CN115948487A - 一种利用环氧化物酶融合体制备(r)-苄基缩水甘油醚的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程与酶工程技术领域，具体涉及一种利用环氧化物酶融合体制备(R)‑苄基缩水甘油醚的方法及应用，包括如下步骤：(1)将待手性拆分的外消旋苄基缩水甘油醚均匀溶解于有机溶剂中；(2)向步骤(1)所得的溶解有外消旋苄基缩水甘油醚的有机溶剂中加入水，经搅拌反应后，整个体系在反应期间保持均质的水包油型乳浊液；(3)待酶促反应结束后离心整个双相反应体系，使有机相与水相分层、细胞或酶沉淀，分取上层的有机相，经过滤、蒸发浓缩，得到(R)‑苄基缩水甘油醚。建立一种正辛烷/水双相体系，使得初始底物浓度限较原单水相体系的不到100mmol/L提升至400mmol/L。

Description

一种利用环氧化物酶融合体制备(R)-苄基缩水甘油醚的方法及应用

技术领域

本发明涉及基因工程与酶工程技术领域，尤其涉及一种利用环氧化物酶融合体制备(R)-苄基缩水甘油醚的方法及应用。

背景技术

环氧化物(epoxide)是一类在结构上具有含氧三元环的环醚，其分子内部含氧三元环高度极化的碳氧键拥有很强的亲电性，故而容易同多种亲核试剂发生反应。作为一类具有高附加值的多功能合成子或砌块，特别是能够作为多种药物的合成前体，它们在医药、农药、材料等精细化工领域中的需求量也与日俱增。

当前主流的合成途径主要包括化学合成法和生物催化法两大类。Sharpless和Jacobsen等经典反应为现代手性有机合成领域的发展奠定了基础，但它们有个共同的缺点：反应的过程中需要用到重金属催化剂以及昂贵的手性配体，增加了合成成本的同时，也对人体健康和环境带来巨大的威胁。不符合当代全球关于“绿色工业”、“绿色化学”以及“可持续发展”的倡导。而相较于化学法，起步较晚的生物催化法可作为一些化学法的替代或补充。目前用于制备手性环氧化物的酶类主要有三种：(1)单加氧酶(monooxygenase)借助于还原型辅因子(如NADH、亚铁血红素和抗坏血酸等)激活氧分子，以此进行烯烃的不对称环氧化，其缺点是该反应往往伴随着副反应的发生，降低了目标产物的产率；(2)卤代醇脱卤酶(halohydrin dehalogenase)催化邻位卤代醇的脱卤闭环反应，生成光学纯的环氧化物和卤素离子，但该反应是可逆的，即接受卤素离子X^-重新将生成的环氧化物转化成卤代醇；(3)环氧化物酶(epoxide hydrolase)能特异性催化外消旋(racemic,rac-)环氧化物的不对称水解反应，保留单一构型环氧化物。其来源广、催化过程中无需辅因子参与以及反应条件温和，被认为是一种颇具开发潜力的酶催化剂，其所介导的不对称催化法作为一种低成本且环境友好的补充或替代方案而备受关注。

关于环氧化物酶所介导的催化反应研究主要在水或者缓冲液中进行，但在较高的底物浓度下(≥200mmol/L)，反应无法获得好的催化结果，主要表现为底物的不完全拆分或不完全转化。究其原因一方面是环氧化物底物通常水溶性较差，另一方面，环氧化物在水相中较易发生非酶水解，而且反应体系的pH越低、温度越高，底物的非酶水解速率就越高。以上原因也限制了环氧化物酶在实际生产中的应用。

(R)-BGE分子式为C₁₀H₁₂O₂，是合成诸如抗帕金森药物苔藓抑素(Chinese ChemicalLetters,2021,32:1-4)、抗癫痫药左乙拉西坦(Tetrahedron Asymmetry,2012,23:1512-1515)和抗真菌剂(+)-安布替星S(Journal of Organic Chemistry,2010,75:5601-5618)等生物活性化合物重要手性砌块。迄今为止，针对于结构上带有苯环的甘油醚类环氧化合物，环氧化物酶相关的文献多集中在rac-苯基缩水甘油醚(phenyl glycidyl ether)的手性拆分反应，而鲜有关于借助于环氧化物酶制备(R)-BGE的报道。例如在最近的一篇研究中，Zhang等利用从大豆基因组中鉴定的一种新型环氧化物酶GmEH3水解rac-BGE，该反应最终也可保留(R)-BGE(ee≥99％)，但其产率仅为23.6％(International Journal ofBiological Macromolecules,2020,164:2795-2803)。

因此，需要构建一种低成本、环保、工艺流程简便的利用经过改造的环氧化物酶手性拆分rac-BGE制备其R构型对映体的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种利用环氧化物酶融合体制备(R)-苄基缩水甘油醚的方法及应用，以解决现有技术中无法实现低成本、环保、工艺流程简便的利用经过改造的环氧化物酶手性拆分rac-BGE制备其R构型对映体的方法的问题。

基于上述目的，本发明提供了一种利用环氧化物酶融合体制备(R)-苄基缩水甘油醚的方法，包括如下步骤：

(1)将待手性拆分的外消旋苄基缩水甘油醚均匀溶解于有机溶剂中；

(2)向步骤(1)所得的溶解有外消旋苄基缩水甘油醚的有机溶剂中加入水，所述水中含有环氧化物酶融合体和/或悬浮有表达环氧化物酶融合体的工程菌细胞，经搅拌反应后，整个体系在反应期间保持均质的水包油型乳浊液；

(3)待酶促反应结束后离心整个双相反应体系，使有机相与水相分层、细胞或酶沉淀，取上层的有机相，经过滤、蒸发浓缩，得到(R)-苄基缩水甘油醚。

优选的，所述有机溶剂为正辛烷；有机相与水相的体积比小于1.0。

其中，环氧化物酶融合体，命名为Pv2Gm。所述的环氧化物酶融合体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该环氧化物酶融合体是将SEQ ID NO.3所示的来源于菜豆的野生环氧化物酶PvEH2氨基酸序列中的第129～140位氨基酸(即¹²⁹WPRNPKVKPVDA¹⁴⁰)替换为SEQ IDNO.4所示的来源于大豆的环氧化物酶GmEH3对应的129～140位氨基酸序列(即¹²⁹LRRDPNIRTVDG¹⁴⁰)。

本发明还提供一种编码环氧化物酶融合体Pv2Gm的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供一种含有所述编码基因的重组载体。

本发明还提供一种含有所述重组载体的宿主细胞。

作为一种可选的实施方式，制备(R)-BGE的方法，包括以下步骤：

(1)将rac-BGE均匀的溶解于正辛烷(CAS号为111-65-9)中；

(2)向步骤(1)所得溶解有rac-BGE的正辛烷(有机相)加入水(水相)，所述水溶液是含有环氧化物酶融合体Pv2Gm和/或表达有Pv2Gm的工程菌细胞；有机相与水相的体积比小于1.0；所加入的菌体细胞的冻干质量与底物外消旋苄基缩水甘油醚物质的量的比例需不低于0.12mg/μmol；所述环氧化物酶融合体为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(3)在维持20～30℃的温度范围内恒速搅拌反应4～24h，整个体系在反应期间保持均质的水包油(O/W)型乳浊液；

(4)待酶促反应结束后离心整个双相反应体系，使有机相与水相分层、细胞或酶沉淀，取上层的有机相，经过滤、蒸发浓缩等步骤，得到(R)-BGE。

在本发明的一种实施方式中，编码所述环氧化物酶融合体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示

在本发明的一种实施方式中，所述工程菌细胞包括表达Pv2Gm的重组E.coli细胞。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中水溶液包括浓度为20mg_干细胞/mL的菌悬液，所述菌悬液是用水重新悬浮冻干菌体细胞得到的。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中有机相与水相的体积比为3:7。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中加入表达有环氧化物酶的重组菌时，菌体质量(mg)与底物物质的量(μmol)的比例η为0.12～0.47mg/μmol。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中反应体系中底物rac-BGE的初始浓度范围在50～400mmol/L。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中反应条件设置为25℃下恒速搅拌反应4～24h。

本发明还提供上述的方法制得的rac-BGE在制药或化工领域的应用。

本发明的有益效果：本发明将SEQ ID NO.3所示序列的第129～140位氨基酸与SEQID NO.4所示序列对应的肽段交换融合，构建融合突变的环氧水解酶融合体Pv2Gm，其氨基酸序列信息如SEQ ID NO.1所示。经融合改造后，表达有突变酶Pv2Gm的菌株E.coli/pv2gm的环氧化物酶活力较表达野生酶菌株E.coli/pveh2提高了1.15倍。再以表达有该酶的E.coli全细胞为催化剂，根据其对于rac-BGE优良的对映选择性和催化活性，通过建立一种正辛烷/水双相体系，使得初始底物浓度限由单水相体系的不到100mmol/L提升至400mmol/L，拆分反应最终获得的(R)-BGE(ee≥99％)的产率可达47.7％，时空产率(time spaceyield,TSY)为2.02g/h/L。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明表达重组Pv2Gm工程菌E.coli/pv2gm的菌液PCR鉴定核酸电泳图；其中，泳道M：DNA marker(250bp)；泳道1～3：E.coli/pv2gm；

图2为本发明重组Pv2Gm的SDS-PAGE图；其中，泳道M:蛋白低分子量Marker；泳道1：E.coli/pv2gm全细胞裂解液；泳道2：E.coli/pv2gm破碎上清；泳道3：纯化后的Pv2Gm；

图3为本发明的工艺流程图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。

需要说明的是，除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

(一)培养基

LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10。

LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，琼脂粉20。

(二)酶活力的定义及测定方法

酶活力单位(U)定义为：在25℃下，每分钟催化1μmol BGE底物转化成邻二醇产物所需的酶量或菌体量。

酶活力的测定方法：在2.0mL洁净的离心管内加入850μL K₂HPO₄-KH₂PO₄磷酸缓冲液(100mmol/L pH＝7.5)和50μL全细胞悬浮液(20mg_干细胞/mL)，于25℃预热2min后迅速加入100μL由乙腈溶解的200mmol/L rac-BGE溶液震荡混匀，使rac-BGE的终浓度为20mmol/L。维持25℃，振荡反应10min。取200μL反应液用1mL HPLC级乙酸乙酯萃取、离心，上层有机相经无水MgSO₄粉末干燥，过0.22μm有机滤膜后借助HPLC做定量分析。

(三)HPLC检测方法

检测条件为：岛津LC-16液相色谱仪，

OD-H正相手性色谱柱(4.6mmΦ×250mm L)，正己烷:异丙醇＝90:10(v/v)，柱温30℃，流速0.8mL/min，检测波长为220nm，各主要物质的保留时间如表1所示，采用外标法测定样品中各物质的含量。

表1底物苄基缩水甘油醚与产物3-苄氧基-1,2-丙二醇

化合物的对映体纯度用对映体过剩率(enantiomeric excess,ee)表征：ee＝[(R-S)/(R+S)]×100％，其中，S和R分别代表(S)-和(R)-BEG的浓度。其中，(R)-BEG的产率Y＝R/M×100％，M代表rac-BGE的初始浓度。

特举以下实施例详细说明，其目的仅在于使本发明的内容更易理解而非限制本发明的保护范围。

实施例1

环氧化物酶融合体基因及E.coli工程菌的构建

将实验室保藏的含有重组表达质粒pCold II-pveh2的基因工程菌E.coli/pveh2接种于2mL的含有0.1mg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基(后简称为LB/Amp培养基)中，37℃培养10h后，用Pure PlasmidMini Kit(康为世纪生物科技有限公司)提取质粒，其中该质粒所表达的环氧化物酶PvEH2的序列如SEQ ID NO.2所示。

设计并合成用于融合PCR的引物，命名为：pveh2-F(SEQ ID NO.5)、pveh2-R(SEQID NO.6)、pv2gm-F(SEQ ID NO.7)和pv2gm-R(SEQ ID NO.8)。融合酶编码基因的获得共需要三步PCR扩增反应，条件列于表2。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳纯化后切胶回收目的基因pv2gm，17℃与pUCm-T连接10h，利用热激法转化E.coli JM109感受态细胞，最后经蓝白斑筛选和DNA测序，将结果正确的重组质粒命名为pUCm-T-pv2gm。

使用Nde I和Sal I分别处理pUCm-T-pv2gm和pCold II，并混匀酶切产物进行连接反应，用连接液转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞，经过Amp抗性平板筛选与DNA测序，获得重组工程菌E.coli Rosetta(DE3)/pCold II-pv2gm，即E.coli/pv2gm。该菌株的菌落PCR鉴定核酸电泳结果如图1所示。

表2融合PCR的体系与条件

实施例2

环氧化物酶全细胞生物催化剂的制备

将E.coli/pv2gm的单菌落接种于LB/Amp培养基中，于37℃、220r/min培养10h，之后按2％(v/v)的接种量转接至新鲜LB培养基内，同样于37℃振荡培养，并在OD₆₀₀达到0.8～1.0时加入IPTG至其终浓度为0.2mmol/L，在15℃下诱导24h后低温离心收集菌体。湿菌体再经真空冷冻干燥处理，获得的冻干细胞粉块用于后续的生物实验。经酶活力测定，E.coli/pv2gm针对BGE的环氧化物酶活力为25.2U/g_干细胞，而表达有野生酶PvEH2的E.coli/pveh2的活力为11.7U/g_干细胞，经融合改造后活力提高了1.15倍。

用Tris-HCl缓冲液(50mmol/L Tris、500mmol/L NaCl，pH 7.0)悬浮E.coli/pv2gm，稀释至约7.5mg_干细胞/mL。菌悬液在冰水浴的条件下经超声波破碎(功率200W，超声破碎3s，间隔8s，有效破碎总时长20min)，之后将细胞破碎液低温离心(4℃，12,000×g，离心15min)以分离细胞碎片，上清液经0.22μm醋酸纤维素微孔滤膜过滤除去杂质后获得含有重组Pv2Gm的粗酶液。

同样用Tris-HCl缓冲液预处理装填好的Ni-NTA柱，平衡后上样粗酶液，在冰水浴条件下反复结合3次，每次结合30min。用含有50mmol/L咪唑的Tris-HCl缓冲液冲洗镍柱以洗去大部分的杂蛋白，再将缓冲液中的咪唑浓度提升至300mmol/L以洗脱目的蛋白Pv2Gm。经镍柱纯化后的洗脱液上样至Sephadex G-25凝胶柱，用Na₂HPO₄–NaH₂PO₄缓冲液(50mmol/L，pH 7.0)洗脱，一是除去咪唑以及部分盐离子，二是更换体系中的缓冲液。收集的目的蛋白，最后通过10kDa的超滤膜进行浓缩，并进行SDS-PAGE电泳，结果如图2所示。实验测得纯化后的融合突变酶Pv2Gm对于rac-BGE的比酶活为48.1U/mg_蛋白质，相较于野生酶PvEH2的21.2U/mg提升了1.27倍。

实施例3

利用E.coli/pv2gm手性拆分rac-BGE

构建经前期实验优化条件后的双相反应体系：以30mL溶解有rac-BGE的正辛烷作为有机相，以70mL悬浮有20mg/mL E.coli/pv2gm冻干菌体的水溶液作为水相。两相于25℃下预热5min，然后加入底物至100、200、300、400和500mmol/L的浓度，反应4～24h后，反应期间取样时将体系震荡混匀进行检测分析，结果见表3。

表3底物浓度对正辛烷/水体系催化结果的影响

注：^a全水相体系反应结果作为对照；^b因手性拆分不完全，产率和TSY值无比较意义

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本发明旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用环氧化物酶融合体制备(R)-苄基缩水甘油醚的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将待手性拆分的外消旋苄基缩水甘油醚均匀溶解于有机溶剂中；

(2)向步骤(1)所得的溶解有外消旋苄基缩水甘油醚的有机溶剂中加入水，所述水中含有环氧化物酶融合体和/或悬浮有表达环氧化物酶融合体的工程菌细胞，经搅拌反应后，整个体系在反应期间保持均质的水包油型乳浊液；

(3)待酶促反应结束后离心整个双相反应体系，使有机相与水相分层、细胞或酶沉淀，取上层的有机相，经过滤、蒸发浓缩，得到(R)-苄基缩水甘油醚。

2.根据权利要求1所述利用环氧化物酶融合体制备(R)-苄基缩水甘油醚的方法，其特征在于，所述有机溶剂为正辛烷；有机相与水相的体积比小于1.0。

3.根据权利要求1所述利用环氧化物酶融合体制备(R)-苄基缩水甘油醚的方法，其特征在于，加入的工程菌细胞的冻干质量与底物外消旋苄基缩水甘油醚物质的量的比例η不低于0.12mg/μmol。

4.根据权利要求1所述利用环氧化物酶融合体制备(R)-苄基缩水甘油醚的方法，其特征在于，所述工程菌细胞为表达有经融合突变的环氧化物酶融合体的重组大肠杆菌细胞。

5.根据权利要求1所述利用环氧化物酶融合体制备(R)-苄基缩水甘油醚的方法，其特征在于，反应体系中底物外消旋苄基缩水甘油醚的初始浓度为100～400mmol/L。

6.根据权利要求1所述利用环氧化物酶融合体制备(R)-苄基缩水甘油醚的方法，其特征在于，所述环氧化物酶融合体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.根据权利要求6所述利用环氧化物酶融合体制备(R)-苄基缩水甘油醚的方法，其特征在于，编码所述环氧化物酶融合体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

8.一种含权利要求7所述基因的重组载体。

9.一种含权利要求8所述重组载体的宿主细胞。

10.权利要求1-7任一所述的方法制得的(R)-苄基缩水甘油醚在制药或化工领域的应用。

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