JPH099973A - ロードコッカス属細菌由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子およびアミダーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】ロードコッカス属細菌由来のニトリルヒドラタ
ーゼ遺伝子とアミダーゼ遺伝子およびそれらのＤＮＡ配
列を提供すること。 【構成】ロードコッカス属細菌由来のニトリルヒドラタ
ーゼ遺伝子およびアミダーゼ遺伝子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はロードコッカス属細菌由
来のニトリル分解系酵素であるニトリルヒドラターゼ遺
伝子およびアミダーゼ遺伝子のＤＮＡ配列に関する。

【０００２】

【従来の技術】ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ
はそれぞれニトリル化合物をアミドに、アミド化合物を
カルボン酸に変換する反応を触媒する。本発明で得られ
るニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼを用いること
によってニトリル化合物から、医薬原料や液晶材料等に
有用なアミドまたはカルボン酸を得ることができる。ニ
トリル化合物を温和な条件下でそれぞれ相当するアミド
または酸に変換する方法が生体触媒の利用によって開発
され、このような触媒能をもつ微生物が報告されている
（特公昭５６−１７９１８号公報、特公昭５９−３７９
５１号公報、特公昭６１−１６２１９３号公報、特公昭
６１−２１５１９号公報、特公昭６４−８６８８９号公
報、特公平４−１９７１８９号公報、ＥＰ０４４４６４
０など）。

【０００３】また、これらの微生物からはニトリルヒド
ラターゼやアミダーゼあるいはニトリラーゼが精製さ
れ、さらにはこれらの酵素の遺伝子工学的利用を計るた
め、その遺伝子が単離され一次構造が決定されている。
ニトリルヒドラターゼ遺伝子については、例えばロード
コッカス属細菌由来の遺伝子が特開平２−１１９７７８
号公報やＥＰ０４４５６４６において、シュードモナス
属細菌由来の遺伝子が特開平３−２５１１８４号公報に
おいて、リゾビウム属細菌由来の遺伝子が特開平６−２
５２９６号公報や特開平６−３０３９７１号公報におい
て、またアミダーゼ遺伝子については、例えばブレビバ
クテリウム属細菌とロードコッカス属細菌由来の遺伝子
がＥＰ０４３３１１７に開示されている。さらにロード
コッカス属細菌由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子およ
びアミダーゼ両遺伝子を含む組換え体プラスミドに関す
る発明が特開平５−６８５５６号公報で開示されてい
る。

【０００４】近年、このような微生物がもつニトリル化
合物の変換能を応用する試みがなされている。特に付加
価値の高い光学活性化合物の製造に利用するために、微
生物のスクリーニングがおこなわれている。例えば、特
開平２−８４１９８号公報には光学活性なα−置換有機
酸の製造に用いる微生物について、特開平４−３４１１
８５号公報には光学活性な２−ヒドロキシカルボン酸の
製造に用いる微生物について、ＥＰ０４３３１１７には
光学活性なケトプロフェンの製造に用いる微生物につい
てそれぞれ開示されている。また例えば、Ｍａｙａｕｘ
らはＳ（＋）−２−フェニルプロピオン酸の製造に用い
るロードコッカス属細菌のアミダーゼ遺伝子のＤＮＡ配
列の報告をおこなっている（Mayaux,J-F. et al.,J.Bac
teriol.,173,6694,(1991)）

【０００５】このような微生物のうち、ロードコッカス
ロードクラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏ
ｃｈｒｏｕｓ）ＩＦＯ１５５６４株は様々なラセミ体や
プロキラルなニトリル化合物に対し鏡像体選択的加水分
解能をもつことが報告されていて、今後、光学活性化合
物の製造のための利用の拡大が予想される（Kakeya,H.
et al.,Tetrahedoron Lett.,32,1343,(1991))。例え
ば、ロードコッカスロードクラスＩＦＯ１５５６４株の
培養菌体を用いた光学活性化合物の製造例として、３位
に置換基をもつグルタルニトリル型基質を光学活性なシ
アノカルボン酸に変換する反応（Kakeya.H.,et al.,Che
m.Lett.,1823,(1991))およびプロキラルなジ置換マロノ
ニトリルを強誘電液晶の原料に有用な光学活性アミドカ
ルボン酸に変換する反応（Yokoyama,M.,et al.,Tetrahe
dron:Asymmetry,4,1080,(1993))等があげられる。本菌
のもつこのような特性を工業的に利用するためには、反
応を触媒する酵素のより一層の生産性向上、熱や有機溶
媒中での安定性、あるいは特徴ある基質特異性や位置特
異性などが望まれる。しかし、本菌のニトリルヒドラタ
ーゼやアミダーゼあるいは同様の特性を示す他の生物由
来の酵素については、その構造が明らかにされていな
い。従って、現在多くの研究者が検討している遺伝子工
学的手法やタンパク質工学的手法を用いた酵素の効率的
な生産や改変による改良をおこなうことができなかっ
た。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的はロード
コッカス属細菌由来のニトリルヒドラターゼおよびアミ
ダーゼを、遺伝子工学的手法を用いて効率良く生産した
り、タンパク質工学的手法を用いて改良するために必要
なロードコッカス属細菌由来のニトリルヒドラターゼ遺
伝子、アミダーゼ遺伝子およびそれらのＤＮＡ配列を提
供することにある。

【課題を解決するための手段】本発明は、下記（１）〜
（４）の構成を有する。 （１）配列表の配列番号１で示されるロードコッカス属
細菌菌由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子。 （２）配列表の配列番号２で示されるロードコッカス属
細菌由来のアミダーゼ遺伝子。 （３）ロードコッカス属細菌がロードコッカス ロード
クラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏ
ｕｓ）ＩＦＯ１５５６４株である前記第１項記載の遺伝
子。 （４）ロードコッカス属細菌がロードコッカス ロード
クラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏ
ｕｓ）ＩＦＯ１５５６４株である前記第２項記載の遺伝
子。

【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。ロードコ
ッカス ロードクラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈ
ｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＩＦＯ１５５６４株染色体ＤＮＡ
は、例えばＳａｉｔｏらの方法（Saito,H.& Miura,K.,B
iochim.Biophy.Acta.,72,619,(1963)）を用いて調製す
ることができる。遺伝子のクローニングに用いる染色体
ＤＮＡライブラリーは、例えばｐＵＣ１９プラスミドベ
クターやλＥＭＢＬ３ファージベクターなどを用いて作
製することができる。ニトリルヒドラターゼ遺伝子とア
ミダーゼ遺伝子のクローニングは、例えばＳａｉｋｉら
のＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏ
ｎ（ＰＣＲ）法（Saiki,R.K. et al.,Science,230,1350
(1985)）を用いておこなうことができる。この時、使用
するＰＣＲ用プライマーは、既知ニトリルヒドラターゼ
遺伝子あるいは既知アミダーゼ遺伝子のアミノ酸配列を
比較検討することにより、よく保存された部位あるいは
保存が充分期待される部位などから選び出さなければな
らない。ロードコッカス菌ではＲ．ｓｐ．株（Mayaux,J
-F. et al.,J.Bacteriol.,173,6694,(1991)）、Ｒ．ｓ
ｐ．Ｎ−７７４株（Hashimoto,Y. et al.,Biochim.Biop
hys.Acta.,1088,225,(1991)）、Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐ
ｏｌｉｓＪＣＭ６８２３株（Durban,R. et al.,Biosci.
Biotech.Biochem.,57,1323,(1993)）あるいはＲ．ｒｈ
ｏｄｏｃｈｒｏｕｓＪ１（Kobayashi,M. et al.,Eur.J.
Biochem.,217,327,(1993))株などについて配列が明らか
にされている。また、Ｒ．ｓｐ株、Ｒ．ｓｐ．Ｎ−７７
４株あるいはＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓＪＣＭ６８
２３株などの解析から、これらのアミダーゼ遺伝子下流
にニトリルヒドラターゼ遺伝子が存在することが報告さ
れている。

