CN105969837B

CN105969837B - 一种酶法制备(s)-环氧苯乙烷的方法

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Publication number: CN105969837B
Application number: CN201610535106.0A
Authority: CN
Inventors: 邬敏辰; 胡蝶; 王瑞; 叶慧华; 唐诗涵; 李剑芳
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Nanjing Kemo biomedical Co., Ltd
Priority date: 2016-07-07
Filing date: 2016-07-07
Publication date: 2019-12-24
Anticipated expiration: 2036-07-07
Also published as: CN105969837A

Abstract

本发明公开了一种酶法制备(S)‑环氧苯乙烷的方法，属于生物催化技术领域。本发明在正己醇/缓冲液的双相体系中，利用来源于宇佐美曲霉的环氧化物水解酶催化外消旋环氧苯乙烷的水解动力学拆分，制备(S)‑环氧苯乙烷的方法；与单相反应体系相比，动力学拆分rac‑SO的浓度从24g/L提高至120g/L；时空产率从为3.1g/L/h提高至20.3g/L/h；动力学拆分120g/Lrac‑SO制备(S)‑SO的ee值从36.8％提高至98.3％，并实现了(S)‑SO的克级制备。本发明方法工艺简单、产物的对映体纯度和得率高、催化效率高和环境友好，具有较大工业化应用前景。

Description

一种酶法制备(S)-环氧苯乙烷的方法

技术领域

本发明涉及一种酶法制备(S)-环氧苯乙烷的方法，属于生物催化技术领域。

背景技术

手性环氧化物和邻二醇是一类高附加值的多功能合成子或砌块，可用于药物、精细化学品、农药和功能性材料等的合成，如白三烯、昆虫信息素、甾类物质、β-肾上腺素阻断剂、神经保护剂和艾滋病毒蛋白酶抑制剂等。传统的化学法合成具有光学活性的环氧化合物和邻位二醇时，往往需要重金属类有毒物质作为催化剂且反应条件较为苛刻，不仅面临着环境的巨大挑战，且难以得到高对映体纯度的目的产物，生产效率低。环氧化物水解酶(Epoxide hydrolases,EHs)可催化水解酶动力学拆分(Hydrolytic kinetic resolution)外消旋环氧化物制备手性环氧化物或邻二醇，具有产物对映体纯度和产率高以及对环境友好等优点而备受关注。微生物来源的EHs不需要辅助因子、立体选择性强、底物谱宽广、绿色无污染和反应条件温和等特点，成为一种非常具有潜力的酶催化剂。利用微生物来源的EHs生物法制备手性环氧化物与二醇的合成路线为人们提供了一种可能取代化学方法的高效专一、环境友好的合成方法。然而，底物和产物为水不溶性有机化合物，且底物在水相中易自发水解，均不利于EHs的催化反应。另外，酶催化反应存在底物或者产物抑制作用、稳定性差等不利因素，也使工艺规模难以放大，极大的限制了它们在工业生产中的应用。

目前，为解决EHs应用过程中遇到限制因素，酶固定化、非水相催化介质(水不溶性有机溶剂或离子液体)、和膜反应器等技术被引入酶促反应系统。Jia等利用DEAE纤维素对Bacillus megaterium的EHs进行了固定化，提高酶稳定性，固定化酶可循环使用10次，但酶固定化存在传质限制导致催化效率低。Archelas等使用A.niger EH拆分三氟甲基取代芳香族环氧化物，采用20％正辛烷/水两相反应体系，底物浓度为由10g/L提高到360g/L，但是不同来源的EHs有机溶剂稳定性等存在很大差异，如来源于Sphingomonas sp.的EH在正己烷中稳定，但来源于Rhodotorula sp.在正己烷中失去催化活性。Choi等将Rhodococcusglutinis EHs制成中空纤维膜反应器应用于两相拆分体系，降低了有机溶剂与底物对酶的失活作用，同时产物的及时移除解决了产物抑制问题，但膜反应器价格昂贵易耗损，不宜应用于实际工业生产应用中。因此，根据不同来源的EHs构建合适的生物催化体系，提高EHs的对映体选择性、稳定性及生产效率等是促进EHs的大规模生产及应用的关键。

