CN110129307B

CN110129307B - 固定化酮还原酶突变体及其在制备度洛西汀手性醇中间体及其类似物中的应用

Info

Publication number: CN110129307B
Application number: CN201910433481.8A
Authority: CN
Inventors: 林涛; 徐明文; 蒋丽丽; 于丽珺
Original assignee: Nanjing Interesting Enzyme Biotechnology Co ltd; Shanghai Ren Enzyme Biotechnology Co ltd; Anhui Quenzyme Biotechnology Co ltd
Current assignee: Anhui Quenzyme Biotechnology Co ltd; Nanjing Interesting Enzyme Biotechnology Co ltd; Shanghai Ren Enzyme Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-05-23
Filing date: 2019-05-23
Publication date: 2023-09-05
Anticipated expiration: 2039-05-23
Also published as: CN110129307A

Abstract

本发明提供了一种固定化酮还原酶突变体，所述的固定化酮还原酶突变体为酮还原酶突变体的固定化细胞或固定化酶。本发明还提供了固定化酮还原酶突变体作为催化剂在制备S‑构型度洛西汀手性醇中间体及其类似物的应用。本发明具有如下技术效果：1）本发明的固定化酮还原酶突变体，可作为催化剂，与辅酶再生体系共同用于制备S‑构型的度洛西汀手性醇中间体及其类似物，反应转化率可达90%、95%或99%以上，产物的手性纯度值可达90%、95%或99%以上。2）固定化后的酶或细胞可以通过简单的过滤进行回收，回收后可以反复使用7‑10次，且重复使用时与初次使用的反应转化率和手性纯度值基本相同。

Description

固定化酮还原酶突变体及其在制备度洛西汀手性醇中间体及其类似物中的应用

技术领域

本发明涉及一种固定化酮还原酶突变体及其在制备度洛西汀手性醇中间体及其类似物中的应用，属于生物酶工程和微生物应用领域。

背景技术

盐酸度洛西汀【Duloxetine hydrochloride，(S)-N-甲基-3-(1-萘氧基)-3-(2-噻吩基)-1-丙胺盐酸盐】是由美国礼来公司研发的新型抗抑郁药，能有效地抑制5-羟色氨和去甲肾上腺素的再摄取，高效、安全、副作用小，对其他症状如全身疼痛和胃肠道紊乱也有疗效，该药还被批准用于糖尿病引起的神经疼痛以及女性尿失禁的治疗。2012年全球20个最畅销的处方药榜单中度洛西汀以49.94亿美元的年销售额排名第9。

研究发现(S)-构型的盐酸度洛西汀药效是(R)型两倍，并且相对于(R)-盐酸度洛西汀来说，(S)型对映体是更强的5-羟色胺再摄取抑制剂，因而(S)-构型手性醇中间体的制备是盐酸度洛西汀的合成关键步骤。

目前S-手性醇中间体的合成主要有化学合成和酶法合成两种途径。化学合成采用化学拆分和化学不对称合成来制备手性中间体，这两种方法均存在诸多问题，如化学拆分需要使用大量的拆分剂，反应步骤长，能耗高以及废物排放量大等；基于过渡金属手性配体催化氢化体系，存在着产品光学纯度不高以及重金属残留等问题，导致收率过低，成本居高不下。随着盐酸度洛西汀的专利在2013年12月到期后，原料药价格一再下探，传统化学合成途径因环保和成本问题受到极大冲击。

酶法合成S-手性醇中间体的研究从十几年前即已开始并有报道。起初是利用脂肪酶代替过渡金属催化剂来进行手性拆分，虽然污染大为减少，但也存在拆分效率低、另一对映体无法利用等问题。后续研究利用酮还原酶来进行手性还原制备S-手性醇中间体。WadaM,et al于2004年克隆一个来源于Exiguobacterium sp.F42的短链醇脱氢酶，用于还原3-氧-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯制备手性醇中间体S-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯，ee值大于98％(Wada M,et al.Biosci Biotechnol Biochem,2004,68:1481-1488)。汤传根等(Tang CG,et al.Biotechnol Lett,2011,33:1435-1440)和吴中柳等(CN103740738A)分别报道了利用粘红酵母菌(Rhodotorula sp.CY12)和来源于金黄杆菌(Chryseobacteriumsp.CA49)的羰基还原酶ChKRED15催化N-甲基-3-羰基-3-(2-噻吩基)丙酰胺生成S-手性中间体，ee值均大于99％。然而上述利用酮还原酶来进行手性醇制备的研究中，底物浓度低(<30g/l),且所制备的手性醇还需经过几步化学反应才能制得度洛西汀手性中间体(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)-1-丙胺，限制了其工业化应用。