【０００８】そしてＰＣＲ法で得たニトリルヒドラター
ゼ遺伝子あるいはアミダーゼ遺伝子あるいはその両遺伝
子の一部を含むＤＮＡ断片をスクリーニング用プローブ
として使用することにより、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ
ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ（Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕ
ｓ）ＩＦＯ１５５６４株の染色体ＤＮＡライブラリーか
らニトリルヒドラターゼ遺伝子とアミダーゼ遺伝子を含
む組換え体ＤＮＡを得ることができる。この組換え体Ｄ
ＮＡをサブクローン化することによって、小断片化する
ことができる。そして、ニトリルヒドラターゼ遺伝子お
よびアミダーゼ遺伝子さらにはそれらの発現に必要な領
域のＤＮＡ配列は、Ｓａｎｇｅｒらによるｄｉｄｅｏｘ
ｙ法（Sanger.F. et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,7
4,5463,(1977)）など公知の手法を用いて決定すること
ができる。ここで得られたニトリルヒドラターゼ遺伝子
およびアミダーゼ遺伝子さらにはそれらの発現に必要な
領域のＤＮＡ配列を含む組換えベクターで形質転換され
た形質転換微生物は次の通り工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されている。 ＪＭ１０９（ｐＣＮＨ−ＳＥ） ＦＥＲＭ Ｐ−１４
９０１号

【０００９】

【実施例】以下実施例にて本発明を具体的に説明する。 染色体ＤＮＡの調製Ｒ ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓＩＦＯ１５５６４株を下記
の培地で３０℃にて２日間培養した。

【００１０】培養後の菌体を集菌し、氷冷した０．１Ｍ
のカルシウム溶液にこの菌体を懸濁し３０分間氷中に放
置した。この懸濁液より再び菌体を集菌した後、この菌
体を１０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）、５０ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁した。この
懸濁液に１ｍｇのリゾチームを加え１時間室温に放置し
た後、さらに１ｍｇのアクロモペプチダーゼを加え３０
分間室温に放置した。この溶液に０．５％ＳＤＳ存在
下、１００μｇ／ｍｌの濃度となるようにプロテナーゼ
Ｋ（メルク社製）を加え、一晩５５℃でゆるやかに振盪
した。この溶液をフェノール抽出、エタノール沈殿する
ことによって染色体ＤＮＡを調製した。

【００１１】染色体ライブラリーの作製 得られた染色体ＤＮＡ２０μｇに対し制限酵素Ｓａｕ３
Ａを用いて部分消化をおこなった。即ち、染色体ＤＮＡ
を４μｇづつ５本のチューブにとり、１００μｌの反応
容量中で、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（日本ジーン、２〜８
Ｕ／μl)を下記の条件で添加し３７℃で反応させた後、
終濃度２０ｍＭとなるようＥＤＴＡを加え反応を停止さ
せた。 このようにして調製した染色体ＤＮＡの部分消化断片を
エタノール沈殿により全量回収した後、この染色体ＤＮ
Ａの部分消化断片を、ベックマンＴＬＳ−５５ローター
を用いて２６、０００ｒｐｍ．、１８時間、１５℃の条
件で１０〜４０％Ｗ／Ｗのショ糖密度勾配遠心法により
展開した。１０〜２０ｋｂのＤＮＡ断片を含む分画をエ
タノール沈殿にて回収し、１０μｌのＴＥ溶液に溶解さ
せた。この試料の９μｌと１μｇのＢａｍＨＩ消化λＥ
ＭＢＬ３ベクター（ストラタジーン、λＥＭＢＬ３／Ｂ
ａｍＨＩ ＶｅｃｔｏｒＫｉｔ）とを３５０ＵのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用いて１５μｌの計でラ
イゲーションした。この反応液４μｌについてＧｉｇａ
ｐａｃｋIIＧｏｌｄ（ストラタジーン社製）を用いてｉ
ｎ ｖｉｔｒｏパッケージングをおこなった。このパッ
ケージング溶液の効率を知るために、大腸菌Ｐ２３９２
株を用いてタイター（ｔｉｔｒｅ）測定をおこなった。
その結果、このλＥＭＢＬ３染色体ＤＮＡライブラリー
のサイズは約５５万個の独立クローンが存在するサイズ
であった。このライブラリーの増幅ライブラリーを作製
するために、ライブラリーをプレーティングした後、プ
レートライセート法によりプレートライセート液を調製
した。このライセート液は１ｘ１０⁶ｐｆｕ／μｌであ
った。

【００１２】ニトリルヒドラターゼ遺伝子およびアミダ
ーゼ遺伝子のクローニング用プローブの作製 既知のＲ．ｓｐ．Ｎ−７７４株、Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐ
ｏｌｉｓＪＣＭ６８２３株およびＲ．ｒｈｏｄｏｃｈｒ
ｏｕｓＪ１株のアミダーゼ遺伝子を比較検討し、図１の
アミノ酸に対応するＤＮＡ配列からなるＰＣＲ用混合プ
ライマーを合成した。

【００１３】

【図１】

【００１４】ＰＣＲ法は以下の反応条件でおこなった。 反応液組成：Ｒ ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓＩＦＯ１５５６４染色体ＤＮＡ １μｇ ＡＭＮ−１プライマー １００ｐｍｏｌ ＡＭＲ−１プライマー １００ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ溶液 各１ｍＭ １０ｘ反応バッファー １０μｌ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製） ２．５Ｕｎｉｔ 計１００μｌ 反応条件： 熱変性 ９４℃、４５秒 アニーリング ６０℃、６０秒 ＤＮＡ合成 ７２℃、６０秒 サイクル数 ４０回 このようにして得た増幅ＤＮＡ断片のうち、予想される
約０．７ｋｂの断片を回収し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
により平滑末端化とＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによ
りリン酸化処理をおこなった。このＤＮＡ断片をｐＵＣ
１１８のＳｍａＩ部位と連結した。この組換え体プラス
ミドの導入ＤＮＡ断片について、ｄｉｄｅｏｘｙ法によ
りＤＮＡ配列を決定し、翻訳されたアミノ酸配列が既知
のアミダーゼと相同性があることを確認した。アミダー
ゼ遺伝子の一部が挿入されていることが確認された組換
え体プラスミドに対し、前述のプライマーＡＭＮ−１、
ＡＭＲ−１を用いて再び同様の条件によるＰＣＲをおこ
ない、その導入された約０．７ｋｂＤＮＡ断片の増幅を
おこなった。このＤＮＡ断片をＢｃａＢＥＳＴラベリン
グキット（宝酒造）の方法に従って［³²Ｐ］により標識
をおこなった。この標識ＤＮＡ断片をスクリーニング用
のプローブとして用いた。