利用来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的重组环氧化物水解酶(reAuEH2)催化外消旋环氧苯乙烷(rac-SO)具有高对映选择性、高催化活性和底物耐受性，但存在明显底物抑制作用，从而导致reAuEH2不能实现高浓度底物的有效拆分，且时空产率低。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用环氧化物水解酶(reAuEH2)高效制备(S)-环氧苯乙烷的方法。

所述方法是构建有机/水双相体系，所述有机相可以是正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、正己烷、环己烷、正庚烷和正辛烷中的一种或几种的混合；所述水相可以是水、磷酸盐缓冲液和Tris-盐酸缓冲溶液等，其pH为6.0～9.5；有机相与水相的体积比是1:9至9:1；反应体系中底物与环氧化物水解酶的用量的质量比例是30～1(w/w)，底物的添加量是2.4g/L至120g/L，反应温度0～35℃，搅拌条件下进行。

在本发明的一种实施方式中，所述环氧化物水解酶的基因来源于宇佐美曲霉，环氧化物水解酶为大肠杆菌表达重组酶。

在本发明的一种实施方式中，所述有机相为正己醇。

在本发明的一种实施方式中，所述水相为pH 7.0的磷酸盐缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，有机相为正己醇，水相为pH 7.0的磷酸盐缓冲液，有机相与水相的体积比1:1。

在本发明的一种实施方式中，底物与酶的用量比例为6:1(w/w)。

在本发明的一种实施方式中，底物浓度120g/L，底物与酶的用量比例为6:1(w/w)。

在本发明的一种实施方式中，反应温度为25℃。

在本发明的一种实施方式中，所述酶的制备是收集产环氧化物水解酶的重组菌全细胞湿菌体，洗涤悬浮，超声破碎后离心收集上清液，过滤得到酶液。酶液可进一步冻干得到冻干酶粉。

在本发明的一种实施方式中，还可以用产环氧化物水解酶的重组菌全细胞替代酶。

在本发明的一种实施方式中，所述产环氧化物水解酶的重组菌全细胞的制备是收集产环氧化物水解酶的全细胞湿菌体，或全细胞冻菌体。

在本发明的一种实施方式中，产环氧化物水解酶的全细胞可以是产来源于宇佐美曲霉的环氧化物水解酶的大肠杆菌基因工程菌。

本发明以rac-SO为底物，E.coli/(reAuEH2)全细胞或reAuEH2酶作为生物催化剂，在合适的双相体系中实现rac-SO的克级规模的动力学拆分制备手性纯的(S)-SO。本发明显著提高了水解动力学拆分的rac-SO的浓度、时空产率和产物(S)-SO的对映体纯度。与单水相反应体系相比，reAuEH2催化rac-SO的浓度从24g/L提高至120g/L，提高5倍；时空产率从为3.1g/L/h提高至20.3g/L/h，提高6.5倍；催化120g/L rac-SO制备(S)-SO的ee值从36.8％提高至98.3％。本发明实现了(S)-SO的克级制备，且工艺简单、产物的对映体纯度和得率高、催化效率高和环境友好，具有较大工业化应用前景。

附图说明

图1ReAuEH2催化外消旋环氧苯乙烷水解动力学拆分的时间进程曲线

具体实施方式

实施例1

环氧化水解酶酶活力测定方法：在1.5mL的EP管中加入100μL酶液和850μL磷酸钾缓冲液(50mM，pH＝7.0)，35℃预热2min；加入50μL 200mM的rac-SO，反应15min后，加入1mL乙酸乙酯中混匀，10000r/min离心5min后，取上层有机相于新的EP管中，加入适量无水MgSO₄干燥过0.22μm的有机膜，进行手性气相色谱分析。色谱条件：岛津GC-2010GC气相色谱仪，CYCLOSIL-B手性色谱柱，火焰离子化检测器；进样口和检测口温度为250℃,从100℃以5℃/min程序升温至190℃；(R)-SO和(S)-SO保留时间为6.087和6.187。酶活力单位定义：在此测定条件下，以每分钟消耗1μmol环氧苯乙烷所需的酶量定义为1个环氧化物水解酶活力单位(U)。(S)-SO的ee＝[(S-R)/(S+R)]×100％。

