CN110423741B - 羰基还原酶-辅酶nadp+共固定化酶及其制备与应用 - Google Patents

羰基还原酶-辅酶nadp+共固定化酶及其制备与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110423741B
CN110423741B CN201910642229.8A CN201910642229A CN110423741B CN 110423741 B CN110423741 B CN 110423741B CN 201910642229 A CN201910642229 A CN 201910642229A CN 110423741 B CN110423741 B CN 110423741B
Authority
CN
China
Prior art keywords
carbonyl reductase
amino resin
enzyme
immobilized
buffer solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910642229.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110423741A (zh
Inventor
柳志强
张晓健
郑裕国
王文重
吴迪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University of Technology ZJUT
Original Assignee
Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University of Technology ZJUT filed Critical Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority to CN201910642229.8A priority Critical patent/CN110423741B/zh
Publication of CN110423741A publication Critical patent/CN110423741A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110423741B publication Critical patent/CN110423741B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/002—Nitriles (-CN)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01184—Carbonyl reductase (NADPH) (1.1.1.184)

Abstract

本发明涉及一种羰基还原酶‑辅酶NADP+共固定化酶及其在不对称催化他汀类药物中间体(3R,5S)‑6‑氯‑3,5‑二羟基己酸叔丁酯合成中的应用。本发明的作用机理为：氨基树脂被戊二醛活化，使其表面带有醛基的功能基团，羰基还原酶与辅酶进一步分别于其表面的醛基共价结合。本发明采用SCR‑NADP+@LX‑1000HAA为催化剂，稳定性好，使用寿命长，有机溶剂耐受性好，可多次重复利用，并且反应过程中无需外源添加昂贵的辅酶，大幅度降低生产成本。本方法工艺简单，成本低廉，产品产率与纯度高，在他汀手性中间体的工业化生产中具有极高应用价值。

Description

羰基还原酶-辅酶NADP+共固定化酶及其制备与应用
(一)技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种羰基还原酶-辅酶NADP+共固定化酶及其在不对称催化他汀类药物中间体(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯合成中的应用。
(二)背景技术
他汀类药物是国内外治疗各种类型高胆固醇血症的首选药物，常用于心血管疾病和动脉粥样硬化的预防。他汀类药物是一类3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A (HMG-CoA)还原酶抑制剂，作为一种治疗血脂异常常用的药物，有着极高的市场价值。(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯是一种可用于合成包括瑞舒伐他汀钙、阿托伐他汀钙与匹伐他汀钙在内的他汀类药物的重要手性中间体。
目前工业上生产(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯主要以手性恶唑硼烷为催化剂，不对称加氢还原生成(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯，反应能耗大，对反应器要求高，催化剂价格昂贵，且产物立体选择性低，分离纯化过程复杂，综合收率低，限制了该方法的大规模应用。
生物酶法不对称合成具有高立体选择性的(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯，具有高对映体选择和高区域选择性、反应条件相对温和的优点。羰基还原酶(CarbonylReductase)属于短链脱氢酶家族，能够有效催化羰基不对称还原生成手性醇，被广泛应用于合成具有生理、药理活性的手性醇类药物，是合成手性药物中间体的重要生物催化剂。Sun等通过对酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2233进行固定化，增加生物酶的使用率，56g/L的固定化细胞转化 50g/L的(S)-CHOH，转化率为100.0％，d.e.值>99.0％，且在使用15批次后，固定化细胞仍能保持一半以上酶活，大大的节约了生产成本。浙江工业大学Liu 等利用自主开发的重组羰基还原酶SCR作为生物催化剂，以异丙醇为辅底物，不对称还原(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯合成(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯，30℃，pH 7.0的磷酸钾盐缓冲液下，底物浓度400g/L，产物产率 97.5％，d.e.值达到99％。在无外源辅酶添加的情况下，产物浓度达到了393g/L，单位菌体时空产率达到13.7mM/h/g DCW。南京郎恩公司采用双酶一锅法从(S) -6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯，底物浓度120g/L，产率98.3％，e.e.>99％。
采用游离细胞或者酶作为催化剂，游离细胞或者酶的稳定性较差，易变性失活；细胞或者酶只能一次性使用，增加了酶制剂成本与废水、废渣排放；酶与底物和产物的混合加大了产物的分离纯化的难度，影响产品收率，增加生产成本。采用辅酶共固定化酶技术可以有效地克服以上问题，实现辅酶的循环利用，降低酶制剂成本，提高产品产率，为推动手性(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的绿色生物合成技术走向产业应用。彭益强等对SiO2纳米粒子用活化醇盐水解法制备，将羰基还原酶(CR)和甲酸脱氢酶(FDH)双酶进行共固定化，催化羟基苯乙酮制备(R)-苯基乙二醇，产物浓度为35.6g/L，可连续进行12批次反应。Petkova等将二氧化硅纳米颗粒表面的功能基团进行化学修饰，使其携带有氨基、环氧基、巯基等功能基团，然后将乙醇脱氢酶(HLADH)和酮还原酶(KRED 117)与辅酶进行共固定化，催化对甲氧基苯基丙酮的不对称还原反应，但是催化底物浓度较低，底物浓度只有6mM。Benitez-Mateos AI等人将酮还原酶(KRED) 和NADPH共固定化在多孔琼脂糖珠上，具有较高的活性和稳定性，共固定化酶能够不对称还原了11种羰基化合物，在单批次反应中产物产率达到100％，e.e. 值为99.0％，时空产率为97-112g/L/day，然后将该催化剂运用到微型填充柱中，在不外源添加NADPH的间歇反应器中，能够反应5批次。
目前国内外在共固定化酶催化他列汀药物手性中间体合成领域研究较少，相关研究存在着总酶活回收率低、固定化酶制备成本高、催化活力不理想、稳定性差、底物浓度不高、有机溶剂耐受性差等问题，严重限制了固定化生物催化剂在他汀药物关键中间体的生产中的应用。
(三)专利内容