【００１５】ニトリルヒドラターゼ遺伝子およびアミダ
ーゼ遺伝子のクローニング 前記ライセート液の約１０⁵ｐｆｕ分のファージ溶液
と、２８℃で一晩培養しＯ．Ｄ．₆₀₀＝０．５となるよ
うに１０ｍＭのＭｇＳＯ₄で調製したＰ２３９２株２０
０μｌとを混合した。この溶液を３７℃、１５分間イン
キュベートした後、０．７％アガロースを３ｍｌ加え
た。１．５％アガロースＬＢ培地（１０％バクトトリプ
トン（ディフコ）、５％イーストエキストラ（ディフ
コ）、５％ＮａＣｌ）のプレート（９ｃｍ直径）に、プ
レートあたり１００００〜１５０００プラークとなるよ
うにこの溶液を播き、プラークのできたプレートを作製
した。このプレートに対し、前述した［³²Ｐ］標識プロ
ーブを用いてManiatisらのMolecular Cloning（Cold S
pring Harbor Laboratory,N.Y.(1982))記載の方法に従
い６５℃でプラークハイブリダイゼーションをおこなっ
た。その結果、組換えファージプラーク１０００個あた
り１〜２個の陽性シグナルを得た。陽性シグナルを示す
組換えファージに対し２次スクリーニングをおこない、
最終的に４個の組換えファージを純化し、Maniatisらの
Molecular Cloning（Cold Spring Harbor Laboratory,
N.Y.(1982))記載の方法に従ってファージＤＮＡを調製
した。この調製したファージＤＮＡを種々の制限酵素を
加えて消化し、サザンブロッティング解析（Southern,
E.M.,J.Mol.Biol.,98,503(1975)）をおこなった。そし
て、標識プローブによって検出された約９ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ消化ＤＮＡ断片を有すファージクローンについて、
さらに詳細な制限酵素による解析をおこなった。その結
果このファージクローンには、約１５ｋｂのＤＮＡ断片
が挿入されていることが判明した。その制限酵素地図を
図２に示した。さらに、この挿入された約１５ｋｂのＤ
ＮＡ断片についてサザン解析をおこない、その結果、Ｅ
ｃｏＲＩ−ＳａｃＩ消化約６ｋｂＤＮＡ断片がプローブ
によって検出されたので、このＤＮＡ断片をｐＵＣ１９
のＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ部位に導入した。得られた組換
え体プラスミドをｐＣＮＨ−ＳＥとした。

【００１６】

【図２】

【００１７】ｐＣＮＨ−ＳＥのＤＮＡ配列の決定 ｐＣＮＨ−ＳＥのＤＮＡ配列の決定をＢｃａＢＥＳＴシ
ークエンシングキット（宝酒造社製）の方法に従ってお
こなった。その結果、配列表の配列番号３に示すような
オープンリーディングフレームの存在が確認された。５
２１アミノ酸をコードするオープンリーディングフレー
ムがアミダーゼ遺伝子をコードするＤＮＡ配列であるこ
と、２０７アミノ酸をコードするオープンリーディング
フレームがニトリルヒドラーターゼのαサブユニット遺
伝子をコードするＤＮＡ配列であること、２１２アミノ
酸をコードするオープンリーディングフレームがニトリ
ルヒドラターゼのβサブユニット遺伝子をコードするＤ
ＮＡ配列であることがわかった。さらに、ニトリルヒド
ラターゼのβサブユニットをコードしているオープンリ
ーディングフレームの下流にＨａｓｈｉｍｏｔｏら（Ha
shimoto,Y.et al.,Biosci.Biotech.Biochem.,58,1859,
(1994))によって示されたニトリルヒドラターゼの活性
発現に関与する因子をコードする３９９アミノ酸よりな
るオープンリーディングフレームが存在した。

【００１８】

【発明の効果】本発明は光学活性の製造に利用可能なロ
ードコッカス属細菌のニトリルヒドラターゼおよびアミ
ダーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を提供するものである。これ
らのＤＮＡ配列は、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ
の遺伝子工学的手法を用いた効率的生産やタンパク質工
学的手法を用いた酵素の改良などに利用できる。このよ
うにして得た酵素は有用化合物の工業的生産への応用に
期待できる。

