CN105039361A - 羰基还原酶基因、编码酶、载体、菌株及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种来源于圆红冬孢酵母(Rhodosporidium？toruloides)ZJB14212的羰基还原酶、基因、载体、菌株，以及其在制备手性药物中间体中的应用；所述羰基还原酶能够生物催化制备高光学纯度的(S)-N,N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺、(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺、(R)-3-氯-1-(2-噻吩基)-1-丙醇、(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯、(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙腈、6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯、(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮及[S-(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种从圆红冬孢酵母ZJB2014212中提取的羰基还原酶基因、编码酶、载体、菌株及应用。
(二)背景技术
立体选择性羰基还原酶(SpecificCarbonylReductase,SCR；Ketoreductase,KRED，EC1.1.1.x)是一类能够催化醇和醛/酮之间双向可逆氧化还原反应的酶类，并且需要辅酶NAD(H)(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)或NADP(H)(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)作为氢传递体。NADH和NADPH作为电子供体参与其还原反应，NAD和NADP则作为电子受体参与其氧化反应。目前立体选择性羰基还原酶主要分布于三个超家族：短链脱氢酶/还原酶(Short-ChainDehydrogenase/Reductases,SDRs)，中链脱氢酶/还原酶(Medium-ChainDehydrogenases/Reductases,MDRs)和醛酮还原酶(Aldo-KetoReductases,AKRs)。虽然三者的催化功能相似，但在结构上差异较大。该类酶广泛分布于各类动物、微生物和植物中。其中，由于微生物种类繁多、分布广，是立体选择性羰基还原酶的主要来源。目前已从多种微生物中发现了立体选择性羰基还原酶，如：Pichiafinlandica、Vibriovulnificus、Clostridiumljungdahlii、Candidaglabrata、Polygonumminus、Serratiaquinivorans、Oenococcusoeni、Arabidopsisthaliana、Serratiamarcescens、Rhodococcuserythropolis、Chryseobacteriumsp.、Candidamagnoliae、Lactobacilluscoryniformis、Lactobacillusjensenii以及Burkholderiagladioli等。此外，还从极端微生物中发现了嗜极端环境的立体选择性羰基还原酶，如：Thermococcusguaymasensis、Thermococcussibiricus、Haloferaxvolcanii、Sulfolobusacidocaldarius、Thermusthermophilus、Carboxydothermushydrogenoformans、Thermotogamaritime、Thermococcuskodakarensis、Pyrobaculumcalidifontis、KoliellaAntarctica和Halobacteriumsp.等。
近年来，随着基因组学、蛋白质组学和生物信息学的迅速发展，基因挖掘技术已成为获得立体选择性羰基还原酶的重要手段。目前利用此技术已挖掘到许多的立体选择性羰基还原酶。其中部分立体选择性羰基还原酶基因已成功在不同的宿主(大肠杆菌、毕赤酵母等)中表达，获得选择性及产酶活力均较高的基因工程菌，并应用于羰基类化合物不对称催化合成中。尽管如此，许多立体选择性羰基还原酶的底物识别专一性强，大大限制了其应用范围。此外，许多酶的催化效率较低，也限制了其工业化应用。因此，筛选具有高效高选择性的新型微生物菌株，并通过基因工程技术获得具有较宽底物谱的立体选择性羰基还原酶，研究其在手性药物中间体合成中的应用具有重要的意义，也为实现工业化生产奠定基础。
度洛西汀(欣百达，Cymbalta)是一种5-羟色胺及去甲肾上腺素再摄取双重抑制剂(SNRIs)，由美国EliLilly公司开发。它含有噻吩结构以及一个手性中心，仅S构型的对映体具有药物活性。噻吩酮类化合物是合成(S)-度洛西汀的关键手性中间体，其中包括(S)-N,N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺、(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺、(R)-3-氯-1-(2-噻吩基)-1-丙醇、(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯以及(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙腈等。目前获得该类中间体的主要方法是利用手性过渡金属配合物作为催化剂不对称还原相应的潜手性生成手性醇。微生物法不对称还原合成噻吩酮类化合物的报道较少。Pankaj等报道了热带假丝酵母(CandidatropicalisMTCC-5158)和维斯假丝酵母菌(Candidaviswanathii)催化底物N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺合成(S)-N,N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺，转化率>80％，ee>99％，但底物浓度只有5mM,催化时间长(24-60h)。国内专利CN102925368，CN103013898和CN103421854公开了球饱白僵菌(Beauveriabassiana)及马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycemarxianus)中的羰基还原酶不对称还原制备(S)-N,N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺，底物浓度可达30g/L，转化率>80％，ee>99％。美国专利US20130177962公开了利用酮还原酶(KRED)生产(S)-N,N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的方法，底物浓度可达100g/L，但该工艺需要严格的控温和反应控制，并添加异丙醇，副产物丙酮难以去除。
6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯是HMG-CoA酶抑制剂的关键手性中间体。其化学法合成中则需要使用易燃易爆的正丁基锂、硼烷，并且需要在<-65℃低温条件下进行，能耗大，再加6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯非对映诱导不充分，产物的光学纯度难以达到要求。近年来，利用酶法代替化学法改善反应条件，降低反应成本，提高产物的选择性成为关注的重点。利用酯酶拆分外消旋6-氯-(3,5S)-二羟基己酸叔丁酯最高产率仅50％。目前报道的能高立体选择性催化(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原生成6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯的菌株有Lactobacilluskefir和SaccharomycescerevisiaeCGMCCNo.2233等，但催化效率较低。Ou等人将SaccharomycescerevisiaeCGMCCNo.2233做成固定化细胞，在底物浓度低于50g/L时，底物能完全转化，并且非对映选择性de>99％。
依泽替米贝(Ezetimibe，)，化学名1-(4-氟苯基)-(3R)-[3-(4-氟苯基)-(3S)-羟基丙基]-(4S)-(4-羟基苯基)-2-丙内酰胺，是一类新型的选择性胆固醇吸收抑制剂，由Merk公司研制，2002年首先在德国上市。该药物能与肠道中的胆固醇吸收转运载体NPC1L1结合，从而有效降低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量，选择性抑制食物以及胆汁中的胆固醇在小肠的吸收。化合物(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮是合成依泽替米贝的关键手性中间体，目前主要是利用不对称还原法合成。Homann等首先发现了菌株SchizosaccharomycesoctosporusATCC2479和BurkholderiacenocepaciaMTCC5427能催化(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮生成(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮，de>99％。目前，Codexis公司利用蛋白质工程技术将L.kefir中的羰基还原酶进行了多轮改造，将每轮的有益突变结合起来最终得到一个比较理想的羰基还原酶突变体，其活性和选择性与野生型相比均得到了大幅度的提高，成功地将该反应体系放大，在底物浓度为100g/L时，产率接近99％，de>99％。
孟鲁斯特，化学名[3-[(1S)-[3(E)-[2-(7-氯喹啉)乙烯基]苯基-3-(乙酰苯基)-丙基硫甲基]-2(S)-甲基环丙烷乙酸钠]，能有效地抑制半胱氨酰白三烯(LTC，LTD，LTE)与CysLT受体结合所产生的生理效应而无任何受体激动活性。利用立体选择性还原[(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羰基丙基]苯甲酸甲酯生成[S-(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯是合成孟鲁斯特的关键一步。由于化学法存在一定的局限性，近年来利用酶法的方法逐渐增多。Roberge等人报道的利用Microbacteriumsp.MB5614中的酮还原酶催化该反应，ee达95％。Codexis公司将L.kefir中的羰基还原酶进行多轮定向进化，得到了一系列突变体，产率提高了2000倍，并建立了异丙醇为辅助底物的辅酶循环系统，催化100g/L的底物，产率99.3％，ee99.9％。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种从圆红冬孢酵母ZJB2014212中提取的羰基还原酶基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，以及其在制备手性药物中间体中的应用。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种来源于圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)ZJB2014212的立体选择性羰基还原酶基因，所述羰基还原酶基因的核苷酸序列为SEQIDNO：1所示。