美国Codexis公司以Lactobacillus kefir来源的醇脱氢酶出发，采用DNA重排等定向进化技术，得到一系列突变体酶，其催化底物浓度可达80g/l，ee值大于99％(US20080206824A)，有望用于工业化生产。然而国内目前还未有可用于工业化生产的酶及其突变体的研究报道。

酶或细胞固定化技术即是将含酶的细胞或酶液用固定化载体材料，将酶束缚、限制在一定的空间内或连接在载体材料上，保留其催化活性，并可回收及重复使用的一类技术。此类方法可以将价格昂贵的酶产品在反应后再次多次地回收使用，从而降低酶的使用成本。同时固定化后细胞或酶蛋白由于连接到更大颗粒的固定化载体材料，使在工业上难于过滤的酶和细胞等小分子，凝聚成易于过滤的大颗粒，从而极大得降低了工业化过滤的操作难度和对应成本，解决了工业上酶催化剂和产物的分离纯化困难的问题。

固定化酶在文献中曾用水不溶酶、不溶性酶、固相酶、结合酶、固定酶、酶树脂及载体结合酶等名称。

酶的催化反应依赖于它的活性部位的完整性，因此在固定某一酶时必须选择适当条件，使其活性部位的基团不受影响，并避免高温、强酸及强碱等条件，不使蛋白质变性。如附图33所示，酶的固定化方法主要有以下几种方法：

(a)载体结合法：最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。

(b)交联法依靠双功能团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酶。常采用的双功能团试剂有戊二醛、顺丁烯二酸酐等。酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。

(c)包埋法：酶被裹在凝胶的细格子中或被半透性的聚合物膜包围而成为格子型和微胶囊型两种。包埋法制备固定化酶除包埋水溶性酶外还常包埋细胞，制成固定化细胞，例如可用明胶及戊二醛包埋具有青霉素酰化酶活力的菌体，可连续水解帤基青霉素，工业生产6-氨基青霉烷酸。

酶经过固定化后，比较能耐受温度及pH的变化，最适pH往往稍有移位，对底物专一性没有任何改变，实际使用效率提高几十倍(如5′-磷酸二酯酶的工业应用)甚至几百倍(如青霉素酰化酶的工业应用)。

固定化酶的形式多样，可制成机械性能好的颗粒装成酶柱用于连续生产；或在反应器中进行批式搅拌反应；也可制成酶膜、酶管等应用于分析化学；又可制成微胶囊酶，作为治疗酶应用于临床。现在又有人用酶膜(包括细胞、组织、微生物制成的膜)与电、光、热等敏感的元件组成一种装置称生物传感器，用于测定有机化合物和发酵自动控制中信息的传递及环境保护中有害物质的检测。最常用的是酶膜与离子选择电极组成的生物传感器，例如脲传感器是由固定化脲酶、固定化硝化菌及氧电极组成，脲经脲酶分解成氨及二氧化碳，氨又继续被硝化菌氧化，总耗氧量则通过氧电极反映出电流的变化，用以计算脲的含量。

1916年Nelson和Griffin发现了酶的固定化现象后，科学家就开始的了固定化酶的研究工作(J.M.Nelson,E.J.Griffin.Adsorption of invertase.J.Am.Chem.Soc.,1916,38(5):1109-115)。固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定化酶的统一英文名称为Immobilized enzyme。随着固定化技术的发展，出现固定化菌体。1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了固定化细胞技术。1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸，取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍，更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的变革提供了新的方向。(邹泽昌；氧化硅介孔泡沫材料的制备及其木瓜蛋白酶固定化[D]；北京工业大学；2009年)

现有技术没有提供同类固定化的酮还原酶突变体及其应用效果。

现有技术中其他酮还原酶的固定化存在如下技术问题：1、固定化成本较高、操作手续复杂；2、固定化循环使用次数不多；3、固定化后催化效率下降等。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种来源于赤红球菌菌属Rhodococcus ruber的酮还原酶Rr Kred基因，并提供对该酶和产酶的细胞进行固定化的方法，以及用该酶及其制备的固定化细胞和固定化酶，作为生物催化剂用于制备度洛西汀手性中间体及其类似物的方法。

本发明的技术方案如下：

一种固定化酮还原酶突变体，所述的固定化酮还原酶突变体为酮还原酶突变体的固定化细胞或固定化酶，固定化酶表示所述的酮还原酶突变体固定化于固相支撑物上；固定化细胞表示酮还原酶突变体表达于固定化于固相支撑物上的微生物细胞中；