【００１９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１５６６ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 起源 生物名：ロードコッカス ロードクラス（Ｒｈｏｄｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ） 株名：ＩＦＯ１５５６４ 配列の特徴 配列の産物：アミダーゼ 存在位置：１．．１５６６ 特徴を決定した方法：Ｅ 1 ATG GCG ACA ATC CGA CCT GAC GAC AAT GCA ATA GAC ACC GCC GCA 45 Met Ala Thr Ile Arg Pro Asp Asp Asn Ala Ile Asp Thr Ala Ala 10 46 AAG CAT TAC GGC ATC ACT CTC GAC CAA TCA GCC CGG CTC GAG TGG 90 Lys his Tyr Gly Ile Thr Leu Asp Gln Ser Ala Arg Leu Glu Trp 20 30 91 CCG GCA CTG ATC GAC GGA GCA CTG GGC TCC TAC GAC GTC GTC GAC 135 Pro Ala Leu Ile Asp Gly Ala Leu Gly Ser Tyr Asp Val Val Asp 40 136 CAG TTG TAC GCC GAC GAG GCA ACC CCG CCG ACC ACG TCA CGT GAG 180 Gln Leu Tyr Ala Asp Glu Ala Thr Pro Pro Thr Thr Ser Arg Glu 50 60 181 CAC ACG GTC CCA ACA GCG AGC GAA AAT CCT TTG AGC GCT TGG TAT 225 His Thr Val Pro Thr Ala Ser Glu Asn Pro Leu Ser Ala Trp Tyr 70 226 GTG ACC ACA AGC ATC CCG CCG ACG TCG GAC GGC GTC CTG ACC GGC 270 Val Thr Thr Ser Ile Pro Pro Thr Ser Asp Gly Val Leu Thr Gly 80 90 271 CGA CGC GTG GCG ATC AAG GCA AAC GTG ACC GTG GCC GGA GTT CCG 315 Arg Arg Val Ala Ile Lys Asp Asn Val Thr Val Ala Gly Val Pro 100 316 ATG ATG AAC GGG TCT CGG ACA GTA GAG GGG TTC ACT CCG TCT CGC 360 Mec Met Asn Gly Ser Arg Thr Val Glu Gly Phe Thr Pro Ser Arg 110 120 361 GAC GCG ACT GTG ATC ACT CGA CTA CTG GCG GCC GGT GCA ACC GTC 405 Asp Ala Thr Val Ile Thr Arg Leu Leu Ala Ala Gly Ala Thr Val 130 406 GCG GGC AAA GCT GTG TGT GAG GAC CTG TGT TTC TCC GGT TCG AGC 450 Ala Gly Lys Ala Val Cys Glu Asp Leu Cys Phe Ser Gly Ser Ser 140 150 451 TTC ACA CCG GCA AGC GGA CCG GTC CGC AAT CCA TGG GAC CCA CAG 495 Phe Thr Pro Ala Ser Gly Pro Val Arg Asn Pro Trp Asp Pro Gln 160 496 CGT GAA GCA GGT GGA TCA TCC GGT GGC AGT GCG GCT CTC GTC GCA 540 Arg Glu Ala Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ala Ala Leu Val Ala 170 180 541 AAC GGT GAC GTC GAT TTT GCC ATC GGC GGG GAT CAG GGT GGA TCG 585 Asn Gly Asp Val Asp Phe Ala Ile Gly Gly Asp Gln Gly Gly Ser 190 586 ATC CGG ATC CCG GCG GCA TTC TGC GGC GTC GTC GGA CAC AAG CCG 630 Ile Arg Ile Pro Ala Ala Phe Cys Gly Val Val Gly His Lys Pro 200 210 631 ACG TTC GGG CTC GTC CCG TAT ACC GGT GCA TTT CCC ATC GAG CGA 675 Thr Phe Gly Leu Val Pro Tyr Thr Gly Ala Phe Pro Ile Glu Arg 220 676 ACA ATC GAC CAT CTC GGC CCG ATC ACA CGC ACG GTC CAC GAT GCC 720 Thr Ile Asp His Leu Gly Pro Ile Thr Arg Thr Val His Asp Ala 230 240 721 GCA CTG ATG CTC TCG GTC ATC GCC GGT CGC GAC GGT AAC GAC CCA 765 Ala Leu Met Leu Ser Val Ile Ala Gly Arg Asp Gly Asn Asp Pro 250 766 CGC CAA GCC GAC AGC GTC GAA GCA GGT GAC TAT CTG TCC ACC CTC 810 Arg Gln Ala Asp Ser Val Glu Ala Gly Asp Tyr Leu Ser Thr Leu 260 270 811 GAC TCC GAT GTG GAT GGT CTG CGA ATC GGG ATC GTT CGA GAA GGT 855 Asp Ser Asp Val Asp Gly Leu Arg Ile Gly Ile Val Arg Glu Gly 280 856 TTC GGG CAC GCG GTC TCA CAG CCC GAG GTC GAC GAC GCA GTC CGC 900 Phe Gly His Ala Val Ser Gln Pro Glu Val Asp Asp Ala Val Arg 290 300 901 GCA GCG GCA CAC AGT CTG TCC GAA ATC GGT TGC ACG GTA GAG GAA 945 Ala Ala Ala His Ser Leu Ser Glu Ile Gly Cys Thr Val Glu Glu 310 946 GTA AAC ATC CCG TGG CAC CTA CAT GCT TTC CAC ATC TGG AAC GTG 990 Val Asn Ile Pro Trp His Leu His Ala Phe His Ile Trp Asn Val 320 330 991 ATC GCC ACG GAC GGT GGT GCC TAC CAG ATG TTG GAC GGC AAC GGA 1035 Ile Ala Thr Asp Gly Gly Ala Tyr Gln Met Leu Asp Gly Asn Gly 340 1036 TAC GGC ATG AAC GCC GAA GGT TTG TAC GAT CCG GAA GTG ACG GCA 1080 Tyr Gly Met Asn Ala Glu Gly Leu Tyr Asp Pro Glu Val Thr Ala 350 360 1081 CAC TTT GCT TCT CGA CGC CTT CAG CAC GCC GAC GCT CTG TCC GAA 1125 His Phe Ala Ser Arg Arg Leu Gln His Ala Asp Ala Leu Ser Glu 370 1126 ACC GTC AAA CTG GTG GCT CTG ACC GGC CAC CAC GGC ATC ACC ACC 1170 Thr Val Lys Leu Val Ala Leu Thr Gly His His Gly Ile Thr Thr 380 390 1171 CTC GGC GGC GCG AGC TAC GGC AAA GCC CGG AAC CTC GTA CCG CTC 1215 Leu Gly Gly Ala Ser Tyr Gly Lys Ala Arg Asn Leu Val Pro Leu 400 1216 GCC CGC GCC GCC TAC GAC ACT GCC TTG AGA CAA TTC GAC GTC CTG 1260 Ala Arg Ala Ala Tyr Asp Thr Ala Leu Arg Gln Phe Asp Val Leu 410 420 1261 GTG ATG CCC ACA CTG CCC TAC GTC GCA TCC GAA CTA CCG GCG AAG 1305 Val Met Pro Thr Leu Pro Tyr Val Ala Ser Glu Leu Pro Ala Lys 430 1306 GAC GTG GAT CGT GCA ACC TTC ATC ACG AAG GCT CTC GGG ATG ATC 1350 Asp Val Asp Arg Ala Thr Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Met Ile 440 450 1351 GCC AAC ACA GCA CCG TTC GAC GTG ACC GGA CAT CCG TCC CTG TCC 1395 Ala Asn Thr Ala Pro Phe Asp Val Thr Gly His Pro Ser Leu Ser 460 1396 GTT CCC GCC GGC CTG GTG AAC GGG CTT CCG GTC GGA ATG ATG ATC 1440 Val Pro Ala Gly Leu Val Asn Gly Leu Pro Val Gly Met Met Ile 470 480 1441 ACC GGC AAG ACC TTC GAC GAT GCG ACG GTC CTC CGG GTC GGG CGC 1485 Thr Gly Lys Thr Phe Asp Asp Ala Thr Val Leu Arg Val Gly Arg 490 1486 GCA TTC GAA AAG CTT CGC GGC GCG TTT CCG ACG CCT GCC GAC CAC 1530 Ala Phe Glu Lys Leu Arg Gly Ala Phe Pro Thr Pro Ala Asp His 500 510 1531 ATC TCC GAC TCT GCA CCA CAA CTC AGC CTC ACC TAG 1566 Ile Ser Asp Ser Ala Pro Gln Leu Ser Leu Thr *** 520 配列番号：２ 配列の長さ：１２８９ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 起源 生物名：ロードコッカス ロードクラス（Ｒｈｏｄｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ） 株名：ＩＦＯ１５５６４ 配列の特徴 配列の産物：ニトリルヒドラターゼαサブユニット 存在位置：１．．