JPH08256771A - アミダーゼ活性を有する新規タンパク質およびそれをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 単一サブユニットから構成されて、アミダー
ゼ活性を有する新規酵素タンパク質をコマモナス アシ
ドボランス ＫＰＯ−２７７１−４菌から分離精製し、
このタンパク質をコードする遺伝子を決定した。この新
規タンパク質、ならびに該遺伝子を含有し発現させた微
生物またはその処理物を、ラセミ体のアミド化合物にエ
ナンチオ選択的に作用させて対応する光学活性有機酸を
製造する。 【効果】 上記微生物またはその処理物を用いることに
より、ラセミ体のアミド化合物よりその対応する光学活
性な有機酸を効率的に生産できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はエナンチオ選択的アミダ
ーゼ活性を有する新規なタンパク質およびそれをコード
する遺伝子、ならびに該遺伝子を含有する微生物を用い
るアミド類から有機酸を製造する方法、コマモナス ア
シドボランス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓａｃｉｄｏｖｏｒａ
ｎｓ） ＫＰＯ−２７７１−４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４
８４２）に関する。詳しくは、アミド類からその対応す
る有機酸をエナンチオ選択的に生成させる活性を有する
新規なタンパク質およびそれをコードする遺伝子と、こ
の遺伝子を含有する微生物またはその調製物を、ラセミ
体のアミド類に作用させて対応する光学活性な有機酸を
製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】およびアミド類を加水分解して有機酸を
製造するには、反応触媒として酸またはアルカリを用い
て処理する化学合成法が知られている。近年、アミダー
ゼを含有する微生物を触媒として用いる微生物合成法が
用いられるようになった。この微生物法は、常温常圧で
反応を行うことができるとともに、エナンチオ選択的に
反応を行うことができるため、光学活性な有機酸類を製
造する際に、広く用いられる方法である（特開昭６１−
８８８９４号公報、特開昭６２−５５０９８号公報、特
開平１−３０９６９５号公報、特開平１−２４０１９９
号公報、特開平２−８４１９８号公報、特開平５−５０
７６２５号公報、特開平５−３０９９２号公報、特開平
５−７６３９１号公報、特開平５−４９４９８号公
報）。

【０００３】しかしながら、この微生物法の工業的な利
用においては、微生物触媒を調製する段階において、そ
の微生物の安全性評価、アミダーゼ活性を十分に高める
最適培養法の検討など各微生物に応じて多くの課題を解
決する必要があり、コスト面をクリアーするには必ずし
も容易でない場合がある。一方、この様な微生物法の改
良法として、微生物触媒自体、即ちアミダーゼを遺伝子
工学手法を用いてより有利な状態にして、アミド類から
その対応する有機酸をエナンチオ選択的に製造する方法
が検討されている（特開平４−２１８３７９号公報、特
開平５−２３６９９３号公報）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来のアミ
ダーゼ活性に比較して、よりアミダーゼ活性の強い微生
物を探索し、このアミダーゼを単離・精製し、遺伝子工
学手法を用いてアミダーゼを発現し、アミド類からその
対応する有機酸をエナンチオ選択的に製造する好適な技
術を提供しようとするものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】発明者らは、よりアミダ
ーゼ活性の強い微生物を探索して見い出し、このアミダ
ーゼを初めて単離・精製した。さらに、このタンパクを
コードする遺伝子も初めて分離取得し発現させることに
成功し、本発明を完成するに至った。次に、本発明を詳
細に説明する。

【０００６】本発明に用いられる微生物は、佐賀県の畑
土壌中よりＲ−ケトプロフェンアミド（Ｒ−３−ベンゾ
イル−α−メチルベンゼンアセトアミド）を唯一Ｎ源と
して資化生育することのできるものとして探索し、アミ
ダーゼ活性が強いものとして選ばれたコマモナス アシ
ドボランス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａ
ｎｓ）ＫＰＯ−２７７１−４株である。本菌株は工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１４８４２として寄託されている。菌学的な性質は以下
に示される。 形態；桿菌 ０．６〜１．３×１．４〜２．７μｍ グラム染色； − 胞子； − 運動性； ＋ 肉汁寒天平板培養における生育状態；円形、平滑で光沢
あり、白色。 生育温度；３７℃ ＋、４１℃ −、４５℃ − カタラーゼ； ＋ オキシダーゼ； ＋ グルコース発酵（ＯＦテスト）； − ＮＯ₃還元； ＋ インドール産生； − グルコースからの酸； − アルギニンジヒドロラーゼ； − ウレアーゼ； − エスクリン加水分解； − ゼラチン加水分解； − β−ガラクトシダーゼ； − グルコース同化； − アラビノース同化； − マンノース同化； − マンニトール同化； − Ｎ−アセチルグルコサミン同化； − マルトース同化； − グルコン酸同化； − カプリン酸同化； − アジピン酸同化； ＋ リンゴ酸同化； ＋ クエン酸同化； ＋ フェニル酢酸同化； ＋ シトクロームオキシダーゼ； ＋ ＮＯ₃−Ｎ₂； − ＮＯ₂−Ｎ₂； − ３％塩化ナトリウム中での生育；（＋） Ｔｗｅｅｎ ８０； ＋ アセトアミドのアルカリ性化； − アラントインのアルカリ性化； ＋ 酒石酸のアルカリ性化； ＋ フラクトースからの酸； ＋ 酢酸資化能； ＋ 上記の菌学的性状において、グラム陰性で運動性のある
桿菌であり、カタラーゼ活性およびオキシダーゼ活性を
有し、かつグルコースＯＦテストが陰性で、フラクトー
スＯＦテストが陽性であることからコマモナス属に属す
る微生物と判断し、プロカリオート（Ｔｈｅ ＰＲＯＫ
ＡＲＹＯＴＥＳ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９
９２，Ｂａｌｏｗｓ Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｅｒｌｉ
ｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌｏｇ）およびバージェ
イズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリ
オロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓ
ｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏ
ｌｕｍｅ１，１９８４，Ｓｎｅａｔｈ Ｐ．Ｈ．Ａ．ｅ
ｔ．ａｌ．，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ．Ｗｉｌｌｉａｍｓａ
ｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ）を参照して、コマモナス属に属
するコマモナス アシドボランスに属すると同定し、本
株をコマモナス アシドボランス ＫＰＯ−２７７１−
４株と命名した。