本发明目的是提供一种羰基还原酶-辅酶NADP+共固定化酶，以及该固定化酶在制备他汀类药物手性中间体(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用。本发明方法主要使用共价结合技术，可实现羰基还原酶的高效制备，在水-有机相反应体系得到固定化酶酶活回收率高，稳定性好，有机溶剂耐受性好。将所得固定化酶应用于反应体系中，催化(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯合成，提高底物浓度、时空转化率等主要指标。
本发明采用的技术方案是：
一种羰基还原酶-辅酶NADP+共固定化酶，其特征在于所述共固定化酶由按下方法制备获得：
(1)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列转化到宿主菌大肠杆菌中，得到基因工程菌经发酵培养，获得湿菌体悬浮于的pH 6.9～7.1缓冲液中得到菌悬液，菌悬液经细胞破碎(超声破碎，功率240W，破碎1s暂停1s)、离心，得到羰基还原酶粗酶液；
(2)氨基树脂加入pH7.8～8.2的磷酸缓冲液，置于25～30℃摇床15～20min，维持pH7.8～8.2，1h后过滤抽干，加入至2～3％的戊二醛磷酸缓冲溶液中，25～30℃摇床60～80min，过滤，去离子水洗涤，得到处理后的氨基树脂；
(3)粗酶液中加入步骤(2)预处理后的氨基树脂，氨基树脂添加量为 15～100g/100L粗酶液；
(4)在20～30℃、200～300rpm条件下水浴搅拌固定化6～8h，再加入辅酶 NADP+固定化10～12h，抽滤，滤饼用pH 7.0磷酸钾盐缓冲液清洗两次，抽滤去除缓冲液，即得所述羰基还原酶-辅酶NADP+共固定化酶。
所述基因工程菌是由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列(编码蛋白氨基酸序列为SEQID NO.2所示)以大肠杆菌为宿主菌构建而成。
所述氨基树脂为下列之一：LX-1000NH，LX-1000EPHA，LX-1000EPH， LX-1000HAA，LX-1000HA(A)，ESR-3，LX-HFA，优选为LX-1000HAA。
步骤(1)粗酶液可按如下方法制得：将羰基还原酶基因工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃、200rpm下培养8h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃、150rpm下培养至菌体OD600达0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养10h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集湿菌体；取1g湿菌体，悬浮于10mL pH7.0、100mM磷酸钾盐缓冲液中，在冰浴中超声破碎或者使用高压匀浆机进行细泡破碎，破碎液离心，取上清液即为粗酶液。
本发明还涉及制备所述的羰基还原酶-辅酶NADP+共固定化酶的方法，所述方法如下：
(1)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列转化到宿主菌大肠杆菌中，得到基因工程菌经发酵培养，获得湿菌体悬浮于的pH 6.9～7.1缓冲液中得到菌悬液，菌悬液经细胞破碎、离心，得到羰基还原酶粗酶液；
(2)氨基树脂加入pH7.8～8.2的磷酸缓冲液，置于25～30℃摇床15～20min，维持pH7.8～8.2，1h后过滤抽干，加入至2～3％的戊二醛磷酸缓冲溶液中，25～30℃摇床60～80min，过滤，去离子水洗涤，得到处理后的氨基树脂；所述氨基树脂为下列之一：LX-1000NH，LX-1000EPHA， LX-1000EPH，LX-1000HAA，LX-1000HA(A)，ESR-3，LX-HFA；
(3)粗酶液中加入步骤(2)预处理后的氨基树脂，氨基树脂添加量为 15～100g/100L粗酶液；
在20～30℃、200～300rpm条件下水浴搅拌固定化6～8h，再加入辅酶NADP+固定化10～12h，抽滤，滤饼用pH 7.0磷酸钾盐缓冲液清洗两次，抽滤去除缓冲液，即得所述羰基还原酶-辅酶NADP+共固定化酶。
本发明还涉及所述的羰基还原酶-辅酶NADP+共固定化酶在不对称还原制备 (3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用。
具体所述应用为：所述应用为：以羰基还原酶基因工程菌共固定化酶为催化剂，加入以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以异丙醇为辅底物，以 pH值为7.0的磷酸钾缓冲液(优选pH 7.0、100mM磷酸钾缓冲液)或正己烷为反应介质构成反应体系(以pH7.0的缓冲液为反应介质构成水-有机相反应体系，或以正己烷为反应介质构成均一有机相反应体系)，在15～65℃、200～800rpm条件(优选30℃、600rpm)下反应18～24h，反应完全后，将混合液抽滤回收固定化酶，滤液分离纯化，得到所述(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。
进一步，所述催化剂用量为以湿菌体记为15-100g/L(优选60g/L)反应体系，异丙醇体积用量为10-80％(优选40％)，底物终浓度200g/L反应体系。
所述滤液分离纯化方法可为下列之一：(1)当反应介质为磷酸钾缓冲液时，则将混合液抽滤回收固定化酶，滤液先旋蒸至无液体流出，获得浓缩物，将浓缩物用乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥、过滤获得滤液，将滤液旋蒸至无液体流出，干燥，获得(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯；(2) 当反应介质为正己烷时，则将混合液抽滤回收固定化酶，滤液用无水硫酸钠干燥、过滤，获得滤液，将滤液旋蒸至无液体流出，干燥，获得(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。
所述底物为(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯时，其反应式见图1所示，具体地，所述的反应为：以羰基还原酶基因工程菌固定化酶为催化剂，以(S) -6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(式II)为底物，以异丙醇为辅助底物，以磷酸钾盐缓冲液(优选pH 7.0、100mM磷酸钾缓冲液)或正己烷为反应介质构成反应体系，在30℃、600rpm条件下反应完全后，获得含(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯(式II)的混合液，将混合液抽滤回收固定化酶，滤液分离纯化，即为产物(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯；所述生物催化剂用量以湿菌体记为15-100g/L反应体系，异丙醇体积用量为10-80％(优选40％)，底物终浓度50-200g/L反应体系。
水-有机相催化体系(10mL)组成及催化条件如下：4mL异丙醇，6mL Ph7.0 100mM磷酸钾缓冲溶液，固定化酶制剂2g(等同于游离细胞的60g/L)，2g底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯；30℃，600r/min水浴条件下反应30min，取样检测酶活。同样条件下，以游离酶作为对照。
均一有机相催化体系(10mL)组成及催化条件：4mL异丙醇，6mL正己烷，固定化酶制剂2g(等同于游离细胞的60g/L)，2g底物(S)-6-氯-5-羟基-3- 羰基己酸叔丁酯；30℃，600rpm水浴条件下反应30min，取样检测酶活。同样条件下，以游离酶作为对照。
样品处理：取样100μL，加入900μL 30％乙腈混匀终止反应，之后再取200μL 混合液加800μL30％乙腈处理稀释5倍，10000rpm离心3min后取上清液过有机膜。
固定化酶酶活的定义：在30℃、600rpm条件下，以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物催化反应30min，每分钟内催化生成1μmol产物(3R,5S) -6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
