CN109880876B - 一种利用菜豆环氧化物水解酶制备(r)-间硝基苯乙二醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用菜豆环氧化物水解酶制备(R)‑间硝基苯乙二醇的方法，属于生物催化技术领域。本发明以表达有环氧化物水解酶PvEH2的大肠杆菌全细胞为催化剂，根据其针对外消旋间硝基环氧苯乙烷的优良的立体选择性特性，通过建立一种双相体系——石油醚/水，提高了底物的初始上样浓度和整个催化反应的效率，减轻了单水相体系中高浓度的间硝基环氧苯乙烷对于PvEH2活性的抑制，同时降低了底物自发水解的程度，产物邻二醇的对映体纯度(ee_p)可达90.2％，底物的转化率可达99.5％。

Description

一种利用菜豆环氧化物水解酶制备(R)-间硝基苯乙二醇的 方法

技术领域

本发明涉及一种利用菜豆环氧化物水解酶制备(R)-间硝基苯乙二醇的方法，属于生物催化技术领域。

背景技术

(R)-间硝基苯乙二醇((R)-m-nitrophenyl-1,2-diol，简写为(R)-mNPED)分子式为C₈H₉O₄N，是医药和精细化工等领域中一种具有较高附加值的手性化合物，利用其制备的光学纯α-羟基酸是合成前列腺素、头孢菌素以及血管扩张素转化酶抑制剂等物质的重要的手性砌块。

目前，在制备某些手性环氧化物时，利用Sharpless不对称环氧化、Jacobsen环氧化和水解拆分等传统化学法制备的结果往往不尽如人意，产物的对映体过量率(enantiomeric excess,ee)一般只有30％-80％，而且所使用的重金属催化剂也给环境带来巨大的威胁。近年来，生物酶动力学拆分和归一性水解法由于具有其较好的立体选择性，而不断受到重视。环氧化物水解酶(epoxide hydrolases,EHs)就是其中一类重要的酶，该酶可以催化环氧化物的开环水解，将水分子立体选择性地加成到环氧三元环上，生成结构与之相应的1,2-邻位二醇。

EHs来源广泛、无需辅因子、反应条件环境友好，被认为是一种颇具开发潜力和研究价值的生物催化剂。基于EHs的催化机理，可以将EHs介导的不对称催化反应划分为两大类型：动力学拆分和对映归一性水解。前者通过使用对映选择性较高(通常要求对映选择率E值不低于30)的EHs对外消旋环氧化物底物进行手性拆分的反应，最终获得对映体纯度较高(ee≥95％)的单构型环氧化物。但是拆分反应自身存在一定的局限性——所得单构型环氧化物的理论产率仅有50％。而另一类型反应——对映归一性水解中产物邻二醇的理论产率可达到100％。使用单个EH实现对外消旋环氧化物的归一性水解是一种理想的生物催化模式，但是这要求EHs对于指定环氧化物的两种构型必须具备高而且互补的区域选择性，然而目前这种EHs较少。

迄今为止，也仅有少数利用EHs，即生物法制备(R)-mNPED的报道。有研究者利用从兔肝提取的EH通过水解外消旋间硝基环氧苯乙烷(racemic m-nitrostyrene oxide；简称为rac-mNSO)，但是最终制备的手性纯(R)-mNPED的产率仅有40％(G.Bellucci,C.Chiappe,F.Marioni,Enantioselective hydrolysis of substituted phenyloxiranes by rabbitliver microsomal epoxide hydrolase[J],Indian Journal of Chemistry Section B-organic Chemistry Including Medicinal Chemistry,31(1992)828-831)。此外，还有研究团队利用可以表达EH的Aspergillus niger细胞制备(R)-mNPED，但是在单水相中产物的产率最高仅有48％，且光学纯度也只有66％ee_p(H.Jin,Z.Y.Li,X.W.Dong,Enantioselective hydrolysis of various substituted styrene oxides withAspergillus niger CGMCC 0496[J],Organic&Biomolecular Chemistry,2(2004)408-414)。

因此，本发明提供一种低成本、环保、工艺流程简便的利用菜豆环氧化物水解酶归一性水解外消旋环氧化物制备(R)-间硝基苯乙二醇的方法，对于工业上制备(R)-间硝基苯乙二醇具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种制备(R)-间硝基苯乙二醇的方法，包括以下步骤：