【０００７】本菌株の培養は、公知の培養方法に準じて
行うことができる。培養条件は、通常液体培養で行う
が、工業的には深部通気攪拌培養を行うのが有利であ
る。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いら
れるものが広く使用されうる。使用する培地は、一般微
生物の栄養源として公知のものが利用でき、例えばグル
コース、サッカロース、ラクトース、糖蜜、グリセリ
ン、フマール酸、クエン酸、酢酸、グルタミン酸等の炭
素源、例えば硫酸アンモニウム、尿素、塩化アンモニウ
ム等の窒素源、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の窒
素源としての有機栄養源、ビタミン類、リン酸、マグネ
シウム、カリウム、鉄等の無機栄養源を適宜組み合わせ
て使用できる。また、微生物中のアミダーゼ活性の量を
増大させる物質として、イソブチロニトリル、２−アザ
シクロノナノン、Ｎ−メチルカプロラクタム等を添加し
てもよい。培地のｐＨは５〜１０、培養温度は１０〜３
８℃の範囲で選べばよい。培養日数は１〜５日の範囲で
目的のアミダーゼの含量が最大になるまで培養すればよ
い。

【０００８】酵素の精製は、通常の酵素精製法を用いる
ことができる。培養終了液より遠心分離等によって菌体
を集め、超音波処理等の機械的方法によって菌体を破砕
する。遠心分離により残渣を除き粗酵素を得る。次に、
超遠心分離分画、塩析、吸着クロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ハイドロフォービッククロ
マトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、結晶化
等により精製される。

【０００９】酵素活性の測定法は次の様にして行った。
ケトプロフェンアミド５μｍｏｌ、リン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ８．０）１０μｍｏｌ、牛血清アルブミン１ｍ
ｇおよび適当量の酵素液を加え、１．０ｍｌになるよう
に混合して、３０℃にて３０分間反応させた後、メタノ
ール４．０ｍｌを添加して反応を停止させた。生成した
ケトプロフェン（３−ベンゾイル−α−メチルベンゼン
アセティクアシド）は高速液体クロマトグラフィーによ
り測定した。その条件としては、ノバパック^TMフェニル
（ウォーターズ社）のカラムで、０．０５Ｍリン酸１カ
リウム（ｐＨ３．５）とアセトニトリルを６０：４０に
混合した溶媒を１ｍｌ／ｍｉｎで溶出させ、２５４ｎｍ
の吸光度にて検出した。基質特異性等の検討において
は、反応により生成したアンモニアをＪ．Ｃｌｉｎ．Ｐ
ａｔｈ．，１３，１５６（１９６０）の方法にて測定し
た。１分間に１μｍｏｌのケトプロフェンまたはアンモ
ニアを生成する酵素量を１単位とした。

【００１０】ケトプロフェンの光学純度は高速液体クロ
マトグラフィー（条件；スミキラルＯＡ−２５００Ｓの
カラムで、０．０３Ｍ酢酸アンモニウム添加メタノール
溶媒を１．０ｍｌ／ｍｉｎで溶出させ、２５４ｎｍの吸
光度で検出。）を用いて測定した。酵素の均一性は、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動をトリスーグリ
シン緩衝液を用い４〜１２％ゲルにて、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２４４，４４０６（１９６９）の方法にて
行った。均一な１本のタンパクバンドが見られ、公知の
標準タンパクとの比較よりこのタンパクの分子量は５
４．０±２．０ｋＤａとなった。

【００１１】酵素の性質は、均一に精製された後、次の
様であった。 酵素作用；アミド類に作用し、カルボン酸とアンモニ
アに加水分解する反応の触媒としての機能を示す。少な
くともケトプロフェンアミドに対しては、エナンチオ選
択的加水分解を行いＲ−ケトプロフェンを生成する反応
の触媒としての機能を示す。 基質特異性；脂肪族アミドに作用するが、特にｎ−カ
プロンアミドに強く作用する。 分子量；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びろ過法により分子量は
５４．０±２．０のｋＤａであり、単一のサブユニット
から構成されるモノマーである。 Ｎ末アミノ酸配列；Ｅｄｍａｎ分解反応を応用したＡ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社の気相プロテイン
・シーケンサーに適用し、ＰＴＨアミノ酸をＨＰＬＣ法
にて分析した結果、Ｎ末アミノ酸配列は次のようであ
る。 Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔ
ｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅ
ｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ
−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ− この配列から、特開平４−２１８３７９号公報記載のブ
レビバクテリムＲ３１２及びロドコッカスのアミダー
ゼ、さらには特開平５−２３６９９３号公報記載のコマ
モナスのアミダーゼとは全く配列が異なり、本発明のタ
ンパク質が全く新規であることを示している。 至適ｐＨ及び至適温度；各種緩衝液〔−●−；リン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ５．５〜８．０）、−△−；トリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０〜９．０）、−〇−；グリ
シン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０〜１１．０）〕を用
いて至適ｐＨをみたところ、図１に示す通り、至適ｐＨ
はかなり広く８．５〜１０．０付近が最も良かった。３
５℃付近で加水分解活性は最大となった。 温度安定性；リン酸緩衝液ｐＨ８．０、２８℃に１週
間放置しても、活性は７５％以上残存していた。

【００１２】上記の性質を持つ酵素タンパク質をコード
する遺伝子としては配列表の配列番号３に示すような塩
基配列を有するものが挙げられる。本発明のタンパク質
をコードする遺伝子ＤＮＡ断片は、例えば、次のような
方法によって得られる。本発明のタンパク質をコードす
る遺伝子を含有するＤＮＡライブラリーとしては、土壌
から分離してきたコマモナス アシドボランス（Ｃｏｍ
ａｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）ＫＰＯ−２７
７１−４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４８４２）から調製して
きた染色体ＤＮＡを用いて、常法により作成したプラス
ミドライブラリーが利用できる。

