JP2003502021A

JP2003502021A - アスペルギルス起源のエポキシドヒドロラーゼ

Info

Publication number: JP2003502021A
Application number: JP2000616360A
Authority: JP
Inventors: アラント，ミヒャエル; アルシェラ，アラン・ロベール; バラティ，ジャック; フュルトス，ローラン
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1999-05-05
Filing date: 2000-05-05
Publication date: 2003-01-21
Also published as: DE60039355D1; FR2793259A1; US7060477B2; FR2793259B1; CA2372097C; EP1173585A1; WO2000068394A1; AU4413600A; CA2372097A1; US20030143710A1; ATE399867T1; EP1173585B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、真菌細胞からの抽出によって、あるいは真菌タンパク質をコードするヌクレオチド配列によって形質転換された宿主細胞において培養することによって、実質的に純粋な形態で得られるもののとごき、エポキシドヒドロラーゼ活性を有する真菌起源のタンパク質に関する。また、本発明は、特に、エナンチオ純粋エポキシドおよび／またはジオールを調製する方法を実施するためのその使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、エポキシドヒドロラーゼ活性を保有する、真菌起源のタンパク質ま
たは後者から誘導されたタンパク質、ならびに、特に、高エナンチオマー純度の
エポキシドおよび／または隣接ジオールのごときエナンチオマー的に純粋な（ま
たはエナンチオ純粋）分子の調製のためのそれらの使用に関する。

【０００２】エポキシドまたは隣接ジオールは、有機合成において重要な化合物である。も
しそれらかキラル構造を有すれば、それらはラセミ形態または光学的に豊富なま
たはエナンチオマー的に純粋な形態で用いることができる。最初の場合、それら
は化学工業のための基本的生成物（グリコール、プロピレングリコール等のごと
き工業製品の重合性モノマーまたは成分）を構成する。第２の場合、それらは、
種々の光学的に純粋な生成物、例えば、医薬または植物保護工業によって市販さ
れる生物学的に活性な分子または特定の光学特性を持つ物質（例えば、液晶）の
生産のためのキラル合成として用いることができる。

【０００３】これが、それらの生産を行うために種々の化学合成の戦略を工夫してきた理由
である。ジオールの生産に関しては、これらの戦略は、しばしば、多かれ少なか
れ濃縮された酸性または塩基性無機媒体中でのエポキシドの加水分解を含み、こ
れは、それ自体、プロセスの進行中に形成された母液または塩の再プロセッシン
グのためさらなる費用を生じる。

【０００４】これらの分子は光学的に活性な形態で生産されなければならない場合、いくつ
かの戦略が記載され開発されてきた（Schurigら、１９９２、Pedragosa-Moreau
ら、１９９５）。例えば、Katzuki-Sharpless 酸化反応は、チタン系のキラル有
機金属触媒によってオレフィンを光学的に豊富なエポキシドに変換することを可
能とする。しかしながら、このアプローチは、触媒の配位で必要な二重結合のア
ルファ位置にアルコール基を有するオレフィンに限定される。

【０００５】他の方法がより最近に開発されており、それらもまた、マンガンまたはコバル
トのごとき重金属を非常にしばしば含む有機金属触媒の使用に大部分基礎を置く
。しかしながら、それらはあるタイプの基質に非常に効果的であるが、それらは
分子の他のファミリーに対する平均的選択性を呈するに過ぎない。全ての場合に
おいて、それらは、関係する重金属の使用によって課された技術的拘束のため、
工業条件で用いるのは困難である。

【０００６】この問題を克服するための生体触媒の種々の技術が記載されている。それらは
リパーゼ、ペルオキシダーゼまたはモノオキシゲナーゼのごとき酵素の使用を含
む間接的戦略を使用する（Archelasら、１９９７）。しかしながら、これらのア
プローチのほとんどは、コファクターのリサイクリングのために高価なシステム
の開発を必要とし、再度、それらを分取条件で実施するのを特に困難かつ高価な
ものとする。

【０００７】従って、エポキシドの直接的加水分解を行うのを可能とする酵素の使用は、光
学的に豊富なエポキシドまたは非キラル、ラセミまたは光学的に豊富なジオール
の直接的調製の興味深いオリジナル手段を表す。エポキシドヒドロラーゼと呼ば
れるこれらの酵素は、一方で、コファクターを必要とせず、他方で、特に温和な
条件で水分子のエポキシドへの付加を行うのを可能とする利点を提供する。もし
基質がキラルであれば、この付加プロセスのエナンチオ選択性および位置選択性
に応じて、得られたジオールはラセミ体またはエナンチオマーが豊富なものとな
るであろう（Archelasら、１９９８）。

【０００８】膨大な研究が哺乳動物に存在するこのタイプの酵素に向けられてきたが、有機
合成におけるそれらの使用は、それらを十分な量で得る困難性のため考えること
ができない。

【０００９】有機合成における「ツール」としての−簡単な微生物発酵によって多量に生産
することができる−微生物起源（細菌、酵母、真菌）のエポキシドヒドロラーゼ
を用いる可能性は、従って、かなりの進歩を構成するであろう。

【００１０】微生物を生物触媒として用いることによる光学的に活性な化合物の調製の例が
記載されているが、種々の微生物で検出された特徴付けのされていない酵素活性
に関するに過ぎない。かくして、欧州特許出願ＥＰ６１１８２６（Daicel Chemi
cal Industries Co. Ltd.）においては、ラセミ体エポキシドから出発して（Ｓ
）光学的活性エポキシドを生産することができる与えられた微生物の例は、特に
、Candida, Rhodosporidium, Rhodococcusおよび Nosardioides属に属する微生
物の株である。（Ｒ）光学活性エポキシドを生産できる微生物の例は、特に、Th
ichosporon, Geotrichum, Corynebacterium, MicrococcusおよびBrevibacterium
属に属する微生物の株である。

【００１１】スチレンオキシドは、哺乳動物エポキシドヒドロラーゼで行われる実験で最も
広い適用を見い出すテスト基質の１つであり、このモデル基質の芳香環が置換さ
れた種々の誘導体はこの意味で調べられてきた（Dansetteら、１９７８；Westka
emperら、１９８１）。より最近では、微生物起源の酵素活性で行われた実験も
またこのモデル基質を用い、本発明者ら自身は、番号ＬＣＰ５２１で自然歴史博
物館（パリ）に登録された真菌 Aspergillus nigerの株によってエナンチオ選択
的にこれらの分子が加水分解され得ることを示した（Lab. de Cryptogamic, 12
rue Buffon, 75005 パリ、フランス）（Pedragosa-Moreauら、１９９６）。

【００１２】それにも拘わらず、今日までに記載された真菌 Aspergillus nigerのごとき真
菌の助けを借りて行うエナンチオ選択性加水分解実験は真菌の全細胞または細胞
抽出物を利用し、これは適用において多数の技術的問題を生じ、良好な収率を与
えず、使用する生物学的触媒の構造がはっきりすることを可能としない。

【００１３】真菌起源のよく同定され特徴付けされたエポキシドヒドロラーゼの使用はこれ
らの欠点を救済できるようにするであろうが、これまで、真菌起源のエポキシド
ヒドロラーゼを単離し精製することが可能とはなっておらず、これは、そのよう
な酵素がその天然環境から完全に単離されるのに十分には安定ではない可能性を
示唆する。

【００１４】本発明は、真菌からエポキシドヒドロラーゼを単離し精製するのが可能である
事実の本発明者らによる証明に由来する。かくして、本発明は、Aspergillus種
のもののごとき真菌のエポキシドヒドロラーゼ活性を有する酵素の（精製、配列
決定、クローニングによる）同定に続く。

【００１５】本発明の目的の１つは、真菌起源のエポキシドヒドロラーゼ活性を持つ新規酵
素を提供することにある。

【００１６】本発明のもう１つの目的は、これらの酵素をコードするヌクレオチド配列を提
供することにある。

【００１７】本発明の更なる目的は、当該酵素が有利に過剰発現される、前記ヌクレオチド
配列によって形質転換された宿主細胞を提供することにある。

【００１８】また、本発明は、特に、真菌の細胞からの抽出および精製によって、あるいは
前記した宿主細胞を培養することによって該酵素を得る方法を提供する目的を有
する。

【００１９】本発明のもう１つの目的は、種々のエポキシドおよび／またはジオールの合成
のための、前記酵素または前記した該酵素の生産者である宿主細胞を用いる生体
触媒の新規方法を提供することにあり、これらの方法は、従前に記載された真菌
の全細胞または細胞抽出物を用いる方法よりも高い収率を与える。