所述的酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码所述的酮还原酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

酮还原酶Rr Kred的基因序列通过金斯瑞生物科技有限公司全基因合成所得，在编码区两端分别添加Nde I和Hind III限制性内切酶位点。目的基因片段通过限制性内切酶Nde I和Hind III酶切后，与经过同样双酶切的pET21a(+)载体进行连接、转化和筛选，筛选得到的阳性质粒Rr Kred-pET21a(+)转入BL21(DE3)宿主菌中，从而构建该酮还原酶的体外异源表达体系。

根据现有公共知识，任何基因经操作或者改造后连入各类表达载体，转化至合适宿主细胞，经适当条件诱导均能过量表达目的蛋白。因此，酮还原酶Rr Kred其表达的载体可以为pET或者pCW或者pUC或者pPIC9k等，表达宿主可以为大肠杆菌，毕赤酵母，链霉菌等。

本发明还提供了含酮还原酶Rr Kred细胞进行固定化细胞，及获得酶液进行固定化酶的方法。固定化细胞采用壳聚糖对含酶细胞和戊二醛溶液进行交联，用无水碳酸钠进行制粒，过滤后得到固定化细胞。固定化酶采用戊二醛交联活化后的树脂，加入酶液连接到树脂上，最后用丙氨酸封闭树脂上的活性位点，获得固定在树脂上的酶备用。

本发明还提供了所述的固定化酮还原酶突变体作为催化剂在制备S-构型度洛西汀手性醇中间体及其类似物的应用，其特征在于，所述制备方法如下：在辅酶再生体系的存在下，固定化酮还原酶突变体催化剂催化度洛西汀手性酮基中间体及其类似物与度洛西汀手性醇基中间体及其类似物之间发生立体特异性平衡反应，反应式如下：

其中的R＝H，代表N取代单甲基；R＝CH₃，代表N取代双甲基；R＝Ph，代表N取代甲基、苄基。

所述的制备度洛西汀手性醇中间体及其他类似物的方法，包括下列方法的任意一种：

(a)采用异丙醇和Im-Rr Kred进行反应，反应路线如下：

(b)采用葡萄糖结合葡萄糖脱氢酶Gdh进行反应，反应路线如下：

所述的转化反应体系中包括酮还原酶Rr Kred的固定化细胞或固定化酶、磷酸缓冲液、辅酶NADP、底物和辅酶再生底物异丙醇或葡萄糖；

其中，固定化细胞或固定化酶的用量在10-20g/200ml(优选10g/200ml)，缓冲液浓度在50-200mM(优选50mM)，缓冲液pH值在6.0-8.5之间(优选7.0)，辅酶浓度为0.01-0.05g/200ml之间(优选0.02g/200ml)，底物浓度在1-4g/200ml之间，辅酶再生底物浓度根据底物浓度进行调整。

所述的反应的温度为35-40℃。

所述的反应的pH为7-11。

本发明还提供了酮还原酶Rr Kred作为生物催化剂在转化底物N，N-双甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)-1-丙胺(II)及其类似物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)-1-丙胺(I)生成对应手性醇中间体(V，IV)中的应用。

以上为转化底物及其对应的S-手性醇中间体的结构式。

反应后产物通过乙腈萃取后经HPLC验证，反应转化率可达90％，或95％，或99％以上，产物的手性纯度值可达90％，或95％，或99％以上。从而可证明该酶突变体可用于原料I、II的生物不对称还原。

可进行上述生物催化反应的酶包括相应的固定化细胞或者固定化酶等其他存在形态。

本发明所用的辅酶再生体系为葡萄糖-葡萄糖脱氢酶体系或异丙醇-醇脱氢酶体系。其中葡萄糖脱氢酶体系采用的酶来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)等的体外重组酶，优选为来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的葡萄糖脱氢酶(BsGDH)的基因重组酶。异丙醇-醇脱氢酶体系所用的酶主要来源于酮还原酶Rr Kred或其固定化的载体形式。具体的为，本发明下面如无特殊说明，采用的辅酶再生体系为异丙醇-酮还原酶酶Rr Kred的辅酶再生体系。

本发明具有如下技术效果：

1)本发明的固定化酮还原酶突变体，可作为催化剂，与辅酶再生体系共同用于制备S-构型的度洛西汀手性醇中间体及其类似物，反应转化率可达90％、95％或99％以上，产物的手性纯度值可达90％、95％或99％以上。反应条件温和，几乎无副产物，辅酶循环体系稳定，具有较大的工业化应用前景。