【００１３】本発明に係る遺伝子ＤＮＡは、大略下記の
工程によって造成することができる。（１）コマモナス
アシドボランス ＫＰＯ−２７７１−４株から染色体
のＤＮＡを抽出し、適当な制限酵素（例えばＳａｕ３Ａ
１等）で部分分解する。 （２）（１）で得られたＤＮＡ断片を適当なベクターに
組み込み、コマモナスアシドボランスの染色体ＤＮＡラ
イブラリーを構築する。 （３）得られた精製アミダーゼのＮ末端アミノ酸配列の
一部分について、これより推定される遺伝子のＤＮＡ塩
基配列をもつオリゴヌクレオチドの混合物を合成し、こ
れをＤＮＡプローブと称する。 （４）（３）で得たＤＮＡプローブをラベルし、（２）
で得られたライブラリーとハイブリダイゼーションを行
わせ、該プローブと相同性を示すクローンを選択分離す
る。 （５）（４）で選択したクローンよりＤＮＡを抽出し、
同上のプローブを用いてサザンハイブリダイゼーション
を行い、適当なサイズの制限酵素断片上に目的の遺伝子
を位置づけ、それをプラスにミドベクターにサブクロー
ンする。 （６）サブクローン化されたプラスミドを用いて、ベク
ターに組み込まれたコマモナス アシドボランス ＫＰ
Ｏ−２７７１−４株由来のＤＮＡの塩基配列を決定す
る。 （７）決定されたＤＮＡ塩基配列中にアミダーゼのアミ
ノ酸配列の読取り枠を見い出し、上記工程で得られたＤ
ＮＡ断片中に、アミダーゼの全コード領域が存在するこ
とを確認する。

【００１４】上記の工程中でＤＮＡ、組換え体宿主とし
ての大腸菌の取扱いに必要な一般的な操作は、当業者間
で通常行われているものであり、例えばＭａｎｉａｔｉ
ｓらの実験操作書（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａ
ｌ．， ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８
２， １９８９）に従えば容易に実施できる。使用する
酵素、試薬類もすべて市販の製品を用いることができ、
特に断らない限り、製品で指定されている使用条件に従
えば、完全にそれらの目的を達成することができる。

【００１５】上記（１）において該菌からの全ＤＮＡ抽
出は、例えばＳａｉｔｏら〔Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９−６２９（１９６
３）〕の方法に準じて行うことができる。上記（２）に
おけるベクターとしては、例えば、ＥＭＢＬ３，ＥＭＢ
Ｌ４（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）等のラムダファージベ
クターもしくは、ｐＨＣ７９（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ〈ＢＲＬ〉
社）等のコスミドベクターを使用することができる。上
記（３）において指定された塩基配列をもつオリゴヌク
レオチドの混合物の合成には、市販のＤＮＡ合成機を用
い、その操作手順に従って実施することができる。上記
（４）におけるラベル化は、従来から汎用されている放
射性同位元素あるいはジゴキシゲニン、ビオチン等の非
放射性化合物のいずれも使用可能であり、ジゴキシゲニ
ンによる標識は、ノンラジオシステムＤＮＡ標識システ
ム（ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ：Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ社）を用い、それに付属するプロトコールに従
えば容易に実施できる。上記（６）におけるＤＮＡ塩基
配列の決定法も公知の方法を用いることができる〔たと
えば文献：サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７７），７
４，５４６３−５４６７〕。

【００１６】また、以下の実施例において、特に断らな
い限り、制限酵素消化により生ずるＤＮＡ断片のアガロ
ースゲルからの分離精製はジーンクリーン（ＧＥＮＥ
ＣＬＥＡＮ^TM フナコシ社販）を用いてその添付プロト
コールに従って行い、サブクローニング、プラスミド構
築等における基本操作（ＤＮＡ断片間の連結反応、該反
応により生ずるハイブリッドプラスミドによる大腸菌の
形質転換、得られた形質転換体からのプラスミドの調製
及びその解析等）はすべて上記マニアティスの実験操作
書に準じて行った。

【００１７】上記の方法によって得られたアミダーゼ遺
伝子を保有する組換え大腸菌をエシェリヒア コリ（Ｅ
ｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＫＰ０２株と命名し、
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭ
Ｐ−１４８４１として寄託されている。更に、本発明
により得られた遺伝子を種々の大腸菌用発現プラスミド
〔例えばｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社）〕に組み込
むことにより、アミダーゼ高発現株を造成することが可
能となる。また、他の微生物、例えばブレビバクテリウ
ム属に属する菌、ロドコッカス属に属する菌、バチルス
属に属する菌など細菌類、放線菌や酵母に対しても、宿
主−ベクター系が確立されているものを用いることによ
り、大腸菌の場合と同様に、得られた遺伝子をベクター
に組み込むことにより、アミダーゼ高発現系株を創製す
ることを可能とする。例えば、ブレビバクテリウム属に
属する菌の場合には、Ｇａｌｚｙら（ＦＥＭＳ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１２２，１２９
〜１３６（１９９４））の方法、ロドコッカス属に属す
る菌の場合には、Ｂｅｐｐｕら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，１８１，５６３〜５７０（１９８９）の方法
に従って創製することができる。

【００１８】またこのＫＰ０２株の培養に当たっては、
その栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよ
く、通常多くの場合は液体培養を行うが、工業的には深
部通気攪拌培養を行うのが有利である。培養の栄養源と
しては、先に挙げた如くの微生物の培養に用いられる炭
素源、窒素源、無機栄養源を適宜組み合わせて使用でき
る。

【００１９】培養の温度は微生物が発育し、アミダーゼ
を生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア コ
リの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養条
件は、条件によって多少異なるが、アミダーゼが最高収
量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了す
ればよく、通常は１２〜４８時間程度である。培地ｐＨ
は菌が発育し、アミダーゼを生産する範囲で適宜変更そ
得るもので、好ましくはｐＨ６〜８程度である。

【００２０】本発明は、また、下記一般式（Ｉ）

【００２１】

【化３】

【００２２】（式中、Ｒ₁ は置換または無置換のアルキ
ル基、置換または無置換のアリール基、置換または無置
換の複素環基を示す。Ｒ₂ はハロゲン原子、ヒドロキシ
基、アルキル基を示す。ただし、Ｒ₁ とＲ₂ は同一とな
ることはない。）に示されるラセミ体のアミド類に、上
記に記される遺伝子を含有する微生物またはその調整物
を作用させ、下記一般式（ＩＩ）