【００２０】従って、本発明は、特に温和な実験条件で、すなわち、特に、緩衝化または非
緩衝化水性倍地中および／または水混和性または水非混和性有機溶媒の存在下で
、有機または無機の酸性または塩基性試薬を使用することなく、行うことができ
る利点を提供する非キラルまたはキラルエポキシドの加水分解の方法を提供する
ことをその目的とする。出発エポキシドの固有の立体化学特性に応じ、これらの
方法は、非キラル、ラセミ体または光学的に豊富なジオールの生産、または−も
し出発エポキシドがキラルであれば−光学的に豊富な形態またはエナンチオマー
的に純粋でさえある形態の２つのエナンチオマーの内の１つの生産をもたらす。

【００２１】本発明は、真菌の細胞からの抽出によって、または前記した真菌タンパク質を
コードするヌクレオチド配列によって形質転換された宿主細胞の培養によって実
質的に純粋な形態で得られるごとき、エポキシドヒドロラーゼ活性を有する真菌
起源の任意のタンパク質、または真菌起源の前記したタンパク質の１以上のアミ
ノ酸の置換、欠失または付加によって誘導され、かつエポキシドヒドロラーゼ活
性を保有する任意のタンパク質に関する。

【００２２】前記したエポキシドヒドロラーゼ活性は基質としてパラ−ニトロスチレンオキ
シド（ｐＮＳＯ）を用い、特に、以下の方法に従って形成されたジオールの量を
測定し、前記したエポキシドヒドロラーゼ活性を測定することができる。

【００２３】酵素を含有する５０μLの調製物を４１０μLの０．１Mリン酸ナトリウム緩衝
液pH７．０（緩衝液Ｂ）に添加し、混合物を３５℃にて２分間プレインキュベー
トする。次いで、ＤＭＦ中のラセミ体ｐＮＳＯの５０mMの溶液の４０μLを添加
する（最終ｐＮＳＯ濃度：４mM）。

【００２４】インキュベーションから１０分後に、１mLのジクロロメタンを添加することに
よって反応を停止させる。混合物を激しく撹拌して、基質および生産されたジオ
ール双方を抽出する。形成されたジオールの量は、従前に記載されているごとく
（Nellaiahら、１９９６）、ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）（Waters Associates、米国）によってシリカカラムでの分離後に測定される。

【００２５】１ユニットのエポキシドヒドロラーゼは、前記条件での１分当たり１μモルの
ジオールの形成を触媒する酵素の量を表す。生抽出物とのインキュベーションの
後に、形成されたジオールの量は少なくとも３０分間は時間と共に直線的に増加
し、反応速度は０．０１〜１．２ユニットの範囲の酵素の濃度に比例する（Nell
aiahら、１９９６）。

【００２６】本発明は、さらに詳しくは、 −配列番号２の配列、 −誘導された配列が、好ましくは、配列番号２の配列に対して少なくとも４０
％、特にほぼ８０％を超える相同性を有し、特に、１以上のアミノ酸の置換、抑
制または付加によって配列番号２の配列から誘導され、かつエポキシドヒドロラ
ーゼ活性を保有する任意の配列、または、 −断片が、好ましくは、配列番号２の位置１および３３９に位置するアミノ酸
によって境界を定められた領域中で連続する少なくとも約１０アミノ酸よりなる
配列番号２の配列の任意の断片、または前記の後者から誘導され、かつエポキシ
ドヒドロラーゼ活性を保有する配列の断片、を含むことを特徴とする前記任意のタンパク質に関する。

【００２７】本発明は、さらに詳しくは、Aspergillus属の真菌の細胞の培養物からの抽出
および精製によって得られるごとき、実質的に純粋な形態の真菌エポキシドヒド
ロラーゼにすることを特徴とする前記任意のタンパク質に関する。

【００２８】従って、本発明は、さらに詳しくは、Aspergillus nigerまたはAspergillus t
urinegensisの株の細胞の培養からの抽出および精製によって得られるごとき、
配列番号２によって表される実質的に純粋な形態の真菌エポキシドヒドロラーゼ
にすることを特徴とする任意の前記タンパク質に関する。

【００２９】また、本発明は、 −配列番号２によって表されるエポキシドヒドロラーゼをコードする配列番号
１のヌクレオチド配列または遺伝暗号の縮重によって配列番号１から誘導され、
かつ配列番号２によって表されるエポキシドヒドロラーゼをコードする任意の配
列、 −誘導された配列が、好ましくは、配列番号１の配列に対して少なくとも約４
５％、特に約８０％を超える相同性を有し、特に、１以上のヌクレオチドの置換
、欠失または付加によって配列番号１の配列から誘導され、かつエポキシドヒド
ロラーゼ活性を保有する酵素をコードする任意の配列、または、 −断片が、好ましくは、配列番号１の配列の位置１および１１９７に位置する
ヌクレオチドによって境界が定められた領域中で連続する少なくとも約２０ヌク
レオチドよりなり、配列番号１の配列の任意の断片、または前記の後者から誘導
され、かつエポキシドヒドロラーゼ活性を保有する酵素をコードする配列の任意
の断片、を含有するベクターによって適当な宿主細胞の形質転換により実質的に純粋な形
態で得られるごとき、組換え真菌エポキシドヒドロラーゼに相当することを特徴
とする、前記任意のタンパク質に関する。

【００３０】従って、本発明は、さらに詳しくは、配列番号１のヌクレオチド配列、または
遺伝暗号の縮重によって配列番号１から誘導され、かつ配列番号２によって表さ
れるエポキシドヒドロラーゼをコードする任意の配列を含有するベクターによっ
て適当な宿主細胞の形質転換により得られるごとき、配列番号２によって表され
る組換え真菌エポキシドヒドロラーゼに関する。

【００３１】また、本発明は、前記定義のエポキシドヒドロラーゼ活性を持つ真菌起源のタ
ンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列に関する。

【００３２】本発明は、さらに詳しくは、 −配列番号２によって表されるエポキシドヒドロラーゼをコードする配列番号
１によって表される配列、 −遺伝暗号の縮重によって配列番号１の配列から誘導され、かつ配列番号２に
よって表されるエポキシドヒドロラーゼをコードする任意の配列、 −誘導された配列が、好ましくは配列番号１の配列に対して少なくとも約４５
％、特に約８０％を超える相同性を有し、特に１以上のヌクレオチドの置換、欠
失または付加によって配列番号１の配列から誘導され、かつエポキシドヒドロラ
ーゼ活性を保有する酵素をコードする任意の配列、 −断片が、好ましくは、配列番号１の配列の位置１および１１９７に位置した
ヌクレオチドによって境界が定められた領域中で連続する少なくとも約２０ヌク
レオチドから構成され、配列番号１の配列の任意の断片、または前記定義の後者
から誘導され、かつエポキシドヒドロラーゼ活性を保有する酵素をコードする配
列の任意の断片、 −前記配列または断片の任意の相補的ヌクレオチド配列、または、 −エポキシドヒドロラーゼ活性を保有する酵素をコードし、かつ前記配列また
は断片の１つとハイブリダイズすることができる任意のヌクレオチド配列；を含み、前記配列または断片が一本鎖または二本鎖形態であることを特徴とする
、前記ヌクレオチド配列に関する。

【００３３】また、本発明は前記定義のヌクレオチド配列を含有する任意のベクター、特に
プラスミドに関する。

【００３４】有利には、前記ベクターにおける本発明のヌクレオチド配列は、前記定義のエ
ポキシドヒドロラーゼ活性を持つタンパク質の発現を調節するエレメント、特に
、必要であれば誘導性のプロモーター、および転写ターミネーターの制御下に置
かれる。

【００３５】好ましくは、前記プロモーターは、ベクターによって形質転換された宿主細胞
における該タンパク質の過剰発現を可能とするものから選択され、該宿主細胞は
、それ自体、特に細菌、ウイルス、酵母、真菌、植物または哺乳動物細胞の中で
、該タンパク質を過剰発現できるものから選択される。

【００３６】また、本発明は特に細菌、ウイルス、酵母、真菌、植物または哺乳動物細胞か
ら選択される任意の宿主細胞に関し、該宿主細胞は、そのゲノムが、エポキシド
ヒドロラーゼ活性を持つタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列を含有す
るように、前記定義のベクターによって形質転換される。

【００３７】また、本発明は、特に、医薬および植物−保護分野において、または特異的光
学材料の製造において、エポキシドまたはエナンチオマー的に純粋な隣接ジオー
ルの調製方法の実施における、酵素生物触媒としての前記定義のエポキシドヒド
ロラーゼ活性を持つタンパク質の使用に関する。