６２４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列の産物：ニトリルヒドラターゼβサブユニット 存在位置：６５１．．１２８９ 特徴を決定した方法：Ｅ 1 ATG TCA GTA ACG ATC GAC CAC ACA ACG GAG AAC GCC GCA CCG GCC 45 Met Ser Val Thr Ile Asp His Thr Thr Glu Asn Ala Ala Pro Ala 10 46 CAG GGG CCG GTC TCC GAT CGC GCG TGG GCC CTG TTC CGC GCA CTC 90 Gln Gly Pro Val Ser Asp Arg Ala Trp Ala Leu Phe Arg Ala Leu 20 30 91 GAC GGT AAG GGA TTG GTA CCC GAC GGT TAC GTC GAG GGA TGG AAG 135 Asp Gly Lys Gly Leu Val Pro Asp Gly Tyr Val Glu Gly Trp Lys 40 136 AAG ACC TTC GAG GAG GAC TTC AGT CCA AGG CGC GGA GCG GAA TTG 180 Lys Thr Phe Glu Glu Asp Phe Ser Pro Arg Arg Gly Ala Glu Leu 50 60 181 GTC GCG CGG GCT TGG ACC GAC CCC GAT TTC CGG CAA CTG CTT CTC 225 Val Ala Arg Ala Trp Thr Asp Pro Asp Phe Arg Gln Leu Leu Leu 70 226 ACC GAC GGT ACC GCC GCG GTT GCC CAG TAC GGA TAT CTT GGC CCC 270 Thr Asp Gly Thr Ala Ala Val Ala Gln Tyr Gly Tyr Leu Gly Pro 80 90 271 CAG GGC GAA TAC ATC GTG GCA GTC GAA GAC ACC CCG ACC CTC AAG 315 Gln Gly Glu Tyr Ile Val Ala Val Glu Asp Thr Pro Thr Leu Lys 100 316 AAC GTG ATC GTG TGC TCG CTG TGT TCA TGC ACC GCG TGG CCC ATT 360 Asn Val Ile Val Cys Ser Leu Cys Ser Cys Thr Ala Trp Pro Ile 110 120 361 CTC GGC CTG CCC CCT ACC TGG TAC AAG AGT TTC GAA TAC CGT GCG 405 Leu Gly Leu Pro Pro Thr Trp Tyr Lys Ser Phe Glu Tyr Arg Ala 130 406 CGA GTG GTG CGT GAG CCA CGG AAG GTT CTC TCC GAG ATC GGA ACC 450 Arg Val Val Arg Glu Pro Arg Lys Val Leu Ser Glu Met Gly Thr 140 150 451 GAG ATC GCG TCG GAC GTC GAG ATC CGC GTC TAC GAC ACC ACC GCC 495 Glu Ile Ala Ser Asp Val Glu Ile Arg Val Tyr Asp Thr Thr Ala 160 496 GAA ACT CGC TAC ATG GTT CTC CCG CAA CGT CCC GCA GGC ACC GAA 540 Glu Thr Arg Tyr Met Val Leu Pro Gln Arg Pro Ala Gly Thr Glu 170 180 541 GGC TGG AGC CAG GAA CAG CTT CAA GAG ATC GTC ACC AAG GAC TGC 585 Gly Trp Ser Gln Glu Gln Leu Gln Glu Ile Val Thr Lys Asp Cys 190 586 CTG ATC GGC GTC GCA GTC CCG CAG GTC CCC ACC GTC TGA TCACCCCG 632 Leu Ile Gly Val Ala Val Pro Gln Val Pro Thr Val *** 200 633 AC AAGAAAGAAG CACACC ATG GAT GGA GTA CAC GAT CTT GCC GGA GTT 680 Met Asp Gly Val His Asp Leu Ala Gly Val 10 681 CAA GGC TTC GGC AAA GTC CCG CAT ACC GTC AAC GCC GAC ATC GGC 725 Gln Gly Phe Gly Lys Val Pro His Thr Val Asn Ala Asp Ile Gly 20 726 CCC ACC TTC CAC GCC GAG TGG GAA CAC CTG CCG TAC AGC CTG ATG 770 Pro Thr Phe His Ala Glu Trp Glu His Leu Pro Tyr Ser Leu Met 30 40 771 TTC GCC GGT GTC GCC GAA CTC GGG GCA TTC AGC GTC GAC GAA GTT 815 Phe Ala Gly Val Ala Glu Leu Gly Ala Phe Ser Val Asp Glu Val 50 816 CGA TAC GTC GTC GAG CGG ATG GAA CCA CGC CAC TAC ATG ATG ACC 860 Arg Tyr Val Val Glu Arg Met Glu Pro Arg His Tyr Met Met Thr 60 70 861 CCG TAC TAC GAG AGG TAC GTC ATC GGC GTC GCG ACG CTG ATG GTC 905 Pro Tyr Tyr Glu Arg Tyr Val Ile Gly Val Ala Thr Leu Met Val 80 906 GAA AAG GGA ATC CTG ACG CAG GAA GAA CTC GAA AGC CTT GCA GGG 950 Glu Lys Gly Ile Leu Thr Gln Glu Glu Leu Glu Ser Leu Ala Gly 90 100 951 GGA CCG TTC CCA CTG TCG CGG CCC AGC GAA TCC GAA GGG CGT CCG 995 Gly Pro Phe Pro Leu Ser Arg Pro Ser Glu Ser Glu Gly Arg Pro 110 996 GCA CCC GTC GAG ACG ACC ACC TTC GAA ATC GGT CAG CGT GTA CGC 1040 Ala Pro Val Glu Thr Thr Thr Phe Glu Ile Gly Gln Arg Val Arg 120 130 1041 GTG CGC GAC GAG TAC GTT CCG GGG CAT ATT CGA ATG CCT GCG TAC 1085 Val Arg Asp Glu Tyr Val Pro Gly His Ile Arg Met Pro Ala Tyr 140 1086 TGC CGC GGA CGA GTG GGA ACC ATC TCT CAT CGG ACT AGC GAG AAG 1130 Cys Arg Gly Arg Val Gly Thr Ile Ser His Arg Thr Ser Glu Lys 150 160 1131 TGG CCG TTT CCC GAC GCA ATT GGC CAC GGG CGC AAC GAC GCC GGC 1175 Trp Pro Phe Pro Asp Ala Ile Gly His Gly Arg Asn Asp Ala Gly 170 1176 GAA GAA CCG ACG TAC CAC GTG AAG TTC GCC GCC GAG GAA TTG TTC 1220 Glu Glu Pro Thr Tyr His Val Lys Phe Ala Ala Glu Glu Leu Phe 180 190 1221 GGT AGC GAC ACC GAC GGC GGC AGC GTC GTA GTC GAC CTC TTC GAG 1265 Gly Ser Asp Thr Asp Gly Gly Ser Val Val Val Asp Leu Phe Glu 200 1266 GGT TAC CTC GAG CCT GCG GCC TGA 1289 Gly Tyr Leu Glu Pro Ala Ala *** 210 配列番号：３ 配列の長さ：４７７５ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 起源 生物名：ロードコッカス ロードクラス（Ｒｈｏｄｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ） 株名：ＩＦＯ１５５６４ クローン名：ｐＣＮＨ−ＳＥ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＲＢＳ 存在位置：３３０．．３３４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列の産物：アミダーゼ 存在位置：３４５．．１９１０ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ＲＢＳ 存在位置：１９７３．．