2)固定化后的酶或细胞可以通过简单的过滤进行回收，回收后可以反复使用7-10次，且重复使用时与初次使用的反应转化率和手性纯度值基本相同。

附图说明

图1为实施例4的HPLC检测结果图。

图2为实施例4的SFC检测结果图。

图3为实施例5的HPLC检测结果图。

图4为实施例5的SFC检测结果图。

图5为实施例6的HPLC检测结果图。

图6为实施例6的SFC检测结果图。

图7为实施例7的HPLC检测结果图。

图8为实施例7的SFC检测结果图。

图9为实施例8的HPLC检测结果图。

图10为实施例8的SFC检测结果图。

图11为实施例9的HPLC检测结果图。

图12为实施例9的SFC检测结果图。

图13为实施例10的HPLC检测结果图。

图14为实施例10的SFC检测结果图。

图15为实施例11的HPLC检测结果图。

图16为实施例11的SFC检测结果图。

图17为实施例12的HPLC检测结果图。

图18为实施例12的SFC检测结果图。

图19为实施例13的HPLC检测结果图。

图20为实施例13的SFC检测结果图。

图21为实施例14的HPLC检测结果图。

图22为实施例14的SFC检测结果图。

图23为实施例14的固定化细胞循环使用7次后的HPLC检测结果图。

图24为实施例14的固定化细胞循环使用7次后的SFC检测结果图。

图25为实施例15的HPLC检测结果图。

图26为实施例15的SFC检测结果图。

图27为实施例15的固定化细胞循环使用7次后的HPLC检测结果图。

图28为实施例15的固定化细胞循环使用7次后的SFC检测结果图。

图29为实施例16的HPLC检测结果图。

图30为实施例16的SFC检测结果图。

图31为实施例16的固定化酶循环使用6次后的HPLC检测结果图。

图32为实施例16的固定化酶循环使用6次后的SFC检测结果图。

图33为现有技术中的固定化方法。

具体实施方式

以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。

实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础等译，第三版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行

本发明的实施例中的底物转化率的检测和产物手性纯度的检测的方法如下：

底物转化率的检测通过HPLC进行，检测的条件如下：仪器为安捷伦HPLC1100、液相柱为安捷伦Agllent 5 TC-C18(2)250*4.6mm、流动相Buffer A为甲醇、流动相Buffer B为0.1％磷酸的水溶液(1L超纯水+1mL磷酸)、A相和B相以20％加80％的比例混合，柱温箱温度30℃、流速1mL/min、检测波长245nm、样品浓度2mg/mL、进样量2uL。检测后将产物的峰面积除以产物和底物的峰面积之和，求得转化率。

产物手性纯度的检测通过超临界流体色谱(SFC)检测。检测后将S型产物的峰面积除以S型产物和R型产物的峰面积之和，求得手性纯度。

上述检测样品均采用流动相稀释到合适浓度后，用0.22μm的滤膜过滤进仪器检测。

本发明的实施例中的固定化细胞的制备方法如下：

将50g细胞加入50ml水搅拌均匀，另取50ml水中加入2～3g壳聚糖并加入3ml冰乙酸，充分搅拌至壳聚糖完全溶解。将50ml壳聚糖溶液倒入已经搅拌均匀的细胞溶液充分搅拌30min，加10ml异丙醇搅拌。取50％浓度戊二醛4～5ml加水稀释至12ml并加入以上壳聚糖细胞溶液中充分搅拌。搅拌交联30～50min。将3g无水碳酸钠加入150ml水中充分搅拌溶解。将碳酸钠溶液缓慢加入以上交联好的壳聚糖固定化细胞中充分搅拌，此时为中性。过滤得到固定化细胞，滤饼用500ml水冲洗2～3次，用200ml的20mM磷酸缓冲淋洗一次。过滤得到滤饼称重约80g，滤干放入4℃冰箱保存。

将上述得到的固定化细胞用于底物催化反应。将1g底物溶解于40ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，随后加入800mg葡萄糖，待搅拌溶解后加入5mg NADP+、2.5g GDH湿菌体，加入2g固定化细胞，并加入10ml磷酸缓冲将体积补充到50ml。反应液置于40℃恒温水浴锅中，磁力搅拌反应。反应10mim后取样，进行HPLC检测，底物转化率达到19％，产物ee值>99％。

转化率定义为产品峰/(产品峰+底物峰)*100％的数值，酶活定义为40度下每min每g固定化细胞反应生成产物的微摩尔数。计算过程如下：酶活＝转化率*(1/221)*1000000/10/2。本次10min后的转化率为19％，则酶活＝19％*(1/221)*1000000/10/2＝43U/min/g。