【００３８】従って、本発明は、以下の式（II）および（III）：

【００３９】

【化３】

【００４０】（式中、Ｒ¹，Ｒ²，Ｒ³およびＲ⁴は任意の基、特に、医薬および植物−保護化合
物、または該エポキシドまたは隣接ジオールに対応する特異的光学材料に特徴的
な基を表す）のエポキシドの各々および／またはエナンチオマー的に純粋なジオールの調製方
法に関し、該方法は、以下の式（Ｉ）：

【００４１】

【化４】

【００４２】のジアステレオマーエポキシドの混合物、またラセミ形態のキラルエポキシド、
またはプロキラルエポキシドを、前記定義のエポキシドヒドロラーゼ活性を持つ
タンパク質、または前記定義のエポキシドヒドロラーゼ活性を持つタンパク質を
発現または過剰発現する前記宿主細胞で処理する工程を含み、これは、 −式（II）および（III）の前記化合物の混合物、必要であれば、式（II）お
よび（III）の該化合物は精製のさらなる工程によって分離することができ、 −または前記式（III）の化合物のみ；の生産に導く。

【００４３】前記式（III）の化合物のみの生産の場合では、これは、出発エポキシドに応
じて、もう１つの化学的または酵素的試薬、例えば、パラ−ニトロスチレンオキ
シド（Pedragosa-Moreauら、１９９７）の場合には硫酸、または特にスチレンオ
キシド（Pedragosa-Moreauら、１９９３）の場合にはBeauveria sulfurescensの
細胞での前記処理を伴うまたはそれに続く処理によって行うことができる。

【００４４】有利には、本発明による前記方法を前記定義のエポキシドヒドロラーゼ活性を
持つタンパク質によって行う場合、後者はＤＥＡＥセルロースまたはＤＥＡＥセ
ファロース、またはこの酵素を固定化することができる任意の他の支持体または
技術のごとき固体支持体上に固定化することができる。

【００４５】また、本発明は、さらに詳しくは、非キラルエポキシドの加水分解につき前記
した方法の実施における、前記した形質転換宿主細胞を含めた、種々の形態の前
記定義のエポキシドヒドロラーゼ活性を持つタンパク質、この酵素を生産するAs
pergillus nigerのごとき真菌の全細胞、該細胞の可溶性または凍結乾燥酵素抽
出物または前記定義の固体支持体に固定化した酵素の使用に関する。

【００４６】また、本発明は、好ましくは、細菌、ウイルス、酵母、真菌、植物または哺乳
動物細胞から選択された宿主細胞を前記ベクターで形質転換する工程、および該
細胞によって生産された組換えエポキシドヒドロラーゼを精製する工程を含むこ
とを特徴とする、前記定義の組換えエポキシドヒドロラーゼ活性を持つタンパク
質の調製方法に関する。

【００４７】また、本発明は実質的に純粋な形態の真菌エポキシドヒドロラーゼの調製方法
に関し、該方法は、 −特に、フレンチプレスまたは任意の他の適当な手段を用い真菌を破砕するこ
とによって、Aspergillus種の真菌のごとき真菌の細胞培養から酵素を抽出する
工程、続いて、低速遠心（約１００００ｇ）、上清の回収、および限外濾過によ
る濃縮の工程、 −特に、ＤＥＡＥ−セファロース、フェニル−セファロース、モノＱおよびス
ペローズ１２のカラムを連続的に通すことによって、これまでの工程で得られた
抽出物から酵素を精製する工程を含む。

【００４８】本発明は、さらに、真菌 Aspergillus nigerの株からのエポキシドヒドロラー
ゼの精製、ならびにこのエポキシドヒドロラーゼをコードする遺伝子のクローニ
ング、および本発明による方法の適用の例の以下の記載によって説明される。

【００４９】Ａ）高エナンチオ選択性での Aspergillus nigerからエポキシドヒドロラーゼの
精製および特徴付けＩ）装置および方法１）試薬用いたテスト基質はラセミｐ−ニトロスチレンオキシド（ｐＮＳＯ）である。
それは、WestkaemperおよびHanzlik、１９８０によって記載された技術に従って
ω−ブロモ−４−ニトロアセトフェノンから合成される。その純粋な（Ｒ）およ
び（Ｓ）エナンチオマーは生物変換の工程によってこのラセミ基質から得られる
（Ｐedragosa-Moreaiら、１９９６）。ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セ
ファロース、フェニル−セファロース、「モノＱ」およびスペローズ１２カラム
はPharmacia LKB（Uppsala、スウェーデン）から得られる。Ｈ₂〔¹⁸Ｏ〕はIsote
c（Miamisburg、米国）から得られ、その〔¹⁸Ｏ〕含有量は９５％である。全て
のタンパク質クロマトグラフィーは、４℃にてFPLC Pharmaciaシステムを用いて
行われる。

【００５０】２）生物、増殖の条件および抽出物の調製この実験で用いた真菌Aspergillus nigerの株は番号ＬＣＰ５２１下で自然歴
史博物館（パリ）（Lab. DE Cryptogamie, 12 rue Buffon, 75005 パリ、フラン
ス）に登録されている。培養は、Nellaiahら，１９９６に記載された条件で５Ｌ
（液体容積）の容量を持つファーメンターで行う。培養の４０時間後に細胞を濾
過によって収穫する。それを、１mMシステイン、１mM ＥＤＴＡおよび０．３mM
塩化フェニルメタンスルフォニル（ＰＭＳＦ）を含有するpH７．１の１０mMトリ
ス−ＨＣｌ緩衝液に懸濁させる。無細胞抽出物は、フレンチプレス、または当業
者が使用することができる任意の他の手段、およびNellaiahら，１９９６によっ
て記載された条件での低速遠心（１０００ｇ）を用いて真菌を破砕することによ
って調製される。この抽出物は、１０、４０または１００kDaまでのカットオフ
閾値を持つ膜を用いるタンジェンシァルフロー濾過によって１００mLまで濃縮す
る。いずれの他の操作も、１mMシステイン１mM ＥＤＴＡおよび０．３mM ＰＭ
ＳＦを含有する緩衝溶液中で４℃の温度で行って、酵素の不活化を回避する。タ
ンパク質の濃度は、参照としてウシ血清アルブミンを用い、Lowryら、１９８１
の方法によって測定される。

【００５１】３）エポキシドヒドロラーゼの精製酵素を含有する濃縮された溶液を、０．１３M ＫＣｌを含有する緩衝液Ａで
予め平衡化させたＤＥＡＥ（ジエチルアミノエテル）−セファロース（２．５cm
×３０cm）のカラムに沈積させる。カラムを３６０mLの平衡化緩衝液で洗浄し、
溶出は、緩衝液Ａ中の０．１３−０．２３M ＫＣｌの直線グラジエント（全容
量：５１０mL、流速：３mL／分、画分の容量：６mL）で行う。

【００５２】活性は、０．１７−０．２０Mの塩化カリウム濃度で溶出させる。活性画分を
合わせ、限外濾過によって５mLまで濃縮する。濃縮物を、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ０
．２５Mおよび２１％（ｖ／ｖ）のエチレングリコールを含有する緩衝液Ａで予
め平衡化させたフェニル−セファロースのカラム（１cm×１０cm）に沈積させる
。カラムを同一緩衝液１０mLで洗浄し、ついで、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ０．２５Mを
含有する緩衝液Ａ中の２１−５１％（ｖ／ｖ）のエチレングリコールの直線グラ
ジエントで溶出を行う（合計容量：９５mL、流速：０．５mL／分、画分の用量：
１mL）で行う。

【００５３】活性は３０−４３％（ｖ／ｖ）のエチレングリコール濃度で溶出させる。活性
画分を合わせ、５mLに濃縮する。濃縮物を、０．１３M ＫＣｌを含有するトリ
ス−ＨＣｌ緩衝液１０mM、pH６．５で予め平衡化させたモノＱカラム（０．５cm
×５）上に沈積させる。カラムを５mLの緩衝液で洗浄し、溶出は、０．１３−０
．２５Mの塩化カリウムの直線グラジエント（合計用量８５mL；流速０．５mL／
分；画分の容量：１mL）で行う。活性を、０．１５−０．１６Mの塩化カリウム
の濃度まで溶出させる。活性画分を合わせ１ｍＬまで濃縮する。酵素を含有する
溶液（２００mL）をスペローズ１２のカラム（１cm×３０cm）上に沈積させ、緩
衝液Ａで平衡化させる（流速０．３mL／分；画分の容量：０．６mL）。この工程
を５回（各回２００μL）行い、全ての活性画分を合わせる。かく得られた調製
物を４℃にて保存する。