所述立体选择性羰基还原酶基因由如下方法得到：
利用PCR技术，在引物1(ATGTCTTCGCCTACTCCCAACGTC)、引物2(CTACCATGGCAAGAACGTCCCGTC)的作用下以来源于圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)ZJB2014212菌株中的cDNA为模板克隆长约0.8kb的羰基还原酶基因序列，命名为rtscr9。将该片段连接到pGEM-T载体上，获得克隆载体pGEM-T-rtscr9，将载体转化大肠杆菌获得含载体pGEM-T-rtscr9的重组大肠杆菌。对重组质粒测序，并利用软件对测序结果进行分析，该序列含有一个长759bp的开放阅读框。
本发明表达引物3(catatgTCTTCGCCTACTCCCAACGTC)和引物4(aagcttCTACCATGGCAAGAACGTCCCGTC)，酶切位点分别为NdeⅠ和HindⅢ(下划线)，以克隆载体pGEM-T-rtscr9为模板，通过PCR扩增得到了用于表达的羰基还原酶基因。
本发明所述圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)ZJB2014212，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCCNo：M2014613，保藏日期2014年12月2日，邮编430072。
任何对SEQIDNO:1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、插入或缺失处理获得的核苷酸序列，只要其与该核苷酸具有90％以上的同源性，均属于本发明的保护范围。
本发明提供一种由所述羰基还原酶基因(rtscr9)编码的重组羰基还原酶，命名为RtSCR9，所述重组羰基还原酶的氨基酸序列为SEQIDNO:2所示。
任何对SEQIDNO:2所示氨基酸序列中氨基酸进行插入、缺失或替换的处理获得的多肽片段或其突变体，只要其与SEQIDNO:2所示氨基酸序列具有95％以上同源性，均属于本发明的保护范围。
本发明涉及含所述羰基还原酶基因的重组载体。
本发明涉及利用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌，具体为：将羰基还原酶基因同表达载体pET28a连接，构建了含有羰基还原酶基因的异源表达重组质粒pET28a-rtscr9。将表达重组质粒pET28a-rtscr9转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，获得含有重组质粒pET28a-rtscr9的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-rtscr9。
本发明还涉及羰基还原酶基因在构建重组羰基还原酶中的应用，具体为：构建含有所述羰基还原酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌(优选E.coliBL21(DE3))中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组羰基还原酶的菌体细胞，破碎后获得的羰基还原酶粗酶液进行纯化，获得羰基还原酶纯酶。
本发明还涉及所述羰基还原酶在制备手性药物中间体中的应用，所述应用为：以含羰基还原酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，于pH值为6～10的缓冲液中，加入底物，辅助底物和NAD(P)+，在20～40℃、50～250rpm条件下反应(优选30℃、150r/min下反应4～8h)，反应完全后，获得含手性药物中间体的混合液，将混合液用乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，烘干后获得药物手性中间体；所述底物为N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐、N-甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐、3-氯丙酰基-2-噻吩、3-酮-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯、3-酮-3-(2-噻吩基)丙腈、(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮和[(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羰基丙基]苯甲酸甲酯中的一种；所述辅助底物为葡萄糖、甲酸铵、异丙醇或无水乙醇，优选葡萄糖，所述辅助底物为葡萄糖时，添加葡萄糖脱氢酶构成辅助底物体系，所述辅助底物为甲酸铵时，添加甲酸脱氢酶构成辅助底物体系；所述催化剂的用量以湿菌体重量计为20～200g/L缓冲液(优选40g/L)，所述底物的初始浓度为50～2000mmol/L缓冲液(优选100～1000mmol/L)，所述辅助底物的用量为25～18000mmol/L缓冲液(优选600～6000mmol/L)，所述NAD(P)+的用量为0～3mmol/L缓冲液(优选0.08～0.75mmol/L)，所述葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶用量以含葡萄糖脱氢酶基因或甲酸脱氢酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体重量计均为10～200g/L缓冲液(优选10g/L)。所述底物3-氯丙酰基-2-噻吩、3-酮-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯以及3-酮-3-(2-噻吩基)丙腈以2500mmol/LDMSO溶液的形式加入(即底物用二甲基亚砜配制成2500mmol/L的溶液)。所述底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮及[(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羰基丙基]苯甲酸甲酯以1000mmol/LDMSO溶液的形式加入(即底物用二甲基亚砜配制成1000mmol/L的溶液)。
进一步，本发明所述含羰基还原酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的湿菌体按如下方法制备：将含有羰基还原酶基因的重组工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、5000rpm离心5min，弃去上清液，收集湿菌体。
本发明所述脱氢酶湿菌体按如下方法制备：分别将含葡萄糖脱氢酶(GDH)的(优选来源于Exiguobacteriumsibiricum255-15的GDH，GenBank:ACB59697.1)重组菌BL21(DE3)/pET28b-gdh)和含甲酸脱氢酶(FDH)(优选来源于Candidaboidinii的FDH，GenBank:AF004096)的重组菌BL21(DE3)/pET28b-fdh接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以1％接种量(v/v)接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、5000rpm离心5min，弃去上清液，收集沉淀，即分别获得葡萄糖脱氢酶湿菌体和甲酸脱氢酶湿菌体。
进一步，优选所述的反应以含羰基还原酶基因的工重组程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，于pH值为6～10的缓冲液中，加入底物，葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和NAD(P)+，在30℃、150rpm条件下反应，反应完全后，获得含手性药物中间体的混合液；所述底物为N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐、N-甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐、3-氯丙酰基-2-噻吩、3-酮-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯、3-酮-3-(2-噻吩基)丙腈、(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮和[(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羰基丙基]苯甲酸甲酯中的一种；所述催化剂的用量以湿菌体的重量计为40g/L缓冲液，所述底物的浓度为50～2000mmol/L缓冲液(优选100～1000mmol/L)，所述辅助底物的用量为300～12000mmol/L缓冲液(优选600～6000mmol/L)，所述葡萄糖脱氢酶的用量以含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体重量计为10g/L缓冲液，所述NAD(P)+的用量为0～3mmol/L缓冲液(优选0.08～0.75mmol/L)；所述底物3-氯丙酰基-2-噻吩、3-酮-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯以及3-酮-3-(2-噻吩基)丙腈以2500mmol/LDMSO溶液的形式加入，所述底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮及[(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羰基丙基]苯甲酸甲酯以1000mmol/LDMSO溶液的形式加入。