本发明中产物的检测方法：液相色谱柱：ZORBAX SB-C8，4.6×150mm， 5-Micron，流动相：30％乙腈，流速：1.0mL/min，柱温：40℃，保留时间：产物 (3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯：7.0min；底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯：11.7min，检测波长：210nm。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种羰基还原酶-辅酶NADP+共固定化酶，所得共固定化酶总酶活回收>77％。以共固定化羰基还原酶做为生物催化剂进行(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物催化制备，底物浓度 200g/L，反应16h，产物得率均在98％以上，e.e.＞99％，d.e.＞99.5％。将固定化酶回收利用，重复反应10批次，酶活任然保留初始酶活的62％以上，各批次底物转化率均大于95％。本发明反应过程无需外源辅酶添加，产品产率与纯度高，在他汀类药物手性中间体的工业化生产中具有极高应用价值。且本发明开发了新型有机相生物催化制备他汀药物关键中间体技术，可简化工艺步骤，减少“三废”排放。
(四)附图说明
图1为(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯合成方程式。
图2为表达质粒pET28b-SCR图谱。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：羰基还原酶基因工程菌细胞的培养
(1)羰基还原酶基因工程菌的构建：根据基因序列SEQ ID NO.1(编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示)设计引物1 (CCGCATATGACTGATCGTTTAAAAG)、引物2(TTGCTCGAGTTATTGAGCAGTGTATCC)，并分别在引物1和引物2中引入了Nde I和Xho I限制性酶切位点(下划线标记)。以拟布氏乳杆菌(Lactobacillus parabuchneri)菌基因组DNA为模板，在引物1和引物2的引发下，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，获羰基还原酶SCR基因序列，测序后利用 Nde I和Xho I限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并利用T4 DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的商业化载体pET28b(Invitrogen)进行连接，构建表达载体pET28b-SCR(Liu Z-Q,et al.Biotechnology Progress,2017,DOI 10.1002/btpr.2460.)(图2)。将构建的表达载体pET28b-SCR 转化至大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen)中(42℃，90s)，涂布于含有50μg/mL 卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，筛选获得含有表达重组质粒pET28b-SCR的重组大肠杆菌BL21(DE3) /pET28b-SCR。
(2)将羰基还原酶基因工程菌BL21(DE3)/pET28b-SCR接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养8h，再以 1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM 的IPTG，28℃下诱导培养10h后，4℃、8,000rpm离心10min，弃去上清液，收集沉淀，即获得羰基还原酶基因工程菌湿菌体。
(3)取1g湿菌体，悬浮于10mL磷酸盐缓冲液中(pH＝7.0,100mM)，在冰浴中超声破碎20min，功率240W，破1S停1S，或者使用高压匀浆机进行细泡破碎，压力为30MPa，破碎后将上述破碎液于4℃，12,000rpm条件下离心 10min，取上清液即为粗酶液。该酶液可直接作为生物催化剂或者用于固定化。
实施例2：(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯与(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的液相检测方法及固定化羰基还原酶的活力测定：液相色谱仪器： Shimadzu LC-20AD系统-SPD-20紫外检测器。
检测转化率的液相色谱柱为ZORBAX SB-C8(4.6×150mm，5-Micron)，流动相：30％乙腈，流速1.0mL/min，检测波长210nm，柱温：40℃。保留时间：产物((3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯)：9.67min；底物(S)-6-氯-5-羟基 -3-羰基己酸叔丁酯：6.35min。
以实施例5方法得到的固定化酶用于催化底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，催化体系(10mL)组成及催化条件如下：4mL辅底物异丙醇，6mL磷酸钾盐缓冲液(优选100mM、pH 7.0)，2g固定化酶制剂(相当于湿菌体60g/L)， 2g底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(终浓度200g/L)。30℃，600rpm 条件下反应30min，取样检测酶活。同样条件下，以羰基还原酶粗酶液作为对照。
酶活单位(U)定义为：在30℃、600rpm、pH 7.0条件下，1min内生成1 μmol产物(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯所需的酶量定义为1U。(3R,5S) -6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生成量采用高效液相色谱在210nm下测定。根据体系中(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生成量计算固定化羰基还原酶的酶活。
样品处理：取样100μL，加入900μL 30％乙腈混匀终止反应，之后再取200μL 混合液加800μL 30％乙腈处理稀释5倍，10000rpm离心3min后取上清液过有机膜。
实施例3：固定化载体树脂材料的筛选
用蒸馏水配制pH 7.0的磷酸钾盐(K2HPO4-KH2PO4)缓冲液(摩尔浓度为 100mM)，称取30mL若干组实施例1方法制备的羰基还原酶粗酶液。分别准确称取10g(干重)LX-1000NH，LX-1000EPHA，LX-1000EPH，LX-1000HAA， LX-1000HA，LX-1000HA(A)，ESR-3，LX-EP，LX-EP200，LX-EPF，LX-HFA， D5587，D5730，ES103B,8806M，8806F，HZ816，HZ830，HPD-722，HP-70， S-8，NKA-9，X-5，AB-8，A502，D201，D284，D301，D296，201*7，D262，D280树脂添加到30mL粗酶液中进行混合，在室温(25℃)，低速水浴搅拌浆搅拌吸附18h，固定化结束；抽滤除去上清液，所得滤饼用于水-有机溶剂两相反应的固定化酶则直接用100mM pH7.0磷酸钾缓冲溶液浸洗3-5次，抽滤除去多余水份后，获得固定化羰基还原酶。计算固定化效率，采用实施例2方法测定酶活，以游离酶活性为100％，结果见表1所示，所得优选载体树脂为LX-1000HAA氨基树脂。
表1：不同载体的酶活及酶活回收率
Figure BDA0002132272490000091
Figure BDA0002132272490000101
实施例4：载体树脂活化
(1)配制0.1M pH8.0的缓冲溶液配制(1L)：1L去离子水加入，KH2PO423.8g，K2HPO42.75g，定容到1000mL，调节pH至7.8-8.2；配制2％的戊二醛磷酸缓冲溶液(1L)：40mL戊二醛(50％)，加入960mLH2O，K2HPO44.76g，溶解后用KH2PO4调节pH至7.8-8.2。
(2)将10g载体LX-1000HAA(购于西安蓝晓科技新材料股份有限公司)加入 100mL，0.1M pH8.0的缓冲液，控温25℃摇床慢摇15min后，测pH，维持pH7.8-8.2，1h后过滤抽干，然后再将前面的10g载体，加入50mL 2％的戊二醛磷酸缓冲液，控温25℃摇床慢摇1h，过滤，用去离子水洗涤载体至水清。