实施例2

重组环氧化物水解酶(reAuEH2)的制备：AuEH2的核酸序列和氨基酸序列及表达重组酶reAuEH2的工程菌E.coli/(reAuEH2)的构建参见公开号为CN102994470A的发明专利申请，reAuEH2的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。挑取E.coli/(reAuEH2)单菌落于LB培养基中37℃条件下培养12h，以2％(v/v)的接种量转接入新鲜的100mL的LB培养基中，37℃条件下培养2h后，加入0.2mM IPTG诱导剂28℃培养8h，诱导reAuEH2的高效表达，重组细胞经8000rpm离心收集，加入磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.0)悬浮，超声破碎后离心收集上清液，经10KDa的超滤离心管浓缩，获得的reAuEH2酶液，测定其蛋白含量为40mg/mL，比酶活力为3.8U/mg。

实施例3有机溶剂对环氧化物水解酶活力的影响

在1mL反应体系中，包含20mM rac-SO和100μL适当稀释的reAuEH2酶液和磷酸盐缓冲液，并分别添加10％、15％、25％和35％(v/v)的水溶性有机溶剂甲醇、DMSO、DMF和异丙醇，在35℃反应15min，测定水溶性有机溶剂对reAuEH2酶活力的影响，以不添加任何有机溶剂的反应体系作为对照。当所测定的水溶性有机溶剂添加量为10％时，reAuEH2保留>95％酶活力，当DMSO添加量为25％时，reAuEH2的酶活力保留50％，甲醇、DMF和异丙醇添加量为25％时reAuEH2的仅保留<30％酶活力。

另外，reAuEH2酶液与乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、三氯甲烷、甲苯、异丁醇、异戊醇、正戊醇、正己醇、正辛醇、正己烷、环己烷、正庚烷、正辛烷和异辛烷等体积比混匀，在25℃和220rpm条件下孵育8h后，吸取适量预处理的reAuEH2酶液，按照测定环氧化水解酶酶活力测定方法测定reAuEH2的残余酶活力，以在等量磷酸盐缓冲液中处理的reAuEH2酶液作为对照。reAuEH2在水不溶性有机溶剂孵育8h后，残余酶活力分别为63.5％(乙酸乙酯)、53.9％(乙酸丁酯)、0％(二氯甲烷)、49.4％(三氯甲烷)、13.4％(甲苯)、51.3％(异丁醇)、70.1％(异戊醇)、96.2％(正戊醇)、95.6％(正己醇)、95.6％(正辛醇)、99.8％(正己烷)、98.1％(环己烷)、98.4％(正庚烷)、98.3％(正辛烷)和96.3％(异辛烷)。

实施例4不同反应体系对转化反应的影响

构建4种反应体系：第一种为由磷酸盐缓冲液(50mM,pH7.0)构建的单水相体系，第二种为DMSO/缓冲液(1:9,v/v)双相体系，第三种正己烷/缓冲液(2:8,v/v)双相体系，第四种正己醇/缓冲液(2:8,v/v)双相体系。在4种反应体系中分别加入rac-SO(全体积浓度为90g/L,750mM)和实施例2制备的reAuEH2酶液(全体积浓度为7.5g/L)，底物质量与酶的质量比例为12(w/w)，在25℃和220rpm条件下反应，获得产物(S)-SO的对映体过量率(ee)分别为44.9％、45.2％、56.2％和93.7％。利用20％正己醇/缓冲液双相体系，(S)-SO的ee从单相体系中的44.9％提高至93.7％。

实施例5双相体系的相体积比、底物量/酶量比率和反应温度对转化反应的影响

在正己醇/缓冲液(50mM,pH7.0)双相体系中，正己醇添加量为20％、40％、50％、60％和80％(v/v)，分别加入rac-SO(全体积浓度为90g/L)和实施例2制备的reAuEH2酶液(全体积浓度为6g/L)，即底物质量与酶的质量比例为15(w/w)，在25℃和220rpm条件下反应。正己醇添加量为20％、40％、50％、60％和80％(v/v)的双相体系中，(S)-SO的ee值分别为75.7％、95.4％、98.0％、98.1％和98.2％，得率分别47.8％、38.6％、36.0％、34.2％、30.1％。当正己醇含量≥50％，(S)-SO的ee值>98％，但随着正己醇含量的增加，(S)-SO得率降低，故正己醇/缓冲液(50mM,pH7.0)双相体系中的最适相体积比为1:1(v/v)。

在正己醇/缓冲液(50mM,pH7.0)双相体系中，固定两相体积比为1:1(v/v)，分别加入rac-SO(全体积浓度为90g/L)和不同量的实施例2制备的reAuEH2酶液(全体积浓度为15g/L、9g/L、6g/L和3g/L)使得底物质量与酶的质量比例值分别为6、10、15和30(w/w)，在25℃和220rpm条件下反应。当底物质量与酶质量比例值值为6、10和15(w/w)时，(S)-SO的ee值均>98％，反应时间分别为1.5h、3h和8h，时空产率分别为21.6g/L/h、10.8g/L/h和4.1g/L/h。当底物质量与酶质量比例值值为6(w/w)时，时空产率最高，本发明选择底物质量与酶质量比例值为6(w/w)作为最适的底物量/酶量比率。然而，若考虑生物催化剂reAuEH2的成本，可减少reAuEH2酶量的添加，延长反应时间，在实际生产过程，可根据实际生产成本调节底物量/酶量比率。

在正己醇/缓冲液(50mM,pH7.0)双相体系中，固定两相体积比为1:1(v/v)，分别加入rac-SO(终浓度为90g/L)和实施例2制备的reAuEH2酶液(终浓度为15g/L)，底物质量与酶质量比例值为6(w/w)，分别在4℃、10℃、25℃和35℃和220rpm条件下反应。当反应温度为35℃，(S)-SO的ee值最高仅为33.2％，当反应温度4℃、10℃、25℃时，(S)-SO的ee值均>98％，其得率分别为40％、38％和36％，反应时间分别为1.5h、3h和7h，时空产率分别为21.6g/L/h、17.1g/L/h、5.1g/L/h。尽管随着温度的降低，reAuEH2的对映选择性提高，(S)-SO的得率从36％提供至40％，但反应时间延长，从而降低时空产率。可选择常温25℃作为最适的反应温度。

实施例6利用reAuEH2水解动力学拆分rac-SO制备(S)-SO

1.2g rac-SO溶解在5mL正己醇中，加入5mL reAuEH2酶液(40mg/mL)，添加酶的质量为0.2g，至终体积为10mL，底物质量与酶质量比例值为6，在25℃和220rpm条件下反应，用手性气相色谱监测(S)-SO的ee值反应2h后，获得产物(S)-SO的得率为34.2％，ee值为98.3％，时空产率高达20.3g/L/h，实现了高浓度rac-SO(120g/L,1M)水解动力学拆分制备手性纯(S)-SO。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种酶法制备(S)-环氧苯乙烷的方法