【００２３】

【化４】

【００２４】（式中、Ｒ₁ およびＲ₂ は上記と同一であ
る。）で示される光学活性な有機酸を取得することを特
徴とする光学活性な有機酸の製造方法である。本発明に
おける反応方法は、微生物またはその調製物と式（Ｉ）
で示されるラセミ体のアミド類を接触することにより行
われる。まず、本発明における一般式（Ｉ）に示される
ラセミ体のアミド類において、例えば基Ｒ₁ のアルキル
基としては、例えば炭素数１〜１０の直鎖または分岐鎖
状で、不飽和結合を有してもよい。アリール基として
は、例えばフェニル基やナフチル基などが挙げられる。
複素環基としては、例えば異種原子として窒素、酸素、
硫黄の少なくとも１種を１個から３個を含み、炭素数３
〜１５から構成される複素環からなるものが好ましい。
また基Ｒ₁ における置換基としては、例えば炭素数１〜
４の低級アルキル基、アミノ基、低級アルキル基を有し
てもよい置換アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル
基、チオール基、ニトロ基、フッ素、塩素、ヨウ素、臭
素などのハロゲン原子などの適宜な置換基が挙げられ
る。

【００２５】また基Ｒ₂ としては、例えばフッ素、塩
素、ヨウ素、臭素などのハロゲン原子、ヒドロキシ基や
例えば炭素数１〜１０の直鎖または分岐鎖状で、不飽和
結合を有してもよいアルキル基が挙げられる。具体的な
化合物としては、好適にはケトプロフェンアミド、イブ
プロフェンアミド〔α−メチル−４−（２−メチルプロ
ピル）ベンゼンアセトアミド〕、プラノプロフェンアミ
ド〔α−メチル−５Ｈ−（１）ベンゾピラノ（２，３−
ｂ）ピリジン−７−アセトアミド〕、ナプロキセンアミ
ド〔（±）−６−メトキシ−α−メチル−２−ナフタレ
ンアセトアミド〕、マンデル酸アミド〔α−ヒドロキシ
ベンゼンアセトアミド〕、フェニル酪酸アミド、２−ク
ロロプロピオン酸アミド、β−フェニル乳酸アミド、４
−クロロ−α−（１−メチルエチル）フェニル酢酸アミ
ド、３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミド
などが挙げられる。

【００２６】また本発明における一般式（ＩＩ）で示さ
れる光学活性な有機酸としては、上記一般式（Ｉ）に示
されるアミド類からアミノ基が酵素的に加水分解されて
得られる酸であり、これらの目的物は医薬、農薬、液晶
やこれらの中間体として有用な化合物であり、または光
学分割剤として有用なものである。また本発明における
微生物またはその調製物とは、具体的には、コマモナス
アシドボランス ＫＰＯ−２７７１−４株または前記遺
伝子を含有する形質転換体を培養した培養物、そこから
集めた菌体または菌体処理物（例えば、菌体の破砕物ま
たは菌体より分離抽出した酵素）、さらには菌体または
菌体処理物を適当な方法により担体に固定化したものを
示す。

【００２７】本発明における反応条件としては、反応媒
体は水、緩衝液または有機溶媒をまぜた水性媒体、さら
には有機溶媒と水性媒体との二相系が使用できる。反応
媒体中へは、式（Ｉ）で示されるラセミ体アミド類を固
体または液体のままで、あるいは適当な溶媒に溶かして
添加する。アミド類の添加濃度は０．０１〜７０％重量
の範囲で選べばよく、反応媒体中に完全溶解しなくても
よい。アミダーゼ活性のために用いるその微生物または
その調整物としてはアミダーゼ活性に基づいて適宜使用
量を決定すればよく、原料のアミド類の濃度によって適
宜変更すればよく、例えば０．０１〜２０単位／ｍｌの
範囲で選択すればよい。反応温度は５〜６０℃、反応ｐ
Ｈは４〜１２、反応時間は１〜２００時間の範囲であ
る。アミドは連続的にまたは間欠的に補充してもよい。
また生成される式（ＩＩ）で示される有機酸は連続的に
反応系外へ膜等を使って抜き出してもよい。反応は、生
成される光学活性な有機酸の含有率が低下しない範囲で
止めればよく、通常は反応率が１０〜６０％の範囲に達
するまで行われる。

【００２８】本発明における光学活性な有機酸の回収
は、次のようにして行われる。反応終了液より菌体等の
不溶物を除去した後、ｐＨを７．５〜１０とし、ｎ−ブ
タノール、ベンゼン、ジエチルエーテル、クロロホルム
等の溶媒により未反応のアミド等を抽出除去し、次に、
ｐＨを２〜４としｎ−ブタノール、ベンゼン、ジエチル
エーテル、クロロホルム等の溶媒で抽出することにより
目的物を回収する。さらに、目的物の精製は、シリカゲ
ル、活性炭等を用いた処理、結晶化等により行われる。

【００２９】

【実施例】次に、実施例により本発明をより詳細に説明
するが、本発明はなんらこれによって限定されるもので
はない。

【００３０】

【実施例１】 菌体反応によるＲ−ケトプロフェンの製造 フマル酸ナトリウム１％、酵母エキス１％、ポリペプト
ン０．５％、リン酸２カリウム０．２％、硫酸マグネシ
ウム７水塩０．０２％、硫酸第１鉄７水塩０．００３
％、塩化ナトリウム０．１％、イソブチロニトリル０．
１％を含みｐＨを６．８とした殺菌培地 ５００ｍｌ
に、あらかじめ同培地で培養したコマモナスアシドボラ
ンス ＫＰＯ−２７７１−４（ＦＥＲＭ Ｐ−１４８４
２）株を２％植菌し、２８℃で２日振盪培養した。培養
後、遠心分離により菌体を集め、これを０．０１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ８．０）１６０ｍｌを含む三角フラスコ
中に懸濁させた後、ケトプロフェンアミド（３−ベンゾ
イル−α−メチルベンゼンアセトアミド）２ｇを加え、
３２℃で振盪しながら反応させた。

【００３１】３０時間後に反応を終了し、遠心分離によ
り菌体を除去した後、その上清液のｐＨを１１とし、ジ
クロロメタン２００ｍｌを添加して未反応のアミド等を
抽出除去した。水層のｐＨを２に塩酸にて調製した後、
ジクロロメタン２００ｍｌを添加して目的物を抽出し
た。次に活性炭を１０ｇ添加し十分撹拌した後、活性炭
をろ過し除去した。この液を濃縮し冷却することにより
結晶を得た。これを５０℃、１日減圧乾燥させたところ
７８０ｍｇのＲ−（−）−ケトプロフェンを得た。

【００３２】本品はＴＬＣクロマトグラフィーおよび高
速液体クロマトグラフィーにて単一であった。比旋光度
〔α〕_D ²⁵＝−４１．６°（ｃ＝１，エタノール）及び
高速液体クロマトグラフィーによる光学純度測定によ
り、光学純度は９８．０％ｅ．ｅ．となった。