实施例5：羰基还原酶的固定化
用蒸馏水配制pH 7.0的磷酸钠盐(K2HPO4-KH2PO4)缓冲液(摩尔浓度为100mM)，称取30mL实施例1方法制备的羰基还原酶粗酶液加入到70mL、pH 7.0、100mM磷酸钾盐缓冲液中，得到混合液100mL。准确称取10g(干重) 实施例4预处理后的LX-1000HAA载体树脂添加到100mL混合液中进行混合，在室温(25℃)，低速水浴搅拌浆搅拌吸附6h后，再加入终浓度为3mM的辅酶 NADP+，继续固定化12h，固定化结束；抽滤除去上清液，所得滤饼用100mMPh7.0 磷酸钾缓冲溶液清洗两次，用于均一有机相反应的固定化酶用正己烷浸洗3-5次，抽滤除去多余水分，自然挥发正己烷后，获得固定化羰基还原酶，置4℃冰箱保存备用。
实施例6：羰基还原酶固定化温度优化
分别取60mL实施例1方法制备的羰基还原酶粗酶液到120mL磷酸钾盐缓冲液(100mM、pH 7.0)中，再加入20g实施例1预处理后的载体树脂混合，在15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃， 600rpm条件下，水浴磁力搅拌吸附6h后，再加入终浓度为3mM的NADP+，继续固定化12h，固定化结束；抽滤，除去上清液，所得滤饼用100mMpH7.0 磷酸钾缓冲溶液清洗两次，用于均一有机相反应的固定化酶则用正己烷浸洗3-5次，抽滤除去多余水份，自然挥发正己烷后，获得不同吸附温度下的固定化羰基还原酶。采用实施例2方法测定产物产率以及相对酶活。结果见表2所示，羰基还原酶固定化最适温度为30℃。以最适条件下游离酶酶活为100％。
表2：羰基还原酶固定化温度对产物产率和相对酶活影响
Figure BDA0002132272490000111
Figure BDA0002132272490000121
实施例7：羰基还原酶固定化pH优化
分别取60mL实施例1方法制备的羰基还原酶粗酶液到120mL浓度为100 mM磷酸钾盐缓冲液，调pH为4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0， 8.5，9.0中，再加入20g实施例1预处理后的载体树脂混合，在30℃，600rpm 条件下，水浴磁力搅拌吸附6h后，再加入终浓度为3mM的NADP+，继续固定化12h，固定化结束；抽滤，除去上清液，所得滤饼用蒸馏水清洗两次，用于微水相反应的固定化酶则直接使用正己烷浸洗3-5次，抽滤除去多余水份，自然蒸发正己烷后，获得不同pH下的固定化羰基还原酶。采用实施例2方法测定产物产率以及相对酶活，结果见表3所示，羰基还原酶固定化最适pH为7.0。以最适条件下游离酶酶活为100％。
表3：羰基还原酶固定化pH对产物产率以及相对酶活影响
Figure BDA0002132272490000122
实施例8：固定化羰基还原酶吸附离子强度的优化
分别取60mL实施例1方法制备的羰基还原酶粗酶液到120mL磷酸钾盐缓冲液(20mM，50mM，100mM，200mM，300mM；pH 7.0)中，再加入20g 实施例1预处理后的载体树脂混合，在30℃，600rpm条件下，水浴磁力搅拌吸附6h后，再加入终浓度为3mM的NADP+，继续固定化12h，固定化结束；抽滤，除去上清液，所得滤饼用蒸馏水清洗两次，用于微水相反应的固定化酶则直接使用正己烷浸洗3-5次，抽滤除去多余水份，自然蒸发正己烷后，获得不同离子强度下的固定化羰基还原酶。采用实施例2方法测定产物产率以及相对酶活。结果见表4所示，固定化羰基还原酶最佳吸附离子强度为100mM。
表4：固定化羰基还原酶吸附离子强度对产物产率的影响
Figure BDA0002132272490000131
实施例9：固定化羰基还原酶的初始酶浓度优化
25℃下，在20mL、100mM、pH7.0磷酸钾盐缓冲液中加入2g的氨基树脂LX-1000HAA，再加入不同体积的粗酶液，使得缓冲液中的初始酶质量浓度达到5，7.5，10，12.5，15，17.5，20，22.5，25mg/g树脂，加入终浓度为3mM 的NADP+，600rpm水浴搅拌18h后固定化结束；抽滤除去上清液，所得滤饼用100mM pH7.0磷酸钾缓冲溶液清洗两次，用于均一有机相反应的固定化酶则使用正己烷浸洗3-5次，抽滤除去多余水份，自然挥发正己烷后，获得固定化羰基还原酶。取一定固定化上清液并测定其蛋白浓度以及SDS-PAGE蛋白电泳，观察并计算固定化缓冲液中残留的酶量，计算固定化效率，采用实施例2方法测定相对酶活，(以游离酶液活性为100％)结果见表5所示，所得优选初始酶浓度为 12.5mg/g树脂。以最适条件下游离酶酶活为100％。
表5：不同酶添加量对固定化酶相对酶活的影响
Figure BDA0002132272490000141
实施例10：共固定化羰基还原酶辅酶浓度优化
将实施例1中获得粗酶液，根据需求分装至透析袋中，以20mM磷酸钾缓冲液为透析液，透析四次，每隔4h-6h更换一次透析液(整个过程均在4℃进行)，得到透析酶液A，将酶液A用DEAE-纤维素阴离子层析柱分离一些杂蛋白和一些有机盐离子，回收活性部分，得到酶液B，再将酶液B用超滤管超滤浓缩，然后分装与透析袋中，用同样方法，再次透析多次，每次取样催化，直至反应无法进行，得到不含辅酶的酶液C，用BCA试剂盒检测蛋白含量。结果如表10所示，终浓度为1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM为浓度梯度进行固定化，得到外源添加辅酶浓度为3mM。结果如表6所示。
表6：共固定化阶段外源添加辅酶终浓度优化
Figure BDA0002132272490000142
Figure BDA0002132272490000151
实施例11：固定化羰基还原酶吸附时间的优化
取60mL实施例1方法制备的羰基还原酶粗酶液到120mL磷酸钾盐缓冲液 (100mM、pH7.0)中，再加入20g实施例1预处理后的载体树脂混合，在25℃， 600rpm条件下，分别在2h，6h，10h，15h，24h，30h，48h之后取出2g树脂抽滤，除去上清液，所得滤饼用100mM pH7.0磷酸钾缓冲溶液清洗两次，用于均一有机相反应的固定化酶则使用正己烷浸洗3-5次，抽滤除去多余水份，自然挥发正己烷后，获得不同吸附时间下的固定化羰基还原酶。采用实施例2方法测定蛋白吸附率及酶活回收。结果见表:7所示，固定化羰基还原酶酶最佳吸附时间为18h。以最适条件下游离酶酶活为100％。
表7：固定化羰基还原酶吸附不同时间对酶活的影响
Figure BDA0002132272490000152
Figure BDA0002132272490000161
实施例12：固定化羰基还原酶吸附缓冲液类型的优化
分别取60mL实施例1方法制备的羰基还原酶粗酶液到120mL柠檬酸钠缓冲液(50mMpH4.0，4.5，5.0，5.5，6.0)，磷酸钾缓冲溶液(100mM pH6.0，6.5， 7.0，7.5，8.0)Tris-HCl缓冲液(100mM 8.0，8.5，9.0)中，再加入20g实施例1预处理后的载体树脂混合，在25℃，600rpm条件下，水浴磁力搅拌吸附 24h后固定化结束；抽滤，除去上清液，所得滤饼用100mMpH7.0磷酸钾缓冲溶液清洗两次，用于均一有机相反应的固定化酶则使用正己烷浸洗3-5次，抽滤除去多余水份，自然挥发正己烷后，获得不同缓冲溶液下的固定化羰基还原酶。采用实施例2方法测定产物产率和相对酶活。结果见表8所示，固定化羰基还原酶最佳吸附缓冲液类型为100mM pH7.0磷酸钾盐缓冲液。以最适缓冲溶液类型及最适pH下游离酶活为100％。
表8：固定化羰基还原酶吸附缓冲液类型对产物产率及相对酶活的影响
Figure BDA0002132272490000162
Figure BDA0002132272490000171
实施例13:固定化酶水-有机两相体系中不对称催化合成(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯
以实施例3中获得的固定化酶作为生物催化剂，以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，进行生物转化反应制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。