(1)将外消旋的间硝基环氧苯乙烷溶解于有机试剂中；

(2)向步骤(1)所得含有外消旋的间硝基环氧苯乙烷的有机试剂中加入水溶液，所述水溶液含菜豆环氧化物水解酶和/或含表达菜豆环氧化物水解酶的细胞，使有机相与水相的体积比为(1:9)-(3:7)，在20-30℃下恒温搅拌反应8-12h，所述菜豆环氧化物水解酶含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

(3)反应结束后将整个反应体系静置或离心，使有机相与水相分层，分取下层的水相，萃取，得到(R)-间硝基苯乙二醇。

在本发明的一种实施方式中，有机试剂包括环己烷、正己烷、正庚烷、正辛烷、异辛烷、沸程为60-90℃的石油醚中的一种或者几种试剂的混合。

进一步地，有机试剂为沸程为60-90℃的石油醚。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞包括表达菜豆环氧化物水解酶的重组大肠杆菌细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述菜豆环氧化物水解酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中水溶液包括浓度为100-200mg/mL的菌悬液，所述菌悬液是用水或者pH为7.0的磷酸盐缓冲液重新悬浮菌体细胞得到的。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中有机相与水相的体积比为1:(4-1)。

进一步地，步骤(2)中有机相与水相的体积比为1:4。

在本发明的一种实施方式中，加入表达有菜豆环氧化物水解酶的重组菌时，菌体质量(mg)与底物物质的量(μmol)的比例δ为1-8mg/μmol。

进一步地，菌体质量与底物物质的量的比例δ为5mg/μmol。

在本发明的一种实施方式中，底物的初始浓度为5-50mM。

进一步地，底物的初始浓度为20-40mM。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中以乙酸乙酯作为萃取剂。

进一步地，步骤(3)具体包括：静置或离心使石油醚相与水相分层后，分取下层水相，再用2-3倍体积的乙酸乙酯进行多次萃取，分取得到上层乙酸乙酯萃取相，最后经减压浓缩、干燥并过滤得到(R)-mNPED。

本发明的第二个目的是提供上述的方法在制药或化工领域的应用。

本发明利用来源于菜豆的环氧化物水解酶PvEH2催化rac-mNSO对映归一性水解，在双相体系内进行水解产物(R)-mNPED的制备，提高了底物的上样浓度。在反应的过程中，未参加水解反应的环氧化物主要分布在有机相中，减小了其自发水解的程度和对于酶的失活作用，产物邻二醇的对映体纯度(ee_p)可达90.2％，底物的转化率可达99.5％。此外，反应结束后产物主要集中在水相中，便于后续的萃取与纯化，具有一定的工业应用价值。此外，本发明公开的方法相较于普通的化学合成法，其制备条件环境友好、工艺流程简便、生产成本低廉，具有一定的应用前景。

附图说明

图1：石油醚/水双相体系中利用菜豆环氧化物水解酶PvEH2催化制备(R)-mNPED的工艺流程。

图2：PvEH2在12种有机试剂/缓冲液体系中的稳定性。

图3：两相体积比对水解反应转化率的影响。

图4：菌体与底物质量比对水解反应转化率的影响。

图5：PvEH2归一性水解rac-mNSO的液相色谱监测图。转化率分别在(a)：0％；(b)：45％和(c)：98％。

具体实施方式

(一)培养基

LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10。

(二)酶活的定义及测定方法

PvEH2的酶活力单位(U)定义为：在25℃反应条件下，每分钟催化1μmol rac-mNSO底物转化成产物所需的酶量。

酶活的测定方法：在1.5mL洁净的EP管中加入500μL菌悬液和500μL Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(pH 7.0)，25℃下保温5min，再加入rac-mNSO至其终浓度为10mM，反应10min后取样200μL至1mL乙酸乙酯进行萃取，离心，上清液经0.22μm有机滤膜微滤后，采用Waters高效液相色谱定量分析检测。