【００３３】

【実施例２】 アミダーゼの精製 実施例１と同様な培養にて、コマモナス アシドボラン
ス ＫＰＯ−２７７１−４株を２０００ｍｌ培養した。
遠心分離により集菌し、０．１ｍＭリン酸カリウム緩衝
液〔ｐＨ８．０〕（以後、この緩衝液をＫＰＢと略
す。）にて菌体を洗浄した後、１０３ｍｌのＫＰＢに懸
濁する。この液を、９ｋＨｚにおける超音波処理を約３
０分行い、菌体を破砕した。破砕菌体は、１５，０００
ｘｇ、２０分の遠心分離で除去し、無細胞抽出液を得
た。

【００３４】これに硫酸アンモニウムを３０％になるよ
うに添加した後、遠心分離により上清を取得した。これ
に硫酸アンモニウムをさらに７０％になるように添加
し、遠心分離により活性画分を沈澱として取得した。こ
の沈澱は５０ｍｌのＫＰＢに溶解後、十分な量のＫＰＢ
にて透析し、硫安３０〜７０％画分とした。次に、１０
０，０００ｘｇ、２時間の超遠心分離を行い、上清液を
ＤＥＡＥ−セルロースを通過させ、ＫＰＢと０．５Ｍの
塩化ナトリウムを含むＫＰＢのグラジエントで酵素を溶
出させた。活性画分を集め、硫酸アンモニウムを３０％
となる様に添加した後、フェニルセファロース ＣＬ−
４Ｂのカラムを通過させ、３０％の硫酸アンモニウムを
含むＫＰＢと６０％エチレングリコールを含むＫＰＢの
グラジエントにて酵素を溶出した。

【００３５】活性画分を集め、ＫＰＢで透析した後、Ｄ
ＥＡＥ−セルロースを通過させ、ＫＰＢと０．１Ｍの塩
化ナトリウムを含むＫＰＢのグラジエントにて酵素を溶
出した。集めた活性画分を限外ろ過（ＹＭ１０メンブラ
ン〔アミコン社〕を使用）にて濃縮し、セファクリル
Ｓ−４００のカラムを通過させて、アミダーゼを均一に
精製した。この精製過程を表１に示した。

【００３６】

【表１】

【００３７】

【実施例３】 基質特異性の検討 実施例２で均一に精製されたアミダーゼを用いて、基質
特異性を検討した。アミド化合物５μｍｏｌ、リン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ８．０）１０μｍｏｌ、牛血清アル
ブミン１ｍｇ、２５μｌのメタノール、およびアミダー
ゼ０．００１〜０．１単位を加え、１．０ｍｌになるよ
うに混合し、３０℃にて３０分反応を行わせ、生成する
アンモニアを定量することにより活性を求めた。各種ア
ミド化合物に対する活性について、ケトプロフェンアミ
ドを１００％とした場合の相対活性の結果として表２に
示した。その結果、脂肪酸アミドに作用、特にｎ−カプ
ロンアミドに強く作用する。

【００３８】

【表２】

【００３９】

【実施例４】 至適ｐＨの検討 実施例２．で均一に精製されたアミダーゼを用いて、至
適ｐＨの検討を行った。ケトプロフェンアミド５μｍｏ
ｌ、各緩衝液１０μｍｏｌ、牛血清アルブミン１ｍｇお
よびアミダーゼ０．０１単位を加え、１．０ｍｌになる
ように混合し、３０℃で３０分反応を行わせ、生成する
ケトプロフェンを定量することにより活性を求めた。緩
衝液はｐＨ５．５〜８．０のリン酸カリウム緩衝液、ｐ
Ｈ７．５〜９．０のトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９．０〜
１０．５のグリシン−ＮａＯＨ緩衝液を用いた。結果は
図１に示すとおりとなり、至適ｐＨは８．５〜１０．０
付近であった。

【００４０】

【実施例５】 コマモナス アシドボランス ＫＰＯ−２７７１−４株
の遺伝子ライブラリーの作製 土壌分離菌 コマモナス アシドボランス ＫＰＯ−２
７７１−４株の染色体ＤＮＡは、以下のごとく調製し
た。

【００４１】本菌株を前記実施例１における培地１００
ｍｌに植菌して培養した後集菌し、この菌体を水で洗浄
後、ＴＥ[10mM Tris-HCl(pH8.0),10mM EDTA]１６ｍｌに
懸濁し、リゾチーム１６ｍｇとアクロモペプチダーゼ８
ＫＵを加えて３７℃で１時間振とうした後、４ｍｇプロ
テアーゼK含有の水を０．４ｍｌ添加して更に１５分間
振とうした。次に１０％ＳＤＳを２ｍｌ加え、３７℃で
１時間振とうした後５５℃で更に１０分間インキュベー
トした。次に等量のＴＥ飽和フェノールを加え、１０分
間振とうした。遠心後、上層を取り、等量のＴＥ飽和フ
ェノール・クロロホルムを加え５分間振とうし（以下、
この操作をフェノール処理と呼ぶ）、遠心後の上層に
２．５倍量のエタノールを加えたのちガラス棒でＤＮＡ
を巻き取り、７０％エタノールで脱水した。次にＤＮＡ
を２ｍｌのＴＥバッファーに溶解させた後１００℃、１
０分間の加熱処理したＲＮａｓｅＡ水溶液を終濃度１０
ｕｇ／ｍｌになるように加えて３７℃で２０分間保温し
た。その後１．２ｍｌのＰＥＧ−ＮａＣｌ[20% PEG 600
0,2.5M NaCl]を加えて４℃で２時間静置後、遠心しエタ
ノール沈澱によりＤＮＡを回収した。この結果、１．０
ｍｇの染色体ＤＮＡが得られた。

【００４２】得られた染色体ＤＮＡをＳａｕ ３Ａ（宝
酒造製）で部分消化した後ＥＭＢＬ３ ＣＬＯＮＩＧＫ
ＩＴ(STRATAGENE 製）を用いてλＥＭＢＬ３内のＢａｍ
ＨＩ部位に組み込んだ。次にこのＤＮＡをGIGAPACK II
PACKAGING EXTRACT(STRATAGENE製）を用いてプロトコー
ルに従ってλファージ内にパッケージングして、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ＬＥ３９２に感染させたところ、１ｍｌあたり
６×１０⁵ 個の組み換えファージを含有することが判明
した。