【００５４】４）酵素実験Ｈ₂〔¹⁸Ｏ〕でのインキュベーションは、１８０μLのＨ₂（¹⁸Ｏ）緩衝液Ｂ、
２０μLの精製されたエポキシドヒドロラーゼおよび２０μLの基質（アセトニト
リル中５０mM）を含有する１mLフラスコ中で行う。磁気撹拌（５００rpm）しつ
つ２５℃で、１．５時間インキュベーションした後、残存する基質および形成さ
れた生成物を２mLのジクロロメタンで抽出する。シリカ上の分析クロマトグラフ
ィー（溶離剤：ジエチルエーテル）によってジオールを精製する。ガスクロマト
グラフィー／マススペクトロメトリー（ＧＣ／ＭＳ）によって２μLの試料を分
析する。ｐ−トルエンスルホン酸の存在下での２，２−ジメチルプロパンとの反
応によって、残存するジオールを対応するアセトニドに変換する。該アセトニド
を、Audierら、１９６８によってすでに記載されているごとくにＧＣ／ＭＳによ
って分析する。

【００５５】合計容量５mLでの反応は、０．１Mリン酸ナトリウム緩衝液pH８．０中、４．
３mMの濃度の基質とＤＭＳＯ（２０容量％）とで２５℃で行う。

【００５６】反応は１３Ｕ／Ｌの精製された酵素を添加することによって出発させる。逆相
カラムを用いるＨＰＬＣによる基質および生成物の濃度の定量（Nellaiahら、１
９９６）のため、および気相クロマトグラフィーによるエナンチオマー過剰のエ
ポキシドおよびジオールの定量（Nellaiahら、１９９６）のため、試料を３０分
ごとに採取する。

【００５７】５）ポリアクリルアミドゲル電気泳動ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動は、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
の存在下で、pH８．８にて、分解ゲル（１０％のアクリルアミド）および濃縮ゲ
ル（４％のアクリルアミド）を含有する１mmの厚みを持つプレート上で行われる
（Laemmli、１９７０）。１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、１０％（ｖ／ｖ）のグリセ
ロールおよび２％（ｖ／ｖ）のβ−メルカプトエタノールを含有するトリス−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（６２．５mM、pH８．８）を溶解させ、１００℃にて２分間過熱する
。タンパク質を０．１％（ｗ／ｖ）のクーマシーブルーで染色する。非変性ＰＡ
ＧＥゲル上の移動は、β−メルカプトエタノールを分解緩衝液に添加せず、かつ
試料を加熱しなかった以外は同様に行った。Pharmacia LKB「Phastsystem」シス
テムおよび標準Pharmacia手法によって、等電点電気泳動を３−９のpHグラジエ
ントで行う。タンパク質を硝酸銀で染色する。

【００５８】６）分子量の測定精製されたエポキシドヒドロラーゼ（ＥＨ）の移動度（Ｒｆ）を以下の標準：
ホスホリラーゼＢ（９７．４kDa）、ウシ血清アルブミン（６６．２kDa）オボア
ルブミン（４５kDa）、カルボニックアンヒドロラーゼ（３１kDa）、トリプシン
インヒビター（２１．５kDa）およびリゾチーム（１４．４kDa）のそれと比較す
ることによってＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に分子量を測定した。天然酵素の分子量は、
精製されたＥＨのＫａｖｏ、以下の標準タンパク質：アルコールデヒドロゲナー
ゼ（１５０kDa）、ウシ血清アルブミン（６７kDa）、オボアルブミン（４３kDa
）、キモトリプシノーゲンＡ（２３kDa）およびリボヌクレアーゼＡ（１３．７k
Da）のそれと比較することによって、スペローズ１２の溶出プロフィールから測
定した。排除容量およびデッド容量はデキストランブルーおよびビタミンＢ１２
を用いて測定した。

【００５９】７）アミノ酸配列アミノ酸分析およびＮ−末端配列決定では、標準的なBiorad手法（Hercules、
米国）を用い、ペプチドをＳＤＳゲルから「ガラス−結合」膜（Biometra、ドイ
ツ）に移した。酵素のアミノ酸組成は、自動アミノ酸分析器（Beckman 6300シス
テム、ドイツ）を用い、酸加水分解（２４時間の真空下での１００℃における６
ＮＨＣｌ）後に測定した。分子量は、Delaageの方法を用いてアミノ酸組成か
ら評価した（１９６８）。

【００６０】８）ペプチド配列タンパク質をＳＤＳ緩衝液に溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。
ゲルの一部をクーマシーブルーで染色し、注目するストリップをゲルの残りから
分離した。該ストリップをＨ₂Ｏ−ＣＨ₃ＯＨ（９０：１０）、Ｈ₂Ｏ−ＣＨ₃ＣＮ
（８０：２０）、およびＨ₂Ｏ−ＣＨ₃ＣＮ（５０：５０）で１時間洗浄した。つ
いで、ゲルの該ストリップを小片に切断し、Speed-Vac（Savant）中で真空下で
乾燥した。ついで、２５mMトリスＨＣｌ（pH８．５）、１mM ＥＤＴＡ、０．０
５％ＳＤＳおよび５μgのプロテアーゼＬｙｓ−ｃ（Boehringer Mannheim）を含
有する４００μLの溶液を添加し、混合物を３７℃にて一晩インキュベートした
。加水分解物を逆相ＨＰＬＣカラム（Vydac Ｃ₁₈；２．１×２５０mm）に注入
した。溶液Ｂ（０．０７％のトリフルオロ酢酸を含有するＣＨ₃ＣＮ）の０〜３
５％の直線グラジエントにてカラムを０．２mL／分の流速で１５０分間溶出させ
（溶液Ａは水および０．７％のトリフルオロ酢酸よりなる）、ピークを収集し、
Applied Biosystems モデル４７７Ａマイクロシーケンサーで直接配列決定した
。

【００６１】９）ＰＣＲ反応、クローニングおよび配列決定プライマーとしての部分的アミノ酸配列から得られた変性オリゴマーを用い、
かつ支持体としてAspergillus nigerのゲノムＤＮＡを用い、ＰＣＲ反応を行っ
た。水で洗浄した１．５ｇの菌糸からゲノムＤＮＡを抽出し、液体窒素中で粉砕
し、緩衝液トリス−ＨＣＬ５０mM pH７．５、ＥＤＴＡ５０mM、ＳＤＳ３
％、β−メルカプトエタノール１％に懸濁させた。６５℃での１時間の反応の後
、溶液をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合物（２４／２４
／１，ｖ／ｖ／ｖ）およびクロロホルム／イソアミルアルコール混合物（２４／
１）で溶液を抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、沈積物をＴＥ緩衝液（トリ
ス−ＨＣｌ１０mM pH７．５およびＥＤＴＡ１mM）に溶解させた。ＲＮａｓ
ｅを３７℃にて１時間で添加し（３０μg／mL）、ＤＮＡをイソプロパノールで
沈殿させ、７０％エタノールで洗浄し、水に溶解させた。ＰＣＲ反応は、１００
ngのＤＮＡ、ｄＮＴＰ２００μM、２μMの各プライマーおよび２ユニットのＴａ
ｑポリメラーゼ（Perkin Elmer）を用い、合計容量５０μL中で行った。ＰＣＲ
反応は９５℃にて５分間加熱することにより行い、ついで、３つの温度にて３０
サイクルの増幅で行った（９５℃において１分、５８℃にて１分、および７２℃
にて１分）。１ユニット／μLのターミナルトランスフェラーゼ（Boehringer）
での処理の後、増幅された断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）（
Statagene）のＥＣＯＲＶ部位にクローン化した。Pharmacia T7配列決定キッ
トを用いて断片を配列決定した。

【００６２】 II）結果４−段階クロマトグラフィーを用い、Aspergillus nigerからのＥＨを電気泳
動的に均一まで精製した。合計して、１２０μgの精製酵素が２４ｇの乾燥菌糸
、すなわち、５Ｌの培養液から出発して調製された。これの比較的低い値は次の
２反応による：１）タンパク質の濃度が低い場合、総じての（全）収率は、限外濾過による主
として濃縮の段階の精製手法の間に酵素の不安定性のため低い（４％）；２）Asbergillus nigerの細胞抽出物におけるＥＨの初期含有量は低い：可溶
性タンパク質の０．４％の値は、精製された酵素の特異的活性を用いて計算され
る。しかしながら、精製された酵素は、ｐＮＳＯに対する真菌の活性の全て原因
である。かくして、おそらくは、Aspergillus niger中にこの基質に対するただ
１つの活性なタンパク質がある。

