KR101940647B1 - 신규 라이신 디카르복실라제 및 이를 이용하여 카다베린을 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 라이신 디카르복실라제, 당해 활성을 코딩하는 유전자로 형질전환된 미생물 및 이를 이용하여 카다베린을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규 라이신 디카르복실라제 및 이를 이용하여 카다베린을 생산하는 방법{The novel Lysine Decarboxylase and Process for producing cadeverine using the same}

본 발명은 신규 라이신 디카르복실라제, 당해 활성을 코딩하는 유전자로 형질전환된 미생물 및 이를 이용하여 카다베린을 생산하는 방법에 관한 것이다.

다이아민 (diamine)을 이용한 나일론의 일반적인 생산 방법은 1,4-다이아미노부탄 (1,4-diaminobutane)과 헥사메틸렌다이아민 (hexamethylenediamine)을 원료로 하는 화학적 공정에 의한다. 이 원료 물질들은 석유기반 유기화합물로부터 만들어지기 때문에 환경 규제가 강화되면서 생물 기반 경로를 통한 대체물질에 대한 시장 요구가 커지고 있다.

한편 카다베린은 NH₂(CH₂)₅NH₂의 분자식을 가지는 5개의 탄소로 구성된 다이아민 (diamine) 유기화합물로, 나일론 5,6의 원료 물질이 될 수 있다. 바이오 기반의 카다베린을 제조한다면, 생물 기반의 시장 요구를 만족시키면서 다양한 나일론 생산이 가능할 것으로 예상된다.

카다베린의 바이오 기반 생산과 관련하여, 라이신을 생전환시키는 연구는 1940년대 이전에 널리 알려졌다 (Gale E.F., Epps H.M. 1944. Studies on bacterial amino-acid decarboxylases. Biochem J. 38, 232-242). 생전환의 핵심 단계인 라이신 디카르복실라제는 라이신으로부터 카다베린을 생성시키는 효소이다 (도 1). 다양한 미생물에서 라이신 디카르복실라제의 활성이 보고된 바 있으며, 효소의 특이적 활성 (specific activity, mmol/min/mg)이 알려진 라이신 디카르복실라제는 4종 (대장균(Escherichia coli), 박테리움 카다베리스(Bacterium cadaveris), 글리신 맥스(Glycine max), 셀레노모나스 루미난티움(Selenomonas ruminantium))이다. 이 중 대장균 유래의 라이신 디카르복실라제가 가장 높은 활성을 보이는 라이신 디카르복실라제로 평가되며, 실제 생산에 활용되는 효소도 대장균 유래 CadA에 국한되어 있다 (일본특허 제2005-147171호, 유럽특허 제2004-010711호, 및 일본특허 제2002-257374호). 그러나 라이신 디카르복실라제를 라이신에 반응시켜 카다베린을 생성하는 경우, 라이신의 탈탄산에 의해 이산화탄소가 발생하고, 1가의 양이온인 라이신으로부터 2가의 양이온인 카다베린이 생성됨으로 인해, 반응 중에 pH가 상승한다. 이에 따라 상기 라이신 디카르복실라제는 효소 반응 진행시에 pH가 변화함에 따라, 효율이 저하되는 문제점이 나타난다. 또한, 반응 용액 중에 생성된 산, 또는 염기에 의해 효소가 변성되어 활성을 상실할 수도 있다.

이에 본 발명자들은 고온 및 pH에 대한 안정성을 가지는 신규 라이신 디카르복실라제를 발굴하고 당해 라이신 디카르복실라제가 에스케리키아 속 균주에서 발현 가능함을 확인하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 신규 라이신 디카르복실라제 및 당해 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 라이신 디카르복실라제를 발현하도록 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 효소 및 이를 포함하는 미생물을 이용하여 카다베린을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 구체적인 일 양태에서, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 75% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는, 신규 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질을 제공한다.

본 발명에서 용어 "라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase) 활성을 가지는 단백질"은 피리독살-5'-인산(pyridoxal-5'-phosphate)을 보조효소로 이용하여 라이신의 탈카복실화 반응을 촉매함으로써, 라이신을 탈탄산시켜 카다베린(cadaverine)과 이산화탄소를 생성할 수 있는 활성을 갖는 단백질을 의미한다.

상기 서열번호 1 또는 이와 75% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질은 슈도모나스 속 유래의 미생물로부터 신규 발굴한 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질일 수 있으며, 당해 활성을 가지는 단백질이라면 슈도모나스 속 유래 미생물로부터 발굴한 미생물은 모두 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 슈도모나스 속 균주는 슈도모나스 써모톨러란스 (Pseuodomonas thermotolerans), 슈도모나스 알칼리제네스 (Pseuodomonas alcaligenes), 슈도모나스 레지노보란스 (Pseuodomonas resinovorans), 슈도모나스 푸티다 (Pseuodomonas putida), 및 슈도모나스 신싼싸 (Pseuodomonas synxantha) 일 수 있다.

구체적으로 슈도모나스 써모톨러란스 미생물 유래의 신규 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 서열 상동성이 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상인 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 슈도모나스 알칼리제네스 균주 유래의 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 서열 상동성이 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상인 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 슈도모나스 레지노보란스 균주 유래의 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이와 서열 상동성이 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상인 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 슈도모나스 푸티다 균주 유래의 라이신 디카르복실라제는 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 이와 서열 상동성이 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상인 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 슈도모나스 신싼싸 균주 유래의 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이와 서열 상동성이 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상인 아미노산 서열을 가질 수 있다. 그러나 상기의 아미노산 서열에 한정되는 것은 아니며, 라이신 디카르복실라제 활성을 유지하는 한 가능한 아미노산 서열을 모두 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 구체적인 일 양태에서, 상기 신규 발굴한 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 구체적으로는 서열번호 2의 염기 서열과 75% 이상의 서열 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 공개된 슈도모나스 속 유래의 균주의 게놈 서열로부터 얻을 수 있다. 구체적으로 슈도모나스 써모톨러란스 슈도모나스 알칼리제네스, 슈도모나스 레지노보란스, 슈도모나스 푸티다 (Pseuodomonas putida), 및 슈도모나스 신싼싸로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균주의 게놈 서열에서 유래할 수 있다. 상기 슈도모나스 써모톨러란스 균주 유래의 라이신 디카르복실라제 유전자 서열은 서열번호 2의 염기 서열을 가질 수 있으며, 또한 서열번호 2의 염기 서열과 상동성이 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상인 염기 서열을 가질 수 있다. 상기 슈도모나스 알칼리제네스 균주 유래의 라이신 디카르복실라제 유전자 서열은 서열번호 4의 염기 서열을 가질 수 있으며, 또한 서열번호 4의 염기 서열과 상동성이 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상인 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 슈도모나스 레지노보란스 균주 유래의 라이신 디카르복실라제 유전자 서열은 공개된 슈도모나스 레지노보란스의 게놈 서열로부터 얻을 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 6의 염기 서열을 가질 수 있다. 또한 서열번호 6의 염기 서열과 상동성이 75%이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상인 염기 서열을 가질 수 있다. 상기 슈도모나스 푸티다 균주 유래의 라이신 디카르복실라제 유전자 서열은 서열번호 8의 염기 서열을 가질 수 있으며, 또한 서열번호 8의 염기 서열과 상동성이 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상인 염기 서열을 가질 수 있다. 상기 슈도모나스 신싼싸 균주 유래의 L-라이신 디카르복실라제 유전자 서열은 서열번호 10의 염기 서열을 가질 수 있으며, 또한 서열번호 10의 염기 서열과 상동성이 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상인 염기 서열을 가질 수 있다. 그러나 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 신규 발굴한 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질을 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드라면 제한 없이 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0를 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다 (예. Sambrook et al., 1989, infra 참고).

더욱 구체적으로는 상기 라이신 디카르복실라제는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또한, 상기 L-라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 및 서열번호 10의 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 슈도모나스 속 균주들 유래의 라이신 디카르복실라제는 높은 pH에서도 활성 변화가 크게 일어나지 않아 pH 변화에 안정성을 갖는 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 구체적인 일 양태에서, 상기 신규 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질을 발현하도록 형질전환된 미생물을 제공한다. 상기 형질전환된 미생물은 당해 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질이 발현되도록 형질전환이 된다면 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함한다. 예를 들면, 에스케리키아 (Escherichia) 속, 어위니아 (Erwinia) 속, 세라티아 (Serratia) 속, 프로비덴시아 (Providencia) 속, 코리네형 미생물 균주가 포함될 수 있다. 상기 미생물은 구체적으로 에스케리키아 속 또는 코리네박테리움 속에 속하는 미생물일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 대장균 또는 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한 상기 형질전환된 미생물의 모균주는 야생형에 비하여 향상된 라이신 생산능을 가지는 미생물일 수 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 용어 "야생형에 비하여 향상된 라이신 생산능을 가지는 미생물"이란, 천연 상태의 미생물 또는 모균주 대비 라이신의 생산능이 증가된 미생물을 의미하는데, 상기 라이신 생산능이 향상된 미생물은 모균주 대비 라이신 생산능이 향상된 미생물이라면 특별히 제한되지 않는다.

상기와 같이 야생형에 비하여 향상된 라이신 생산능을 부여하기 위해, 영양요구성 돌연변이주, 유사체에 내성을 갖는 균주 또는 라이신을 생산하는 능력을 갖는 대사 제어 돌연변이주를 수득하는 방법 및 라이신 생합성 효소 활성을 증가시킨 재조합 균주를 생산하는 방법과 같은 미생물을 생육하는 통상적인 방법을 사용할 수 있다. 라이신 생산 미생물의 생육시, 영양요구성, 유사체 내성 및 대사 제어 돌연변이와 같은 특성은 단독으로 또는 조합하여 부여될 수 있다. 증가시킨 라이신 생합성 효소 활성은 단독이거나 조합적일 수 있다. 추가로, 영양요구성, 유사체 내성 및 대사 제어 돌연변이와 같은 특성을 부여하면서 라이신 생합성 효소 활성을 함께 증가시킬 수도 있다. 구체적으로, 라이신 생합성 효소를 암호화하는 유전자는 디하이드로다이피콜리네이트 신타제 유전자(dapA), 아스파르토키나제 유전자(lysC), 디하이드로다이피콜리네이트 환원효소 유전자(dapB), 디아미노피멜레이트 탈탄산효소 유전자(lysA), 디아미노피멜레이트 탈수소효소 유전자(ddh), 포스포에놀피루브산 카복실라제 유전자(ppc, 아스파르테이트 아미노전이효소 유전자(aspC), 및 아스파르트산 세미알데하이드 탈수소효소 유전자(asd) 등의 효소를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 라이신 생합성 효소 활성을 증가시킴으로써 라이신을 생산하는 능력을 부여 또는 증가시키는 방법은 당해 효소를 암호화하는 유전자에 돌연변이를 유도하거나 당해 유전자를 증폭시켜 효소의 세포내 활성을 증가시킴으로써 수행될 수 있다. 이들은 유전자 재조합에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 야생형에 비하여 향상된 라이신 생산능을 가지는 미생물이라면 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함할 수 있다. 구체적으로 에스케리키아 속 미생물 또는 코리네형 미생물일 수 있다. 상기 에스케리키아 미생물은 대장균(Escherichia coli), 에스케리키아 알베르티(Escherichia albertii), 에스케리키아 블라태(Escherichia blattae), 에스케리키아 퍼구소니 (Escherichia fergusonii), 에스케리키아 헤르만니(Escherichia hermannii) 또는 에스케리아 불너리스(Escherichia vulneris)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 더욱 구체적으로는 상기 에스케리키아 속 균주는 대장균일 수 있다. 상기 코리네형 미생물은 코리네박테리움(Corynebacterium) 또는 브레비박테리움(Brevibacterium) 속의 미생물을 포함한다. 또한 상기 코리네형 미생물은 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토페르멘툼 (Brevibacterium lactofermentum)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

미생물이 상기 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질을 발현하도록 형질전환되기 위해, 본 발명의 라이신 디카르복실라제 유전자가 형질전환의 목적이 되는 미생물 내에 라이신 디카르복실라제 단백질 또는 유전자 발현단위로 포함될 수 있다. 상기 라이신 디카르복실라제의 유전자 발현단위는 벡터에 작동가능하게 연결되어 상기 미생물에 형질전환되어 포함되거나 상기 미생물의 염색체 내에 삽입되는 것 일 수 있다. 구체적으로, 상기 라이신 디카르복실라제 유전자가 개시코돈의 상류에 연결된 프로모터에 의해 과발현되도록 작동가능하게 연결되는 것일 수 있다.

본 발명에서, 용어 "발현단위"는 프로모터와 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 단편을 의미하며, 이에 3'-UTL, 5'-UTL, poly A tail 등이 추가로 포함될 수도 있다. 본 발명에서 용어 "발현단위"는 "발현카세트"와 혼용될 수 있다.

본 발명에서, 용어 “작동가능하게 연결”이란 라이신 디카르복실라제를 암호화하는 유전자의 전사를 개시 및 매개하도록, 상기 유전자 서열과 프로모터 활성을 갖는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 이는 프로모터 활성을 갖는 핵산 서열이 라이신 디카르복실라제 유전자와 작동가능하게 연결되어, 상기 라이신 디카르복실라제 유전자의 전사 활성을 조절할 수 있음을 의미하는 것이다.

본 발명에서 용어 "형질전환"은 상기 슈도모나스 속 균주에서 유래된 라이신 디카르복실라제 유전자를 숙주세포, 구체적으로 에스케리키아 속 균주 또는 코리네형 미생물 내로 도입하여 상기 숙주세포 내에서 발현될 수 있도록 하는 전반적인 행위를 의미한다. 이때, 상기 라이신 디카르복실라제 유전자는 라이신 디카르복실라제를 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드로서 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 유전자는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 상기 유전자의 발현에 필요한 모든 요소(element)를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포 내로 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 전사종결 신호, 리보좀 결합 부위 및 번역 종결 신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터의 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포로 도입되어, 숙주세포의 발현에 필요한 서열과 작동가능하게 연결되는 것일 수도 있다. 상기 재조합 벡터는 숙주세포에 DNA를 도입하여 단백질을 발현시키기 위한 수단으로서, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 등 공지의 발현 벡터를 사용할 수 있다. 상기 벡터는 DNA 재조합 기술을 이용한 임의의 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

상기 형질전환의 방법은 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 어떠한 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 그 예로, 일렉트로포레이션 (electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전 (calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염 (retroviral infection), 미세주입법 (microinjection), DEAE-덱스트란 (DEAE-dextran), 양이온 리포좀 (cationic liposome) 법 등이 있고, 이로 제한되지 않는다.

일 구체예에서 향상된 라이신 생산능을 가지는 미생물이 본 발명의 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질을 발현하도록 형질전환됨으로써, 우수한 카다베린 생산능을 가질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체적인 일 양태는 카다베린을 생산하기 위한 신규 라이신 디카르복실라제, 또는 신규 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질을 발현하도록 형질전환된 미생물의 용도를 제공한다.

상기 신규 라이신 디카르복실라제 및 상기 신규 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질을 발현하도록 형질전환된 미생물은 각각 상기한 바와 같다. 일 구체예에서 본 발명의 라이신 디카르복실라제는 온도 또는 pH의 변화에 대해서 종래 카다베린의 생산에 이용되었던 대장균 유래의 라이신 디카르복실라제보다 더 안정성이 높은 것을 확인하였다. 특히 본 발명의 신규 라이신 디카르복실라제는 pH 안정성이 대장균 유래의 라이신 디카르복실라제보다 상대적으로 높아, 라이신으로부터 카다베린으로의 전환 반응에서 유리하다. 따라서 본 발명의 신규 라이신 디카르복실라제 및 상기 신규 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질을 발현하도록 형질전환된 미생물은 카다베린의 생산에 활용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 카다베린 제조방법을 제공한다.

본 발명의 카다베린 제조방법의 구체적인 일 양태는 신규 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질 또는 상기 활성을 가지는 단백질을 발현하도록 형질전환된 미생물을 이용하여 라이신으로부터 카다베린으로 전환하는 단계; 및 상기 전환된 카다베린을 회수하는 단계를 포함하는 카다베린의 제조방법이다.

상기 신규 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질 및 상기 형질전환된 미생물은 각각 상기한 바와 같다. 상기 형질전환된 미생물은 구체적으로 에스케리키아속 미생물일 수 있다.

상기 라이신을 카다베린으로 전환하는 단계는 신규 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질을 발현하는 미생물로부터 추출하여 정제된 효소를 이용하여 라이신을 탈탄산시킴으로써 카다베린을 생산할 수 있다. 또는 상기 형질전환된 미생물을 배양한 배지에 라이신을 첨가함으로써 미생물 자체를 이용하여 라이신을 탈탄산시킴으로써 카다베린으로 전환시킬 수 있다.

또한 본 발명의 카다베린 제조방법의 또 다른 구체적인 일 양태는 야생형에 비하여 향상된 라이신 생산능을 가지는 미생물이 신규 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질이 발현되도록 형질전환된 카다베린 생산능을 가지는 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 미생물 또는 배지에서 카다베린을 회수하는 단계를 포함하는 카다베린의 제조방법을 제공한다.

상기 신규 L-라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질 및 상기 야생형에 비하여 향상된 라이신 생산능을 가지는 미생물은 각각 상기한 바와 같다.

상기 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 미생물에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식, 유가식, 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.

구체적인 예로, 상기 탄소원은 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으며, 구체적으로는 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 질소원은, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으며, 상기 예는 예시일 뿐 이에 한정되지 않는다.

또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배지에 적절한 방식으로 첨가하여 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양액 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양액의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 예를 들면 25℃ 내지 40℃일 수 있다. 배양기간은 원하는 라이신 디카르복실라제의 생성량이 얻어질 때까지 지속될 수 있으며, 예를 들면 10 내지 160 시간일 수 있다.

상기 카다베린을 회수하는 방법은, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지로부터 생산된 카다베린을 수집 또는 회수할 수 있다. 또한 이러한 회수 방법에는, 원심분리, 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배지를 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온 교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

또한 상기 카다베린의 제조방법은 상기 미생물 또는 배지로부터 라이신 디카르복실라제를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 미생물 또는 배지로부터 라이신 디카르복실라제를 회수하는 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 미생물 또는 배지로부터 생산된 라이신 디카르복실라제를 수집 또는 회수할 수 있다. 또한 이러한 회수 방법에는, 원심분리, 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온 교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다. 또한 배지 중 미생물을 파괴하여 얻은 세포 분쇄액(cell lysate)로부터 라이신 디카르복실라제을 회수할 수 있다. 상기 세포 분쇄액은 당해 분야에 공지된 적절한 방법을 이용하여 얻을 수 있다. 예를 들면 물리적인 분쇄기나, 적절한 상업적으로 입수가능한 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer)를 이용할 수 있다. 이러한 세포 분쇄액로부터 원심분리 등 적절한 당해 분야에서 공지된 방법을 통해 라이신 디카르복실라제를 회수할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 슈도모나스(Psuedomonas) 속 균주 유래의 신규 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질은 pH 상승 변화에도 안정된 활성을 가질 수 있어, 라이신으로부터 카다베린으로의 전환 반응에 효율적으로 이용될 수 있으므로, 카다베린의 생산에 널리 활용될 수 있다.

도 1은 라이신 디카르복실라제가 라이신으로부터 카다베린을 생성시키는 반응 메카니즘을 나타낸다.
도 2는 PtLDC 및 N-말단에 his-tag을 가지는 PtLDC의 발현 결과를 보여주는 SDS-PAGE 젤 사진이다.
도 3은 PtLDC의 라이신을 카다베린으로 전환시키는 반응성을 나타낸다.
도 4는 다양한 온도에 따른 PtLDC의 상대적인 효소활성을 나타낸다.
도 5는 다양한 pH에 따른 PtLDC의 상대적인 효소활성을 나타낸다.
도 6은 PaLDC 및 PrLDC의 발현을 보여주는 SDS-PAGE 젤 사진이다.
도 7은 PaLDC의 라이신을 카다베린으로 전환시키는 반응성을 나타낸다.
도 8은 다양한 온도에 따른 PaLDC의 상대적인 효소활성을 나타낸다.
도 9는 다양한 pH에 따른 PaLDC의 상대적인 효소활성을 나타낸다.
도 10은 PrLDC의 라이신을 카다베린으로 전환시키는 반응성을 나타낸다.
도 11은 다양한 온도에 따른 PrLDC의 상대적인 효소활성을 나타낸다.
도 12는 다양한 pH에 따른 PrLDC의 상대적인 효소활성을 나타낸다.
도 13은 EcLDC, PpLDC, PtLDC 및 PxLDC의 발현 결과를 보여주는 SDS-PAGE 젤 사진이다.
도 14는 PpLDC의 라이신을 카다베린으로 전환시키는 반응성을 나타낸다.
도 15는 다양한 온도에 따른 PpLDC의 상대적인 효소활성을 나타낸다.
도 16은 다양한 pH에 따른 PpLDC의 상대적인 효소활성을 나타낸다.
도 17은 PxLDC의 라이신을 카다베린으로 전환시키는 반응성을 나타낸다.
도 18은 다양한 pH에 따른 PxLDC의 상대적인 효소활성을 나타낸다.
도 19는 다양한 온도에 따른 EcLDC와 PtLDC의 각 상대적인 활성을 나타낸다.
도 20은 다양한 pH에 따른 EcLDC와 PtLDC의 각 상대적인 활성을 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 카다베린 생산용 신규 라이신 디카르복실라제의 선별

1-1. 슈도모나스 써모톨러란스 유래 라이신 디카르복실라제의 선별

카다베린 생산에 활용하기 위한 신규 라이신 디카르복실라제를 선별하기 위해, 미국 국립생물정보센터 (NCBI)에서 제공되는 BLAST 프로그램 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)을 이용하여, 대장균 유래 라이신 디카르복실라제의 활성부위 펩타이드 서열과 높은 유사도를 가지는 호열성 균주 유래 라이신 디카르복실라제를 검색하였다. 구체적으로 대장균 유래 라이신 디카르복실라제의 주요 아미노산인 367번째 라이신을 중심으로 N-말단과 C-말단 각 15개의 아미노산을 포함하는, 총 31개의 펩타이드 서열 (GRVEGKVIYETQSTHKLLAAFSQASMIHVKG: 서열번호 12)을 기반으로, BLAST 서치를 진행하였다. 검색 결과 에스케리키아 (Escherichia), 쉬겔라 (Shigella), 엔테로박테리아 (Enterobacteria), 에드워지엘라 (Edwardsiella), 클렙시엘라 (Klebsiella), 세라티아 (Serratia), 예르시니아 (Yersinia), 요케넬라 (Yokenella), 라울텔라 (Raoultella), 세라티티스 (Ceratitis), 살모넬라 (Salmonella), 수테렐라 (Sutterella), 쉽웰리아 (Shimwellia), 비브리오 (Vibrio), 슈도모나스 (Pseudomonas) 속 미생물 등이 높은 상동성을 가지는 것으로 확인되었다. 그 중, 대장균의 라이신 디카르복실라제 정도의 활성을 가지면서, 동시에 높은 열안정성을 가질 수 있는 라이신 디카르복실라제를 탐색하는 것을 목적으로 하였다. 일반적으로 호열성 균주 안에 존재하는 단백질들이 열안정성이 높은 것으로 알려져 있으므로, 탐색된 균주 중에서 호열성 (46~60℃) 미생물로 알려진 슈도모나스 써모톨러란스를 선택하였다.

1-2. 다양한 슈도모나스 속 균주 유래 라이신 디카르복실라제의 선별

슈도모나스 써모톨러란스 균주 이외에 다른 슈도모나스 속 균주 유래 라이신 다카르복실라제를 선별하기 위해, 슈도모나스 종간의 상동성이 낮은 4 개의 균주 (슈도모나스 알칼리제네스, 슈도모나스 레지노보란스, 슈도모나스 푸티다, 슈도모나스 신싼싸)를 선정하였다. 미국 국립생물정보센터 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 제공하는 nucleotide 및 genome 프로그램을 이용하여, 상기 선정된 4개의 슈도모나스 종 유래의 라이신 디카르복실라제의 유전자와 아미노산 서열을 확인하였다.

하기 표 1은 각각 슈도모나스 종 유래 라이신 디카르복실라제에 대한 아미노산 서열 상동성을 나타낸다.

	PtLDC	PaLDC	PrLDC	PpLDC	PxLDC
PtLDC		87 %	86 %	81 %	84 %
PaLDC	87 %		89 %	80 %	85 %
PrLDC	86 %	89 %		77 %	83 %
PpLDC	81 %	80 %	77 %		84 %
PxLDC	84 %	85 %	83 %	84 %

PtLDC: 슈도모나스 써모톨러란스(P. thermotolerans) 유래 라이신 디카르복실라제

PaLDC: 슈도모나스 알칼리제네스(P. alcaligenes) 유래 라이신 디카르복실라제

PrLDC: 슈도모나스 레지노보란스(P. resinovorans) 유래 라이신 디카르복실라제

PpLDC: 슈도모나스 푸티다(P. putida) 유래 라이신 디카르복실라제

PxLDC: 슈도모나스 신싼싸(P. synxantha) 유래 라이신 디카르복실라제

실시예 2. 슈도모나스 써모톨러란스 유래 라이신 디카르복실라제 유전자가 도입된 대장균 제조 및 그로부터 발현된 라이신 디카르복실라제 활성 분석

2-1. 슈도모나스 써모톨러란스 유래 라이신 디카르복실라제 유전자에 의한 대장균의 형질전환

슈도모나스 써모톨러란스 유래 라이신 디카르복실라제 유전자의 대장균으로의 도입 및 대장균에서의 발현을 위한 재조합 유전자의 클로닝을 진행하였다. 슈도모나스 써모톨러란스에 대한 유전정보는 NCBI의 Genome (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/) 데이터 정보로부터 확보하였다.

슈도모나스 써모톨러란스의 유전체(genomic) DNA를 확보한 후 이를 주형으로 한 중합연쇄반응 (PCR)을 통해 슈도모나스 써모톨러란스 유래 라이신 디카르복실라제 유전자 (ptldc)를 증폭하였다. PCR 수행을 위해, 5_LDC_NdeI (AATATACATATGTACAAAGACCTCCAATTCCCC)(서열번호 13)와 3_LDC_XhoI (AATATACTCGAGTCAGATCTTGATGCAGTCCACCG)(서열번호 14) 프라이머를 이용하였으며, PfuUltraTM DNA 폴리머라제 (Stratagene사, 미국)를 사용하여 94℃: 30초, 55℃: 30초, 72℃: 2분 조건을 30회 반복한 결과, 증폭된 ptldc (서열번호 2)를 확보하였다. 또한 N-말단에 His-tag을 갖는 슈도모나스 써모톨러란스 유래 라이신 디카르복실라제 발현을 위해, 프라이머로 5_LDC_BamHI (AATATAGGATCCGTACAAAGACCTCCAATTCCCC)(서열번호 15)와 3_LDC_SacI (AATATAGAGCTCTCAGATCTTGATGCAGTCCACCG)(서열번호 16)을 이용하여, 상기 PCR 수행 방법과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 다음 PCR 수행으로부터 얻어진 각 ptldc 유전자를 대장균 발현 벡터인 pET-Deut1에 각각 삽입하였다. 그 후 ptldc 유전자가 클로닝된 플라스미드를 열 충격 형질변환 방법에 의해 대장균 Rosetta에 삽입하였다. 형질전환된 균주를 50ml 액체 LB 배지 (50mg/ml 암피실린 포함)를 이용하여 37℃ 온도 조건에서 배양하였으며, OD600 값이 0.8에 도달하였을 때, 0.4 mM 농도의 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 넣고 18 ℃에서 48시간 동안 배양하여 발현을 유도하였다. 발현이 완료된 각 슈도모나스 써모톨러란스 유래 라이신 디카르복실라제(PtLDC)들은 SDS-PAGE 젤 결과를 통해서 확인하였다 (도 2). 상기 SDS-PAGE 젤 결과를 통해, 저온에서 발현된 PtLDC와 His-tag이 포함된 PtLDC가 가용성 단백질로 과발현된 것을 확인할 수 있었다 (도 2의 레인 2 및 4).

상기 ptldc (서열번호 2)를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 대장균 Rosetta 균주를 'Escherichia coli CC04-0055'로 명명하고, 2014년 7월 24일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM11559P를 부여받았다.

2-2. 대장균에서 발현된 슈도모나스 써모톨러란스 유래 라이신 디카르복실라제의 활성 분석

(1) 라이신 디카르복실라제의 반응성 확인

PtLDC와 His-tag이 포함된 PtLDC의 반응성을 검증하기 위하여 가용성 단백질(soluble protein) 50 ml, 100 mM 피리독살-포스페이트 (pyridoxal-phosphate, PLP), 250 mM 라이신을 넣고 200 ml의 부피로 46 ℃에서 2시간 반응하였다. 반응 완충용액은 50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.2를 사용하였다. 공벡터가 도입된 균주를 대조군(control)으로 하여 라이신과 카다베린의 양을 분석하였다 (도 3). 고성능 액체 크로마토그래피 (Waters, Milford, MA)를 이용하여 라이신과 카다베린의 정확한 양을 2414 Refractive Indes Detector (Waters, Milford, MA) 로 분석하였다. Lysine?HCl 시약과 1,5-디아미노 펜탄(카다베린) 시약을 Sigma (St. Louis, MO) 에서 구매하고, 1mM 시트르산, 10mM 타르타르산, 24mM 에틸렌 디아민, 5% 아세토니트릴로 구성된 이동상 (mobile phase)을 이용하여 IonoSpher C3-100mm, 5mm 컬럼 (column)에서 분리하여 두 물질을 분리 및 정량하였다. 대조군의 경우는 카다베린이 전혀 생성되지 않는 것을 확인할 수 있었다. N-말단에 His-tag이 삽입된 PtLDC의 경우에는 72%의 라이신을, PtLDC는 100%의 라이신을 전환시켜 카다베린을 생성되는 것을 확인할 수 있었다.

(2) 온도 및 pH에 따른 라이신 디카르복실라제의 활성 분석

PtLDC의 다양한 온도 조건 (30, 42, 50, 60, 70, 80 ℃)에서 효소적 특성을 파악하기 위해서 상대적인 효소 활성 (relative activity)을 비교하였다. PtLDC를 희석하여 250mM의 라이신 기질을 사용하여 60℃에서 30분간 반응시킬 때, 42mM 카다베린이 생성되는 것을 확인하였다. 이때 사용된 완충액은 50mM 소듐 포스페이트 버퍼 (pH6.2)였으며, 동량의 효소와 동일한 반응조건으로 온도 조건만 30, 42, 50, 70, 80 ℃로 처리하여 카다베린의 농도를 분석하였다. 그리고 60℃ 온도 반응에서 생성된 카다베린 양과 상대적으로 비교하였다 (도 4). 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 PtLDC는 60 ℃에서 가장 높은 활성을 보였다. 또한 55~65℃의 온도 조건에서는 80% 이상의 활성을 유지하는 것으로 평가되었다.

추가적으로 다양한 pH (6.2, 7.0, 8.0, 9.0) 에 대한 라이신 디카르복실라제의 활성 평가를 수행하였다. 온도 조건을 60℃로 고정하고 동량의 효소와 동일한 반응조건으로 50mM 소듐 포스페이트 버퍼 (pH6.2), 50mM 트리스 버퍼 (pH 7.0), 100mM 포타슘 포스페이트 버퍼 (pH 8.0), 50 mM 트리스 버퍼 (pH 9.0) 를 이용하여 각각 다른 pH에서 반응성을 비교하였다 (도 5). pH 8.0에서 PtLDC가 가장 높은 활성을 보였으나, pH 6 내지 pH 9의 조건에서도 90% 이상의 활성이 유지되는 것으로 확인되었다. 각 pH 조건에서 생성되는 카다베린 양을 pH 8.0 조건에서 생성되는 카다베린 양과 상대적으로 비교하였다 (도5). 실험 결과를 통해서 PtLDC는 pH 변화 또는 높은 pH에 대해 높은 안정성을 가지는 것으로 평가된다.

실시예 3. 슈도모나스 알칼리제네스 유래 라이신 디카르복실라제 유전자가 도입된 대장균 제조 및 그로부터 발현된 라이신 디카르복실라제 활성 분석

3-1. 슈도모나스 알칼리제네스 유래 라이신 디카르복실라제 유전자에 의한 대장균의 형질전환

슈도모나스 알칼리제네스 유래 라이신 디카르복실라제 유전자 (paldc)를 클로닝하기 위해, 5_PaLDC_NdeI (AATATACATATGTACAAAGACCTGAA GTTCCCCATCC)(서열번호 17)와 3_PaLDC_XhoI (AATATACTCGAGTCACTCCCTTATGCAATCAACGGTATAGC)(서열번호 18) 프라이머를 이용하였으며, 정제된 슈도모나스 알칼리제네스의 유전체 DNA를 주형으로 PCR을 수행하였다. 중합효소로 Pfu DNA 폴리머라제를 사용하였으며, 94℃: 30초, 55℃: 30초, 72℃: 2분 조건을 30회 반복하여 PCR을 수행한 결과, 증폭된 paldc 유전자 (서열번호 4)를 확보하였다.

얻어진 paldc 유전자는 상기 실시예 2-1과 동일한 방법에 의해 대장균에서 저온 발현시킨 후, SDS-PAGE 젤에 의해 그 결과를 확인하였다 (도 6). 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 슈도모나스 알칼리제네스 유래 라이신 디카르복실라제 (PaLDC)는 불용성 단백질로서 대부분 발현되었으며, 가용성 단백질은 SDS-PAGE 젤 상에서 확인되지 않았다 (도 6, 레인 1, 2 참조).

3-2. 대장균에서 발현된 슈도모나스 알칼리제네스 유래 라이신 디카르복실라제의 활성 분석

(1) 라이신 디카르복실라제의 반응성 확인

PaLDC의 반응성을 검증하기 위하여, 상기 실시예 3-1에 얻은 PaLDC의 세포분쇄액(cell lysate)을 13,000 rpm에서 15 분간 원심분리시켜서 얻은 상등액(가용성 단백질)을 이용하여 라이신 전환반응을 수행하였다. 가용성 단백질 50 μl, 100 mM PLP, 250 mM 라이신을 50 mM 소듐 포스페이트 (pH 6.2) 완충용액으로 채워서 200 μl의 반응 부피로 46 ℃에서 2시간 반응하였다. 그 결과 70 % 라이신이 PaLDC에 의해 카다베린으로 전환된 것을 확인할 수 있었다 (도 7).

(2) 온도 및 pH에 따른 라이신 디카르복실라제의 활성 분석

슈도모나스 알칼리제네스 유래 라이신 디카르복실라제의 활성을 위한 최적 온도 조건을 찾기 위하여, 실시예 2-2와 같은 방법으로 30, 40, 46, 60 ℃ 온도 조건에서 효소 활성을 평가하였다. 그 결과, PaLDC는 50 ℃에서 가장 좋은 활성을 가지는 것으로 확인되었다 (도 8).

또한 실시예 2-2와 같은 방법으로 슈도모나스 알칼리제네스 유래 라이신 디카르복실라제의 pH에 대한 활성 조건을 평가하였다. 그 결과, PaLDC는 pH 8 및 pH 9에서 높은 안정성을 보였으며, pH 6에서도 95% 이상의 활성이 유지되는 것을 확인하였다(도 9).

실시예 4. 슈도모나스 레지노보란스 유래 라이신 디카르복실라제 유전자가 도입된 대장균 제조 및 그로부터 발현된 라이신 디카르복실라제 활성 분석

4-1. 슈도모나스 레지노보란스 유래 라이신 디카르복실라제 유전자에 의한 대장균의 형질전환

슈도모나스 레지노보란스 유래 라이신 디카르복실라제 유전자(prldc)를 클로닝하기 위해서 5_PrLDC_NdeI (AATATACATATGTACAAAGAGCTC AAGTTCCCCGTCCTC))(서열번호 19) 와 3_PrLDC_XhoI (AATATACTCGAG TTATTCCCTGATGCAGTCCACTGTA TAGC))(서열번호 20)의 프라이머를 이용하였으며, 정제된 슈도모나스 레지노보란스 유전체 DNA를 주형으로 PCR을 수행하였다. 실시예 3-1과 동일한 중합효소 및 PCR 수행 조건으로 PCR을 수행하여, 증폭된 prldc(서열번호 6)를 확보할 수 있었다.

얻어진 prldc 유전자는 상기 실시예 2-1과 동일한 방법에 의해 대장균에서 저온 발현시킨 다음, SDS-PAGE 젤에 의해 그 결과를 확인하였다 (도 6; 레인 3,4). 그 결과, PrLDC는 저온 발현조건에서도 거의 발현되지 않는 것을 확인하였다.

4-2. 대장균에서 발현된 슈도모나스 레지노보란스 유래 라이신 디카르복실라제의 활성 분석

(1) 라이신 디카르복실라제의 반응성 확인

슈도모나스 레지노보란스 유래 라이신 디카르복실라제 (PrLDC)의 반응성을 검증하기 위하여, 상기 4-1에 얻은 PrLDC의 세포분쇄액을 13,000 rpm에서 15 분간 원심분리시키고 상등액을 이용하여 라이신 전환반응을 수행하였다. 가용성 단백질 50 μl, 100 mM PLP, 250 mM 라이신을 50 mM 소듐 포스페이트 (pH 6.2) 완충용액으로 채워서 200 μl의 반응 부피로 46 ℃에서 2시간 반응하였다. 라이신 전환 반응결과, PrLDC에 의해 66 % 카다베린이 생성되었다 (도 10).

(2) 온도 및 pH에 따른 라이신 디카르복실라제의 활성 분석

PrLDC의 활성을 위한 최적 온도 조건을 찾기 위하여, 실시예 2-2와 같은 방법으로 30, 40, 46, 60 ℃ 온도 조건에서 효소 활성을 평가하였다. 그 결과, PrLDC는 60 ℃에서 가장 좋은 활성을 가지는 것으로 확인되었다 (도 11).

또한 실시예 2-2와 같은 방법으로 PrLDC의 pH에 따른 활성을 평가하였다. 그 결과, PrLDC는 pH 6에서 가장 높은 활성을 보였으나, pH 9에서도 90% 이상의 활성을 보유하는 것을 확인할 수 있었다.(도 12).

실시예 5. 슈도모나스 푸티다 유래 라이신 디카르복실라제 유전자가 도입된 대장균 제조 및 그로부터 발현된 라이신 디카르복실라제 활성 분석

5-1. 슈도모나스 푸티다 유래 라이신 디카르복실라제 유전자에 의한 대장균의 형질전환

슈도모나스 푸티다 유래 라이신 디카르복실라제 유전자 (ppldc)를 클로닝하기 위해, 5_PpLDC_NdeI (AATATACATATGTACAAAGACCTCCAA TTCCCC))(서열번호 21)와 3_PpLDC_XhoI (AATATACTCGAGTCACTCCCTTATGCAATCAACGGTATAGC)(서열번호 22)의 프라이머를 이용하여 정제된 슈도모나스 푸티다 유전체 DNA를 주형으로 PCR을 수행하였다. 중합효소로 Pfu DNA 폴리머라제를 사용하였으며, 94℃: 30초, 55℃: 30초, 72℃: 2분 조건을 30회 반복하여 PCR을 수행한 결과, 증폭된 ppldc 유전자 (서열번호 8)를 확보하였다.

얻어진 ppldc 유전자를 상기 실시예 2-1과 동일한 방법에 의해 대장균에서 저온 발현시킨 다음, SDS-PAGE 젤에 의해 그 결과를 확인하였다 (도 13). 도 13의 레인 3, 및 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 슈도모나스 푸티다 유래 라이신 디카르복실라제 (PpLDC)는 저온 발현조건에서도 거의 발현되지 않는 것을 확인하였다.

세포분쇄액을 13,000 rpm에서 15 분간 원심분리시키고 상등액을 이용하여 라이신 전환반응을 수행하였다.

5-2. 대장균에서 발현된 슈도모나스 푸티다 유래 라이신 디카르복실라제의 활성 분석

(1) 라이신 디카르복실라제의 반응성 확인

PpLDC의 반응성을 검증하기 위하여, 상기 5-1에 얻은 PpLDC의 세포분쇄액(cell lysate)을 13,000 rpm에서 15 분간 원심분리시키고 상등액을 이용하여 라이신 전환반응을 수행하였다. 가용성 단백질 50 μl, 100 mM PLP, 250 mM 라이신을 50 mM 소듐 포스페이트 (pH 6.2) 완충용액으로 채워서 200 μl의 반응 부피로 46 ℃에서 2시간 반응하였다. 그 결과 16 % 카다베린이 생성되었다 (도 14).

(2) 온도 및 pH에 따른 라이신 디카르복실라제의 활성 분석

PpLDC의 활성을 위한 최적 온도 조건을 찾기 위하여, 실시예 2-2와 같은 방법으로 50, 60, 70 ℃ 의 온도 조건에서 효소 활성을 평가하였다. 그 결과, PpLDC는 50 ℃ 에서 가장 좋은 활성을 가지는 것으로 확인되었다 (도 15).

또한 실시예 2-2와 같은 방법으로 PpLDC의 pH에 대한 활성 조건을 평가하였다. 그 결과,pH 6에서 가장 높은 활성을 보였으며, pH가 높아지면 반응성이 낮게 평가되었다 (도 16).

실시예 6. 슈도모나스 신싼싸 유래 라이신 디카르복실라제 유전자가 도입된 대장균 제조 및 그로부터 발현된 라이신 디카르복실라제 활성 분석

6-1. 슈도모나스 신싼싸 유래 라이신 디카르복실라제 유전자에 의한 대장균의 형질전환

슈도모나스 신싼싸 유래 라이신 디카르복실라제 유전자 (pxldc)를 클로닝하기 위해, 5_PxLDC_NdeI (AATATACATATGTACAAAGACCTCCAA TTCCCC)(서열번호 23)와 3_PxLDC_XhoI (AATATACTCGAGTCACTCCCTTATGCAATCAACGGTATAGC)(서열번호 24)의 프라이머를 이용하고, 정제된 슈도모나스 신싼싸 유전체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 유전자 증폭을 위해서 Pfu DNA polymerase를 사용하였으며, 94℃: 30초, 45℃: 30초, 72℃: 2분 조건을 30회 반복하여 증폭된 pxldc를 확보할 수 있었다 (서열번호 10).

얻어진 pxldc 유전자는 상기 실시예 2-1과 동일한 방법에 의해 대장균에서 저온 발현시킨 다음, SDS-PAGE 젤에 의해 그 결과를 확인하였다 (도 13). 도 13의 레인 7 및 8에서 볼 수 있는 바와 같이, 슈도모나스 신싼싸 유래 라이신 디카르복실라제 (PxLDC)는 저온 발현조건에서 가용성단백질로 과발현되는 것을 확인할 수 있었다.

6-2. 대장균에서 발현된 슈도모나스 신싼싸 유래 라이신 디카르복실라제의 활성 분석

(1) PxLDC의 반응성 확인

PxLDC의 반응성을 검증하기 위하여, 상기 6-1에 얻은 PxLDC의 세포분쇄액을 13,000 rpm에서 15 분간 원심분리시키고 상등액을 이용하여 라이신 전환반응을 수행하였다. 가용성 단백질 50 μl, 100 mM PLP, 250 mM 라이신을 50 mM 소듐 포스페이트 (pH 6.2) 완충용액으로 채워서 200 μl의 반응 부피로 46 ℃에서 2시간 반응하였다. 그 결과 25 % 카다베린이 생성되었다 (도 17).

(2) pH에 따른 라이신 디카르복실라제의 활성 분석

PxLDC의 최적 pH 조건을 찾기 위하여, 실시예 2-2와 같은 방법으로 다양한 pH 효소 활성을 평가하였다 (도 18). 그 결과, PxLDC는 pH 6에서 가장 높은 활성을 보였으며, pH가 높아질수록 반응성이 낮게 평가되었다.

실시예 7. 대장균 유래 라이신 디카르복실라제와 슈도모나스 써모톨러란스 유래 라이신 디카르복실라제의 활성 비교 분석

7-1. 대장균 유래 라이신 디카르복실라제 클로닝 및 발현

대장균 라이신 디카르복실라제 유전자인 cadA를 클로닝하여 EcLDC (서열번호 11)를 발현하였다. PtLDC와 EcLDC의 아미노산 서열의 상동성은 36%이다. cadA 유전자가 클로닝된 플라스미드를 대장균 K-12 BL21를 삽입하고 37℃ 온도 조건에서 배양하여 4시간 발현을 유도하였다. 발현이 완료된 EcLDC는 SDS-PAGE 젤을 통해서 확인한 결과 (도 13; 레인 1, 2), EcLDC가 가용성 단백질로 과발현되는 것을 확인하였다.

7-2. EcLDC 및 PtLDC 의 상대적인 효소 활성 비교 분석

(1) 온도에 따른 활성 비교

실시예 2-2와 같은 방법으로, 다양한 온도 조건 (37, 42, 50, 60, 70, 80 ℃) 에서 EcLDC와 PtLDC의 상대적인 효소 활성 (relative activity)을 비교하였다 (도 19).

그 결과, EcLDC와 PtLDC 모두 60 ℃에서 가장 높은 활성을 보이는 것으로 확인되었다. 50 ℃에서 EcLDC는 54 %의 상대적 활성 (60 ℃에서 EcLDC의 활성을 100 %로 고정)을 가지며, 80 ℃ 에서는 12 %의 상대적 활성을 가지는 것으로 평가되었다. PtLDC의 경우 50 ℃에서 76 %의 상대적 활성 (60 ℃ 에서 PtLDC 의 활성을 100 %으로 고정)을 가지며, 80 ℃에서는 19 %의 상대적 활성을 가지는 것으로 평가되었다. 고온 조건에서 PtLDC가 활성을 더 잘 유지하는 것으로 확인되었다. 결론적으로 두 효소 모두 온도에 따른 활성의 차이가 크게 나타났으며, 상대적인 활성은 PtLDC가 더 잘 유지되는 것으로 평가되었다.

(2) pH에 따른 활성 비교

추가적으로, 실시예 2-2와 같은 방법으로 다양한 pH (6.2, 7.4, 8.0, 9.0) 에 대한 평가를 진행하였다 (도 20). 그 결과, EcLDC는 pH 6에서 가장 높은 활성을 보이는 것으로 평가되었으며, pH가 증가될수록 EcLDC 효소 활성이 크게 감소하였다. pH 9에서 EcLDC는 50 % 정도의 활성이 유지되었다. 반면에 PtLDC는 pH에 의한 활성 변화가 크게 관찰되지 않았으며, pH 6.2~9 사이의 pH에서 90 % 이상의 활성이 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라 온도와 pH에 대해서 PtLDC의 안정성이 EcLDC 보다 높은 것으로 평가되었다.

(3) PtLDC와 EcLDC의 활성 비교

PtLDC와 EcLDC의 단백질량을 정량하여 특이적 활성(specific activity) (unit/mg)을 평가하였을 때, PtLDC는 10060 (unit/mg), EcLDC는 36335 (unit/mg)의 값을 가졌다. 반응성을 비교해 볼 때, EcLDC가 PtLDC보다 약 3.6배 높은 활성을 보였다. 또한 최적 온도를 비교하면 두 효소 모두 60 ℃에서 최적 반응을 하였으며, 온도가 변화됨에 따라서 활성이 크게 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 최적 pH 조건을 비교하면, EcLDC의 경우 pH가 높아짐에 따라 비활율이 높아지지만, PtLDC의 경우 pH 변화에 대해서는 효소 활성 변화가 크게 일어나지 않는 것으로 관찰되었다.

EcLDC가 PtLDC보다 높은 활성을 가지고 있으나, 라이신 디카르복실라제의 반응으로 pH가 증가하게 되면 EcLDC의 활성이 pH 변화에 의해서 크게 영향을 받을 수 있다. PtLDC는 상대적 pH 안정성이 EcLDC보다 높게 평가되며, 라이신 전환 반응에서 유리한 점을 가지고 있다. 또한 라이신을 생전환하여 카다베린을 상업적으로 생산할 때 산 처리를 통해서 pH 조정이 필요하지만 PtLDC는 pH 적정부분을 완화할 수 있으며, 이 부분은 카다베린 생전환에서 생산 단가를 낮추는 효과를 기대할 수 있을 것으로 평가된다.

한국미생물보존센터(국외) KCCM11559P 20140724

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> The novel Lysine Decarboxylase and Process for producing cadeverine using the same <130> PN122256 <160> 24 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 751 <212> PRT <213> Pseudomonas thermotolerans <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(751) <223> Lysine decarboxylase from Pseudomonas thermotolerans (PtLDC) <400> 1 Met Tyr Lys Asp Leu Gln Phe Pro Ile Leu Ile Val His Arg Asp Ile 1 5 10 15 Lys Ala Asp Thr Val Ala Gly Asn Arg Val Arg Glu Ile Ala Arg Glu 20 25 30 Leu Glu Gln Asp Gly Phe Ala Ile Leu Ser Thr Ala Ser Ala Ser Glu 35 40 45 Gly Arg Ile Val Ala Ser Thr His His Gly Leu Ala Cys Ile Leu Val 50 55 60 Ala Ala Glu Gly Ala Gly Glu Asn Arg Ser Leu Leu Gln Asp Val Val 65 70 75 80 Glu Leu Ile Arg Val Ala Arg Val Arg Ala Pro Gln Leu Pro Ile Phe 85 90 95 Ala Leu Gly Glu Gln Val Thr Ile Glu Asn Ala Pro Ala Glu Ala Met 100 105 110 Ala Asp Leu Asn Gln Leu Arg Gly Leu Leu Tyr Leu Phe Glu Asp Thr 115 120 125 Val Pro Phe Leu Ala Arg Gln Val Ala Arg Ala Ala Arg Gly Tyr Leu 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Pseudomonas putida <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(749) <223> Lysine decarboxylase from Pseudomonas putida (PpLDC) <400> 7 Met Tyr Lys Asp Leu Lys Phe Pro Ile Leu Ile Val His Arg Ala Ile 1 5 10 15 Lys Ala Asp Ser Val Ala Gly Glu Arg Val Arg Gly Ile Ala Glu Glu 20 25 30 Leu Arg Gln Asp Gly Phe Ala Ile Leu Ala Ala Ala Asp His Ala Glu 35 40 45 Ala Arg Leu Val Ala Ala Thr His His Gly Leu Ala Cys Met Leu Ile 50 55 60 Ala Ala Glu Gly Val Gly Glu Asn Thr His Leu Leu Gln Asn Met Ala 65 70 75 80 Glu Leu Ile Arg Leu Ala Arg Leu Arg Ala Pro Asp Leu Pro Ile Phe 85 90 95 Ala Leu Gly Glu Gln Val Thr Leu Glu Asn Ala Pro Ala Glu Ala Met 100 105 110 Ser Glu Leu Asn Gln Leu Arg Gly Ile Leu Tyr Leu Phe Glu Asp Thr 115 120 125 Val Pro Phe Leu Ala Arg Gln Val Ala Arg Ala Ala His Thr Tyr Leu 130 135 140 Asp Gly Leu Leu Pro Pro Phe Phe Lys Ala Leu Val Gln His Thr Ala 145 150 155 160 Gln Ser Asn Tyr Ser Trp His Thr Pro Gly His Gly Gly Gly Val Ala 165 170 175 Tyr His Lys Ser Pro Val Gly Gln Ala Phe His Gln Phe 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gattccaatt attcctggca cacccctggc catggcggtg gcgtggcgta tcgtaaaagc 540 ccggtggggc aggcgtttca ccagttcttc ggggagaaca ccctgcgctc ggacttgtct 600 gtttctgtcc ctgaactggg ctcgctgctc gatcataccg ggcccctggc cgaagccgag 660 gcccgcgccg cgcgcaactt tggcgccgac cataccttct tcgtcatcaa tggcacctcc 720 accgccaaca agatcgtctg gcattccatg gtcggtcgcg acgacctggt gttggtggac 780 cgcaactgcc acaagtcagt gctgcactcg atcatcatga ccggcgcgat cccgctgtat 840 ctgtgcccgg agcgcaacga actggggatc atcggcccga tccccttgag tgaattcagc 900 cccgaatcaa tccgcgccaa gatcgacgcc agcccgttgg catatggccg gccacccaag 960 gtgaagctgg cggtggtgac caattccacc tacgacggcc tgtgctacaa cgccgaactg 1020 atcaagcagc aattgggtaa tagcgtagag gtgctgcact tcgacgaagc ctggtatgcc 1080 tatgcggcat ttcacgagtt tttcgccggg cgctatggca tgggcacctc gcgcacaccg 1140 gacagcccgc tggtatttac cacccactcc acccacaaac tgctggccgc attcagccag 1200 gcatcgatga ttcatgtgca ggatggcggc gcacggcagc tggaccgtga ccgtttcaac 1260 gaagccttca tgatgcacat ctcgacttca ccgcaataca gcatcatcgc ttcgctggat 1320 gtcgcttcgg cgatgatgga aggccccgcc gggcgctcgc tgttgcagga aatgttcgac 1380 gaggccctga gtttccgccg cgcgctggcc aacctgcgcc agcatatcgc tgccgaggat 1440 tggtggtttt cgatctggca gccacaatcg gtggcgggta tcgaccgcgt tgccacggcg 1500 gactggctat tgcatcccca ggatgattgg cacggctttg gcgatgtggc tgaagattat 1560 gtcttgctgg acccgatcaa agtcaccctg gtgatgcctg gcctcaatgc aggtggcgcc 1620 ttgagcgatt gtgggattcc cgccgcggtg gtcagcaagt ttctctggga gcgcggcctc 1680 gtggtggaaa aaaccgggct ttattcgttc ctcgtgttgt tttccatggg gatcaccaaa 1740 ggcaagtgga gcaccttgct caccgagttg ctggagttca agcgcagtta cgatgccaac 1800 gtcagcctgg ccagttgttt gccctcggtg tacgcccagg ggccggtacg ttatcagggc 1860 ttgggcctgc gcgatctttg cgaccagttg cacagctgtt accgtagcaa cgccaccgcc 1920 aagcatctca agcgcatgta cacagtattg ccgcagatcg cgatgaaacc cgccgatgcc 1980 tacgaccaac tggtcagagg cgaagttgaa gcggtatcca tcgatgcctt gccaggacgc 2040 atcgcagccg taatgctggt gccttatcca ccgggcattc cattgataat gcccggcgag 2100 cgctttactg aatcaacgcg ttcaatcatc gactacctgg catttgcccg cacgttcgat 2160 agcagtttcc ccggttttgt cgccgatgtt catgggctgc aacacgaaga tgatggcagt 2220 ggccgtcgtt acaccgtcga ttgcatcaag ggttaa 2256 <210> 11 <211> 715 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(715) <223> Lysine decarboxylase from Escherichia coli (EcLDC) <400> 11 Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu 1 5 10 15 Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln 20 25 30 Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn 35 40 45 Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu 50 55 60 Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr 65 70 75 80 Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp 100 105 110 Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile 115 120 125 Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys 130 135 140 Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys 145 150 155 160 Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met 165 170 175 Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp 180 185 190 His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe 195 200 205 Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn 210 215 220 Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile 225 230 235 240 Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp 245 250 255 Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu 260 265 270 Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg 275 280 285 Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys 305 310 315 320 Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr 325 330 335 Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly 340 345 350 Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu 355 360 365 Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val 370 375 380 Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser 385 390 395 400 Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met 405 410 415 Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala 420 425 430 Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly 435 440 445 Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys 450 455 460 Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp 465 470 475 480 Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro 485 490 495 Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser 500 505 510 Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr 515 520 525 Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr 530 535 540 Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe 545 550 555 560 Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu 565 570 575 Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn 580 585 590 Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg 595 600 605 Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe 610 615 620 Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met 625 630 635 640 Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val 645 650 655 Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val 660 665 670 Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly 675 680 685 Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr 690 695 700 Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys 705 710 715 <210> 12 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 15 amino acid of Lysine decarboxylase from Escherichia coli <400> 12 Gly Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys 1 5 10 15 Leu Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly 20 25 30 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 LDC NdeI <400> 13 aatatacata tgtacaaaga cctccaattc ccc 33 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3 LDC XhoI <400> 14 aatatactcg agtcagatct tgatgcagtc caccg 35 <210> 15 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 LDC BamHI <400> 15 aatataggat ccgtacaaag acctccaatt cccc 34 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3 LDC SacI <400> 16 aatatagagc tctcagatct tgatgcagtc caccg 35 <210> 17 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 PaLDC NdeI <400> 17 aatatacata tgtacaaaga cctgaagttc cccatcc 37 <210> 18 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3 PaLDC XhoI <400> 18 aatatactcg agtcactccc ttatgcaatc aacggtatag c 41 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 PrLDC NdeI <400> 19 aatatacata tgtacaaaga gctcaagttc cccgtcctc 39 <210> 20 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3 PrLDC XhoI <400> 20 aatatactcg agttattccc tgatgcagtc cactgtatag c 41 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5_LDC_NdeI_ppldc <400> 21 aatatacata tgtacaaaga cctccaattc ccc 33 <210> 22 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3_PaLDC_XhoI_ppldc <400> 22 aatatactcg agtcactccc ttatgcaatc aacggtatag c 41 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5_LDC_NdeI_pxldc <400> 23 aatatacata tgtacaaaga cctccaattc ccc 33 <210> 24 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3_PaLDC_XhoI_pxldc <400> 24 aatatactcg agtcactccc ttatgcaatc aacggtatag c 41

Claims (4)

1. 서열번호 1, 3, 5, 7 또는 9의 아미노산 서열로 이루어지며, 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질을 발현하도록 형질전환된 미생물로부터 생산된 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질 또는 상기 미생물을 이용하여 라이신으로부터 카다베린으로 전환하는 단계, 및
   상기 전환된 카다베린을 회수하는 단계를 포함하며,
   상기 미생물은 대장균 또는 코리네박테리움 글루타미쿰이고, 상기 라이신으로부터 카다베린으로 전환하는 단계의 반응은 pH 6 내지 9에서 진행되는 카다베린의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 라이신 디카르복실라제 활성은 pH 6 내지 9의 범위에서 라이신 디카르복실라제 활성의 최고 활성을 기준으로 70% 이상의 활성을 갖는 카다베린의 제조방법.
3. 서열번호 1, 3, 5, 7 또는 9의 아미노산 서열로 이루어지며, 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질을 발현하도록 형질전환된 미생물을 배지에서 배양하는 단계로서, 형질전환되는 미생물은 야생형에 비하여 향상된 라이신 생산능을 가지는 미생물이고, 상기 형질전환된 미생물은 카다베린 생산능을 갖는 것인 단계, 및
   상기 미생물 또는 배지에서 카다베린을 회수하는 단계를 포함하며,
   상기 미생물은 대장균 또는 코리네박테리움 글루타미쿰이고, 상기 형질전환된 미생물을 배지에서 배양하는 단계는 pH 6 내지 9에서 진행되는 것인 카다베린의 제조방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 라이신 디카르복실라제 활성은 pH 6 내지 9의 범위에서 라이신 디카르복실라제 활성의 최고 활성을 기준으로 70% 이상의 활성을 갖는 카다베린의 제조방법.

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