【００４３】

【実施例６】アミダーゼタンパク質をコードするDNA断
片を含むクローンのスクリーニング精製アミダーゼから
決定されたＮ末端アミノ酸配列に基づいて、配列表の配
列番号１と２に示した合成ｍｉｘＤＮＡ ＫＰ０１（２
０ｍｅｒ、９６ｍｉｘ）とＫＰ０２（２０ｍｅｒ、２５
６ｍｉｘ）を化学合成し、それぞれ４００ｐｍｏｌをノ
ンラジオシステムＤＮＡ標識システム(DNA Labeling Ki
t 、Boehringer製）を用い、それに付属するプロトコー
ルに従って、ジゴキシゲニン標識デオキシウリジン−３
−リン酸（ＤＩＧ−ｄＵＴＰ）で標識した。以後これら
のプローブをＫＰ０１、ＫＰ０２−プローブと称する。

【００４４】上記実施例５で調製したファージ液（遺伝
子ライブラリー）の一部をＬＥ３９２に感染させ、４枚
のプレートに４×１０³ 個のプラークを形成させた。こ
れらプラークをフィルター(Hybond-N 、Amersham製）に
転写し、アルカリ変成、中和処理を行いUV照射でＤＮＡ
を固定した後、上記で得られたＫＰ０１、ＫＰ０２−プ
ローブとハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイ
ゼーションは、５×ＳＳＣ、０．０２％ＳＤＳ、１％ブ
ロッキング剤(Blocking Reagent 、Boehringer製）、
０．１％Ｎ−ラウロイルザルコシン及び終濃度１０ｐｍ
ｏｌ／ｍｌでＫＰ０−プローブを含有する溶液を用いて
５０℃で終夜行った。

【００４５】次いで、フィルターを０．１％のＳＤＳを
含む６×ＳＳＣ溶液中室温で５分間ずつ２回洗浄し、さ
らに同バッファーでＫＰ０１−プローブは５４、５８、
６２、６６℃で、ＫＰ０２−プローブは５６、６０、６
４、６８℃で５分ずつ１回洗浄した。次いでアルカリホ
スファターゼ標識された抗ジゴキシゲニン抗体及び発光
基質ＡＭＰＰＤを利用した検出キット(DIG Luminescent
Detection Kit、Boehringer製）を使用し、その添付プ
ロトコールに従ってＫＰ０１、ＫＰ０２−プローブと最
も厳しい条件下でハイブリダイズしたクローンの検出を
行った。

【００４６】その結果、５個の陽性スポットが見いださ
れた。これらのスポットに対応するファージクローンを
λ−ＫＰ０１、λ−ＫＰ０２、λ−ＫＰ０３、λ−ＫＰ
０４、λ−ＫＰ０５と各々命名した。得られた５個のフ
ァージクローンよりグロスバーガー(Grossberger）記載
の方法（文献：Nucleic Acids,Research(1987)15,6737)
に従ってＤＮＡを抽出した。次いでこのラムダＤＮＡを
ＢｇｌＩＩで消化して、アガロースゲル電気泳動を行っ
た後、ＫＰ０１−プローブを用いてサザンハイブリダイ
ゼーション（方法については文献：サザン(Sourthern),
〔J.Mol.Biol.(1975)98,503-517 〕を行った。なお、ハ
イブリダイゼーション後のフィルター（ハイボンドＮ）
の洗浄を５４℃で行った以外の操作は上記に記載したも
のと同様に行った。その結果、上記クロ−ンλ−ＫＰ０
４に存在する２．７ＫｂのＢｇｌＩＩ断片が該プロ−ブ
とハイブリダイズすることが判明した。

【００４７】

【実施例７】 ＤＮＡ断片のサブクローニング及び塩基配列の決定 実施例６で得た２．７ＫｂのＢｇｌＩＩ断片をプラスミ
ドベクターｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩ部位にサブクロー
ニングすることによって、ｐＫＰ０２を取得した。

【００４８】次に、ｐＫＰ０２を種々の制限酵素で切断
しアガロースゲル電気泳動により解析した結果、図２で
示される２．７Ｋｂインサートの制限酵素地図が得られ
た。上記のインサート内のＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片の
全塩基配列をサンガーらの方法に基づき決定した。この
結果、配列表の配列番号３に示すような塩基配列と予想
される翻訳産物の配列が得られた。翻訳産物配列中のメ
チオニンに続く２５のアミノ酸からなる配列は精製タン
パクから決定されたＮ末端アミノ酸配列と完全に一致し
ていた。また、本酵素は４７３個のアミノ酸によって構
成されていることが確認された。なお、ｐＫＰ０２を有
する大腸菌ＫＰ０２株は、インサートを保持しないベク
タープラスミドを有する大腸菌に比べて明かなアミダー
ゼ活性を有していたことから、本インサート内に、アミ
ダーゼ遺伝子が存在していることが確認された。

【００４９】

【実施例８】ｐＫＰＯ２を有する大腸菌ＫＰ０２株を用
いたＲ−ケトプロフェンの製造肉エキス０．３％、ペプ
トン１％、塩化ナトリウム０．５％、イソプロピル−β
−Ｄ−（−）−チオガラクトピラノシドを１ｍＭ（別
殺）含みｐＨを７．０とした殺菌培地５００ｍｌに、あ
らかじめ同培地で培養したＫＰ０２株を２％植菌し、３
７℃で１日振盪培養した。培養後、遠心分離により菌体
を集め、これを０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２０ｍｌを含む三角フラスコ中に懸濁させた後、ケトプ
ロフェンアミド２００ｍｇを加え、３２℃で４０時間反
応させた。反応終了液は除菌後、実施例１と同様な方法
にて精製を行うことにより、６５ｍｇのＲ−（−）−ケ
トプロフェンを得た。高速液体クロマトグラフィーによ
る、純度は９９．５％、光学純度は９９％ｅ．ｅ．であ
った。

【００５０】

【発明の効果】本発明により、アミダーゼ活性を有する
新規タンパク質及びこのタンパク質をコードする新規遺
伝子が得られた。この新規アミダーゼ及びこの遺伝子を
含有する微生物またはその調製物を作用させることによ
り、ラセミ体のアミド化合物からエナンチオ選択的加水
分解を行って光学活性な有機酸を工業的に有利に製造す
ることが可能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明のアミダーゼの至適ｐＨ曲線を示
す。