本发明的实施例中的固定化酶的制备方法如下：

将100g树脂用5倍体积的纯水洗涤2次，再用4倍体积pH8.0 25mmol磷酸缓冲洗涤2次。将树脂加入4倍树脂体积6％的戊二醛，室温下搅拌6小时，进行交联活化。然后用5倍树脂体积的纯水洗涤2次，再用4倍体积pH8.0 25mmol磷酸洗涤2次，过滤收集活化好的树脂，备用。

在备用的树脂上加入5倍体积的酶液，20℃以下，缓慢搅拌过夜。离心收集树脂。取5倍体积pH8.0 25mmol磷酸缓冲溶解15g L-丙氨酸，加入上一步骤的树脂，搅拌1小时。离心收集树脂，用3倍树脂体积的pH8.0 25mmol磷酸缓冲洗涤2次。离心收集树脂，得固定化酶约98g，4℃保藏。

将上述得到的固定化酶用于底物催化反应。将1g底物溶解于40ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，随后加入800mg葡萄糖，待搅拌溶解后加入5mg NADP+、2.5gGDH湿菌体，加入10g固定化酶，并加入10ml磷酸缓冲将体积补充到50ml。反应液置于40℃恒温水浴锅中，磁力搅拌反应。反应10mim后取样，进行HPLC检测，底物转化率达到12％，产物ee值>99％。

转化率定义为产品峰/(产品峰+底物峰)*100％的数值，酶活定义为40度下每min每g固定化细胞反应生成产物的微摩尔数。计算过程如下：酶活＝转化率*(1/221)*1000000/10/10。本次10min后的转化率为12％，则酶活＝12％*(1/221)*1000000/10/10＝5.4U/min/g。

实施例1原核表达体系的构建

酮还原酶Rr Kred基因片段由金斯瑞生物科技有限公司合成，并重组到pET21a载体上。将阳性重组质粒Rr Kred-pET21a(+)转化表达宿主菌BL21(DE3)(购自天根生化科技(北京)有限公司)，得到原核表达菌株Rr Kred-pET21a(+)/BL21(DE3)，作为后续催化反应原代菌株。

用于辅酶再生的葡萄糖脱氢酶(BsGDH)(LOC111893255)和醇脱氢酶(TbADH)(LOC101068320)基因由金斯瑞生物科技有限公司合成，后续重组表达质粒的构建同RrKred-pET21a(+)质粒的构建，转入BL21(DE3)中后分别得到BsGDH-pET21a(+)/BL21(DE3)、TbADH-pET21a(+)/BL21(DE3)表达菌株。

实施例2酶的发酵制备

上述构建的表达菌株Rr Kred-pET21a(+)/BL21(DE3)、BsGDH-pET21a(+)/BL21(DE3)、TbADH-pET21a(+)/BL21(DE3)在加有终浓度为100ug/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基【10g/l胰蛋白胨(OXIOD)，5g/l酵母粉(OXIOD)，10g/l氯化钠(国药试剂)】中于37℃、200rpm振荡培养过夜后，按1％(V/V)比例接种于含有终浓度为100ug/ml氨苄青霉素的500ml LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养。待OD600在0.8-1.0之间时，加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，IPTG)，并在25℃诱导过夜。菌体在8000rpm条件下离心收集，备用。取一部分菌体，以1g湿菌体对应4g磷酸缓冲液的比例，悬浮于50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，超声破碎(200W，3s/5s，10min)，4℃、12000rpm离心20min，取上清备用。

实施例3酶的催化活性检测

将上述得到的酶液用于底物催化反应。将1g底物溶解于40ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，随后加入800mg葡萄糖，待搅拌溶解后加入5mg NADP+、2.5gGDH湿菌体，加入10ml酶上清液将体积补充到50ml。反应液置于40℃恒温水浴锅中，磁力搅拌反应。反应10mim后取样，进行HPLC检测，底物转化率达到30％，产物ee值>99％。

转化率定义为产品峰/(产品峰+底物峰)*100％的数值，酶活定义为40度下每min每ml酶液反应生成产物的微摩尔数。计算过程如下：酶活＝转化率*(1/221)*1000000/10/10。本次10min后的转化率为30％，则酶活＝30％*(1/221)*1000000/10/10＝13.6U/min/ml。

实施例4固定化Rr Kred细胞的生物催化

将1g底物原料化合物II溶解于160ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.02g NADP+，加入10g上述制备的固定化细胞，并用缓冲液将体积补充到200mL。反应液置于40℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应过程中每隔2h用0.1M NaOH将pH调节到7.0左右，反应24h后进行HPLC和SFC检测。

HPLC结果请见图1，SFC结果请见图2。

经过计算，得出底物转化率>98％,ee值>99％。

实施例5固定化Rr Kred细胞的生物催化

将1g底物原料化合物II溶解于160ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.02g NADP+，32g葡萄糖、0.4g GDH冻干粉，加入10g上述制备的固定化细胞，并用缓冲液将体积补充到200mL。反应液置于40℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应过程中每隔2h用0.1M NaOH将pH调节到7.0左右，反应24h后进行HPLC和SFC检测。

HPLC结果请见图3，SFC结果请见图4。

经过计算，得出底物转化率>99％,ee值>99％。

实施例6固定化酶Rr Kred的生物催化

将1g底物原料化合物I溶解于160ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.02g NADP+，加入10g上述用树脂交联制备的固定化酶，并用缓冲液将体积补充到200mL。反应液置于40℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应过程中每隔2h用0.1M NaOH将pH调节到7.0左右，反应24h后进行HPLC和SFC检测。

HPLC结果请见图5，SFC结果请见图6。

经过计算，得出底物转化率>98％,ee值>99％。

实施例7固定化酶Rr Kred的生物催化

将1g底物原料化合物I溶解于800ml含有20％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.02g NADP+，32g葡萄糖、0.4g GDH冻干粉，加入10g上述用树脂交联制备的固定化酶，并用缓冲液将体积补充到200mL。反应液置于40℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应过程中每隔2h用0.1M NaOH将pH调节到7.0左右，反应24h后进行HPLC和SFC检测。

HPLC结果请见图7，SFC结果请见图8。

经过计算，得出底物转化率>99％,ee值>99％。

实施例8固定化Rr Kred细胞的生物催化

将2g底物原料化合物II溶解于160ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.02g NADP+，加入10g上述制备的固定化细胞，并用缓冲液将体积补充到200mL。反应液置于40℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应过程中每隔2h用0.1M NaOH将pH调节到7.0左右，反应24h后进行HPLC和SFC检测。

HPLC结果请见图9，SFC结果请见图10。

经过计算，得出底物转化率>95％,ee值>99％。

实施例9固定化Rr Kred细胞的生物催化

将2g底物原料化合物II溶解于160ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.02g NADP+，32g葡萄糖、0.4g GDH冻干粉，加入10g上述制备的固定化细胞，并用缓冲液将体积补充到200mL。反应过程中每隔2h用0.1M NaOH将pH调节到7.0左右，反应液置于40℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行HPLC和SFC检测。

HPLC结果请见图11，SFC结果请见图12。

经过计算，得出底物转化率>96％,ee值>99％。

实施例10固定化酶Rr Kred的生物催化

将2g底物原料化合物I溶解于160ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.02g NADP+，加入10g上述用树脂交联制备的固定化酶，并用缓冲液将体积补充到200mL。反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应过程中每隔2h用0.1M NaOH将pH调节到7.0左右，反应24h后进行HPLC和SFC检测。

HPLC结果请见图13，SFC结果请见图14。

经过计算，得出底物转化率>90％,ee值>99％。

实施例11固定化酶Rr Kred的生物催化

将2g底物原料化合物II溶解于160ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.02g NADP+，加入10g上述用树脂交联制备的固定化酶，并用缓冲液将体积补充到200mL。反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应过程中每隔2h用0.1M NaOH将pH调节到7.0左右，反应24h后进行HPLC和SFC检测。

HPLC结果请见图15，SFC结果请见图16。

经过计算，得出底物转化率>90％,ee值>99％。

实施例12固定化Rr Kred细胞的生物催化

将4g底物原料化合物II溶解于160ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.02g NADP+，32g葡萄糖、0.4g GDH冻干粉，加入10g上述制备的固定化细胞，并用缓冲液将体积补充到200mL。反应过程中每隔2h用0.1M NaOH将pH调节到7.0左右，反应液置于40℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行HPLC和SFC检测。

HPLC结果请见图17，SFC结果请见图18。

经过计算，得出底物转化率>85％,ee值>99％。

实施例13固定化Rr Kred细胞的生物催化

将4g底物原料化合物I溶解于160ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.02g NADP+，32g葡萄糖、0.4g GDH冻干粉，加入10g上述制备的固定化细胞，并用缓冲液将体积补充到200mL。反应过程中每隔2h用0.1M NaOH将pH调节到7.0左右，反应液置于40℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行HPLC和SFC检测。