进一步，本发明所述羰基还原酶RtSCR9作为生物催化剂在转化底物N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐(图6中式1)生成(S)-N,N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺(图6中式2)中的应用，具体的反应体系为：以磷酸盐缓冲液(100mM,pH7.0)为反应介质，以含羰基还原酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，加入葡萄糖脱氢酶，N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐，NADP+和葡萄糖，30℃，转速150r/min条件下水浴摇床反应4h，反应结束后，反应液加6MNaOH水溶液调pH至11～12，反应液用等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，获得浓缩物，干燥，即为(S)-N,N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺；底物的终浓度1000mmol/L缓冲液，NADP+用量为0.75mmol/L缓冲液，葡萄糖用量为6000mmol/L缓冲液，RtSCR9湿菌体用量为40g/L缓冲液，葡萄糖脱氢酶以含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体重量计为10g/L缓冲液。
本发明所述底物为N-甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐时，其反应式见图7所示，具体的反应体系为：以含羰基还原酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以磷酸钾缓冲液(pH7.0)为反应介质，加入葡萄糖脱氢酶、葡萄糖、NADP+，底物N-甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺(式3)，30℃，转速150r/min条件下反应4h，反应结束后，反应液加6MNaOH水溶液调pH至11～12，再加入等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，获得浓缩物，干燥，即为(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺(式4)；所述重组羰基还原酶湿菌体用量40g/L缓冲液、葡萄糖脱氢酶用量以含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体重量计为10g/L缓冲液、葡萄糖用量为1500mmol/L缓冲液、NADP+用量为0.2mmol/L缓冲液、底物浓度250mmol/L缓冲液。
本发明所述底物为3-氯丙酰基-2-噻吩时，其反应式见图8所示，具体的反应体系为：以含重组羰基还原酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以磷酸钾缓冲液(pH7.0)为反应介质，加入葡萄糖脱氢酶，葡萄糖，NADP+，底物3-氯丙酰基-2-噻吩(式5)，30℃，转速150r/min条件下反应4h，反应结束后，反应液加入等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，浓缩物干燥，即为(R)-3-氯-1-(2-噻吩基)-1-丙醇(式6)；所述重组羰基还原酶湿菌体用量40g/L缓冲液、葡萄糖脱氢酶用量以含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体重量计为10g/L缓冲液，葡萄糖用量为1500mmol/L缓冲液、NADP+用量为0.2mmol/L缓冲液，底物浓度250mmol/L缓冲液。
本发明所述底物为3-酮-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯时，其反应式见图9所示，具体的反应体系为：以含重组羰基还原酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以磷酸钾缓冲液(pH7.0)为反应介质，加入葡萄糖脱氢酶，葡萄糖，NADP+，底物3-酮-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯(式7)，30℃，转速150r/min条件下反应4h，反应结束后加入等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，浓缩物干燥即为(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯(式8)；所述重组羰基还原酶湿菌体用量为40g/L缓冲液、葡萄糖脱氢酶用量以含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用量计为10g/L缓冲液，葡萄糖用量为1500mmol/L缓冲液、NADP+用量为0.2mmol/L缓冲液，底物浓度250mmol/L缓冲液。
本发明所述底物为3-酮-3-(2-噻吩基)丙腈时，其反应式见图10所示，具体的反应体系为：以含重组羰基还原酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以磷酸钾缓冲液(pH7.0)为反应介质，加入葡萄糖脱氢酶，葡萄糖，NADP+，底物3-酮-3-(2-噻吩基)丙腈(式9)，30℃，转速150r/min条件下反应4h，反应结束后加入等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，浓缩物干燥即为(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙腈(式10)；所述重组羰基还原酶湿菌体用量为40g/L缓冲液、葡萄糖脱氢酶用量以含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用量计为10g/L缓冲液，葡萄糖用量为1500mmol/L缓冲液、NADP+用量为0.2mmol/L缓冲液，底物浓度250mmol/L缓冲液。
本发明所述底物为(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯时，其反应式见图11所示，具体的反应体系为：以含重组羰基还原酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以磷酸钾缓冲液(pH7.0)为反应介质，加入葡萄糖脱氢酶，葡萄糖，NADP+，底物(S)-6-氯--5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(式11)，30℃，转速150r/min条件下反应8h，反应结束后加入等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，浓缩物干燥即为6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯(式12)；所述重组羰基还原酶湿菌体用量为40g/L缓冲液、葡萄糖脱氢酶用量以含葡萄糖脱氢酶的工程菌经发酵培养获得的湿菌体重量计为10g/L缓冲液，葡萄糖用量为600mmol/L缓冲液、NADP+用量为0.08mmol/L缓冲液，底物浓度100mmol/L缓冲液。
本发明所述底物为(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮时，其反应式见图12所示，具体的反应体系为：以含重组羰基还原酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以磷酸钾缓冲液(pH7.0)为反应介质，加入葡萄糖脱氢酶，葡萄糖，NADP+，底物(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮(式13)，30℃，转速150r/min条件下反应8h，反应结束后加入等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，浓缩物干燥即为(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮(式14)；所述重组羰基还原酶湿菌体用量为40g/L缓冲液、葡萄糖脱氢酶用量以含葡萄糖脱氢酶的工程菌经发酵培养获得的湿菌体重量计为10g/L缓冲液，葡萄糖用量为600mmol/L缓冲液、NADP+用量为0.08mmol/L缓冲液，底物浓度100mmol/L缓冲液。
本发明所述底物为[(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羰基丙基]苯甲酸甲酯时，其反应式见图13所示，具体的反应体系为：以含重组羰基还原酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以磷酸钾缓冲液(pH7.0)为反应介质，加入葡萄糖脱氢酶，葡萄糖，NADP+，底物[(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羰基丙基]苯甲酸甲酯(式15)，30℃，转速150r/min条件下反应8h，反应结束后加入等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，浓缩物干燥即为[S-(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯(式16)；所述重组羰基还原酶湿菌体用量为40g/L缓冲液、葡萄糖脱氢酶用量以含葡萄糖脱氢酶的工程菌经发酵培养获得的湿菌体重量计为10g/L缓冲液，葡萄糖用量为600mmol/L缓冲液、NADP+用量为0.08mmol/L缓冲液，底物浓度100mmol/L缓冲液。
本发明所述催化剂还包括羰基还原酶RtSCR9纯酶、粗酶液或者粗酶粉等其他形态。采用羰基还原酶重组基因工程菌作催化剂时，需结合一种辅酶循环系统，包括葡萄糖/葡萄糖脱氢酶(GDH)、甲酸/甲酸脱氢酶(FDH)等双酶双底物辅酶循环系统以及乙醇、异丙醇等单酶双底物辅酶循环系统。通常用辅助底物代替NAD(P)H进行反应，常用的辅助底物为：葡萄糖25～18000mmol/L、乙醇或异丙醇2～30％(v/v，占总转化体系的质量体积百分数)；较佳的菌体浓度为10～200g/L。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种来源于圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)ZJB2014212的羰基还原酶基因，该羰基还原酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的表达重组质粒pET28a-rtscr9，再转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌，该大肠杆菌含有重组羰基还原酶，可以利用重组大肠杆菌作为生物催化剂进行生物催化反应，为药物手性中间体的生物催化合成提供了可供选择的新型酶源。