【００６３】精製されたエポキシドヒドロラーゼ（ＥＨ）は、クーマシーブルーでの染色後
に天然ＰＡＧＥまたはＳＤＳゲルにおいて単一のバンドを有する。非−変性ポリ
アクリルアミドゲルの電気泳動後に得られたゲルのスライスの活性の測定は、標
識されたタンパク質のバンドと同一レベルに位置した単一のバンドを明らかとす
る。タンパク質の等電点は、３〜９のpHグラジエントを用いる等電点電気泳動お
よび硝酸銀染色による測定後に４．５である。

【００６４】 Aspergillus nigerのＥＨは、４５kDaの４つの同一のサブユニットよりなるテ
トラマーである。他の供給源からのＥＨは、一般に、モノマーまたはダイマータ
ンパク質である。しかしながら、Corynebacterium属のエポキシドヒドロラーゼ
はドデカマーであると最近記載されている（Misawaら、１９９８）。

【００６５】いくつかの選択的試薬の活性に対する効果をテストした。ＥＤＴＡおよびＰＭ
ＳＦは効果を示さない。メタ−クロロ安息香酸または過酸化水素のごとき酸化剤
は、酵素の活性を強く阻害する。他方、β−メルカプトエタノールまたはシステ
インのごとき還元剤は酵素の活性に対して陽性の効果を示す。さらに、強力な不
活化が、ＨｇＣｌ₂、４−ヒドロキシ−水銀安息香酸、ヨードアセタミドまたは
ジチオニトロベンゼン（ＤＴＮＢ）のごときチオールブロッキング剤で観察され
る。全てのこれらの結果は、エポキシドヒドロラーゼの活性に対する１以上のシ
ステイン残基の必須の役割を示す。同様の効果が哺乳動物からの可溶性ＥＨ（ｓ
ＥＨ）（Wixtromら、１９８５）および Pseudomonas種からのＥＨ（Rinkら，１
９９７）で観察され、他方、哺乳動物からのミクロソームＥＨ（ｍＥＨ）（Wixt
romら、１９８５）はチオール試薬に対して感受性ではない。

【００６６】 pH活性プロフィールおよびω−ブロモ−４−ニトロアセトフェノンによる阻害
は、触媒メカニズムにおけるヒスチジン残基の関与を示唆する。さらに、ある種
のシステイン残基は、ｍＥＨでは示されていないが、哺乳動物ｓＥＨで示されて
いるごとく酵素の活性で重要である（Wixtromら、１９８５）。エポキシドの加
水分解についての哺乳動物ｓＥＨおよびｍＥＨの触媒メカニズムが最近解明され
ている（Beethamら、１９９５；Arandら、１９９６）。中間体共有結合エステル
の形成に関与する二段階メカニズムが、２つのアスパラギン酸および１つのヒス
チジン残基の関与でもって示されている。しかしながら、微生物ＥＨの触媒メカ
ニズムについてはほとんど知られていない。最近、同様のメカニズムが、細菌Ag
robacterium radiobacderのエポキシドヒドロラーゼについて示された（Rinkら
、１９９７）。これらのエレメントは、Aspergillus nigerのＥＨが、哺乳動物
ＥＨとしてのエポキシドの水和についての同様のメカニズムを用いることを示唆
する。このメカニズムは、Aspergillus nigerからの生の抽出物によるパラ−置
換スチレンオキシドの加水分解で示された触媒の一般的プロセスを説明する（Be
dragosa-Moreauら、１９９６）。

【００６７】ｐＮＳＯでは、有機溶媒の添加が基質を溶解させるのに必要である。事実、共
溶媒の不存在下では、活性は検出できない。他の可溶性ＥＨでは、ミセルの基質
に対してそれらは活性ではないことが示されている（Hammockら、１９９７）。
かくして、Aspergillus nigerからのエポキシドヒドロラーゼの活性に対する異
なる共溶媒の効果を調べた。共溶媒の性質は、エポキシドの開環における収率に
対してかなりの影響を有し、最も強い活性はＤＭＦおよびアセトンで得られてい
る。ＴＨＦで得られた低い活性は、溶媒に通常存在する痕跡量の過酸化物による
酵素の不活化と相関し得る。

【００６８】酵素は５〜９の範囲のpHで活性であり、最大ピークはpH７においてである。酵
素は２〜４５℃の範囲の温度で活性であり、４０℃で最大活性である。２〜４０
℃では、活性は、低い活性化エネルギー（２７kJ・モル^-1・゜Ｋ^-1）によって示
されるごとくわずかに増加する（４倍に過ぎない）。

【００６９】現実的な観点から、Aspergillus nigerからのＥＨは、高度にエナンチオ選択
的にラセミ体エポキシドを加水分解するその能力のため有機合成で非常に興味深
い。エナンチオ選択性は、（Ｓ）エナンチオマーに対するｐＮＳＯの（Ｒ）エナ
ンチオマーについてのより高い親和性およびより高い触媒定数のためである。

【００７０】具体的定数の比率（k_cat/Km）は、（Ｒ）エナンチオマーの加水分解の初期速
度が、ラセミ体ｐＮＳＯで出発する（Ｓ）エナンチオマーのそれよりも５５倍速
いことを示す。この結果は、同一基質についての全細胞で観察されたものと同様
である（Pedragosa-Moreau, 1997）。さらに、反応の位置選択性は非常に高い：
全真菌で示されるごとく２炭素で９７％である（Pedragosa-Moreau, 1996）。As
pergillus nigerの精製されたＥＨによるｐＮＳＯの加水分解のエナンチオ選択
性および位置選択性は、細胞の全てで測定されたものと非常に同様である。従っ
て、精製された酵素はｐＮＳＯに対する真菌の全活性を担う。

【００７１】Ｂ）哺乳動物ミクロソームエポキシドヒドロラーゼに関するAspergillus niger
からの可溶性エポキシドヒドロラーゼのクローニングおよび特徴付けＩ）実験手法１）Aspergillus niger（A. niger）からの核酸の単離培養１Ｌ当たり１０ｇのグルコースおよび２０ｇのトウモロコシリカー（Sigm
a, St. Louis、カタログ番号Ｃ４６４８）を含有する培地中で、Aspergillus ni
ger（前記株Ｎｏ．ＬＣＰ５２１）を培養した。真菌の胞子を接種した後３日間
、２８℃で撹拌したフラスコ中の１００mlの用量でインキュベーションを行った
。クロス上の濾過によって菌糸を収穫し、湿潤重量の測定後に−７０℃で保存し
た。菌糸１ｇ当たり１０mLの変性溶液を用い、ChomczynskiおよびSacchi（１９
８６）の方法によってＲＮＡの抽出を行う。典型的な収量は菌糸１ｇ当たり３０
０μgの合計ＲＮＡである。ＲＮＡの単離では、１５mLの溶解溶液（０．１Mの酢
酸ナトリウムを含有するグアニジン塩酸塩の溶液pH５．５）中にて、Potterタイ
プのガラスホモゲナイザーで２ｇの菌糸をホモゲナイズする。１０分間の１０，
０００ｇにおける遠心の後、上清をもう１つのチューブに移し、２．５容量のエ
タノールを添加する。沈殿した核酸を１０分間の１０，０００ｇにおける遠心に
よって集め、得られた残渣を、簡単に乾燥した後、１０mLの溶解緩衝液中に一晩
で溶解させる。不溶性画分を遠心によって除去し、２５mLのエタノールを添加す
ることによって核酸を再度沈殿させる。遠心ペレットを７０％エタノールで洗浄
し、３０分間風乾し、ＴＥ緩衝液pH８．０に溶解させる。