(三)气相色谱检测方法

实验样品的分析采用气相色谱仪GC-2010Plus(日本岛津)，配备有手性毛细色谱柱CP-ChiralSil-DEX CB(安捷伦)和氢火焰离子化检测器。

检测条件为：检测器和气化室温度250℃，载气为氮气，吹扫流量为3mL/min，分流比为1:40。检测期间柱温由初始的100℃以5℃/min的速率上升至190℃。气相色谱定量检测法采用内标法，所使用的内标物为正己醇(与萃取剂乙酸乙酯按照1:1000的体积比混合)。校正因子(factor,F)：F＝A_标内/A_标底，A_标内和A_标底分别表示标准对照品中内标正己醇和环氧底物的峰面积。底物转化率：c＝(1-A_样底×F/A_样内)×100％，A_样底和A_样内分别表示样品中环氧底物和内标正己醇的峰面积。按照上述条件进行检测时，各物质的保留时间如表1所示。

(四)液相色谱检测方法

实验样品的分析采用液相色谱仪Waters(e2695)，配备有紫外检测器2489UV/VisDetector以及正相手性色谱柱OD-H(4.6mmΦ×250mm L)，流动相为正己烷:异丙醇＝9:1(v/v)，流速0.8mL/min，柱温30℃，检测波长254nm，液相色谱定量检测法采用摩尔吸光系数法，各物质的保留时间见表1。

表1底物与产物在气、液相检测中的保留时间

注：ND，即Not Detectable，表示由于受实验条件和仪器的检测精度问题无法检测。

化合物的对映体纯度用对映体过剩率表征见公式：ee_p＝[(R_d-S_d)/(R_d+S_d)]×100％，其中，S_d和R_d分别代表(S)-和(R)-mNPED的浓度。

(R)-mNPED产率Y的计算：Y＝R_d/M×100％，M代表rac-mNSO的初始浓度。

特举以下实施例详细说明，其目的仅在于使本发明的内容更易理解而非限制本发明的保护范围。

实施例1：全细胞生物催化剂的制备

提取菜豆的总RNA(使用TRIZOL试剂盒，Invitrogen公司)，参照试剂盒说明书进行操作。反转录过程参照Takara公司的RT-PCR试剂盒PCR PrimeScriptTM RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书，然后以反转录得到的cDNA为模板，上、下游引物序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4(引物中引入Nde I和Xho I限制性内切酶酶切位点，引物均由上海生工有限公司合成)，采用常规PCR方法扩增pveh2全长基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1，PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，循环30次，再在72℃下延伸10min。PCR产物用1.0％琼脂糖核酸凝胶电泳检测与纯化后用DNA胶回收试剂盒(上海生工)回收目的片段，回收产物和表达载体pCold II经相同的限制酶的处理之后，用T4DNA连接酶将两者在17℃下过夜连接，得到重组表达载体pColdII-pveh2。并将其导入到E.coli BL21(DE3)的感受态细胞内，涂布于含有0.1mg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养16h，挑取阳性克隆，转接于含有相同卡那霉素含量的LB液体培养基中振荡培养，提取质粒并用Nde I和Xho I进行双酶切鉴定，pveh2核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

将携带有重组质粒pCold II-pveh2的基因工程菌E.coli/pveh2单菌落接种于10mL含有0.1mg/mL氨苄霉素的LB培养基中，于37℃下220r/min振荡培养12h，作为种子培养基使用，之后按1％(v/v)的接种量转接至新鲜LB培养基内，同样于37℃下220r/min振荡培养，并在OD₆₀₀达到0.8时加入IPTG至终浓度为0.4mM，然后在14℃下诱导20h后离心收集菌体。用Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(pH＝7.0)重新悬浮，配制获得100mg湿细胞/mL浓度的全细胞悬浮液。E.coli/pveh2经过诱导，酶活力可达到2.38U/g菌体湿细胞。

实施例2：有机相溶剂的筛选

基于PvEH2或E.coli/pveh2在多种憎水有机试剂中的稳定性，筛选适用于构建双相体系的有机相试剂。将菌体湿细胞经超声破碎、4℃低温离心、0.22μm水系滤膜微滤处理后获得细胞提取物(粗酶液)。然后将12种有机试剂和细胞提取物按照1:1的体积比相互混合(各800μL)，并于25℃、220rpm的条件下分别保持4h和8h。之后体系经离心分层，在酶所处的水相层中吸取500μL，再加入rac-mNSO原溶液至10mM，两者混匀后立即置于25℃下，震荡反应10min后测定酶的活力(U/mL)。