催化体系(10mL)组成及催化条件如下：6mL pH 7.0、100mM磷酸钾缓冲液中加入4mL异丙醇和2g(终浓度为200g/L)底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，2g固定化酶(相当于60g/L湿菌体)构成反应体系10mL。30℃，转速600rpm条件下反应16h，取样检测产物产率。反应结束后，抽滤回收固定化酶，将滤液先旋蒸至无液体流出去除剩余异丙醇、丙酮等有机溶剂；后用乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸发仪浓缩至无液体流出除去乙酸乙酯，干燥，得到产物(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。产物产率>98％，产物e.e.值>99％，d.e.值>99.5％。(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯与(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的液相检测方法与实施例2相同。
表9：固定化酶在水-有机两相体系中的单批次搅拌式反应进程
Figure BDA0002132272490000172
Figure BDA0002132272490000181
实施例14：固定化羰基还原酶两相催化反应体系辅底物异丙醇浓度优化
以实施例5中获得的固定化酶作为生物催化剂，以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，进行生物转化反应制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。
催化反应体系(10mL)组成以及催化条件如下：2g固定化酶制剂(相当于湿菌体60g/L)，辅底物异丙醇，100mM pH7.0磷酸钾缓冲溶液，辅底物按照(v/v) 10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％添加，2g底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(终浓度200g/L)。30℃，600rpm条件下反应16h。取样采用实施例2方法液相检测0.5h产物产率，结果见表10所示，所得优选异丙醇的添加量为40％(v/v)。以最适异丙醇添加量为对照。
表10：辅底物异丙醇浓度对产物产率以及相对酶活的影响
Figure BDA0002132272490000182
实施例15：固定化羰基还原酶催化合成(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯反应的批次反应
以实施例5中获得的固定化酶作为生物催化剂，以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，进行生物转化反应制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。
催化体系(100mL)组成及催化条件如下：60mL磷酸钾缓冲液(pH 7.0、 100mM)中加入40mL异丙醇和(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯20g(终浓度为200g/L)，20g固定化酶。30℃，转速600rpm条件下反应16h，取样检测转化率。反应结束后，抽滤回收固定化酶，将滤液先旋蒸至无液体流出去除剩余异丙醇、丙酮等有机溶剂；后用乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸发仪浓缩至无液体流出除去乙酸乙酯，干燥，得到产物 (3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。将回收的固定化细胞继续投入下一批次反应，连续反应10个批次。结果如表:11所示，各批次产物产率均保持在95％以上，产物e.e.值>99％，d.e.值>99.5％。
表11：共固定化酶的催化反应批次产物产率
Figure BDA0002132272490000191
实施例16：固定化羰基还原酶有机相催化体系反应介质的筛选
以实施例5中获得的固定化酶作为生物催化剂，以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，进行生物转化反应制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。
催化体系(10mL)组成及催化条件如下：4mL辅底物异丙醇，6mL有机溶剂(二甲基甲酰胺、甲酸、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、正丁醇、叔戊酸、甲苯、对二甲苯、正己烷、甲基叔丁基醚、正辛烷、正十二烷)，分别加入1g 底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(终浓度为100g/L)，2g固定化酶(相当于湿菌体60g/L)。30℃，转速600rpm水浴磁力搅拌条件下0.5h后取样，20h 结束反应。以实施例2中的方法进行液相检测，计算相对酶活、产物得率以及产物e.e.值。结果如表12显示，固定化羰基还原酶非水相反应优选介质为正己烷，以100mM pH7.0磷酸钾缓冲溶液为对照，正己烷中相对酶活最高，18h后产物得率>95％，产物d.e.值>99.5％。
表12：不同有机溶剂反应介质对产物产率、相对酶活及光学纯度的影响
Figure BDA0002132272490000201
Figure BDA0002132272490000211
实施例17：固定化酶在有机相催化体系中正己烷含量优化
以实施例5中获得的固定化酶作为生物催化剂，以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，进行生物转化反应制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。
催化反应体系(10mL)组成以及催化条件如下：2g固定化酶制剂(相当于湿菌体60g/L)，辅底物异丙醇，正己烷按照(v/v)20％，30％，40％，50％，60％， 70％添加，剩余体积由异丙醇补足，1g底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯 (终浓度100g/L)。30℃，600rpm条件下反应18h。取样采用实施例2方法液相检测0.5h产物产率，以100mM pH7.0磷酸钾缓冲溶液为对照，18h后产物得率>95％，产物d.e.值>99.5％。结果见表13所示，所得优选正己烷的添加量为40％ (v/v)。
表13：固定化酶在非水相中的正己烷含量优化
Figure BDA0002132272490000212
实施例18:固定化羰基还原酶在非水相介质中不对称催化合成(3R,5S)-6-氯-3,5- 二羟基己酸叔丁酯
以实施例5中获得的固定化酶作为生物催化剂，以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，进行生物转化反应制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。
催化体系(10mL)组成及催化条件如下：6mL辅底物异丙醇，4mL正己烷，加入1g底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(终浓度为100g/L)，2g固定化酶(相当于湿菌体60g/L)。37℃，转速600rpm水浴磁力搅拌条件下0.5h 后取样，18h结束反应。以实施例2中的方法进行液相检测，计算产物产率以及产物e.e.值。结果见表14所示，18h后产物产率>95％，产物d.e.值>99.5％。
表14：固定化酶在非水相中的单批次搅拌式反应
Figure BDA0002132272490000221
实施例19：卤醇脱卤酶固定化酶均一有机相催化体系反应
根据基因序列SEQ ID NO.3(编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示)设计引物3(CGCCATATGATGCCTGTCACCGACACCGC)、引物4 (ATTTGCGGCCGC TTACGGCCAGCCGCCGGTG)，并分别在引物3和引物 4中引入了Nde I和Not I限制性酶切位点。以Tistrella mobilis菌基因组DNA为模板，以实施例2方法得到卤醇脱卤酶工程细胞，以实施例3方法固定化酶。