【図２】図２は本発明のアミダーゼ遺伝子の制限酵素サ
イトを示す図である。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GAYYTNCAYT AYTGGGARGC

【配列表】

配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TAYTGGGARC CNGCNGARYT

【配列表】

配列番号：3 配列の長さ：２４３８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：コマモナス アシドボランス(Comamonas acidv
orans) 株名：ＫＰＯ−２７７１−４ 配列の特徴 存在位置：４８５−１９０６ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ＣＤＳ 配列 AGATCTTCTT TGATGTCCGC ATCAATCCGC GCACCAGCCC GGCCGACGTC AAGGCCCAGT 60 TCGCGCAGTT CGTCGCGGAA CTGCGCGCAC GGCACCCGGA ACTCGATCTG GACTGGGAGA 120 TGTATGGCTC CGTTCCGGGC GGCACCACCG CGCCGTCCAA CTGGATCGTC CAGTCGGCCA 180 GGCGCGGATG GGAGCATATC GAAGCGCGCC CGCATGGCAT TCCCGAGCTG CTGGGCGGAC 240 AGACCGACGG CGCGGCCCTG CGCCGCTTCG GCATTCCAAC CGCACGCATC GGCTGGCCAT 300 GGCCGGCGCA GGGTTCGCCC GAAAGCGTGG CCGAAGGCCT GGGTGGCATG GGTGCCACCT 360 ATGTCCCGGA CCTGCTGCCT TGCGCGCGCA AGATCATGTA CGCCGTGATC GATACGCTGA 420 CGCGCAGACG TGCGGAACTC GGCTTGCGCT GAGGACTCCC GACAAACTTC CCGACCCATT 480 GCTT ATG CCG AAC GCA GAC CTC CAC TAC TGG GAA GCC GCG GAG CTT GCA 529 Met Pro Asn Ala Asp Leu His Tyr Trp Glu Ala Ala Glu Leu Ala 1 5 10 15 CGC AAG ATC CGC GCG CGC GAC ATC TCG CCT GTA GAA GTT ACC GAA GCC 577 Arg Lys Ile Arg Ala Arg Asp Ile Ser Pro Val Glu Val Thr Glu Ala 20 25 30 ATC CTT GAA CGA ATC TCC GAC CTC GAT CCG GCG CTG CAC AGC TAC GCC 625 Ile Leu Glu Arg Ile Ser Asp Leu Asp Pro Ala Leu His Ser Tyr Ala 35 40 45 CTG GTC CTG CCT GAA CAG GCG CTG GAA CAG GCA CGC GAC GCC GAA CGG 673 Leu Val Leu Pro Glu Gln Ala Leu Glu Gln Ala Arg Asp Ala Glu Arg 50 55 60 GCG CTG ATG CAC GGC GGC CCG CTC GGC GCA CTG CAC GGC GTG CCG GTG 721 Ala Leu Met His Gly Gly Pro Leu Gly Ala Leu His Gly Val Pro Val 65 70 75 GCG GTC AAG GAC CTC TGC TGG CTG GCC GGA TCG CCA ACC GCC GCC GGC 769 Ala Val Lys Asp Leu Cys Trp Leu Ala Gly Ser Pro Thr Ala Ala Gly 80 85 90 95 ACC ACG ATT CAC AAA GAC TTT ATC CCG ACG GAA GAT GCC ACC GTC GTG 817 Thr Thr Ile His Lys Asp Phe Ile Pro Thr Glu Asp Ala Thr Val Val 100 105 110 CGC AAG CTG CGG GAT GCC GGC GCC ATC GTG CTG GGC AAG CTG CAG CTG 865 Arg Lys Leu Arg Asp Ala Gly Ala Ile Val Leu Gly Lys Leu Gln Leu 115 120 125 ACC GAA GGC GCC TTC GCC ACC CAT CAC CCG AGC ATA CCG GAG CCG GTC 913 Thr Glu Gly Ala Phe Ala Thr His His Pro Ser Ile Pro Glu Pro Val 130 135 140 AAT CCC TGG CAC CCC AAC CAC TGG GCC GGC GCC TCT TCC AGC GGC TCC 961 Asn Pro Trp His Pro Asn His Trp Ala Gly Ala Ser Ser Ser Gly Ser 145 150 155 GGT GTC GCC ACG GCC GCC GGG CTT TGC TAC GCA TCG ATC GGC ACG GAC 1009 Gly Val Ala Thr Ala Ala Gly Leu Cys Tyr Ala Ser Ile Gly Thr Asp 160 165 170 175 ACC GGC GGC TCG ATC CGC TTC CCG GCG GCA GCC AAC GGC CTG ACC GGC 1057 Thr Gly Gly Ser Ile Arg Phe Pro Ala Ala Ala Asn Gly Leu Thr Gly 180 185 190 ATC AAG CCG ACG TGG GGC CGG GTC AGC CGC CAC GGA GTA TTC GAG CTC 1105 Ile Lys Pro Thr Trp Gly Arg Val Ser Arg His Gly Val Phe Glu Leu 195 200 205 GGC GCG AGC CTT GAC CAT GTG GGT CCG ATC ACA CGC AGC GCA GCC GAT 1153 Gly Ala Ser Leu Asp His Val Gly Pro Ile Thr Arg Ser Ala Ala Asp 210 215 220 GCC GCG CTG ATG CTA GGG ACC ATT GCC GGC CAC GAT CCG CTG GAT CCG 1201 Ala Ala Leu Met Leu Gly Thr Ile Ala Gly His Asp Pro Leu Asp Pro 225 230 235 ACT TCG CTG CCA CCC TCG CAC CTT GAT TTA CCT GCC GAG AGG AGC GAC 1249 Thr Ser Leu Pro Pro Ser His Leu Asp Leu Pro Ala Glu Arg Ser Asp 240 245 250 255 CTG CGC GGT CTG CGC ATC GGT GTC GAC GTG CAA TGG AAC AGC GAT GGC 1297 Leu Arg Gly Leu Arg Ile Gly Val Asp Val Gln Trp Asn Ser Asp Gly 260 265 270 ACG GAT GAC GTC ATC AGC CAG GCC ATC GAC CGG GCC ATC GAC GTG CTC 1345 Thr Asp Asp Val Ile Ser Gln Ala Ile Asp Arg Ala Ile Asp Val Leu 275 280 285 AAG GCG CTT GAC GGG CAG GTC CAG GAG GTT CGC TTT CCC GCA GTG CGC 1393 Lys Ala Leu Asp Gly Gln Val Gln Glu Val Arg Phe Pro Ala Val Arg 290 295 300 ACC GTG GTC GAC GAA TGG GAA ATC AAC TGC GGC GTC GAA GTC GCC GTG 1441 Thr Val Val Asp Glu Trp Glu Ile Asn Cys Gly Val Glu Val Ala Val 305 310 315 GCG CAT GCG GGG ACG TTC CCG CGC CTG TCG GCG GAA TAT GGG CCA GCG 1489 Ala His Ala Gly Thr Phe Pro Arg Leu Ser Ala Glu Tyr Gly Pro Ala 320 325 330 335 CTG ACC CGG CTG ATC GAG ATT GGT CGC AAT ACC AGC GGC ATG CGC TAT 1537 Leu Thr Arg Leu Ile Glu Ile Gly Arg Asn Thr Ser Gly Met Arg Tyr 340 345 350 CAG CAA GCC TTG CTG AAC CGT GCA GCT TTC CGT GGC AAG GTC AAC AAG 1585 Gln Gln Ala Leu Leu Asn Arg Ala Ala Phe Arg Gly Lys Val Asn Lys 355 360 365 CTG ATG CAG GAC ATC GAT CTG CTG GTC GTC CCG GTA CAG CCT TTC GCC 1633 Leu Met Gln Asp Ile Asp Leu Leu Val Val Pro Val Gln Pro Phe Ala 370 375 380 GCA CCG ACG CAT GAA CAG CTG GGT GCG CTG GCG CAA GAC CCG GAA CTG 1681 Ala Pro Thr His Glu Gln Leu Gly Ala Leu Ala Gln Asp Pro Glu Leu 385 390 395 AAC AGC CGG CTG ATC CAG TTC ACG GCG CCG TTC AAC TCC ACC GGG CAT 1729 Asn Ser Arg Leu Ile Gln Phe Thr Ala Pro Phe Asn Ser Thr Gly His 400 405 410 415 CCC GCG ATC ACG CTG CCA TGT GGA TTC ACC GCG GGC GGC ATG CCG ATC 1777 Pro Ala Ile Thr Leu Pro Cys Gly Phe Thr Ala Gly Gly Met Pro Ile 420 425 430 GCA TTC CAG CTG GTG GCG CGC CAT GGT GAG GAA GCA CTG CTG TGC CGA 1825 Ala Phe Gln Leu Val Ala Arg His Gly Glu Glu Ala Leu Leu Cys Arg 435 440 445 GCC GGC ATG GCA TTC CAG CAG GCC ACC GAC TGG CAC CGC TAC CAT CCG 1873 Ala Gly Met Ala Phe Gln Gln Ala Thr Asp Trp His Arg Tyr His Pro 450 455 460 GAG ATT GGC GTC AAG CGC GCT GAC GCT GCG TGATGAGATC AGGCCGGGCA 1923 Glu Ile Gly Val Lys Arg Ala Asp Ala Ala 465 470 ATGCCGGCCT GATTTCATTC CTGCCCGTCT TCCCGCAACG GTGTGATCGT CGCCGAATCG 1983 CGCGCGGCTT CCTCATAGAT GCCGGTCAGC AGCGAAAGGA AGCGCGATGT CCTTTCAAAT 2043 TTCTCCGACA CCTCGCTGAT TTCCTCCAGC CGCTTCACCA GGATCTCGGC CCTGACCTTG 2103 TAATACTCGT CCGTCAGCCG GACTCCCAGT TCACTGACGG TGTACGCAAA GGTCTTGCTG 2163 TTCTTTTCTC GCTGCTTTTC GATCAGACCG GCCGCTTCCA GCTTGCGCAA GCTGTACTGA 2223 ATATTCGGGA TATCGTCGCG GTTCATCAGG CGCGCAATGG TGGCACTATT CTTCGGCCGG 2283 TCCTGCATCC TGATGACGTG GAGAATGACG TGCTCCTCGT ACTTCATATC CACGTCGGCG 2343 GCAATCGTCA CCATCCCGGT GGACAACACG AACCTGGAAA ACGATTCATG GAACCGGATC 2403 AAGGCCCACT CGAACTCGGT GGCCTTCTGC TCGAG 2438