１９７７ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列の産物：ニトリルヒドラターゼαサブユニット 存在位置：１９８４．．２６０７ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ＲＢＳ 存在位置：２６２２．．２６２７ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列の産物：ニトリルヒドラターゼβサブユニット 存在位置：２６３４．．４５７０ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ 存在位置：３２８８．．３３２９ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列の種類：ハイポセティカル ：Ｙｅｓ 存在位置：３３７１．．４５７０ 特徴を決定した方法：Ｅ 1 GAGCTCGAAC GAACTCCTGC CTCCGCTCAG TTCCCTGTCG GAGACAACGT ACGAA 55 56 GCGATCGTCAGCTTA CGCACGCGCC GTCGAACGAA CGTCCGCAGG CGATCCGGAA 110 111 ACAGTACTTCGGCAGCTTGT CACGACGTCG AAAAGCTCTA CGAACAACGG CGTTCC 166 167 ACTG CATCGACCGATTCTGCTCGC TGAATCACGC CGTGGGCGCC TGTACCCCCG T 221 222 TCTCTCTGA GCGCGCGTAACCCGAACTTA ACGAGTCAAT ATGTCGATAC CTATTGA 277 278 CGC AATTATGGAT CCGGCCCTAGTCTGAAAGAC AAGTGAAGCC GATCACATCA GG 332 333 AGCACACT TCTC ATG GCG ACA ATC CGA CCT GAC GAC AAT GCA ATA 377 Met Ala Thr Ile Arg Pro Asp Asp Asn Ala Ile 10 378 GAC ACC GCC GCA AAG CAT TAC GGC ATC ACT CTC GAC CAA TCA GCC 422 Asp Thr Ala Ala Lys His Tyr Gly Ile Thr Leu Asp Gln Ser Ala 20 423 CGG CTC GAG TGG CCG GCA CTG ATC GAC GGA GCA CTG GGC TCC TAC 467 Arg Leu Glu Trp Pro Ala Leu Ile Asp Gly Ala Leu Gly Ser Tyr 30 40 468 GAC GTC GTC GAC CAG TTG TAC GCC GAC GAG GCA ACC CCG CCG ACC 512 Asp Val Val Asp Gln Leu Tyr Ala Asp Glu Ala Thr Pro Pro Thr 50 513 ACG TCA CGT GAG CAC ACG GTG CCA ACA GCG AGC GAA AAT CCT TTG 557 Thr Ser Arg Glu His Thr Val Pro Thr Ala Ser Glu Asn Pro Leu 60 70 558 AGC GCT TGG TAT GTG ACC ACA AGC ATC CCG CCG ACG TCG GAC GGC 602 Ser Ala Trp Tyr Val Thr Thr Ser Ile Pro Pro Thr Ser Asp Gly 80 603 GTC CTG ACC GGC CGA CGC GTG GCG ATC AAG GAC AAC GTG ACC GTG 647 Val Leu Thr Gly Arg Arg Val Ala Ile Lys Asp Asn Val Thr Val 90 100 648 GCC GGA GTT CCG ATG ATG AAC GGG TCT CGG ACA GTA GAG GGG TTC 692 Ala Gly Val Pro Met Met Asn Gly Ser Arg Thr Val Glu Gly Phe 110 693 ACT CCG TCT CGC GAC GCG ACT GTG ATC ACT CGA CTA CTG GCG GCC 737 Thr Pro Ser Arg Asp Ala Thr Val Ile Thr Arg Leu Leu Ala Ala 120 130 738 GGT GCA ACC GTC GCG GGC AAA GCT GTG TGT GAG GAC CTG TGT TTC 782 Gly Ala Thr Val Ala Gly Lys Ala Val Cys Glu Asp Leu Cys Phe 140 783 TCC GGT TCG AGC TTC ACA CCG GCA AGC GGA CCG GTC CGC AAT CCA 827 Ser Gly Ser Ser Phe Thr Pro Ala Ser Gly Pro Val Arg Asn Pro 150 160 828 TGG GAC CCA CAG CGT GAA GCA GGT GGA TCA TCC GGT GGC AGT GCG 872 Trp Asp Pro Gln Arg Glu Ala Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ala 170 873 GCT CTC GTC GCA AAC GGT GAC GTC GAT TTT GCC ATC GGC GGG GAT 917 Ala Leu Val Ala Asn Gly Asp Val Asp Phe Ala Ile Gly Gly Asp 180 190 918 CAG GGT GGA TCG ATC CGG ATC CCG GCG GCA TTC TGC GGC GTC GTC 962 Gln Gly Gly Ser Ile Arg Ile Pro Ala Ala Phe Cys Gly Val Val 200 963 GGA CAC AAG CCG ACG TTC GGG CTC GTC CCG TAT ACC GGT GCA TTT 1007 Gly His Lys Pro Thr Phe Gly Leu Val Pro Tyr Thr Gly Ala Phe 210 220 1008 CCC ATC GAG CGA ACA ATC GAC CAT CTC GGC CCG ATC ACA CGC ACG 1052 Pro Ile Glu Arg Thr Ile Asp His Leu Gly Pro Ile Thr Arg Thr 230 1053 GTC CAC GAT GCC GCA CTG ATG CTC TCG GTC ATC GCC GGT CGC GAC 1097 Val His Asp Ala Ala Leu Met Leu Ser Val Ile Ala Gly Arg Asp 240 250 1098 GGT AAC GAC CCA CGC CAA GCC GAC AGC GTC GAA GCA GGT GAC TAT 1142 Gly Asn Asp Pro Arg Gln Ala Asp Ser Val Glu Ala Gly Asp Tyr 260 1143 CTG TCC ACC CTC GAC TCC GAT GTG GAT GGT CTG CGA ATC GGG ATC 1187 Leu Ser Thr Leu Asp Ser Asp Val Asp Gly Leu Arg Ile Gly Ile 270 280 1188 GTT CGA GAA GGT TTC GGG CAC GCG GTC TCA CAG CCC GAG GTC GAC 1232 Val Arg Glu Gly Phe Gly His Ala Val Ser Gln Pro Glu Val Asp 290 1233 GAC GCA GTC CGC GCA GCG GCA CAC AGT CTG TCC GAA ATC GGT TGC 1277 Asp Ala Val Arg Ala Ala Ala His Ser Leu Ser Glu Ile Gly Cys 300 310 1278 ACG GTA GAG GAA GTA AAC ATC CCG TGG CAC CTA CAT GCT TTC CAC 1322 Thr Val Glu Glu Val Asn Ile Pro Trp His Leu His Ala Phe His 320 1323 ATC TGG AAC GTG ATC GCC ACG GAC GGT GGT GCC TAC CAG ATG TTG 1367 Ile Trp Asn Val Ile Ala Thr Asp Gly Gly Ala Tyr Gln Met Leu 330 340 1368 GAC GGC AAC GGA TAC GGC ATG AAC GCC GAA GGT TTG TAC GAT CCG 1412 Asp Gly Asn Gly Tyr Gly Met Asn Ala Glu Gly Leu Tyr Asp Pro 350 Glu Val Thr Ala His Phe Ala Ser Arg Arg Leu Gln His Ala Asp 360 370 1458 GCT CTG TCC GAA ACC GTC AAA CTG GTG GCT CTG ACC GGC CAC CAC 1502 Ala Leu Ser Glu Thr Val Lys Leu Val Ala Leu Thr Gly His His 380 1503 GGC ATC ACC ACC CTC GGC GGC GCG AGC TAC GGC AAA GCC CGG AAC 1547 Gly Ile Thr Thr Leu Gly Gly Ala Ser Tyr Gly Lys Ala Arg Asn 390 400 1548 CTC GTA CCG CTC GCC CGC GCC GCC TAC GAC ACT GCC TTG AGA CAA 1592 Leu Val Pro Leu Ala Arg Ala Ala Tyr Asp Thr Ala Leu Arg Gln 410 1593 TTC GAC GTC CTG GTG ATG CCC ACA CTG CCC TAC GTC GCA TCC GAA 1637 Phe Asp Val Leu Val Met Pro Thr Leu Pro Tyr Val Ala Ser Glu 420 430 1638 CTA CCG