【００７２】２）ポリメラーゼ連鎖増幅技術（ポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲ）によるAsperg
illusのＥＨの遺伝子およびｃＤＮＡのクローニング Aspergillus ＥＨの遺伝子の増幅用の逆ＰＣＲを以下のスキームに従って行っ
た：５００ngのゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化し（成功した結果のほとん
どはＢａｍＨＩまたはＣｆｏｌで得られる）、フェノール／クロロホルム混合物
での抽出後のエタノールでの沈殿によって回収する。この５００ngのうち、１０
０ngを、供給業者によって特定された条件下で２０μl容量のＤＮＡリガーゼＴ
４（Life Technologies）での連結によって環化する。１マイクロリットルの得
られた調製物を、供給業者によって推奨される標準的な反応条件下で、ＤＮＡポ
リメラーゼＴａｑ（Parkin Elmer）を用いる３０サイクル（１分間の９４℃、１
分間の６０℃、３分間の７５℃）で行うＰＣＲによって増幅した。用いたプライ
マー： (MA226 5'-ATGCGATCGGACTGCTGGACA-3'及び MA227 5'-CGCGGGCAATCCACACCTAC-3') は、従前に得られたゲノム断片の配列から推定される。ゲノム配列中の２つのプ
ライミング部位の間に位置するＸｈｏｌ制限部位を、所望により、逆ＰＣＲ前に
環状ＤＮＡを再度線状化して、トーション応力を抑制し、従って、ゲノム支持体
の初期増幅の効率を改良するために用いる。ＰＣＲ産物をアガロースゲルでの電
気泳動によって分離し、プローブとして前記ゲノム断片を用いるサザーン技術に
従って、Aspergillus EHの特異的アンプリコンを免疫移動によって同定する。こ
のようにして同定されたAspergillus EH遺伝子の断片を、Quiaex キット（Qiage
n）を用いるアガロースゲルでの電気泳動によって精製し、チェインターミネー
ション法による配列分析のためにｐＧＥＭ−Ｔベクター（Promega）にクローン
する。

【００７３】配列から得られた情報に基づき、ＥＨ遺伝子のタンパク質をコードする領域を
囲う２つのプライマー： (MA290 5'-cggaattccATGgTCACTGGAGGAGCAATAATTAG-3'及び MA291 5'-ttgaatTCCCTACTTCTGCCACAC-3'; ；大文字の残基は支持体配列に相補的である）を推定し、ゲノムＤＮＡの各断片
を増幅し、４０サイクル（１分間の９４℃、１分間の５０℃、６分間の７２℃）
での高忠実度ＤＮＡポリメラーゼＰｆｕ（「Stratagene」）を用いてｍＲＮＡを
逆−転写するために用いる。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで消化し、最終的
な配列分析のためにｐＵＣ１９（New England Biolabs）に挿入する。

【００７４】３）組換えエポキシドヒドロラーゼの発現、精製および分析 E. coliにおける組換え体発現のために、Aspergillusのエポキシドヒドロラー
ゼのｃＤＮＡ断片を、プライマーＭＡ２９１（前記参照）およびプライマーＭＡ
３１８： (5'gctgaattcacATGTCCGCTCCGTTCGCCAAG-3') を用いてＤＮＡポリメラーゼＰｆｕで増幅して、配列分析によって明らかにされ
たAspergillusのエポキシドヒドロラーゼ遺伝子の可能性のある開始コドンにAfI
III Nco1−適合認識部位（プライマーＮＡ３１８中のアンダーライン）に導入す
る。

【００７５】多重切断部位： (5'-CCATGGGAATTCTCGAGATCTAAGCTTATGCATCAGCTGCATGG-3') を、リボソーム結合部位に適合させるためのｐＧＥＦ＋ベクターの開始コドンを
含有するＮｃｏｌ部位（ＲＮＡポリメラーゼＴ７のプロモーターの蒸留）に導入
することによって、ｐＧＥＦ＋細菌発現ベクターを修飾する。得られたプラスミ
ドを以後ｐＧＥＦＩＩと呼ぶ。AspergillusのＥＨのＰＣＲ断片ＡｆＩＩＩ／
ＥｃｏＲＩをｐＧＥＦＩＩのＮｃｏｌ／ＥｃｏＲＩ部位に連結して、ｐＧＥ
ＦＡｓｐＥＨ″発現構築体を得る。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）（
Ｎｂｏｎｇｅｎ）をｐＧＥＦＡｓｐＥＨで形質転換し、３７℃のＬＢ培地に
入れる。後期指数期において、組換えタンパク質の発現の誘導を、イソプロピル
−β−チオガラクトシド（１００μM）を添加することによって行う。２時間後
、ＳＴＥ緩衝液（トリス−ＨＣｌ、１０mM、塩化ナトリウム１００mM、エチレン
ジアミン四酢酸mM、pH７．４）の培養の０．０２容量に再懸濁させ、−７０℃で
貯蔵する。パラ−ニトロスチレンオキシドのＲエナンチオマーを対応するジオー
ルに変換することによって酵素活性を測定する。パラ−ニトロスチレンノキシド
の溶媒として用いた１０μLのアセトニトリルの存在下で、５００μLのＳＴＥ中
８８０μMの基質濃度で３０℃にて３０分間、反応を行う。

【００７６】等容量のクロロホルムで基質を抽出することによって変換反応を停止させる。
これらの条件において、９９．９％を超える基質が有機相に抽出され、ジオール
の６０％が水性相に回収される。

【００７７】４００μLの上清を８００μLの水に添加し、２７７nMにおける光学密度を読む
ことによって、変換基質を定量する（生成物のモル吸光係数は９．１×１０³M^-1 ｃｍ^-1である。前記した方法に従い、Aspergillusのエポキシドヒドロラーゼを
３−工程手法によって均一になるまで精製する。

【００７８】精製されたタンパク質に対する抗体を、Friedbergら、１９９１によって記載
されたいる技術に従ってウサギを免疫化することによって得た。精製タンパク質
はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し、続いて、クーマシー
ブルーによって標識か、あるいは従前に公表された手法に従って免疫移動させる
。

【００７９】４）エポキシドヒドロラーゼ突然変異体の構築および分析可溶性哺乳動物エポキシドヒドロラーゼおよびミクロソームエポキシドヒドロ
ラーゼについて従前に記載されているごとく（Arandら、１９９６；Arandら、１
９９９）、Tomicら、１９９０の方法によって、Aspergillusのエポキシドヒドロ
ラーゼのｃＤＮＡのＰＣＲ−制御指向性突然変異誘発を行う。

【００８０】種々の突然変異を導入するのにプライマーを用いた。触媒求核性Ａｓｐ¹⁹²に
作用する突然変異を、AspergillusのエポキシドヒドロラーゼのｃＤＮＡのＮｃ
ｏＩ内部カセットをＰＣＲ−修飾断片で置換することによって導入した。

【００８１】加えて、ＸｈｏＩ断片を各ＰＣＲ断片で置き換えることによって、電子リレー
システムの残基、すなわち、Ａｓｐ³⁴⁸およびＨｉｓ³⁷⁴を標的化する突然変異を
導入する。ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ修飾を生じさせて、望まない配列
修飾の導入を最小化する。全てのＰＣＲ−生成断片を最後に配列決定して、それ
らが正しいことを確認する。組換え発現の後に、突然変異体タンパク質の可溶性
をテストし、これは、それらの構造一体性のインジケーターを表す。細菌沈積の
音波処理の後に、得られた懸濁液を１０，０００ｇで遠心し、ペレットおよび上
清を、免疫移動によりAspergillusのエポキシドヒドロラーゼの存在につきテス
トする。酵素活性は従前に記載されているごとくに上清でテストする。

【００８２】 II）結果逆ＰＣＲによるAspergillusのエポキシドヒドロラーゼ（ＥＨ）の遺伝子およ
びｃＤＮＡの単離を得た。ゲノムＤＮＡの消化のためのヘキサマー認識部位を持
つ制限酵素を用い、特異的増幅断片を得るのは困難であった。

【００８３】これは、天然起源の配列と比較して、ＭＡ２２６プライマーにおける対合エラ
ーによるようであり、これは長い産物の増幅を弱めるが、テトラマー認識配列を
持つ制限酵素を用いた場合には問題を生じない。しかしながら、ＤＮＡのＢａｍ
ＨＩによる制限後に得られた第１の断片は人工的に断端されてようであり、これ
は、初期アンプリコンの内部プライミングの結果である。結果として、ゲノム配
列から下流のAspergillusのＥＨの３′領域はこの断片を欠き、第２の逆ＰＣＲ
実験で別々に得なければならない。

【００８４】 Aspergillusのエポキシドヒドロラーゼは明らかに哺乳動物のｍＥＨに関連し
ているが、この酵素はいくつかの点でユニークである。

【００８５】まず、それは、哺乳動物のミクロソームエポキシドヒドロラーゼ（ｍＥＨ）、
および節足動物における対応するそれらの酵素とは対照的に、膜に固着配列を有
しない可溶性酵素である。

【００８６】第２に、AspergillusのＥＨは、それらの基質での哺乳動物エポキシドヒドロ
ラーゼのそれよりも、パラ−ニトロスチレンオキシドでかなり高い変換パワーを
有する。