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 41/00 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＺ //(Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有する新規タンパ
   ク質。 作用 アミド類に作用し、カルボン酸とアンモニアに加水分解
   する反応の触媒としての機能を示す。少なくともケトプ
   ロフェンアミド（３−ベンゾイル−α−メチルベンゼン
   アセトアミド）に対しては、エナンチオ選択的加水分解
   を行い、Ｒ−ケトプロフェンを生成する反応の触媒とし
   ての機能を示す。 基質特異性 脂肪族アミドに作用するが、特にｎ−カプロンアミドに
   強く作用する。 分子量 分子量は５４．０±２．０ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
   であり、単一のサブユニットから構成されている。 Ｎ末アミノ酸配列 Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔ
   ｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅ
   ｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ
   −Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ− 至適ｐＨ及び至適温度 ｐＨ８．５〜１０．０、３５℃で加水分解作用が至適で
   ある。 温度安定性 ｐＨ８．０、２８℃で１週間放置しても、活性は７５％
   以上残存している。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のタンパク質をコードす
   る、配列表の配列番号３におけるアミノ酸配列２〜４７
   ３をコードする塩基で表される遺伝子。
3. 【請求項３】 塩基が、配列表の配列番号３における４
   ８８〜１９０３である請求項２記載の遺伝子。
4. 【請求項４】 下記一般式（Ｉ） 【化１】 （式中、Ｒ₁ は置換または無置換のアルキル基、置換ま
   たは無置換のアリール基、置換または無置換の複素環基
   を示す。Ｒ₂ はハロゲン原子、ヒドロキシ基、アルキル
   基を示す。ただし、Ｒ₁ とＲ₂ は同一となることはな
   い。）で示されるラセミ体のアミド類に、請求項２記載
   の遺伝子を含有する微生物またはその調製物を作用さ
   せ、下記一般式（ＩＩ） 【化２】 （式中、Ｒ₁ およびＲ₂ は上記と同一である。）で示さ
   れる光学活性な酸を取得することを特徴とする光学活性
   な有機酸の製造方法。
5. 【請求項５】 コマモナス アシドボランス（Ｃｏｍａ
   ｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ） ＫＰＯ−２７
   ７１−４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４８４２）。