GCG AAG GAC GTG GAT CGT GCA ACC TTC ATC ACG AAG GCT 1682 Leu Pro Ala Lys Asp Val Asp Arg Ala Thr Phe Ile Thr Lys Ala 440 1683 CTC GGG ATG ATC GCC AAC ACA GCA CCG TTC GAC GTG ACC GGA CAT 1727 Leu Gly Met Ile Ala Asn Thr Ala Pro Phe Asp Val Thr Gly His 450 460 1728 CCG TCC CTG TCC GTT CCC GCC GGC CTG GTG AAC GGG CTT CCG GTC 1772 Pro Ser Leu Ser Val Pro Ala Gly Leu Val Asn Gly Leu Pro Val 470 1773 GGA ATG ATG ATC ACC GGC AAG ACC TTC GAC CAT GCG ACG GTC CTC 1817 Gly Met Met Ile Thr Gly Lys Thr Phe Asp Asp Ala Thr Val Leu 480 490 1818 CGG GTC GGG CGC GCA TTC GAA AAG CTT CGC GGC GCG TTT CCG ACG 1862 Arg Val Gly Arg Ala Phe Glu Lys Leu Arg Gly Ala Phe Pro Thr 500 1863 CCT GCC GAC CAC ATC TCC GAC TCT GCA CCA CAA CTC AGC CTC ACC 1907 Pro Ala Asp His Ile Ser Asp Ser Ala Pro Gln Leu Ser Leu Thr 510 520 1908 TAG TTCTGTATCC GCACTTGCAC AACAAATTCC ACCGATTCAC ACATGATCAG C 1961 *** 1962 CCGCATAGA AAAGGTGAAC CAG ATG TCA GTA ACG ATC GAC CAC ACA ACG 2010 Met Ser Val Thr Ile Asp His Thr Thr 2011 GAG AAC GCC GCA CCG GCC CAG GGG CCG GTC TCC GAT CGC GCG TGG 2055 Glu Asn Ala Ala Pro Ala Gln Gly Pro Val Ser Asp Arg Ala Trp 10 20 2056 GCC CTG TTC CGC GCA CTC GAC GGT AAG GGA TTG GTA CCC GAC GGT 2100 Ala Leu Phe Arg Ala Leu Asp Gly Lys Gly Leu Val Pro Asp Gly 30 2101 TAC GTC GAG GGA TGG AAG AAG ACC TTC GAG GAG GAC TTC AGT CCA 2145 Tyr Val Glu Gly Trp Lys Lys Thr Phe Glu Glu Asp Phe Ser Pro 40 50 2146 AGG CGC GGA GCG GAA TTG GTC GCG CGG GCT TGG ACC GAC CCC GAT 2190 Arg Arg Gly Ala Glu Leu Val Ala Arg Ala Trp Thr Asp Pro Asp 60 2191 TTC CGG CAA CTG CTT CTC ACC GAC GGT ACC GCC GCG GTT GCC CAG 2235 Phe Arg Gln Leu Leu Leu Thr Asp Gly Thr Ala Ala Val Ala Gln 70 80 2236 TAC GGA TAT CTT GGC CCC CAG GGC GAA TAC ATC GTG GCA GTC GAA 2280 Tyr Gly Tyr Leu Gly Pro Gln Gly Glu Tyr Ile Val Ala Val Glu 90 2281 GAC ACC CCG ACC CTC AAG AAC GTG ATC GTG TGC TCG CTG TGT TCA 2325 Asp Thr Pro Thr Leu Lys Asn Val Ile Val Cys Ser Leu Cys Ser 100 1100 2326 TGC ACC GCG TGG CCC ATT CTC GGC CTG CCC CCT ACC TGG TAC AAG 2370 Cys Thr Ala Trp Pro Ile Leu Gly Leu Pro Pro Thr Trp Tyr Lys 120 2371 AGT TTC GAA TAC CGT GCG CGA GTG GTG CGT GAG CCA CGG AAG GTT 2415 Ser Peh Glu Tyr Arg Ala Arg Val Val Arg Glu Pro Arg Lys Val 130 140 2416 CTC TCC GAG ATG GGA ACC GAG ATC GCG TCG GAC GTC GAG ATC CGC 2460 Leu Ser Glu Met Gly Thr Glu Ile Ala Ser Asp Val Glu Ile Arg 150 2461 GTC TAC GAC ACC ACC GCC GAA ACT CGC TAC ATG GTT CTC CCG CAA 2505 Val Tyr Asp Thr Thr Ala Glu Thr Arg Tyr Met Val Leu Pro Gln 160 170 2506 CGT CCC GCA GGC ACC GAA GGC TGG AGC CAG GAA CAG CTT CAA GAG 2550 Arg Pro Ala Gly Thr Glu Gly Trp Ser Gln Glu Gln Leu Gln Glu 180 2551 ATC GTC ACC AAG GAC TGC CTG ATC GGC GTC GCA GTC CCG CAG GTC 2595 Ile Val Thr Lys Asp Cys Leu Ile Gly Val Ala Val Pro Gln Val 190 200 2596 CCC ACC GTC TGA TCACCCCGACA AGAAAGAAGC ACACC ATG GAT GGA 2642 Pro Thr Val *** Met Asp Gly 2643 GTA CAC GAT CTT GCC GGA GTT CAA GGC TTC GGC AAA GTC CCG CAT 2687 Val His Asp Leu Ala Gly Val Gln Gly Phe Gly Lys Val Pro His 10 2688 ACC GTC AAC GCC GAC ATC GGC CCC ACC TTC CAC GCC GAG TGG GAA 2732 Thr Val Asn Ala Asp Ile Gly Pro Thr Phe His Ala Glu Trp Glu 20 30 2733 CAC CTG CCG TAC AGC CTG ATG TTC GCC GGT GTC GCC GAA CTC GGG 2777 His Leu Pro Tyr Ser Leu Met Phe Ala Gly Val Ala Glu Leu Gly 40 2778 GCA TTC AGC GTC GAC GAA GTT CGA TAC GTC GTC GAG CGG ATG GAA 2822 Ala Phe Ser Val Asp Glu Val Arg Tyr Val Val Glu Arg Met Glu 50 60 2823 CCA CGC CAC TAC ATG ATG ACC CCG TAC TAC GAG AGG TAC GTC ATC 2867 Pro Arg His Tyr Met Met Thr Pro Tyr Tyr Glu Arg Tyr Val Ile 70 2868 GGC GTC GCG ACG CTG ATG GTC GAA AAG GGA ATC CTG ACG CAG GAA 2912 Gly Val Ala Thr Leu Met Val Glu Lys Gly Ile Leu Thr Gln Glu 80 90 2913 GAA CTC GAA AGC CTT GCA GGG GGA CCG TTC CCA CTG TCG CGG CCC 2957 Glu Leu Glu Ser Leu Ala Gly Gly Pro Phe Pro Leu Ser Arg Pro 100 2958 AGC GAA TCC GAA GGG CGT CCG GCA CCC GTC GAG ACG ACC ACC TTC 3002 Ser Glu Ser Glu Gly Arg Pro Ala Pro Val Glu Thr Thr Thr Phe 110 120 3003 GAA ATC GGT CAG CGT GTA CGC GTG CGC GAC GAG TAC GTT CCG GGG 3047 Glu Ile Gly Gln Arg Val Arg Val Arg Asp Glu Tyr Val Pro Gly 130 3048 CAT ATT CGA ATG CCT GCG TAC TGC CGC GGA CGA GTG GGA ACC ATC 3092 His Ile Arg Met Pro Ala Tyr Cys Arg Gly Arg Val Gly Thr Ile 140 150 3093 TCT CAT CGG ACT AGC GAG AAG TGG CCG TTT CCC GAC GCA ATT GGC 3137 Ser His Arg Thr Ser Glu Lys Trp Pro Phe Pro Asp Ala Ile Gly 160 3138 CAC GGG CGC AAC GAC GCC GGC GAA GAA CCG ACG TAC CAC GTG AAG 3182 His Gly Arg Asn Asp Ala Gly Glu Glu Pro Thr Tyr His Val Lys 170 180 3183 TTC GCC GCC GAG GAA TTG TTC GGT AGC GAC ACC GAC GGC GGC AGC 3227 Phe Ala Ala Glu Glu Leu Phe Gly Ser Asp Thr Asp Gly Gly Ser 190 3228 GTC GTA GTC GAC CTC TTC GAG GGT TAC CTC GAG CCT GCG GCC TGA 3272 Val Val Val Asp Leu Phe Glu Gly Tyr Leu Glu