将固定化卤醇脱卤酶用于催化底物1,3-二氯-2-丙醇合成环氧氯丙烷，催化体系(10mL)组成及催化条件如下：正己烷10mL，加入2g固定化酶，0.5g底物1,3-二氯-2-丙醇(终浓度50g/L)。另进行水相介质对比实验，以等体积磷酸钾缓冲液(pH 9.0、100mM)代替正己烷，其它相同。两组实验均在37℃，转速600rpm条件下反应1h。各取1mL反应液加入3mL的乙酸乙酯的进行萃取 15min，取有机相无水硫酸钠干燥后，进行气相检测。检测条件为：岛津GC-14A 气相分析仪，色谱柱BGB-175，载气为氦气，流量为1.6mL/min，分离比为40:1， FID检测器，进样口和检测器的温度均为220℃。90℃保留7min。经分析，反应1h后，水相介质反应中，1,3-二氯-2-丙醇转化率达88.71％，有机相反应中，丙酮酸转化率为7.47％，卤醇脱卤酶活性损失严重，反应不能有效进行。
实施例20：固定化转氨酶均一有机相催化体系反应
根据基因序列SEQ ID NO.3(编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示)设计引物3(CGCCATATGGCTTTTAG)、引物4(ATTTGCGGCCGC AATCTCGAGTCAATG)，并分别在引物5和引物6中引入了Nde I和Not I限制性酶切位点。以Arthrobacter sp.Knk168菌基因组DNA为模板，以实施例2方法得到转氨酶，以相同方法对转氨酶进行固定化。
将固定化转氨酶用于催化底物苯乙胺合成丙氨酸，催化体系(10mL)组成及催化条件如下：乙酸乙酯10mL，加入2g固定化酶，0.176g底物丙氨酸(终浓度8.8g/L)，氨基供体异丙胺1mL。另进行水相介质对比实验，以10mL磷酸钠盐缓冲液(pH 8.0、200mM)代替乙酸乙酯，其它相同。两组实验均在40℃，转速600rpm条件下反应8h。各取100μL的反应液分别加入200μL的含30mM 的1-氟-2,4-二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺(氨基酸衍生试剂)丙酮终止反应。加入 40μL的1M碳酸氢钠溶液，混匀，在40℃加热1h，冷却至室温后，加入20 μL的2M盐酸溶液。衍生完成后，进行高效液相色谱检测。检测条件为：液相色谱仪器：Shimadzu LC-20AD系统-SPD-20紫外检测器，色谱柱Eclipse XDB-C18 column(4.6mm×150mm，Agilent)，流动相为三乙胺溶液(50mM三乙胺，磷酸调节pH至3.0)∶乙腈＝62.5:37.5，等度洗脱，流速为0.8mL/min，检测波长为340nm。经检测，反应8h，水相介质反应中，丙酮酸转化率达92.13％，有机相反应中，丙酮酸转化率为6.75％，转氨酶活性损失严重，反应不能有效进行。
实施例19与实施例20说明，本发明所涉及的固定化酶技术与有机相反应体系不适用于羰基还原酶外的其他酶与相关反应。本发明仅适用于羰基还原酶高效固定化与催化他汀侧链的不对称合成。
实施例21：共固定化羰基还原酶连续催化体系中填充床高径比优化
以实施例5中获得的固定化酶作为生物催化剂，以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，进行生物转化反应制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。
分别取高径比为20:2、18:2、18:1.4、10:2的填充柱(单位:cm),总体积分别为：62.8cm3，56.52cm3，27.69cm3，31.4cm3，添加酶量为总体积的五分之四的位置，底物浓度50g/L，以60％(v/v)异丙醇为助溶剂，以40％(v/v)正己烷为反应介质，流速均为0.3mL/min，如表15所示，前10批次产物产率没有明显变化，均值分别为：95.34％，92.34％，96.32％，85.45％，产物d.e.大于99.5％。最终选出高径比18:1.4为进一步实验反应装置。
表15：填充床高径比优化
Figure BDA0002132272490000241
实施例22：共固定化羰基还原酶连续催化体系中填充床流速优化
以实施例5中获得的固定化酶作为生物催化剂，以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，进行生物转化反应制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。
以实施例20中填充柱高径比为反应装置，底物浓度50g/L，以60％(v/v) 异丙醇为助溶剂，以40％(v/v)正己烷为反应介质，底物以0.1mL/min，0.2mL/min， 0.3mL/min，0.4mL/min、0.5mL/min的泵入流速进行优化，反应批次为10批次。如表:16所示，得到最佳流速为0.3mL/min，产物产率均大于95％，产物d.e.大于 99％。
表16：填充床底物流速泵入流速优化
Figure BDA0002132272490000251
实施例23：共固定化羰基还原酶连续催化体系中填充床投酶量优化
以实施例5中获得的固定化酶作为生物催化剂，以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，进行生物转化反应制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。
以实施例20中填充柱高径比为反应装置，以实施例22流速为底物泵入流速，底物浓度50g/L,以60％(v/v)异丙醇为助溶剂，以40％(v/v)正己烷为反应介质，投酶量分别为7g，10g，12g，15g，18g，20g，反应批次为10批次，产物产率均值分别为：53.45、70.25、86.43、96.32、93.27、93.32(％)。如表17所示，得到最佳投酶量为15g，产物产率均大于95％，产物d.e.大于99％。
表17：
Figure BDA0002132272490000252
Figure BDA0002132272490000261
实施例24：共固定化羰基还原酶连续催化体系中填充床催化反应批次
以实施例5中获得的固定化酶作为生物催化剂，以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，进行生物转化反应制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。
以60％(v/v)异丙醇为助溶剂，以40％(v/v)正己烷为反应介质，高径比为18:1.4(cm)，底物浓度50g/L,流速为0.3mL/min,投酶量15g，如表18所示，前40批次产物产率均大于95％，产物d.e.大于99.5％。
表18：共固定化酶在非水相中批次反应
Figure BDA0002132272490000262
Figure BDA0002132272490000271
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 羰基还原酶-辅酶NADP+共固定化酶及其制备与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 759
<212> DNA
<213> Lactobacillus parabuchneri
<400> 1
atgactgatc gtctgaaagg caaggtagct attgttactg gtggtaccct gggtatcggt 60
ctggctatcg ctgacaaatt cgtggaagaa ggcgcgaagg tcgttatcac cggtcgtcgt 120
gccgacgttg gcgagcgtgc tgccaaaagc atcggtggta ctgatgttat ccgtttcgta 180
cagcacgatg caagcgatga agcaggctgg accaaactgt tcgataccac ggaagaggca 240
ttcggtccgg taaccaccgt cgtgaacaac gccggtatcg gtgtggtcaa atctgttgaa 300
gacactacca ccgaagagtg gcacaaactg ctgtctgtga acctggacgg cgttttcttc 360
ggtacccgcc tgggtatcca gcgtatgaaa aacaaaggcc tgggcgcaag catcatcaac 420
atgtcctcta ttttcggcat ggtaggcgat ccgactgtag gcgcttataa cgcgtccaaa 480
ggcgcggtgc gtattatgtc caagagcgcg gctctggact gtgcactgaa agactacgac 540
gtgcgcgtaa acacggtaca tccgggtccg attaaaaccc ctatgctgga cgacgttgag 600