<140> CN201610535106.0

<141> 2016-07-07

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 395

<212> PRT

<213> 宇佐美曲霉（Aspergillus usamii）E001

<400> 1

Met Ala Leu Ala Tyr Ser Asn Ile Pro Leu Gly Ala Thr Val Ile Pro

1 5 10 15

Ser Pro Phe Gln Val His Ile Ser Asp Glu Gln Ile Glu Glu Leu Gln

20 25 30

Leu Leu Val Lys Leu Ser Lys Leu Ala Pro Pro Thr Tyr Glu Gly Leu

35 40 45

Gln Gln Asp Arg Arg Tyr Gly Ile Thr Asn Glu Trp Leu Ala Asn Ala

50 55 60

Lys Glu Ala Trp Lys Ser Phe Asp Trp Arg Pro Ala Glu Ser Arg Ile

65 70 75 80

Asn Ser Phe Pro Gln Phe Thr Tyr Asp Ile Glu Gly Leu Thr Ile His

85 90 95

Phe Val Ala Leu Phe Ser Glu Lys Lys Asp Ala Ile Pro Ile Val Leu

100 105 110

Leu His Gly Trp Pro Gly Ser Phe Leu Glu Phe Leu Pro Val Leu Thr

115 120 125

Ser Ile Arg Asp Lys Tyr Ser Pro Glu Thr Leu Pro Tyr His Ile Val

130 135 140

Val Pro Ser Leu Pro Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Gly Pro Pro Leu Asp

145 150 155 160

Val Asn Phe Asn Gly Glu Asp Thr Ala Arg Val Ile Asn Lys Val Met

165 170 175

Leu Asn Leu Gly Phe Glu Asp Gly Tyr Val Ala Gln Gly Gly Asp Ile

180 185 190

Gly Ser Lys Ile Gly Arg Ile Leu Ala Val Asp His Asp Ala Cys Lys

195 200 205

Ala Val His Leu Asn Ala Cys Tyr Met Gly Lys Pro Ser Ser Ile Pro

210 215 220

Asp Thr Ala Ile Thr Glu Glu Asp Lys Arg Ala Leu Ala Arg Ala Gln

225 230 235 240

Trp Phe Ala Thr Phe Gly Ser Gly Tyr Ala Val Glu His Gly Thr Arg

245 250 255

Pro Ser Thr Ile Gly Asn Ala Leu Ser Thr Ser Pro Val Ala Leu Leu

260 265 270

Ser Trp Ile Gly Glu Lys Phe Leu Asp Trp Ala Gly Glu Thr Ile Pro

275 280 285

Leu Glu Thr Ile Leu Glu Ser Val Thr Leu Tyr Trp Phe Thr Glu Thr

290 295 300

Phe Pro Arg Ser Ile Tyr His Tyr Arg Glu Asn Phe Pro Pro Pro Lys

305 310 315 320

Leu Arg His Thr Glu Asp Pro Arg Trp Tyr Ile Arg Lys Pro Phe Gly

325 330 335

Phe Ser Tyr Tyr Pro Met Glu Leu Val Pro Thr Pro Arg Ala Trp Val

340 345 350

Glu Thr Thr Gly Asn Leu Val Phe Trp Gln Ala His Glu Lys Gly Gly

355 360 365

His Phe Ala Ala Leu Glu Arg Pro Gln Asp Tyr Leu Asp Asp Leu Thr

370 375 380

Ala Phe Cys Glu Gln Val Trp Ala Gly Arg Lys

385 390 395

Claims

1.一种制备(S)-环氧苯乙烷的方法，其特征在于，具体的制备方法为：1.2g rac-SO溶解在5mL正己醇中，加入5mL浓度为40mg/mL reAuEH2酶液，添加酶的质量为0.2g，至终体积为10mL，底物质量与酶质量比例值为6，在25℃和220rpm条件下反应；所述reAuEH2的基因来源于宇佐美曲霉，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述reAuEH2的制备方法为：挑取E.coli/(reAuEH2)单菌落于LB培养基中37℃条件下培养12h，以体积分数2％的接种量转接入新鲜的100mL的LB培养基中，37℃条件下培养2h后，加入0.2mM IPTG诱导剂28℃培养8h，诱导reAuEH2的高效表达，重组细胞经8 000rpm离心收集，加入50mM，pH＝7.0磷酸盐缓冲液悬浮，超声破碎后离心收集上清液，经10KDa的超滤离心管浓缩，获得的reAuEH2酶液，测定其蛋白含量为40mg/mL，比酶活力为3.8U/mg。