HPLC结果请见图19，SFC结果请见图20。

经过计算，得出底物转化率>86％,ee值>99％。

实施例14固定化Rr Kred细胞生物催化的反复使用

将1g底物原料化合物II溶解于160ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.02g NADP+，32g葡萄糖、0.4g GDH冻干粉，加入10g上述制备的固定化细胞，并用缓冲液将体积补充到200mL。反应过程中每隔2h用0.1M NaOH将pH调节到7.0左右，反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行HPLC和SFC检测。

HPLC结果请见图21，SFC结果请见图22。

经过计算，得出底物转化率>98％,ee值>99％。

将上述反应液过滤后取得固定化Rr Kred细胞的沉淀，将这些沉淀细胞再次投入上述体系反复再使用7次。

每次反应24h后进行HPLC和SFC检测。

第7次HPLC结果请见图23，SFC结果请见图24。

经过计算得出：收率为84％。所有产品测得的ee值>99％。

实施例15固定化Rr Kred细胞生物催化的反复使用

将1g底物原料化合物I溶解于160ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.02g NADP+，32g葡萄糖、0.4g GDH冻干粉，加入10g上述制备的固定化细胞，并用缓冲液将体积补充到200mL。反应过程中每隔2h用0.1M NaOH将pH调节到7.0左右，反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行HPLC和SFC检测。

HPLC结果请见图25，SFC结果请见图26。

经过计算，得出底物转化率>99％,ee值>99％。

每次反应24h后进行HPLC和SFC检测。

第7次HPLC结果请见图27，SFC结果请见图28。

经过计算得出：收率为85％。所有产品测得的ee值>99％。

实施例16固定化酶Rr Kred的生物催化的反复使用

将1g底物原料化合物II溶解于160ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.02g NADP+，32g葡萄糖、0.4g GDH冻干粉，加入10g上述制备的固定化酶，并用缓冲液将体积补充到200mL。反应过程中每隔2h用0.1M NaOH将pH调节到7.0左右，反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行HPLC和SFC检测。

HPLC结果请见图29，SFC结果请见图30。

经过计算，得出底物转化率>95％,ee值>99％。

将上述反应液过滤后取得固定化酶的沉淀，将这些沉淀再次投入上述体系反复再使用6次。

每次反应24h后进行HPLC和SFC检测。

第6次HPLC结果请见图31，SFC结果请见图32。

经过计算得出：收率依次为80％。所有产品测得的ee值>99％。

序列表

<110> 南京趣酶生物科技有限公司

上海仁酶生物科技有限公司

<120> 固定化酮还原酶突变体及其在制备度洛西汀手性醇中间体及其类似物中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 345

<212> PRT

<213> 赤红球菌(Rhodococcus ruber)

<400> 1

Met Lys Ala Val Gln Tyr Thr Glu Ile Gly Ser Glu Pro Val Val Val

1 5 10 15

Asp Ile Pro Thr Pro Thr Pro Gly Pro Gly Glu Ile Leu Leu Lys Val

20 25 30

Thr Ala Ala Gly Leu Cys His Ser Asp Ile Phe Val Met Asp Met Pro

35 40 45

Ala Ala Gln Tyr Ala Tyr Gly Leu Pro Leu Thr Leu Gly His Glu Gly

50 55 60

Val Gly Thr Val Ala Glu Leu Gly Glu Gly Val Thr Gly Phe Gly Val

65 70 75 80

Gly Asp Ala Val Ala Val Tyr Gly Pro Trp Gly Cys Gly Ala Cys His

85 90 95

Ala Cys Ala Arg Gly Arg Glu Asn Tyr Cys Thr Arg Ala Ala Asp Leu

100 105 110

Gly Ile Thr Pro Pro Gly Leu Gly Ser Pro Gly Ser Met Ala Glu Tyr

115 120 125

Met Ile Val Asp Ser Ala Arg His Leu Val Pro Ile Gly Asp Leu Asp

130 135 140

Pro Val Ala Ala Ala Pro Leu Thr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Tyr His