重组羰基还原酶RtSCR9作为生物催化剂，以N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐为底物制备(S)-N,N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺，底物浓度达1000mM(219g/L)，4h底物转化率为>99％，ee为99.9％，为已报道的最高水平。以N-甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐、3-氯丙酰基-2-噻吩、3-酮-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯以及3-酮-3-(2-噻吩基)丙腈为底物制备(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺、(R)-3-氯-1-(2-噻吩基)-1-丙醇、(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯以及(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙腈，底物浓度为250mM时，反应4h转化率分别为57％，98％，98％，99％。产物ee均>99％。以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮及[(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羰基丙基]苯甲酸甲酯为底物制备6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯、(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮及[S-(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯，反应8h转化率>90％。产物ee均>99％。
(四)附图说明
图1为克隆载体pGEM-T-rtscr9物理图谱；
图2为pET28a-rtscr9重组质粒物理图谱；
图3为羰基还原酶基因PCR扩增低熔点琼脂糖凝胶(argrose)电泳图；其中，泳道1为Marker；泳道2为利用引物1和引物2扩增得到的羰基还原酶基因片段；泳道3为利用引物3和引物4扩增得到的羰基还原酶基因片段。
图4阳性重组质粒pET28a-rtscr9的酶切结构图；其中，泳道1为Marker；泳道2、3、4为pET28a-rtscr9；泳道5为pET28a-rtscr9/NdeIandHindⅢ样品；
图5为羰基还原酶纯化后的SDS-PAGE图：泳道1为蛋白质分子量Marker，泳道2为纯化后的羰基还原酶RtSCR9。
图6为(S)-N,N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺合成方程式。
图7为(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺合成方程式。
图8为(R)-3-氯-1-(2-噻吩基)-1-丙醇合成方程式。
图9为(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯合成方程式。
图10为(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙腈合成方程式。
图11为6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯合成方程式。
图12为(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮合成方程式。
图13为[S-(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯合成方程式。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)ZJB2014212的获取
本发明从浙江、湖北、安徽、江苏等地采取土样，共取土样30份。筛选的具体方法：称取土壤样品5g，加入50mL无菌水制成土壤悬浮液，取1.0mL上清液，加入到筛选培养基中，于30℃、150rpm/min摇床上振荡培养48h。取该培养液进行梯度稀释，取10-5、10-6和10-7的梯度稀释液涂布到LB固体培养基上，置30℃恒温培养箱培养48h。挑取生长出的单菌落接种到液体发酵培养基中进行培养。在30℃摇床上培养48h，离心收集菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤。菌体用于转化，转化条件如下：磷酸盐缓冲液(100mM，pH7.0)中加入菌体，N,N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐50mmol/L缓冲液，葡萄糖50mmol/L缓冲液，置于30℃水浴摇床转化8h，取1mL转化液，调pH至11～12，乙酸乙酯萃取后，高效液相色谱检测分析。
本发明筛选得到的菌株ZJB2014212，于30℃在LB培养基平板培养48h,菌落呈圆形，边缘光滑，有光泽，橘红色，半透明。
所述筛选培养基：0.2％(w/v)N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐，0.1％(NH4)SO4，0.1％K2HPO4,0.1％Na2HPO4·2H2O，0.2％NaH2PO4·12H2O，0.05％MgSO4·7H2O，0.001％FeSO4·7H2O，0.001％CuSO4·5H2O，0.001％MnSO4·5H2O，pH自然；
所述固体LB培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母粉，1％NaCl,2％琼脂，pH7.0；
所述发酵培养基：1％甘油，0.5％蛋白胨，1％酵母粉，0.1％(NH4)SO4，0.1％K2HPO4,0.1％Na2HPO4·2H2O，0.2％NaH2PO4·12H2O，0.05％MgSO4·7H2O，0.001％FeSO4·7H2O，0.001％CuSO4·5H2O，0.001％MnSO4·5H2O，0.1％CaCO3,pH自然。
筛选得到的菌株ZJB2014212，进行生理生化及BIOLOG鉴定(见表1)，利用Biolog自动微生物鉴定系统考察菌株对65种不同碳源的代谢情况。经Biolog读数仪分析代谢指纹，菌株可较强利用44种碳源，对其他21种碳源不能利用或利用能力较弱。Biolog系统给出72h鉴定结果，该菌与Rhodosporidiumtoruloides标准菌株相似，相似性指数为0.994(PROB)。
利用SpinKitforSoil6540-403试剂盒提取基因组DNA(MPBio公司),以基因组DNA为模板，利用引物ITS-1(TCCGTAGGTGAACCTGCGC)和ITS-4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)扩增菌株的18SrDNA基因，将基因产物同T载体连接后，委托上海生工对该菌18SrDNA扩增及测序。菌株ZJB201421218SrDNA序列：SEQIDNO：3，实际长度为612bp。将获得的18SrDNA序列在NCBI网站上用BLAST检索GenBank中相关菌株的18SrRNA基因序列，并进行同源性比对，与GenBank中相关数据进行相似性分析发现，该菌与圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)的同源性最高(homology,99％/612bps,basedon18SrDNA)。基于形态、生理生化特征和18SrDNA序列及系统发育学分析等方面的鉴定，确定该菌为圆红冬孢酵母，命名为圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)ZJB2014212，此株菌已于2014年12月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo：M2014613。
表1.菌株对BiologYT板上65种碳源的利用能力
Notes:+,positive；-,negative；B,borderline
实施例2：羰基还原酶基因rtscr9的扩增
根据圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)ZJB2014212全基因组测序信息，挖掘有潜在催化活力的羰基还原酶，其中一个具有催化N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐生成(S)-N,N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺功能的酶为本发明涉及的羰基还原酶RtSCR9。
利用Ambion公司的试剂提取圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)ZJB2014212菌体的总mRNA。取1mgmRNA为模版，利用ReverTraAceqPCRRT试剂盒(ToYoBo,Japan)对其进行反转录合成cDNA。以该cDNA为模板，在引物1(ATGTCTTCGCCTACTCCCAACGTC)、引物2(CTACCATGGCAAGAACGTCCCGTC)的作用下进行PCR扩增。PCR反应体系(总体积50μL)：10×PfuDNAPolymeraseBuffer5μL，10mMdNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)1μL，浓度为50μM的克隆引物1、引物2各0.5μL，cDNA2μL，PfuDNAPolymerase1μL，无核酸水40μL。
采用Biorad的PCR仪，PCR反应条件：预变性95℃5min，95℃变性30s，65℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
PCR反应液用0.9％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段，利用TaqDNA聚合酶向片段5’端引入碱基A。在T4DNA连接酶作用下将该片段同pGEM-T载体进行连接，得到克隆重组质粒pGEM-T-rtscr9，见图1。将该重组质粒转化至大肠杆菌JM109中，涂布于含有终浓度为50μg/mL氨苄青霉素钠抗性的LB平板，随机挑取阳性克隆测序，利用软件分析测序结果，结果表明：经引物1和引物2扩增到的核苷酸序列长度为759bp(其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示)，该序列编码一个完整的开放阅读框(氨基酸序列为SEDIDNO.2)。
实施例3：重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-rtscr9的构建
根据实施例1分析结果设计表达引物3(catatgTCTTCGCCTACTCCCAACGTC)、引物4(aagcttCTACCATGGCAAGAACGTCCCGTC)，并分别在引物3和引物4中引入了NdeI和HindIII限制性酶切位点(下划线标记)。在引物3和引物4的引发下，利用高保真PfuDNA聚合酶进行扩增，获得长为759bp的羰基还原酶基因序列(其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示)，测序后利用NdeI和HindIII限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并利用T4DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的商业化载体pET28a(Invitrogen)进行连接，构建表达载体pET28a-rtscr9。将构建的表达载体pET28a-rtscr9转化至大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen)中，涂布于含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养8～16h，随机挑取克隆，抽提质粒进行酶切鉴定，鉴定结果见图4所示，由图4可知，双酶切后5泳道出现两条带，一条带与目的基因片段大小一致。该结果说明目的基因已经克隆至pET28a的NdeI和HindIII位点，即获得了重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-rtscr9。
实施例4：重组羰基还原酶(RtSCR9)湿菌体
将实施例3获得的含有表达重组质粒pET28a-rtscr9的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-rtscr9菌体接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以1％接种量(v/v)接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、5000rpm离心5min，弃去上清液，收集沉淀，即获得含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-rtscr9湿菌体。该菌体可直接作为生物催化剂或者用于蛋白纯化。
实施例5：羰基还原酶(RtSCR9)的分离纯化
将实施例4中获得的菌体(即重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-rtscr9湿菌体)以结合缓冲液(50mM，pH8.0磷酸钠缓冲液，含300mMNaCl，10mM咪唑)重悬后，经超声破碎，12000rpm离心40min，上清与经上述结合液平衡过的Ni亲和层析树脂孵育后，再用冲洗缓冲液(50mM，pH8.0磷酸钠缓冲液，含300mMNaCl，20mM咪唑)冲洗至基本无杂蛋白，随后以洗脱缓冲液(50mM，pH8.0磷酸钠缓冲液，含300mMNaCl，250mM咪唑)洗脱并收集目的蛋白，电泳鉴定纯度后合并目的蛋白并以透析缓冲液(50mM，pH8.0磷酸钠缓冲液)透析48h，取截留液采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量为3.6g/L，将酶冻存于-80℃(羰基还原酶RtSCR9蛋白电泳图见附图5)，获得羰基还原酶RtSCR9纯酶。
实施例6：重组羰基还原酶RtSCR9的活性测定
以实施例5方法分离纯化得到的羰基环化酶RtSCR9纯酶用于催化底物N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐。
催化体系组成及催化条件如下：10mL磷酸盐缓冲液(100mM,pH7.0)中加入羰基还原酶RtSCR9纯酶(终浓度为0.1g/L)，N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐(终浓度50mmol/L缓冲液)，NAD(P)H(终浓度0.04mmol/L缓冲液)构成反应体系。30℃，转速150r/min条件下反应5min取样检测酶活。同样条件下，以大肠杆菌BL21(DE3)以及大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a菌体破碎上清经透析得到的截留液作为对照。
酶活单位(U)定义为：在30℃、pH7.0条件下，1min内消耗1μmolNAD(P)H所需的酶量定义为1U。NAD(P)H的消耗量采用酶标仪在340nm下测定。根据体系中NAD(P)H的消耗量计算重组羰基还原酶RtSCR9的酶活。测定结果见表1。
表1重组羰基还原酶RtSCR9的酶活测定
| 菌株/质粒 | 酶活(U/mg) |
| 大肠杆菌BL21(DE3) | 0 |
| 大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a | 0 |
| 大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-rtscr9 | 6.9 |
实施例7：重组羰基还原酶RtSCR9辅酶类型测定
催化体系组成及催化条件如下：10mL磷酸盐缓冲液(100mM,pH7.0)中加入实施例5制备的重组羰基还原酶RtSCR9纯酶(终浓度为0.1g/L)，N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐(终浓度50mmol/L)，NADH或者NADPH(0.04mmol/L缓冲液)构成反应体系。30℃，转速150r/min条件下反应5min后取样检测酶活(方法同实施例6)。同样条件下，以不加辅酶的反应液作为对照。测定结果见表2。
表2重组羰基还原酶RtSCR9辅酶偏好性
| 辅酶类型 | 酶活(U/mg) |
| 对照 | 0 |
| NADH | 0.8 |
| NADPH | 6.9 |
结果表明，该羰基还原酶以NADPH为辅因子时，酶活力远远高于以NADH作为辅酶的酶活力，该酶是一种NADPH辅酶依赖型羰基还原酶。
实施例8：重组羰基还原酶RtSCR9辅酶再生体系
以实施例4方法获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21/pET28a-rtscr9湿菌体作为生物催化剂，以N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐为底物。
(1)羰基还原酶RtSCR9辅酶再生体系的选择
将葡萄糖脱氢酶(GDH)(来源于Exiguobacteriumsibiricum255-15，GenBank:ACB59697.1)的重组菌BL21(DE3)/pET28b-gdh)菌体(甘油管)和甲酸脱氢酶(FDH)(来源于Candidaboidinii，GenBank:AF004096)的重组菌BL21(DE3)/pET28b-fdh)菌体(甘油管)分别接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以1％接种量(v/v)接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、5000rpm离心5min，弃去上清液，收集沉淀，即获得葡萄糖脱氢酶湿菌体或甲酸脱氢酶湿菌体。该菌体可直接应用于辅酶再生体系。
转化体系：磷酸钾缓冲液(100mM,pH7.0)10mL，羰基还原酶RtSCR9湿菌体量0.4g(菌体干重为0.1g)，底物N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐500mmol/L缓冲液，NADP+0.5mmol/L缓冲液，辅助底物(辅助底物为下列之一：500mmol/L缓冲液的葡萄糖、500mmol/L缓冲液的甲酸铵、30％v/v缓冲液的异丙醇或30％v/v缓冲液的乙醇)，脱氢酶(脱氢酶为下列之一：葡萄糖脱氢酶(GDH)或甲酸脱氢酶(FDH)，脱氢酶湿菌体用量为0.4g)，30℃，转速150r/min摇床反应2h。反应结束后用6MNaOH调pH至11～12，等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，浓缩物用HPLC流动相溶解，HPLC检测转化率以及ee。同样条件下，以不加辅酶循环体系的反应液作为对照。结果见表3。
表3不同辅酶循环系统对催化反应的影响
结果表明当选择葡萄糖/GDH作为辅酶再生体系时，转化率最高，达99％。
(2)羰基还原酶RtSCR9辅酶再生循环体系中葡萄糖脱氢酶菌体量的优化
转化体系：磷酸钾缓冲液(100mM,pH7.0)10mL，羰基还原酶RtSCR9湿菌体量0.4g(菌体干重为0.1g，实施例4方法制备)，N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐500mmol/L缓冲液，NADP+0.5mmol/L缓冲液，葡萄糖500mmol/L缓冲液，步骤(1)制备的葡萄糖脱氢酶湿菌体量分别为0.1g、0.2g、0.4g、0.6g、0.8g、1.0g(菌体干重分别为0.25g、0.05g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g)，30℃，转速150r/min摇床反应2h。反应结束后用6MNaOH调pH至11～12，等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，浓缩物用HPLC流动相溶解，HPLC检测转化率。同样条件下，以不加辅酶循环体系的反应液作为对照。优化结果见表4。
表4RtSCR9辅酶再生循环体系中GDH菌体量的优化
| GDH(湿菌体g) | 转化率(％) |
| 0 | 68 |
| 0.1 | 99 |
| 0.2 | 99 |
| 0.4 | 99 |
| 0.6 | 99 |
| 0.8 | 99 |
| 1.0 | 99 |
结果表明当RtSCR9菌体量与葡萄糖脱氢酶菌体量重量比为1:0.25时，辅酶再生循环已基本能够满足RtSCR9对NADPH的需求。以上催化反应产物ee均为99.9％。
(3)羰基还原酶RtSCR9辅酶再生循环体系中葡萄糖浓度的优化。
转化体系：磷酸钾缓冲液(100mM,pH7.0)10mL，羰基还原酶RtSCR9湿菌体量0.4g(菌体干重为0.1g，实施例4制备)，N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐500mmol/L缓冲液，NADP+0.5mmol/L缓冲液，葡萄糖浓度分别为250mmol/L、500mmol/L、1000mmol/L、1500mmol/L、2000mmol/L、2500mmol/L、3000mmol/L、3500mmol/L、4000mmol/L和4500mmol/L缓冲液。步骤(1)制备的葡萄糖脱氢酶湿菌体量0.1g(菌体干重为0.25g)，30℃，转速150r/min下反应2h。反应结束后用6MNaOH调pH至11～12，等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，HPLC检测转化率与ee值。同样条件下，以不加葡萄糖的反应液作为对照。结果见表5。
表5羰基还原酶RtSCR9辅酶再生循环体系中葡萄糖浓度的优化
| 葡萄糖(mmol/L) | 转化率(％) |
| 0 | 12 |
| 250 | 68 |
| 500 | 92 |
| 1000 | 93 |
| 1500 | 94 |
| 2000 | 96 |
| 2500 | 98 |
| 3000 | 99 |
| 3500 | 99 |
| 4000 | 99 |
| 4500 | 99 |
结果表明当葡萄糖浓度为3000mmol/L时，辅酶再生循环体系已基本上能够满足羰基还原酶RtSCR9对NADPH的需求。以上催化反应产物ee为99.9％。
(4)羰基还原酶RtSCR9辅酶再生循环体系中NADP+浓度的优化。
转化体系：磷酸钾缓冲液(100mM,pH7.0)10mL，羰基还原酶RtSCR9湿菌体量0.4g(菌体干重为0.1g，实施例4制备)，N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐500mmol/L缓冲液，NADP+分别为0.2μmol/L、0.5μmol/L、1.0μmol/L、1.5μmol/L、2.0μmol/L和3.0μmol/L缓冲液。葡萄糖浓度为3000mmol/L缓冲液。步骤(1)制备的葡萄糖脱氢酶湿菌体量0.4g(菌体干重为0.1g)，30℃，转速150r/min下反应2h。反应结束后用6MNaOH调pH至11～12，等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，HPLC检测转化率与ee值。同样条件下，以不加NADP+的反应液作为对照。优化结果见表6。
表6羰基还原酶RtSCR9辅酶再生循环体系中NADP+浓度的优化
| NADP+(μmol/L) | 转化率(％) |
| 0 | 90 |
| 0.2 | 95 |
| 0.5 | 97 |
| 1.0 | 98 |
| 1.5 | 99 |
| 2.0 | 99 |
结果表明羰基还原酶RtSCR9催化底物的转化率随NADP+浓度增加而增加，当NADP+浓度大于1.5μmol/L时，转化率趋于稳定。以上催化反应产物ee均为99.9％。
实施例9：重组羰基还原酶RtSCR9在制备(S)-N,N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺中的应用
(1)以实施例4方法获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-rtscr9作为生物催化剂，以N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐为底物，进行生物催化反应制备(S)-N,N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺。
催化体系组成及催化条件如下：10mL磷酸盐缓冲液(100mM,pH7.0)中加入0.4g羰基还原酶RtSCR9湿菌体(菌体干重为0.1g)，0.1g葡萄糖脱氢酶湿菌体(菌体干重为0.025g，实施例8方法制备)，N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐1000mmol/L缓冲液，NADP+0.75mmol/L缓冲液，葡萄糖6000mmol/L缓冲液构成反应体系。30℃，转速150r/min条件下水浴摇床反应4h，反应结束后用6MNaOH调pH至11～12，等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，HPLC检测转化率与ee值。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a湿菌体代替上述重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-rtscr9作为阴性对照。4h后底物的转化率>99％，ee为99.9％。空白对照与阴性对照均显示对底物无活性。
(2)N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺与N,N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的液相检测方法
高效液相色谱仪器：ShimadzuLC-20AD系统-SPD-20A紫外检测器。
检测转化率以及ee时手性色谱柱均为ChiralcelOJ-H(150×2.1mm,5μm)，流动相：正庚烷：乙醇：二乙胺＝97:3:0.1，流速0.2mL/min，检测波长235nm。N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺、(S)-N,N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺以及(R)-N,N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的保留时间分别为：5.8、6.4和7.1min。
实施例10：重组羰基还原酶RtSCR9在制备(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺中的应用
(1)以实施例4中获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-rtscr9湿菌体作为生物催化剂，以N-甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐为底物，进行生物转化反应制备(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺。
催化体系组成及催化条件如下：10mL磷酸钾缓冲液(pH7.0)中加入0.4g重组羰基还原酶RtSCR9湿菌体(菌体干重为0.1g)和0.1g葡萄糖脱氢酶湿菌体(菌体干重为0.025g，实施例8方法制备)，N-甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐250mmol/L缓冲液，NADP+0.2mmol/L缓冲液，葡萄糖1500mmol/L缓冲液。30℃，转速150r/min条件下反应4h。反应结束后加6MNaOH水溶液调pH至11～12。再加入等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，浓缩物用HPLC流动相溶解，HPLC检测产率以及ee。同样条件下，以不含菌体的反应液作为空白对照，以大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a湿菌体代替上述重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-rtscr9湿菌体作为阴性对照。底物的转化率为57％，ee>99％。空白对照与阴性对照均显示对底物无活性。
(2)N-甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺与N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的液相检测方法
高效液相色谱仪器：ShimadzuLC-20AD系统-SPD-20A紫外检测器。
检测转化率以及ee时手性色谱柱均为ChiralcelOJ-H(150×2.1mm,5μm)，流动相：正庚烷：乙醇：二乙胺＝97:3:0.1，流速0.2mL/min，检测波长240nm。N-甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺、(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺以及(R)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的保留时间分别为：2.7、33.9和40.1min。
实施例11：重组羰基还原酶RtSCR9在制备(R)-3-氯-1-(2-噻吩基)-1-丙醇中的应用
(1)以实施例4中获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-rtscr9湿菌体作为生物催化剂，以3-氯丙酰基-2-噻吩为底物，进行生物转化反应制备(R)-3-氯-1-(2-噻吩基)-1-丙醇。
催化体系组成及催化条件如下：10mL磷酸钾缓冲液(pH7.0)中加入0.4g重组羰基还原酶RtSCR9湿菌体(菌体干重为0.1g)和0.1g葡萄糖脱氢酶湿菌体(菌体干重为0.025g，实施例8方法制备)，3-氯丙酰基-2-噻吩0.44g(终浓度250mmol/L缓冲液，初始浓度为2500mmol/LDMSO)，NADP+0.2mmol/L缓冲液，葡萄糖1500mmol/L缓冲液。30℃，转速150r/min条件下反应4h。反应结束后加入等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，浓缩物用流动相溶解，HPLC检测产率以及ee。同样条件下，以不含菌体的反应液作为空白对照，以大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a湿菌体代替上述重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-rtscr9湿菌体作为阴性对照。底物的转化率为98％，ee>99％。空白对照与阴性对照均显示对底物无作用。
(2)3-氯丙酰基-2-噻吩与3-氯-1-(2-噻吩基)-1-丙醇的液相检测方法
高效液相色谱仪器：ShimadzuLC-20AD系统-SPD-20A紫外检测器。
检测转化率以及ee时手性色谱柱均为ChiralcelOD-H(250×4.6mm,5μm)，流动相：正己烷：异丙醇＝98:2，流速1.0mL/min，检测波长254nm。3-氯丙酰基-2-噻吩、(S)-3-氯-1-(2-噻吩基)-1-丙醇以及(R)-3-氯-1-(2-噻吩基)-1-丙醇的保留时间分别为：17.5、25.5和28.2min。
实施例12：重组羰基还原酶RtSCR9在制备(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯中的应用
(1)以实施例4中获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-rtscr9湿菌体作为生物催化剂，以3-酮-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯为底物，进行生物转化反应制备(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯。
催化体系组成及催化条件如下：10mL磷酸钾缓冲液(pH7.0)中加入0.4g重组羰基还原酶RtSCR9湿菌体(菌体干重为0.1g)和0.1g葡萄糖脱氢酶湿菌体(菌体干重为0.025g，实施例8方法制备)，3-酮-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯0.50g(终浓度250mmol/L缓冲液，初始浓度为2500mmol/LDMSO)，NADP+0.2mmol/L缓冲液，葡萄糖1500mmol/L缓冲液。30℃，转速150r/min条件下反应4h。反应结束后加入等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，浓缩物用流动相溶解，GC色谱检测产率以及ee。同样条件下，以不含菌体的反应液作为空白对照，以大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a湿菌体代替上述重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-rtscr9湿菌体作为阴性对照。底物的转化率为98％，ee>99％。空白对照与阴性对照均显示对底物无作用。
(2)3-酮-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯与3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯的气相检测方法
气相色谱仪器：ShimadzuGC-14C系统-FID检测器。
检测转化率以及ee时手性色谱柱均为BGB-174(30m×0.25mm×0.25μM)，进样口温度：240℃，检测器温度：240℃，柱温：160℃。载体为氦气，流速：1.5mL/min。3-酮-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯、(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯以及(R)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯的保留时间分别为：4.2、17.6和19.1min。
实施例13：重组羰基还原酶RtSCR9在制备(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙腈中的应用
(1)以实施例4中获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-rtscr9湿菌体作为生物催化剂，以3-酮-3-(2-噻吩基)丙腈为底物，进行生物转化反应制备(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙腈。
催化体系组成及催化条件如下：10mL磷酸钾缓冲液(pH7.0)中加入0.4g重组羰基还原酶RtSCR9湿菌体(菌体干重为0.1g)和0.1g葡萄糖脱氢酶湿菌体(菌体干重为0.025g，实施例8方法制备)，3-酮-3-(2-噻吩基)丙腈0.38g(终浓度250mmol/L缓冲液，初始浓度为2500mmol/LDMSO)，NADP+0.2mmol/L缓冲液，葡萄糖1500mmol/L缓冲液。30℃，转速150r/min条件下反应4h。反应结束后加入等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，浓缩物用流动相溶解，HPLC检测产率以及ee。同样条件下，以不含菌体的反应液作为空白对照，以大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a湿菌体代替上述重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-rtscr9湿菌体作为阴性对照。底物的转化率为99％，ee>99％。空白对照与阴性对照均显示对底物无作用。
(2)3-酮-3-(2-噻吩基)丙腈与3-羟基-3-(2-噻吩基)丙腈的液相检测方法
高效液相色谱仪器：ShimadzuLC-20AD系统-SPD-20A紫外检测器。
检测转化率以及ee时手性色谱柱均为ChiralcelOJ-H(150×2.1mm,5μm)，流动相：正己烷：异丙醇＝85：15，流速0.2mL/min，检测波长230nm。3-酮-3-(2-噻吩基)丙腈、(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙腈以及(R)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙腈的保留时间分别为：2.6、9.1和10.1min。
实施例14：重组羰基还原酶RtSCR9在制备6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯中的应用
(1)以实施例4中获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-rtscr9湿菌体作为生物催化剂，以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，进行生物转化反应制备6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯。
催化体系组成及催化条件如下：10mL磷酸钾缓冲液(pH7.0)中加入0.4g重组羰基还原酶RtSCR9湿菌体(菌体干重为0.1g)和0.1g葡萄糖脱氢酶湿菌体(菌体干重为0.025g，实施例8方法制备)，(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯0.24g(终浓度100mmol/L缓冲液，初始浓度为1000mmol/LDMSO)，NADP+0.08mmol/L缓冲液，葡萄糖600mmol/L缓冲液。30℃，转速150r/min条件下反应8h。反应结束后加入等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，浓缩物用流动相溶解，HPLC检测产率以及ee。同样条件下，以不含菌体的反应液作为空白对照，以大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a湿菌体代替上述重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-rtscr9湿菌体作为阴性对照。底物的转化率为90％，ee>99％。空白对照与阴性对照均显示对底物无作用。
(2)(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯与6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯的液相检测方法
高效液相色谱仪器：ShimadzuLC-20AD系统-SPD-20A紫外检测器。
检测转化率以及ee时手性色谱柱均为HypersilODS2C18(4.6mm×250mm,2.5μm)，流动相：乙腈：水＝1：3，流速1mL/min，检测波长220nm。(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯以及6-氯-(3S,5S)-二羟基己酸叔丁酯丙腈的保留时间分别为：16.4、13.8和14.2min。
实施例15：重组羰基还原酶RtSCR9在制备(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮中的应用
(1)以实施例4中获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-rtscr9湿菌体作为生物催化剂，以(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮为底物，进行生物转化反应制备(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮。
催化体系组成及催化条件如下：10mL磷酸钾缓冲液(pH7.0)中加入0.4g重组羰基还原酶RtSCR9湿菌体(菌体干重为0.1g)和0.1g葡萄糖脱氢酶湿菌体(菌体干重为0.025g，实施例8方法制备)，(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮0.35g(终浓度100mmol/L缓冲液，初始浓度为1000mmol/LDMSO)，NADP+0.08mmol/L缓冲液，葡萄糖600mmol/L缓冲液。30℃，转速150r/min条件下反应8h。反应结束后加入等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，浓缩物用流动相溶解，HPLC检测产率以及ee。同样条件下，以不含菌体的反应液作为空白对照，以大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a湿菌体代替上述重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-rtscr9湿菌体作为阴性对照。底物的转化率为91％，ee>99％。空白对照与阴性对照均显示对底物无作用。
(2)(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮与(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮的液相检测方法
高效液相色谱仪器：ShimadzuLC-20AD系统-SPD-20A紫外检测器。
检测转化率以及ee时手性色谱柱均为ChiralcelOD-Hcolumn(4.6mm×250mm,2.5μm)，流动相：正己烷：乙醇＝80：20，流速1mL/min，检测波长215nm。(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮、(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮以及(4S)-3-[(5R)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮的保留时间分别为：22.0、19.7和17.2min。
实施例16：重组羰基还原酶RtSCR9在制备[S-(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯中的应用
(1)以实施例4中获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-rtscr9湿菌体作为生物催化剂，以[(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羰基丙基]苯甲酸甲酯为底物，进行生物转化反应制备[S-(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯。
催化体系组成及催化条件如下：10mL磷酸钾缓冲液(pH7.0)中加入0.4g重组羰基还原酶RtSCR9湿菌体(菌体干重为0.1g)和0.1g葡萄糖脱氢酶湿菌体(菌体干重为0.025g，实施例8方法制备)，[(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羰基丙基]苯甲酸甲酯0.46g(终浓度100mmol/L缓冲液，初始浓度为1000mmol/LDMSO)，NADP+0.08mmol/L缓冲液，葡萄糖600mmol/L缓冲液。30℃，转速150r/min条件下反应8h。反应结束后加入等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，浓缩物用流动相溶解，HPLC检测产率以及ee。同样条件下，以不含菌体的反应液作为空白对照，以大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a湿菌体代替上述重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-rtscr9湿菌体作为阴性对照。底物的转化率为90％，ee>99％。空白对照与阴性对照均显示对底物无作用。
(2)[(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羰基丙基]苯甲酸甲酯与[S-(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯的液相检测方法
高效液相色谱仪器：ShimadzuLC-20AD系统-SPD-20A紫外检测器。
检测转化率以及ee时手性色谱柱均为ChiralcelOD-Hcolumn(4.6mm×250mm,2.5μm)，流动相：正己烷：异丙醇＝80：20，流速1mL/min，检测波长287nm。[(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羰基丙基]苯甲酸甲酯、[S-(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯以及[R-(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯的保留时间分别为：12.8、14.4和16.4min。
由以上实验结果可知，本发明得到的含有羰基还原酶基因的重组大肠杆菌具有较强的羰基还原的能力，可直接以含酶的菌体细胞为酶源进行生物催化或者转化反应。羰基还原酶RtSCR9(SEDIDNO.2)作为转化用酶，可以利用N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐、N-甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐、3-氯丙酰基-2-噻吩、3-酮-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯、3-酮-3-(2-噻吩基)丙腈、(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮以及[(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羰基丙基]苯甲酸甲酯为底物，进行生物转化反应制备高光学纯的药物手性中间体(S)-N,N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺、(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺、(R)-3-氯-1-(2-噻吩基)-1-丙醇、(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯以及(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙腈、6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯、(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮及[S-(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯。
Claims (10)
1.一种羰基还原酶基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列为SEQIDNO：1所示。
2.一种权利要求1所述羰基还原酶基因编码的重组羰基还原酶，其特征在于所述重组羰基还原酶的氨基酸序列为SEQIDNO：2所示。
3.一种由权利要求1所述羰基还原酶基因构建的重组载体。
4.一种由权利要求3所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
5.一种权利要求1所述的羰基还原酶基因在制备重组羰基还原酶中的应用，其特征在于所述的应用为：构建含有所述羰基还原酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组羰基还原酶的菌体细胞。
6.一种权利要求2所述重组羰基还原酶在制备手性药物中间体中的应用，其特征在于所述应用为：以含羰基还原酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，于pH值为6～10的缓冲液中，加入底物，辅助底物和NAD(P)+，在20～40℃、50～250rpm条件下反应，反应完全后，获得含药物手性中间体的混合液，将混合液分离纯化，获得手性药物中间体；所述底物为N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐、N-甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐、3-氯丙酰基-2-噻吩、3-酮-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯、3-酮-3-(2-噻吩基)丙腈、(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮和[(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羰基丙基]苯甲酸甲酯中的一种；所述辅助底物为葡萄糖、甲酸铵、异丙醇或无水乙醇，所述辅助底物为葡萄糖时，添加葡萄糖脱氢酶构成辅助底物体系，所述辅助底物为甲酸铵时，添加甲酸铵脱氢酶构成辅助底物体系；所述催化剂的用量以湿菌体的重量计为20～200g/L缓冲液，所述底物的初始浓度为50～2000mmol/L缓冲液，所述辅助底物的用量为25～18000mmol/L缓冲液，所述葡萄糖脱脱氢酶或甲酸铵脱氢酶的用量以含葡萄糖脱氢酶基因或甲酸铵脱氢酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体重量计均为10～200g/L缓冲液，所述NAD(P)+的用量为0～3mmol/缓冲液。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述底物3-氯丙酰基-2-噻吩、3-酮-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯以及3-酮-3-(2-噻吩基)丙腈以2500mmol/L的DMSO溶液的形式加入；所述底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮及[(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羰基丙基]苯甲酸甲酯以1000mmol/LDMSO溶液的形式加入。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含有重组羰基还原酶基因的工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、5000rpm离心5min，弃去上清液，收集湿菌体。
9.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于所述的反应以含重组羰基还原酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，于pH值为6～10的缓冲液中，加入底物，葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和NAD(P)+，在30℃、150rpm条件下反应，反应完全后，获得含手性药物中间体的混合液；所述底物为N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐、N-甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐、3-氯丙酰基-2-噻吩、3-酮-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯、3-酮-3-(2-噻吩基)丙腈、(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮和[(E)]-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羰基丙基]苯甲酸甲酯中的一种；所述催化剂的用量以湿菌体的重量计为40g/L缓冲液，所述底物的初始浓度为50～2000mmol/L缓冲液，所述辅助底物的用量为300～12000mmol/L缓冲液，所述葡萄糖脱脱氢酶的用量以含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体重量计为10g/L缓冲液，所述NAD(P)+的用量为0～3mmol/L缓冲液。
10.一种提供权利要求1所述羰基还原酶基因的圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)ZJB2014212，所述圆红冬孢酵母ZJB2014212保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2014年12月2日，保藏编号CCTCCNo：M2014613，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072。
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