과 나타난 에스터의 가수분해가 일어난 피크(peak)를 면적비로 고려할 때 좌(-)회전성체 : 우(+)회전성체 = 9 : 1로 야생형(wild type)BR060과 같은 80%의 ee(enantiomeric excess)값을 갖고 있음이 확인되었으며 반응시간은 약 200배정도 빨라졌음을 알 수 있었다. 따라서 재조합 균주 pUBL은 토양미생물에서 탐색된 신균주 바실러스 푸밀러스 BR060으로부터 생산된 광학활성 피리도 벤즈옥사진 유도체의 제조방법과 관련하여 (±)-9-할로게노-3-메틸-10(4-메틸-1-피페라지닐)-7-옥소-2,3-디히드로-7H-피리도〔1, 2, 3-데〕〔1, 4〕-벤즈옥사진-6-카르복실산 에스터의 에스터 부분을 비대칭가수분해하는 리파제를 포함하는 것으로 확인되었으며 기존에 밝혀진 여러 가지 효소보다 월등히 우수한 반응성 및 선택성을 지니는 것으로 확인되었다. 이를 하기 (표 2)에 나타내었다.

상기의 클로닝한 대장균(Escherichia coli) pUBL은, 상기의 바실러스 푸밀러스 BR060 과 함께 2000년 4월 6일 한국종균협회 산하 미생물보존센타(Korean Culture Center of Microorganisms; KCCM)(KCCM 10185)에 기탁하였다.

(7) 효소 활성의 측정

ρ-니트로페닐부틸레이트(pNPB; sigma사)용액을 기질로 사용하였으며, 10 mM의 농도로 아세토니트릴에 넣은 보존용액을 만들고, 실험시에 보존용액: 에탄올: 50 mM 완충용액(pH7.0)을 1 : 4 : 95 의 비율로 잘 섞은 다음 효소균체 반응액을 넣어 약 3분간 방치시킨 후 405 nm의 자외선 흡수부를 통하여 효소의 활성을 검출하였다. 효소균체 반응액은 LB배지에서 하룻밤 동안 액체 배양한 액을 원심분리하여 침전 시킨 후 침전 된 세포만을 넣어 각 pH와 온도별로 반응시켰다.

pH :기질용액에 대하여 각 pH 반응별로 제조하고 pUBL의 동일한 균체량을 37℃에서 30분씩 반응시킨 후 측정한 결과, 기질에 대해 pH 6.8- 12.7의 범위에서 높은 안정성을 나타내었다.

온도-효소용액을 최적 pH 조건에서 제조한 기질용액에 대해 반응온도별 (반응온도 20℃-65℃, 간격 5℃)로 30분씩 반응시켜 생성물의 양을 측정한 결과 20-50℃의 온도 범위에서 높은 안정성을 나타내었다.

(8) 핵산염기서열

상기의 균주로 부터 생산되는 리파제를 코딩하는 DNA 염기 서열 및 이에 대한 정보는 다음과 같다. (서열번호 1)

서열의 길이 : 552

서열의 타입 : 핵산

쇄의 수 : 2본쇄

토폴로지 : 선형

분자의 타입 : genomic DNA

기원

생물명 : 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus)

서열

CATATGGCTG AGCATAATCC GGTTGTGATG GTACACGGCA TTGGCGGTGC CTCTTATAAC 60

TTTTTTTCTA TTAAAAGTTA TTTGGTTGGA CAAGGCTGGG ATCGAAACCA ATTATATGCT 120

ATCGATTTCA TAGACAAAAC AGGAAATAAC CGCAACAATG GTCCGCGTCT ATCCAGATTC 180

GTCAAAGATG TGTTAGACAA AACGGGTGCC AAAAAAGTAG ATATTGTGGC TCATAGTATG 240

GGCGGAGCGA ACACATTATA CTATATTAAG AATCTAGATG GCGGCGATAA AATTGAAAAC 300

GTTGTCACAA TTGGTGGAGC AAACGGACTC GTTTCAAGCA GAGCATTACC AGGCACAGAT 360

CCAAATCAAA AAATTCTTTA CACATCTGTC TACAGCTCAG CTGATCTCAT CGTCGTCAAC 420

AGCCTCTCTC GTTTAATTGG CGCAAGAAAC GTTCTGATCC ATGGCGTTGG CCATATCGGT 480

CTATTAACCT CAAGCCAAGT GAAAGGCTAC ATTAAAGAAG GACTGAACGG CGGAGGACAG 540

AATACGAATT AA 552

상기 DNA 서열로부터 유추된 아미노산 서열(서열번호 2)은 하기와 같다.