【００８７】ラットミクロソームエポキシドヒドロラーゼ（ｍＥＨ）は１分間当たりおよび
純粋な酵素１ミリグラム当たりに約５００ナノモル変換されるそのモデル基質ス
チレンオキシドおよびベンゾ〔α〕ピレンオキシドでの特異活性を有するが、As
pergillusのエポキシドヒドロラーゼは、１分間当たりおよび酵素１ミリグラム
当たり１００μモルの４−ニトロ−スチレンオキシドを加水分解する。ラットｍ
ＥＨの変換数は、その触媒部位の電子リレーシステムの酸残基、すなわちＧｌｕ ⁴⁰⁴ をアルパラギン酸で置き換えることによって３０のファクターだけ増加した
。興味深いことに、天然Aspergillusエポキシドヒドロラーゼにおける対応する
残基は、全ての他のｍＥＨ酵素においてグルタミン酸がこの位置を占めるという
事実とは対照的に、既にアルパラギン酸である。Aspergillusのエポキシドヒド
ロラーゼにおける触媒Ａｓｐ³⁴⁸のＧｌｕによる置換は、丁度２のファクターだ
けＶｍａｘの中程度の減少に至る。同一時点において、Ｋ_Mは３のファクターだ
け降下する。この観察の可能な説明は、酵素反応の変換の程度を制限する段階に
おける逆転であろう。哺乳動物のｍＥＨおよびｓＥＨにおいて、酵素反応の第２
の加水分解段階は変換の程度を制限する段階のように見える。そのような条件に
おいて、すなわち、中間体エステルの形成の速度定数ｋ₁が加水分解段階につい
ての該定数ｋ₂よりもかなり大きい場合、低下したｋ₂によるＶｍａｘの減少はＫ _M の同様の減少と並行して起こる。なぜならば、Ｋ_M＝Ｋ_Dｋ₂／（ｋ₁＋ｋ₂）であ
るからである。しかしながら、もし、最初にｋ₁が該程度を制限し、かつｋ₂がか
なり大きいならば、発現ｋ₂／（ｋ₁＋ｋ₂）はほぼ１に等しく、Ｋ_MはＫ_Dと等し
い。電子リレーシステム、すなわち、酵素反応の第２の段階についての触媒部位
の重要な部分の変調によるＶｍａｘの半分化は、恐らくは、ｋ₂がｋ₁の値の半分
まで大きく減少することによるであろう。その結果、ｋ₂／（ｋ₁＋ｋ₂）は、今
や、１／３近く、すなわち、正確に、Aspergillusのエポキシドヒドロラーゼ（
ＥＨ）のＡｓｐ³⁴⁸Ｇｌｕ突然変異体で観察された値である。かくして、これら
の結果は、基質としてのパラ−ニトロスチレンオキシドでのAspergillusのＥＨ
の場合に、ｋ₂がｋ₁よりも大きいという事実（Ａｓｐ³⁴⁸のＧｌｕによる置換が
もはや存在しない状況）と匹敵する。これは、正確に、哺乳動物のｍＥＨで観察
されたシナリオに対応するであろう。

【００８８】 Aspergillusのエポキシドヒドロラーゼの遺伝子の構造は、元の生物の単純性
と比較して非常に複雑である。同定されたイントロンの平均サイズはほぼ６０ｐ
ｂであり、従って、Aspergillus遺伝子におけるイントロンの数とは対照的にAsp
ergillusの多くの他の遺伝子のそれと合致するが、全部で８個は異常に高い。

【００８９】２つの生物におけるイントロンの同一数にも拘わらず、真菌および哺乳動物の
間でエクソン／イントロンは保存されていない。真菌および哺乳動物遺伝子は、
共に、第１の非−コーディングエクソンを有する。ラットにおいては、最初のエ
クソンについての少なくとも３つの代替品の存在が認識されている。ここに、第
１の非−コーディングエクソンは、同一タンパク質の合成のための異なるプロモ
ーターの代替使用を可能とする。

【００９０】Ｃ）適用の例実施例１１５ｇの１，１−ジエトキシブタ−３−エンオキシド（反応媒体１リットル当
たり９４ミリモルまたは０．３モルの濃度）を３００mlのリン酸緩衝液（pH８，
０．１M）に添加する。温度を４℃に調整し、１．２ｇの精製された（天然）酵
素を添加する。４℃で３０時間撹拌した後、残存するエポキシドをペンタンで抽
出する。溶媒の蒸発、続いての蒸留により、４．５ｇの（Ｓ）−エポキシドを単
離することが可能となる（収率＝３０％、ee＝９８％）。水性相のジクロロメタ
ンでの連続的抽出により、シリカカラム上での精製後に、９ｇの（Ｒ）−ジオー
ルを単離することができる（収率＝５４％、ee＝４７％）。

【００９１】

【化５】

【００９２】実施例２６ｇのパラ−ブロモ−αーメチルスチレンオキシド（反応媒体１リットル当た
り２８ミリモルまたは０．３５モルの濃度）を７５mlのリン酸緩衝液（pH８、０
．１M）に添加する。温度を４℃に調整し、０．３５ｇの精製された（天然）酵
素を添加する。０℃で４日間撹拌した後、残存するエポキシドをペンタンで抽出
する。溶媒の蒸発、続いての蒸留により、２．３ｇの（Ｓ）−エポキシドを単離
することが可能となる（収率＝３９％，ee＝９９．７％）。水性相のジクロロメ
タンでの連続的抽出により、シリカカラム上での精製後に、３．１９ｇの（Ｒ）
−ジオールを単離することができる（収率＝４９％，ee＝９６％）

【００９３】

【化６】

【００９４】実施例３４ｇのパラ−クロロスチレンオキシド（反応媒体１リットル当たり２６ミリモ
ルまたは２モルの濃度）を９mlのリン酸緩衝液（pH７、０．１M）に添加する。
温度を０℃に調整し、２．３ｇの精製された（天然）酵素を添加する。０℃で８
時間撹拌した後、残存するエポキシドをペンタンで抽出する。溶媒の蒸発、続い
ての蒸留により、１．９ｇの（Ｓ）−エポキシドを単離することが可能となる（
収率＝４７％，ee＝９９％）。水性相の酢酸エチルでの抽出により、シリカカラ
ム上での精製後に、２．１５ｇの（Ｒ）−ジオールを単離することができる（収
率＝４８％，ee＝９２％）

【００９５】

【化７】

【００９６】実施例４４ｇのパラ−ニトルスチレンオキシド（２４ミリモルすなわち反応媒体１リッ
トル当たり０．３モルの濃度）を１５mlのＤＭＳＯに溶解させ、６０mlのリン酸
緩衝液（pH７，０．１M）に添加する。温度を２７℃に調整し、０．７ｇの精製
された（天然）酵素を添加する。３２時間撹拌した後、反応媒体をＮａＣｌで飽
和させ、次いで、ジクロロメタンで連続的に抽出する。溶媒を蒸発させ、続いて
、シリカゲル上のクロマトグラフィーを行って、１．８ｇの（Ｓ）−エポキシド
（収率＝４５％，ee＝９６％）および２．３ｇの（Ｒ）−ジオール（収率＝５２
％，ee＝８６％）を単離することができる。

【００９７】

【化８】

【００９８】実施例５１．５ｇのパラ−イソブチル−α−メチルスチレンオキシド（７．９ミリモル
すなわち反応媒体１リットル当たり０．２５モルの濃度）を３０mlのトリス緩衝
液（pH８、０．４M）に添加する。温度を４℃に調整し、２．６ｇの精製された
（天然）酵素を添加する。４℃にて２４日間撹拌した後、残存するエポキシドを
ペンタンで抽出する。溶媒を蒸発させて、未精製（Ｓ）−エポキシドを得ること
ができる（ee＝９６％）。水性相をエーテルで抽出して、シリカカラム上での精
製の後に、０．９１ｇの（Ｒ）−ジオールを単離することができる（収率＝５５
％，ee＝７０％）。

【００９９】

【化９】

【０１００】実施例６１ｇのフェニルグリシジルエーテル（６．７ミリモルすなわち反応媒体１リッ
トル当たり３．３モル）を１mlのリン酸緩衝液（pH７、０．１M）に添加する。
温度を２７℃に調整し、２５mgの精製組換え酵素を添加する。２７℃にて１５時
間撹拌した後、エポキシドの全ては対応するラセミ体ジオールに変換される。酢
酸エチルで抽出して、このジオールを定量的収率で単離することができる。

【０１０１】

【化１０】

【０１０２】

【表１】

【０１０３】

【表２】

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｂ 7/00 Ｃ０７Ｄ 301/32 9/14 １０１ 303/04 Ｃ１２Ｐ 41/00 303/08 // Ｃ０７Ｄ 301/32 303/22 303/04 Ｃ１２Ｒ 1:66 303/08 Ｃ０７Ｍ 7:00 303/22 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 9/14 １０１ＡＣ１２Ｒ 1:66） 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＣＣ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:66）Ｃ０７Ｍ 7:00 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者アルシェラ，アラン・ロベールフランス国、エフ−13011 マルセイユ、トラベルス・デ・フネットル・ルージュ 96 (72)発明者バラティ，ジャックフランス国、エフ−13600 ラ・シオタ、アヴニュ・ドゥ・ラ・ドラーユ２ (72)発明者フュルトス，ローランフランス国、エフ−13009 マルセイユ、シュマン・デ・シャレ 26 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 BA11 CA04 DA01 DA02 DA05 DA11 DA12 EA01 EA02 EA03 EA04 GA11 HA01 HA03 4B050 CC01 CC03 DD03 FF01 FF09 FF11 LL01 LL05 4B064 AC01 AE44 CA01 CA19 CB01 CC24 DA01 DA16 4B065 AA01X AA57X AA60Y AA87X AA95X AB01 BA01 CA05 CA18 CA44 CA60 4C048 AA01 BB02 BB03 BB04 BB06 BB08 CC01 KK09 UU03 XX03

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】真菌の細胞からの抽出によって、または前記真菌タンパク質
、もしくは真菌起源であってエポキシドヒドロラーゼ活性を保有する前記タンパ
ク質の１以上のアミノ酸の置換、抑制または付加によって誘導されたタンパク質
をコードするヌクレオチド配列によって形質転換された宿主細胞の培養によって
実質的に純粋な形態で得られた、エポキシドヒドロラーゼ活性を有する真菌起源
のタンパク質。
【請求項２】 −配列番号２、 −誘導された配列が、好ましくは、配列番号２の配列に対して少なくとも約４
０％の相同性を有し、特に、１以上のアミノ酸の置換、抑制または付加によって
配列番号２の配列から誘導され、かつエポキシドヒドロラーゼ活性を保有する任
意の配列、または、 −断片が、好ましくは、配列番号２の配列の位置１および３３９に位置したア
ミノ酸によって境界が定められた領域中で連続する少なくとも約１０アミノ酸か
らなる配列番号２の配列の任意の断片、または前記の後者から誘導され、かつエ
ポキシドヒドロラーゼ活性を保有する配列の任意の断片、を含むことを特徴とする、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】アスペルギルス属（Aspergillus species）の真菌の細胞の
培養物からの抽出および精製によって得られた、実質的に純粋な形態の真菌エポ
キシドヒドロラーゼに相当することを特徴とする、請求項１または２記載のタン
パク質。
【請求項４】アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）またはアス
ペルギルス・ツリゲンシス（Aspergillus turingensis）の株の細胞の培養物か
らの抽出および精製によって得られた、配列番号２によって表される実質的に純
粋な形態の真菌エポキシドヒドロラーゼに相当することを特徴とする、請求項１
〜３いずれか一項記載のタンパク質。
【請求項５】 −配列番号２によって表されたエポキシドヒドロラーゼをコ
ードする配列番号１のヌクレオチド配列、または遺伝暗号の縮重によって配列番
号１から誘導され、かつ配列番号２によって表されるエポキシドヒドロラーゼを
コードする任意の配列、 −誘導された配列が、好ましくは、配列番号１の配列に対して少なくとも約４
５％の相同性を有し、特に、１以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加によ
って配列番号１の配列から誘導され、かつエポキシドヒドロラーゼ活性を保有す
る酵素をコードする任意の配列、または、 −断片が、好ましくは、配列番号１の配列の位置１および１１９７に位置した
ヌクレオチドによって境界が定められた領域中で連続する少なくとも約２０ヌク
レオチドからなり、配列番号１の配列の任意の断片、または前記の後者に由来し
、かつエポキシドヒドロラーゼ活性を保有する酵素をコードする配列の任意の断
片、を含むベクターによって適当な宿主細胞の形質転換により実質的に純粋な形態で
得られた、組換え真菌エポキシドヒドロラーゼに相当することを特徴とする、請
求項１または２記載のタンパク質。
【請求項６】配列番号１のヌクレオチド配列、または遺伝暗号の縮重によ
って配列番号１から誘導され、かつ配列番号２によって表されるエポキシドヒド
ロラーゼをコードする任意の配列を含有するベクターによる適当な宿主細胞の形
質転換によって得られた、配列番号２によって表される真菌組換えエポキシドヒ
ドロラーゼに相当することを特徴とする、請求項５記載のタンパク質。
【請求項７】請求項１〜６いずれか一項記載のエポキシドヒドロラーゼ活
性を有する真菌起源のタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項８】 −配列番号２によって表されるエポキシドヒドロラーゼをコ
ードする配列番号１によって表される配列、 −遺伝暗号の縮重によって配列番号１の配列から誘導され、かつ配列番号２に
よって表されるエポキシドヒドロラーゼをコードする任意の配列、 −誘導された配列が、好ましくは、配列番号１の配列に対して少なくとも約４
５％の相同性を有し、特に、１以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加によ
って配列番号１の配列から誘導され、かつエポキシドヒドロラーゼ活性を保有す
る酵素をコードする任意の配列、 −断片が、好ましくは、配列番号１の配列の位置１および１１９７に位置する
ヌクレオチドによって境界を定められた領域中で連続する少なくとも約２０のヌ
クレオチドからなり、配列番号１の配列の任意の断片または前記定義の後者から
誘導され、かつエポキシドヒドロラーゼ活性を保有する酵素をコードする配列の
任意の断片、 −前記配列または断片の任意の相補的ヌクレオチド配列、または、 −エポキシドヒドロラーゼ活性を保有する酵素をコードし、かつ前記配列また
は断片の１つとハイブリダイズすることができる任意のヌクレオチド配列を含み、前記配列または断片が一本鎖または二本鎖形態であることを特徴とする
、請求項７記載のヌクレオチド配列。
【請求項９】請求項７または８記載のヌクレオチド配列を含有するベクタ
ー、特にプラスミド。
【請求項１０】特に、細菌、ウイルス、酵母、真菌、植物または哺乳動物
細胞から選択される宿主細胞であって、そのゲノムが請求項７または８記載のヌ
クレオチド配列を含有するように、特に請求項９記載のベクターによって形質転
換された宿主細胞。
【請求項１１】特に、医薬および植物保護分野において、または特定の光
学材料の製造分野において、エポキシドまたはエナンチオマー的に純粋な隣接ジ
オールの調製方法の実施における酵素生体触媒としての、請求項１〜６いずれか
一項記載のエポキシドヒドロラーゼ活性を持つタンパク質の使用。
【請求項１２】エポキシドおよび／または、以下の式（II）および（III
）：【化１】（式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴は任意の基、特に、医薬および植物保護化合物
、または該エポキシドまたは隣接ジオールに相当する特定の光学材料に特徴的な
基を表す）の各々のエナンチオマー的に純粋なジオールの製法であって、記号法は、ジアス
テレオ異性体エポキシドの混合物、またはラセミ形態のキラルエポキシド、また
は以下の式（Ｉ）：【化２】のプロキラルエポキシドを、請求項１〜６いずれか一項記載のエポキシドヒドロ
ラーゼ活性を有するタンパク質で、または請求項１〜６いずれか１項記載のエポ
キシドヒドロラーゼ活性を持つタンパク質を発現する請求項１０記載の宿主細胞
で処理する工程を含み、この工程は、 −要すれば、該式（II）および（III）の化合物の精製のさらなる工程によっ
て分離することができる、式（II）および（III）の前記化合物の混合物、 −または、式（III）の前記した化合物のみ；の生産をもたらす製法。
【請求項１３】好ましくは、細菌、ウイルス、酵母、真菌、植物または哺
乳動物細胞から選択された宿主細胞の形質転換の工程、および該細胞によって生
産された組換えエポキシドヒドロラーゼの精製の工程を含むことを特徴とする、
請求項５または６記載の組換えエポキシドヒドロラーゼ活性を持つタンパク質の
製法。
【請求項１４】 −特に、プレスを用いて真菌を破砕することによる、アス
ペルギルス属の真菌のような真菌の細胞培養物から酵素を抽出する工程、続いて
の、低速遠心、上清の回収、および要すれば濃縮の工程、 −特に、ＤＥＡＥ−セファロース、フェニル−セファロース、モノＱおよびス
ペロース１２のカラムを連続的に通過させることによる、前記工程で得られた抽
出物から酵素を精製する工程を含む、請求項３または４記載の実質的に純粋な形態のエポキシドヒドロラーゼ
活性を持つタンパク質の製法。