Pro Ala Ala *** 200 210 3273 TCGTCCAACA TTCCGGGCGG CGGTCACGCG ATCACAGCGT TTCGCGTGAC CGCCG 3327 3328 CCTGA TCACAGCAAT TCTCTCATTC GGAAGGACAC TGGAAATC ATG GTC GAC 3379 Met Val Asp 3380 ACA CGA CTT CCG GTC ACG GTG CTG TCA GGT TTC CTG GGC GCC GGG 3424 Thr Arg Leu Pro Val Thr Val Leu Ser Gly Phe Leu Gly Ala Gly 10 3425 AAG ACG ACA CTA CTC AAC GAG ATC CTG CGA AAT CGG GAG GGC CGC 3469 Lys Thr Thr Leu Leu Asn Glu Ile Leu Arg Asn Arg Glu Gly Arg 20 30 3470 CGG GTT GCG GTG ATC GTC AAC GAC ATG AGC GAA ATC AAC ATC GAC 3514 Arg Val Ala Val Ile Val Asn Asp Met Ser Glu Ile Asn Ile Asp 40 3515 AGT GCA GAA GTC GAG CGT GAG ATC TCG CTC AGT CGC TCC GAG GAG 3559 Ser Ala Glu Val Glu Arg Glu Ile Ser Leu Ser Arg Ser Glu Glu 50 60 3560 AAA CTG GTC GAG ATG ACC AAC GGC TGC ATC TGC TGC ACT CTG CGA 3604 Lys Leu Val Glu Met Thr Asn Gly Cys Ile Cys Cys Thr Leu Arg 70 3605 GAG GAT CTT CTC TCC GAG ATC AGT GCC TTG GCC GCC GAT GGC CGA 3649 Glu Asp Leu Leu Ser Glu Ile Ser Ala Leu Ala Ala Asp Gly Arg 80 90 3650 TTC GAC TAC CTA CTC ATC GAA TCT TCG GGC ATC TCC GAA CCG CTT 3694 Phe Asp Tyr Leu Leu Ile Glu Ser Ser Gly Ile Ser Glu Pro Leu 100 3695 CCC GTC GCA GAG ACG TTC ACA TTC ATC GAT ACC GAC GGC CAC GCC 3739 Pro Val Ala Glu Thr Phe Thr Phe Ile Asp Thr Asp Gly His Ala 110 120 3740 CTC GCC GAC GTC GCC CGA CTC GAC ACC ATG GTC ACC GTC GTC GAC 3784 Leu Ala Asp Val Ala Arg Leu Asp Thr Met Val Thr Val Val Asp 130 3785 GGC CAC AGT TTT CTG CGC GAC TAC ACG GCT GGG GGC CGC GTC GAA 3829 Gly His Ser Phe Leu Arg Asp Tyr Thr Ala Gly Gly Arg Val Glu 140 150 3830 GCC GAT GCC CCG GAA GAC GAA CGA GAC ATC GCG GAT CTG CTT GTC 3847 Ala Asp Ala Pro Glu Asp Glu Arg Asp Ile Ala Asp Leu Leu Val 160 3875 GAT CAG ATC GAA TTT GCC GAC GTC ATC CTG GTG AGC AAG GCC GAT 3919 Asp Gln Ile Glu Phe Ala Asp Val Ile Leu Val Ser Lys Ala Asp 170 180 3920 CTC GTC TCG CAC CAG CAC CTG GTC GAA TTG ACC GCA GTC CTG CGC 3964 Leu Val Ser His Gln His Leu Val Glu Leu Thr Ala Val Leu Arg 190 3965 TCT TTG AAC GCA TCC GCT GCG ATA GTT CCG ATG ACG CTC GGT CGC 4009 Ser Leu Asn Ala Ser Ala Ala Ile Val Pro Met Thr Leu Gly Arg 200 210 4010 ATC CCA CTC GAC ACG ATT CTC GAC ACC GGT TTG TTC TCA CTC GAA 4054 Ile Pro Leu Asp Thr Ile Leu Asp Thr Gly Leu Phe Ser Leu Glu 220 4055 AAG GCT GCA CAG GCC CCC GGA TGG TTA CAA GAA CTC CAA GGT GAA 4099 Lys Ala Ala Gln Ala Pro Gly Trp Leu Gln Glu Leu Gln Gly Glu 230 240 4100 CAC ATC CCC GAA ACC GAG GAG TAC GGA ATC GGT TCG GTG GTG TAC 4144 His Ile Pro Glu Thr Glu Glu Tyr Gly Ile Gly Ser Val Val Tyr 250 4145 CGC GAG CGC GCA CCC TTC CAC CCC CAA CGG CTG CAT GAT TTC CTC 4189 Arg Glu Arg Ala Pro Phe His Pro Gln Arg Leu His Asp Phe Leu 260 270 4190 AGC AGC GAG TGG ACC AAC GGA AAG TTA CTT CGG GCC AAG GGC TAC 4234 Ser Ser Glu Trp Thr Asn Gly Lys Leu Leu Arg Ala Lys Gly Tyr 280 4235 TAC TGG AAT GCC GGC CGG TTC ACC GAG ATC GGG AGT ATT TCT CAG 4279 Tyr Trp Asn Ala Gly Arg Phe Thr Glu Ile Gly Ser Ile Ser Gln 290 300 4280 GCC GGT CAT CTC ATT CGC CAC GGA TAC GTC GGC CGT TGG TGG AAC 4324 Ala Gly His Leu Ile Arg His Gly Tyr Val Gly Arg Trp Trp Asn 310 4325 TTT CTA CCC CGT GAC GAG TGG CCG GCC GAC GAT TAC CGT CGT GAC 4369 Phe Leu Pro Arg Asp Glu Trp Pro Ala Asp Asp Tyr Arg Arg Asp 320 330 4370 GGA ATC CTC GAC AAG TGG GAA GAA CCC GTC GGA GAC TGC CGA CAA 4414 Gly Ile Leu Asp Lys Trp Glu Glu Pro Val Gly Asp Cys Arg Gln 340 4415 GAA CTC GTC TTC ATC GGC CAA GCC ATC GAC CCG TCT CGA CTG CAC 4459 Glu Leu Val Phe Ile Gly Gln Ala Ile Asp Pro Ser Arg Leu His 350 360 4460 CGA GAA CTC GAC GCG TGT CTA CTC ACC ACA GCC GAG ATC GAA CTC 4504 Arg Glu Leu Asp Ala Cys Leu Leu Thr Thr Ala Glu Ile Glu Leu 370 4505 GGG CCA GAC GTG TGG ACC ACC TGG AGC GAC CCC CTG GGC GTC GGC 4549 Gly Pro Asp Val Trp Thr Thr Trp Ser Asp Pro Leu Gly Val Gly 380 390 4550 TAT ACC GAC CAG ACC GTT TGA TATTGGTCCGG TTTGCCGTAA GTTGTGCGC 4600 Tyr Thr Asp Gln Thr Val *** 4601 A ATGGGGGTAT CACGCAACCG AACTCGGGCG TTGTTGATCG TCGCGGCGAT CGC 4654 4655 AGCCGGG ACCGTGGCCG CAGCTACGCC GGCGGGGGCC ACCTGGACAG TCGCGCCG 4709 4710 AT GTGCGGCGAG TGGCGGGTCG AAACCGTAGC GCAAGGGTTG GAACAGCTCG AA 4763 4764 AACCTCGA GCCC 4775

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はアミダーゼ遺伝子のＰＣＲクローニング
のために選んだアミノ酸配列と対応するＤＮＡ配列に基
づいて作製した混合プライマーを示す。

【図２】図２はプラークハイブリダイゼーションで陽性
シグナルを示した組換えＥＭＢＬ３ファージクローンの
中、約９ｋｂのＥｃｏＲＩＤＮＡ断片を有すもの、およ
び組換え体プラスミドｐＣＮＨーＳＥの制限酵素地図を
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１で示されるロードコ
   ッカス属細菌由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子。
2. 【請求項２】配列表の配列番号２で示されるロードコッ
   カス属細菌由来のアミダーゼ遺伝子。
3. 【請求項３】ロードコッカス属細菌がロードコッカス
   ロードクラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃ
   ｈｒｏｕｓ）ＩＦＯ１５５６４株である請求項１記載の
   ニトリルヒドラターゼ遺伝子。
4. 【請求項４】ロードコッカス属細菌がロードコッカス
   ロードクラス （Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏ
   ｃｈｒｏｕｓ）ＩＦＯ１５５６４株である請求項２記載
   のアミダーゼ遺伝子。