ggcgcggaag aaatgtggtc ccagcgtact aaaaccccga tgggccacat cggtgagccg 660
aacgacatcg catgggtatg tgtctatctg gctagcggtg aatctaagtt cgcaaccggt 720
gctgaattcg taatcgatgg tggctggacc gcacagtaa 759
<210> 2
<211> 252
<212> PRT
<213> Lactobacillus parabuchneri
<400> 2
Met Thr Asp Arg Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr
1 5 10 15
Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala
20 25 30
Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Ile Gly Glu Lys Ala Ala
35 40 45
Lys Ser Ile Gly Gly Pro Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala
50 55 60
Ser Asp Glu Ala Gly Trp Thr Glu Leu Phe Asp Thr Thr Lys Asn Ala
65 70 75 80
Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Val Ser
85 90 95
Lys Ser Val Glu Glu Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ser
100 105 110
Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg
115 120 125
Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile
130 135 140
Glu Gly Phe Val Gly Asp Pro Thr Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys
145 150 155 160
Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu
165 170 175
Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Tyr Ile Lys
180 185 190
Thr Pro Leu Val Asp Asp Val Glu Gly Ala Glu Glu Met Met Ser Gln
195 200 205
Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala
210 215 220
Trp Val Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ala Lys Phe Ala Thr Gly
225 230 235 240
Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250

Claims (7)

1.一种羰基还原酶-辅酶NADP+共固定化酶，其特征在于所述共固定化酶按如 下方法制备获得：
（1） SEQ ID NO.1所示核苷酸序列转化到宿主菌大肠杆菌中，得到基因工程菌经发酵培养，获得湿菌体悬浮于的pH 6.9～7.1缓冲液中得到菌悬液，菌悬液经细胞破碎、离心，得到羰基还原酶粗酶液；
（2） 氨基树脂加入pH7.8～8.2的磷酸缓冲液，置于25～30℃摇床15～20min，维持pH7.8～8.2，1h后过滤抽干，加入至2～3％的戊二醛磷酸缓冲溶液中，25～30℃摇床60～80min，过滤，去离子水洗涤，得到处理后的氨基树脂；所述氨基树脂为下列之一：LX-1000NH，LX-1000EPHA，LX-1000EPH，LX-1000HAA；
（3）粗酶液中加入步骤（2）预处理后的氨基树脂，氨基树脂添加量为15～100g/100L粗酶液；
（4） 在20～30℃、200～300rpm条件下水浴搅拌固定化6～8h，再加入辅酶NADP+固定化10～12h，抽滤，滤饼用pH 7.0磷酸钾盐缓冲液清洗两次，抽滤去除缓冲液，即得所述羰基还原酶-辅酶NADP+共固定化酶。
2.如权利要求1所述的羰基还原酶-辅酶NADP+共固定化酶，其特征在于所述氨基树脂为LX-1000HAA。
3.如权利要求1所述的羰基还原酶-辅酶NADP+共固定化酶，其特征在于步骤（1）粗酶液按如下方法制得：将羰基还原酶基因工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃、200rpm下培养8h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃、150rpm下培养至菌体OD600达0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养10h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集湿菌体；取1g湿菌体，悬浮于10mL pH7.0、100mM磷酸钾盐缓冲液中，在冰浴中超声破碎或者使用高压匀浆机进行细泡破碎，破碎液离心，取上清液即为粗酶液。
4.制备权利要求1～3之一所述的羰基还原酶-辅酶NADP+共固定化酶的方法，其特征在于所述方法如下：
（1）SEQ ID NO.1所示核苷酸序列转化到宿主菌大肠杆菌中，得到基因工程菌经发酵培养，获得湿菌体悬浮于的pH 6.9～7.1缓冲液中得到菌悬液，菌悬液经细胞破碎、离心，得到羰基还原酶粗酶液；
（2）氨基树脂加入pH7.8～8.2的磷酸缓冲液，置于25～30℃摇床15～20min，维持pH7.8～8.2，1h后过滤抽干，加入至2～3％的戊二醛磷酸缓冲溶液中，25～30℃摇床60～80min，过滤，去离子水洗涤，得到处理后的氨基树脂；所述氨基树脂为下列之一：LX-1000NH，LX-1000EPHA，LX-1000EPH，LX-1000HAA；
（3）粗酶液中加入步骤（2）预处理后的氨基树脂，氨基树脂添加量为15～100g/100L粗酶液；
（4）在20～30℃、200～300rpm条件下水浴搅拌固定化6～8h，再加入辅酶NADP+固定化10～12h，抽滤，滤饼用pH 7.0磷酸钾盐缓冲液清洗两次，抽滤去除缓冲液，即得所述羰基还原酶-辅酶NADP+共固定化酶。
5.权利要求1～3之一所述的羰基还原酶-辅酶NADP+共固定化酶在不对称还原制备（3R,5S）-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用为：以羰基还原酶基因工程菌共固定化酶为催化剂，加入以（S）-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以异丙醇为辅底物，以pH值为7.0的磷酸钾缓冲液或正己烷为反应介质构成反应体系，在15～65℃、200～800rpm条件下反应18～24h，反应完全后，将混合液抽滤回收固定化酶，滤液分离纯化，得到所述（3R,5S）-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述催化剂用量为15～100g/L反应体系，异丙醇体积用量为10～80％，底物终浓度200g/L反应体系。
CN201910642229.8A 2019-07-16 2019-07-16 羰基还原酶-辅酶nadp+共固定化酶及其制备与应用 Active CN110423741B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910642229.8A CN110423741B (zh) 2019-07-16 2019-07-16 羰基还原酶-辅酶nadp+共固定化酶及其制备与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910642229.8A CN110423741B (zh) 2019-07-16 2019-07-16 羰基还原酶-辅酶nadp+共固定化酶及其制备与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110423741A CN110423741A (zh) 2019-11-08