以初始时E.coli/pveh2在水相(缓冲液)中的酶活为2.38U/g菌体湿细胞，相对活力值为100％，计算各个情况下的相对活力，结果如图2。与水相体系相比，有机试剂均会对酶的稳定性产生一定的负面作用。其中，醇类的影响最大，而(长链)烷烃类对PvEH2的影响则较小。相对于其它同类的有机试剂，石油醚对PvEH2的活性影响最低，4h后，石油醚中的PvEH2的相对活力为80.6％，8h后的相对活力为64.3％，故选择石油醚作为水解反应体系的第二相。

实施例3：两相体积比对水解反应的影响

保持菌体质量(mg)与底物物质的量(μmol)的比例δ＝5.0mg/μmol不变，配制不同体积比(V_石油醚相:V_水相依次为1:9、1:4、3:7、1:1和7:3)的石油醚/水双相体系，将反应体系置于25℃下预热5min后加入底物至终浓度达到20mM，进行反应12h后，将体系震荡混匀取样200μL，采用气、液相色谱进行检测分析，计算此时反应的转化率。结果如图3所示，当V_石油醚相:V_水相为1:9、1:4、3:7、1:1和7:3时，转化率依次为77.3％、95.5％、94.6％、92.1％、60.4％。

实施例4：菌体与底物质量比对水解反应的影响

保持石油醚与缓冲液的体积比(V_石油醚相:V_水相＝1:4)不变，通过加入不同量的菌悬液，使菌体质量与底物摩尔比的比例δ分别达到1.0、3.0、5.0和8.0mg/μmol，于25℃下预热5min后加入底物至终浓度达到20mM，进行反应12h后，将体系震荡混匀取样200μL，采用气、液相色谱进行检测分析，计算此时反应的转化率。结果如图4所示，当菌体质量与底物摩尔比的比例δ为1.0、3.0、5.0和8.0mg/μmol时，转化率分别为81.2％、90.9％、95.0％、85.4％。

实施例5：底物的初始浓度对水解反应的影响

设置双相体系条件为：石油醚与缓冲液的体积比为1:4、菌体与底物的用量比δ为5.0mg/μmol，采用石油醚为第二相，构建石油醚/水双相反应体系，于25℃下预热5min。然后加入底物至20、30、40和50mmol/L等不同的浓度，进行反应10-12h后，将体系震荡混匀25℃下取样200μL，采用气、液相色谱进行检测分析(见图5)。计算此时反应的转化率、ee_p值及产率。

表2石油醚/水体系中PvEH2在不同底物浓度下的催化结果

表3水相体系内PvEH2在不同底物浓度下的催化结果

由表2和表3可知，水相中适宜选择的底物浓度较低，当底物浓度提高到20mM，20h后，转化率会下降至70.2％，ee_p值下降至80.4％，产率下降至63.1％。在双相体系中底物的初始浓度可提高至40mM，12h后，转化率会下降至90.6％，ee_p值下降至85.3％，产率下降至83.4％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种利用菜豆环氧化物水解酶制备(R)-间硝基苯乙二醇的方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 951

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggaataca tagtacacag aacagtggaa gtcaatggca tcaaaatgca tgttgcagag 60

aaaggagagg gtcctgccgt cttgttcctc catggcttcc ctgaactatg gtacacctgg 120

cgccaccaga ttcttgatct cagctcccga ggatatcacg cggttgcacc agatctacga 180

ggctacggtg acacagaggc accagcttcc atgagcagct acagctgctt tgacatagtg 240

ggtgatctgg ttgcgcttat agaccttctg ggtgttgatc aagtcttcct tgtggctcat 300

gactggggtg ccatcatagg ttggtacctc tgcatgtttc gccccgacag agtcaaggcc 360

tatgtctgcc tcagtgtgcc tttctggccc agaaacccaa aggtgaagcc cgttgatgcc 420

atgcgggccc tatacggaga tgactactat atctgcagat tccaggaggc aggaaaggca 480

gaaggtgagt tagccaaaaa tagcactgaa gaggtattga aaaaacttct gacaaatcgc 540

acacctgggc caccaatctt gcaaaaagaa ggaatgggtt caaatctgaa cacttcaatg 600

ccccttcctt cttggctttc actccaagat ctcaagtact atgcttccaa atttgaaaag 660

acaggcttca ctggaggcct caactactac agaaatatca acttaaattg ggagctcaca 720

gcaccttgga ctggagcaca ggtcaaagtt ccagtgaagt tcattactgg tgatttggat 780

tcagtataca cttcactagg gatgaagaac tacatagaga gtggtgcttt caagaaagat 840

gtgccaaatt tggaggaagt tattgtgcag gaaggagttg ctcatttcaa caaccaagaa 900

gctgcagaag atgtcagcaa tcacatttat gattttatga acaacttctg a 951

<210> 2

<211> 316

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Glu Tyr Ile Val His Arg Thr Val Glu Val Asn Gly Ile Lys Met

1 5 10 15

His Val Ala Glu Lys Gly Glu Gly Pro Ala Val Leu Phe Leu His Gly

20 25 30

Phe Pro Glu Leu Trp Tyr Thr Trp Arg His Gln Ile Leu Asp Leu Ser

35 40 45

Ser Arg Gly Tyr His Ala Val Ala Pro Asp Leu Arg Gly Tyr Gly Asp

50 55 60

Thr Glu Ala Pro Ala Ser Met Ser Ser Tyr Ser Cys Phe Asp Ile Val

65 70 75 80

Gly Asp Leu Val Ala Leu Ile Asp Leu Leu Gly Val Asp Gln Val Phe

85 90 95

Leu Val Ala His Asp Trp Gly Ala Ile Ile Gly Trp Tyr Leu Cys Met

100 105 110

Phe Arg Pro Asp Arg Val Lys Ala Tyr Val Cys Leu Ser Val Pro Phe

115 120 125

Trp Pro Arg Asn Pro Lys Val Lys Pro Val Asp Ala Met Arg Ala Leu

130 135 140

Tyr Gly Asp Asp Tyr Tyr Ile Cys Arg Phe Gln Glu Ala Gly Lys Ala

145 150 155 160

Glu Gly Glu Leu Ala Lys Asn Ser Thr Glu Glu Val Leu Lys Lys Leu

165 170 175

Leu Thr Asn Arg Thr Pro Gly Pro Pro Ile Leu Gln Lys Glu Gly Met

180 185 190

Gly Ser Asn Leu Asn Thr Ser Met Pro Leu Pro Ser Trp Leu Ser Leu

195 200 205

Gln Asp Leu Lys Tyr Tyr Ala Ser Lys Phe Glu Lys Thr Gly Phe Thr

210 215 220

Gly Gly Leu Asn Tyr Tyr Arg Asn Ile Asn Leu Asn Trp Glu Leu Thr

225 230 235 240

Ala Pro Trp Thr Gly Ala Gln Val Lys Val Pro Val Lys Phe Ile Thr

245 250 255

Gly Asp Leu Asp Ser Val Tyr Thr Ser Leu Gly Met Lys Asn Tyr Ile

260 265 270

Glu Ser Gly Ala Phe Lys Lys Asp Val Pro Asn Leu Glu Glu Val Ile

275 280 285

Val Gln Glu Gly Val Ala His Phe Asn Asn Gln Glu Ala Ala Glu Asp

290 295 300

Val Ser Asn His Ile Tyr Asp Phe Ile Asn Lys Phe

305 310 315

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catatggaat acatagtaca cagaac 26

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctcgagtcag aacttgttga taaaatcata aatgtgattg c 41

Claims (5)

1.一种制备(R)-间硝基苯乙二醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将外消旋的间硝基环氧苯乙烷溶解于有机试剂中；

（2）向步骤（1）所得含有外消旋的间硝基环氧苯乙烷的有机试剂中加入水溶液，所述水溶液含表达菜豆环氧化物水解酶的细胞，在20-30℃下恒温搅拌反应8-12 h，所述菜豆环氧化物水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的；有机相与水相的体积比为(1:4)~(3:7)；有机试剂为沸程为60-90℃的石油醚；加入的菌体质量与底物物质的量的比例δ为3-5 mg/μmol；

（3）反应结束后将整个反应体系静置或离心，使有机相与水相分层，分取下层的水相，萃取，得到(R)-间硝基苯乙二醇；

所述细胞为表达菜豆环氧化物水解酶的重组大肠杆菌细胞；

底物的初始浓度为5-40 mM。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述菜豆环氧化物水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中水溶液包括浓度为100-200 mg/mL的菌悬液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中以乙酸乙酯作为萃取剂。

5.权利要求1-4任一所述的方法在制药或化工领域的应用。

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