145 150 155 160

Ala Ile Ser Arg Val Leu Pro Leu Leu Gly Pro Gly Ser Thr Ala Val

165 170 175

Val Ile Gly Val Gly Gly Leu Gly His Val Gly Ile Gln Ile Leu Arg

180 185 190

Ala Val Ser Ala Ala Arg Val Ile Ala Val Asp Leu Asp Asp Asp Arg

195 200 205

Leu Ala Leu Ala Arg Glu Val Gly Ala Asp Ala Ala Val Lys Ser Gly

210 215 220

Ala Gly Ala Ala Asp Ala Ile Arg Glu Leu Thr Gly Gly Gln Gly Ala

225 230 235 240

Thr Ala Val Phe Asp Phe Val Gly Ala Gln Ser Thr Ile Asp Thr Ala

245 250 255

Gln Gln Val Val Ala Val Asp Gly His Ile Ser Val Val Gly Ile His

260 265 270

Ala Gly Ala His Ala Lys Val Gly Phe Phe Met Ile Pro Phe Gly Ala

275 280 285

Ser Val Val Thr Pro Tyr Trp Gly Thr Arg Ser Glu Leu Met Glu Val

290 295 300

Val Ala Leu Ala Arg Ala Gly Arg Leu Asp Ile His Thr Glu Thr Phe

305 310 315 320

Thr Leu Asp Glu Gly Pro Ala Ala Tyr Arg Arg Leu Arg Glu Gly Ser

325 330 335

Ile Arg Gly Arg Gly Val Val Val Pro

340 345

<210> 2

<211> 1038

<212> DNA

<213> 赤红球菌(Rhodococcus ruber)

<400> 2

atgaaagcgg tgcagtatac ggaaattggt tcagaaccgg tggttgtcga tatcccgacc 60

ccgacgccgg gtccgggtga aattctgctg aaagtgaccg cggccggcct gtgtcattcg 120

gacatctttg ttatggatat gccggcagct caatatgcat acggtctgcc gctgacgctg 180

ggtcacgagg gtgtgggtac cgttgcggaa ctgggcgaag gtgtgaccgg cttcggtgtt 240

ggcgatgccg ttgcagtcta tggtccgtgg ggttgcggtg catgtcatgc ttgcgcacgt 300

ggtcgcgaaa actactgcac gcgtgcggcc gatctgggta ttaccccgcc gggtctgggt 360

agcccgggtt ctatggccga atatatgatt gtggacagtg cacgccatct ggttccgatc 420

ggtgacctgg atccggtggc agctgcaccg ctgacggatg ctggtctgac cccgtaccac 480

gcgattagtc gtgttctgcc gctgctgggt ccgggttcca ccgcagtggt tatcggtgtc 540

ggcggtctgg gtcacgtggg cattcagatc ctgcgtgctg tgagtgccgc acgcgtcatt 600

gccgtggatc tggatgacga tcgtctggca ctggcacgtg aagttggtgc agatgctgcg 660

gtcaaatccg gtgctggtgc agcagacgca attcgtgaac tgacgggcgg tcagggtgct 720

accgcggttt ttgacttcgt cggcgcacaa agcacgatcg ataccgccca gcaagtcgtg 780

gcagtggacg gtcatatttc tgttgtcggt atccatgccg gcgcacacgc taaagttggc 840

tttttcatga tcccgtttgg cgcgtcagtg gttacgccgt attggggtac ccgttcggaa 900

ctgatggaag tcgtggcact ggcacgtgca ggtcgtctgg atattcacac cgaaacgttc 960

accctggacg aaggtccggc tgcataccgt cgtctgcgtg aaggttctat ccgtggtcgc 1020

ggcgttgtcg tgccgtaa 1038

Claims

1.一种制备S-构型度洛西汀手性醇中间体及其类似物的方法，其特征在于，所述的方法利用固定化酮还原酶突变体作为催化剂，

所述的固定化酮还原酶突变体为酮还原酶突变体的固定化细胞或固定化酶，固定化酶是所述的突变体固定化于固相支撑物上；固定化细胞是所述的酮还原酶突变体表达于固定化于固相支撑物上的微生物细胞中；

所述的酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码所述的酮还原酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述制备方法如下：在辅酶再生体系的存在下，固定化酮还原酶突变体催化剂催化度洛西汀手性酮基中间体及其类似物与度洛西汀手性醇基中间体及其类似物之间发生立体特异性平衡反应，反应式如下：

所述的方法，包括下列方法的任意一种：

(a)采用异丙醇和Im-Rr Kred进行反应，反应路线如下：

其中，固定化细胞或固定化酶的用量在10-20g/200ml，缓冲液浓度在50-200mM，缓冲液pH值在6.0-8.5之间，辅酶浓度为0.01-0.05g/200ml之间，底物浓度在1-4g/200ml之间，辅酶再生底物浓度根据底物浓度进行调整。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固定化细胞的方法为采用壳聚糖对含酶细胞和戊二醛溶液进行交联，用无水碳酸钠进行制粒，过滤后得到固定化细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固定化酶采用戊二醛交联活化后的树脂，加入酶液连接到树脂上，最后用丙氨酸封闭树脂上的活性位点，获得固定在树脂上的酶。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应的温度为35-40℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应的pH为7-11。