CAT ATG GCT GAG CAT AAT CCG GTT GTG ATG GTA CAC GGC ATT GGC GGT

1

His Met Ala Glu His Asn Pro Val Val Met Val His Gly Ile Gly Gly

-1 1 5 10

GCC TCT TAT AAC TTT TTT TCT ATT AAA AGT TAT TTG GTT GGA CAA GGC

49

Ala Ser Tyr Asn Phe Phe Ser Ile Lys Ser Tyr Leu Val Gly Gln Gly

15 20 25 30

TGG GAT CGA AAC CAA TTA TAT GCT ATC GAT TTC ATA GAC AAA ACA GGA

97

Trp Asp Arg Asn Gln Leu Tyr Ala Ile Asp Phe Ile Asp Lys Thr Gly

35 40 45

AAT AAC CGC AAC AAT GGT CCG CGT CTA TCC AGA TTC GTC AAA GAT GTG

145

Asn Asn Arg Asn Asn Gly Pro Arg Leu Ser Arg Phe Val Lys Asp Val

50 55 60

TTA GAC AAA ACG GGT GCC AAA AAA GTA GAT ATT GTG GCT CAT AGT ATG

193

Leu Asp Lys Thr Gly Ala Lys Lys Val Asp Ile Val Ala His Ser Met

65 70 75

GGC GGA GCG AAC ACA TTA TAC TAT ATT AAG AAT CTA GAT GGC GGC GAT

241

Gly Gly Ala Asn Thr Leu Tyr Tyr Ile Lys Asn Leu Asp Gly Gly Asp

80 85 90

AAA ATT GAA AAC GTT GTC ACA ATT GGT GGA GCA AAC GGA CTC GTT TCA

289

Lys Ile Glu Asn Val Val Thr Ile Gly Gly Ala Asn Gly Leu Val Ser

95 100 105 110

AGC AGA GCA TTA CCA GGC ACA GAT CCA AAT CAA AAA ATT CTT TAC ACA

337

Ser Arg Ala Leu Pro Gly Thr Asp Pro Asn Gln Lys Ile Leu Tyr Thr

115 120 125

TCT GTC TAC AGC TCA GCT GAT CTC ATC GTC GTC AAC AGC CTC TCT CGT

385

Ser Val Tyr Ser Ser Ala Asp Leu Ile Val Val Asn Ser Leu Ser Arg

130 135 140

TTA ATT GGC GCA AGA AAC GTT CTG ATC CAT GGC GTT GGC CAT ATC GGT

433

Leu Ile Gly Ala Arg Asn Val Leu Ile His Gly Val Gly His Ile Gly

145 150 155

CTA TTA ACC TCA AGC CAA GTG AAA GGC TAC ATT AAA GAA GGA CTG AAC

481

Leu Leu Thr Ser Ser Gln Val Lys Gly Tyr Ile Lys Glu Gly Leu Asn

160 165 170

GGC GGA GGA CAG AAT ACG AAT TAA

529

Gly Gly Gly Gln Asn Thr Asn

175 180

〔pUBL 재조합균주의 활성 〕

(±)-9-할로게노-3-메틸-10(4-메틸-1-피페라지닐)-7-옥소-2,3-디히드로-7H-피리도〔1, 2, 3-데〕〔1, 4〕-벤즈옥사진-6-카르복실산 2 g을 100 ml의 무수노르말부탄올에 넣고, 2ml의 진한황산을 첨가한 뒤, 120℃로 가열하여 2시간동안 환류반응을 하였다. 반응액을 냉각시킨 후 100 ml의 염화메틸렌과 100 ml의 탈이온수를 넣은 다음 2 N-가성소다 용액으로 중성화 한 후 층분리하고 다시 수층을 100 ml의 염화메틸렌으로 추출후 유기층을 모아 무수망초로 탈수한 후 감압농축하여 목적물을 고상의 잔사로 얻었다. 10 ml의 노르말 헥산을 가하여 결정화 한 후 여과하여 결정을 모은 후 40℃에서 하룻밤 건조하여 (±)-9-할로게노-3-메틸-10(4-메틸-1-피페라지닐)-7-옥소-2,3-디히드로-7H-피리도〔1, 2, 3-데〕〔1, 4〕-벤즈옥사진-6-카르복실산 부틸에스터 2.22g을 얻었다(참조: 대한민국 특허출원제 99-7183호). 이상에서 제조된 (±)-9-할로게노-3-메틸-10(4-메틸-1-피페라지닐)-7-옥소-2,3-디히드로-7H-피리도〔1, 2, 3-데〕〔1, 4〕-벤즈옥사진-6-카르복실산 부틸에스터 2.2 g을 0.1%의 농도로 50 mM 소디움-인산 완충액(pH6.8)에 현탁시킨 후 하룻밤 배양된 pUBL 재조합균주의 세포를 원심분리하여 침전시킨 것을 적정량 넣어 하룻밤동안 37℃에서 250rpm으로 흔들어주며 반응시켰다. 박층크로마토그래피로 에스터의 분해여부를 확인하였으며, 생성물이 기질의 남은 양과 비교해 거의 반반이 되었음을 확인하였다. 그런 다음, 암모니아수로 반응액을 pH 9.5의 약알칼리로 조절한 다음 200 ml의 초산에틸로 2회 추출하여 미반응의 9-할로게노-3-메틸-10(4-메틸-1-피페라지닐)-7-옥소-2,3-디히드로-7H-피리도〔1, 2, 3-데〕〔1, 4〕-벤즈옥사진-6-카르복실산 부틸에스터를 제거한 다음 수층을 염산으로 중성화하고 250 ml의 클로로포름으로 2회 추출하였다. 클로로포름의 무수망초로 탈수한 다음 감압농축하여 결정을 얻은 후 얻어진 결정에 100 ml의 이소프로필 알코올을 넣어 가열한 다음 서냉하여 실온에서 3시간 교반한 다음 결정을 여과하여 (+)라세미체를 분리하고, 여액만 모아 농축한 다음 디에틸에테르를 가하여 재결정화한 후 여과하여 결정을 모은 뒤, 건조시켜 0.7 g의 (-)-9-할로게노-3-메틸-10(4-메틸-1-피페라지닐)-7-옥소-2,3-디히드로-7H-피리도〔1, 2, 3-데〕〔1, 4〕-벤즈옥사진-6-카르복실산을 얻었다. 그 결과, 수율은 약 70%였다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 광학활성 피리도 벤즈옥사진 유도체에 대하여 선택성과 반응성이 높은 세균성 리파제와 이를 생산하는 신균주 바실러스 푸밀러스 BR060 및 이 리파제를 암호화하고 있는 유전자를 이용해 이를 대량 생산 할 수 있도록 형질전환시킨Eschrichia colipUBL을 제공함으로써, (-)-9-할로게노-3-메틸-10(4-메틸-1-피페라지닐)-7-옥소-2,3-디히드로-7H-피리도〔1, 2, 3-데〕〔1, 4〕-벤즈옥사진-6-카르복실산을 보다 경제적이면서도 효율적일 뿐만 아니라, 환경친화적인 방법으로 제조할 수 있는 효과가 있다.

Claims (6)

1. 리파제를 생산하는 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) BR060.
2. 서열번호 1에 기재된 상기 제 1 항의 리파제-코딩 DNA.
3. 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 상기 제 1 항의 리파제.
4. 제 2 항의 리파제-코딩 DNA를 함유한 발현 재조합 벡터 플라스미드 pUBL.
5. 제 4 항의 발현 재조합 벡터 pUBL로 형질전환된 대장균(Escherichia coli) pUBL.
6. 제 1 항의 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) BR060 또는 제 5 항의 대장균(Escherichia coli) pUBL을 이용하여 (±)-9-할로게노-3-메틸-10(4-메틸-1-피페라지닐)-7-옥소-2,3-디히드로-7H-피리도〔1, 2, 3-데〕〔1, 4〕-벤즈옥사진-6-카르복실산 에스터의 에스터 부분을 효소적으로 비대칭 가수분해하는 과정을 포함하는 광학활성 피리도 벤즈옥사진 유도체의 제조방법.