CN110423741B true CN110423741B (zh) 2021-08-17

Family

ID=68409767

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910642229.8A Active CN110423741B (zh) 2019-07-16 2019-07-16 羰基还原酶-辅酶nadp+共固定化酶及其制备与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110423741B (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7420944B2 (ja) 2019-12-02 2024-01-23 ジーリン アシムケム ラボラトリーズ カンパニー リミテッド 共固定化酵素、その製造方法及びその使用
CN115418362A (zh) * 2019-12-02 2022-12-02 吉林凯莱英医药化学有限公司 共固定化酶、其制备方法及其应用
CN110964710B (zh) * 2019-12-25 2022-01-21 吉林凯莱英医药化学有限公司 固定化酶、其制备方法及其应用
WO2021128086A1 (zh) * 2019-12-25 2021-07-01 吉林凯莱英医药化学有限公司 固定化酶、其制备方法及其应用
CN110938609B (zh) * 2019-12-27 2021-07-23 南京朗恩生物科技有限公司 一种活性增强的酮还原酶突变体及其应用
CN111575334B (zh) * 2020-06-03 2021-09-07 湖州颐盛生物科技有限公司 一种制备(s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的方法
CN111647591A (zh) * 2020-06-24 2020-09-11 湖州颐盛生物科技有限公司 利用固定化酶制备他汀中间体的方法
CN112430591B (zh) * 2020-11-24 2022-05-24 浙江工业大学 纳米高分子-双酶复合物及其制备与在(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯合成中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101985616A (zh) * 2010-11-11 2011-03-16 西北工业大学 一种制备固定化腺苷甲硫氨酸合成酶和腺苷甲硫氨酸的方法
WO2013057468A1 (en) * 2011-10-19 2013-04-25 Cipla Limited Process for the preparation of an endothelin receptor antagonist
CN104911224A (zh) * 2015-06-26 2015-09-16 南京工业大学 一种催化合成阿扎那韦中间体的方法
CN105039361A (zh) * 2015-06-30 2015-11-11 浙江工业大学 羰基还原酶基因、编码酶、载体、菌株及应用
CN107653238A (zh) * 2017-10-17 2018-02-02 浙江工业大学 一种羰基还原酶基因工程菌固定化细胞及其应用
CN108486075A (zh) * 2018-02-14 2018-09-04 浙江工业大学 一种重组羰基还原酶突变体、基因、工程菌及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101985616A (zh) * 2010-11-11 2011-03-16 西北工业大学 一种制备固定化腺苷甲硫氨酸合成酶和腺苷甲硫氨酸的方法
WO2013057468A1 (en) * 2011-10-19 2013-04-25 Cipla Limited Process for the preparation of an endothelin receptor antagonist
CN104911224A (zh) * 2015-06-26 2015-09-16 南京工业大学 一种催化合成阿扎那韦中间体的方法
CN105039361A (zh) * 2015-06-30 2015-11-11 浙江工业大学 羰基还原酶基因、编码酶、载体、菌株及应用
CN107653238A (zh) * 2017-10-17 2018-02-02 浙江工业大学 一种羰基还原酶基因工程菌固定化细胞及其应用
CN108486075A (zh) * 2018-02-14 2018-09-04 浙江工业大学 一种重组羰基还原酶突变体、基因、工程菌及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Xiao‑Jian Zhang等."Asymmetric synthesis of tert‑butyl (3R,5S)‑6‑chloro‑3,5‑dihydroxyhexanoate using a self‑sufcient biocatalyst based on carbonyl reductase and cofactor co‑immobilization".《Bioprocess and Biosystems Engineering》.2019,第43卷21-31. *
羰基还原酶不对称还原(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯;曹政等;《生物加工过程》;20130131;第11卷(第1期);17-22 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110423741A (zh) 2019-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110423741B (zh) 羰基还原酶-辅酶nadp+共固定化酶及其制备与应用
CN107653238B (zh) 一种羰基还原酶基因工程菌固定化细胞及其应用
CN111172140B (zh) 一种腈水解酶突变体及其在制备抗癫痫药物中间体中的应用
CN109055327B (zh) 醛酮还原酶突变体及其应用
CN112795603B (zh) 一种制备(s)-2-(3-吡啶)-吡咯烷的方法
CN109468291B (zh) 一种羰基还原酶EbSDR8突变体及其构建方法和应用
CN110387359B (zh) 羰基还原酶突变体及其应用
CN112662658A (zh) 固定化重组大肠杆菌利用l-苯丙氨酸生产l-苯丙酮酸
CN105624128B (zh) 一种固定化单胺氧化酶及其在合成手性氮杂双环化合物中的应用
WO2012142921A1 (zh) 生物催化不对称还原制备(r)-邻氯扁桃酸甲酯的方法
CN110770339B (zh) 一种酸性磷酸酶突变体、其应用及其制备烟酰胺核糖的方法
CN108410831B (zh) 酮酸还原酶、基因、工程菌及在合成手性芳香2-羟酸中的应用
CN103966275B (zh) 生物法制备高纯度l-叔亮氨酸
CN108359626B (zh) 一种工程菌及其在制备(r)-3-羟基-5-己烯酸酯中的应用
CN111454918B (zh) 一种烯醇还原酶突变体及其在制备(r)-香茅醛中的应用
CN113817693A (zh) 一种短链羰基还原酶PpYSDR突变体、编码基因、重组表达载体、基因工程菌及应用
CN110423740B (zh) 一种提高对映选择性的卤醇脱卤酶突变体及其应用
CN113322291A (zh) 一种手性氨基醇类化合物的合成方法
CN114350631B (zh) 草铵膦脱氢酶突变体、工程菌、固定化细胞及应用
CN113151131B (zh) 一种产异丁香酚单加氧酶的自诱导培养基及其应用
CN113930376A (zh) 一种用于催化生产d-对羟基苯甘氨酸的工程菌、高密度培养方法及催化生产方法
CN108441433B (zh) 胶红酵母nq1及在制备手性醇中的应用
CN114774491B (zh) 制备(2s,3r)-2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-羟基丁酸酯的方法
CN114410619B (zh) 一种固定化生物催化剂合成(S)-N-Boc-羟基哌啶的方法
CN117904066A (zh) 一种重组羰基还原酶突变体及其在催化合成手性醇中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant