CN101985616A - 一种制备固定化腺苷甲硫氨酸合成酶和腺苷甲硫氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备固定化腺苷甲硫氨酸合成酶和腺苷甲硫氨酸的方法，技术特征在于：将氨基树脂载体Seplite LX-1000HA与戊二醛溶液交联，再经过戊二醛交联的氨基树脂载体与重组腺苷甲硫氨酸合成酶溶液反应，得到固定化腺苷甲硫氨酸合成酶；本发明使用的氨基树脂载体蛋白固定率高，固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的酶活力回收率高，稳定性和连续操作性能优良。利用该固定化腺苷甲硫氨酸合成酶生产腺苷甲硫氨酸，反应操作简单，生产周期短，产物纯化容易，而且固定化酶可以重复利用，大幅度降低生产成本并提高生产效率，为腺苷甲硫氨酸的工业化生产提供了一条新的途径。

Description

一种制备固定化腺苷甲硫氨酸合成酶和腺苷甲硫氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种制备固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的方法，以及采用制备的固定化腺苷甲硫氨酸合成酶制备腺苷甲硫氨酸的方法，涉及酶固定化以及利用固定化酶催化合成高价值化合物的技术领域。

背景技术

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)是广泛存在于生物体内的一种重要代谢中间体，1952年首先由Cantoni发现，相对分子质量399。SAM是双手性物质，具有2种异构体：(R，S)-SAM和(S，S)-SAM，只有(S，S)-SAM具有生物活性。在生物体内，SAM是由L-甲硫氨酸(L-Met)和三磷酸腺苷(ATP)经腺苷甲硫氨酸合成酶催化合成。由于SAM含有一个高能锍原子能激活相邻碳原子的亲核攻击反应，从而具有转甲基、转硫基、转氨丙基等作用。SAM参与了体内40多种生化反应，与蛋白质、核酸、神经递质、磷脂质和维生素的合成密切相关，并连接多胺和谷胱甘肽的转化。在欧洲，SAM已作为处方药广泛用于肝病、抑郁症、关节炎等疾病的治疗；在美国，1999年FDA批准SAM作为保健品上市，在美国已成为最畅销的营养品之一；2000年我国开始进口，每年有1亿多元的销售，市场前景看好。目前国内使用的SAM主要是德国基诺(Knol1)和意大利RADIUM FARMAS.R.L.(IT)两个外资公司的产品，其价格昂贵，不能普及使用。我国人口众多，有相当数量的肝病和关节炎患者，且随着城市生活节奏加快和工作压力加大，抑郁症患者明显增多。同时SAM具有副作用小，疗效显著等特点，在我国必将有着巨大的应用前景。我国SAM的开发尚处于起步阶段，市场需求在不断增长，但SAM售价昂贵。因此，建立廉价有效的生产工艺是SAM大规模推广应用的关键。目前SAM制备方法主要有化学合成法、发酵法和酶促转化法三种。

1化学合成法：

目前，化学合成法制备SAM主要有三条途径：①利用5’-甲硫腺苷和DL-2-氨基-4-溴丁基酸化学合成消旋的SAM，合成的SAM 50％具有生物活性；②通过S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine，SAH)和甲基供体CH3I或CH3)3SI催化合成。但反应底物SAH价格昂贵，而且产物中也含有20-30％没有生物活性的(R，S)-SAM异构体；③以价格低廉的腺苷(adenosine)为底物和亚硫酰氯(thionyl chloride)进行反应制备5-(氯甲基)腺苷盐酸盐(5′-chloromethyl adenosine hydrochloride)；以L-甲硫氨酸为底物在-30℃至-40℃的条件下生成L-同型半胱氨酸(L-homocysteine)；以5-(氯甲基)腺苷盐酸盐和L-同型半胱氨酸为底物在70℃至80℃的条件下进行缩合反应得到S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)；以三甲基氧鎓四氟硼酸盐(trimethyloxonium tetrafluoroborate)为甲基供体对SAH进行甲基化得到终产物SAM。尽管该方法原料价格低廉，但是反应过程复杂，反应温度极端，反应周期长，并且反应产物仅有60％～65％具有生物活性。由于化学法合成SAM存在产率低、反应条件苛刻、反应产物异构体多、分离纯化困难以及环境污染等不足，现已很少使用。

2微生物发酵法：

微生物发酵法是20世纪60年代至今工业化生产SAM的主要途径。一些微生物尤其是酵母属(Saccharomyces)的一些菌株，在含有L-甲硫氨酸的培养基中生长时，可以在细胞内积累较高浓度的SAM。通过这些微生物的大规模发酵，然后提取精制，获得有生物活性的SAM。但发酵法的缺点是终产物积累量低、原料转化率低、生产周期长以及纯化工艺复杂等，从而导致了其价格居高不下，限制了SAM的广泛生产及应用。发酵法主要是采用在酵母菌培养基中添加L-甲硫氨酸发酵生产SAM，是60年代至80年代生产SAM的主要方法。酿酒酵母属(Saccharomyces)的一些自然菌种在相对大量的L-甲硫氨酸存在条件下，便能够在细胞内催化ATP与L-甲硫氨酸反应合成SAM。Shiozaki等通过筛选300多株不同的菌株，分离到一株清酒酵母(Saccharomycessake k-6)，在10ml培养基小量发酵产出1.55g/L的SAM。进一步优化培养条件，该菌在10L发酵罐中培养7d后SAM产量高达10.8g/L(Shiozaki S，Shimizu S，Yamada H.JBiotechnol，2006，24(6)：345-354.)。He等向毕赤酵母中插入外源的腺苷甲硫氨酸合成酶基因SAM2，同时敲除SAM分解代谢途径中的β-胱硫醚合成酶基因，通过超表达SAM2和切断SAM的代谢途径，使SAM产量比起始菌株提高了56倍。优化发酵条件，最终摇瓶中SAM的最高产量达3.6g/L，5L发酵罐中SAM产量达13.5g/L(He J，Deng J，Zheng Y，etal.Journal of Biotechnology，2006，126(4)：519-527)。Appling等构建了由亚甲基四氢叶酸还原酶和腺苷甲硫氨酸合成酶组成的嵌合基因，转化酿酒酵母表达SAM，使L-甲硫氨酸的转化率提高到40％(Appling；Dean R.United States Patent：7,033,815)；尽管发酵法生产SAM的技术在不断改进，但是发酵法存在以下几个固有和难以解决的问题：(1).底物L-甲硫氨酸转化率低；(2).发酵产物为(-)SAM和(+)SAM的混合物，而具有生物活性的(-)SAM仅占70％左右，并且(-)SAM和(+)SAM难以分离；(3).酵母菌发酵周期长(3-5天)，需要消耗大量的能源；(4).酵母菌破碎后的SAM溶液成分复杂，SAM提取纯化工艺繁多，所以导致SAM回收率较低。

3酶促转化法：

酶促转化法与化学合成法和发酵法相比，具有底物转化率高、产物积累量高、分离提纯容易、反应周期短及环境友好等优点，因而是较为有效的工业化生产方法。酶促转化法主要利用腺苷甲硫氨酸合成酶催化底物L-甲硫氨酸和ATP生成(-)SAM，酶促反应如下式所示：

L-Methionine+ATP+H2O+E→[E·SAM·PPPi]→E+SAM+Pi+PP

然而腺苷甲硫氨酸合成酶在动物、植物和微生物中含量少、酶活低、且分离纯化困难，因此通过酶促转化法生产SAM受到腺苷甲硫氨酸合成酶活力的限制，因此酶促转化法生产SAM的关键问题就是要得到大量高活性的固定化腺苷甲硫氨酸合成酶。基因工程的发展使获得大量高活性的腺苷甲硫氨酸合成酶成为可能，我们课题组构建了高效表达腺苷甲硫氨酸合成酶的重组大肠杆菌，重组菌的酶活性比原始菌提高了157倍(牛卫宁；左晓佳；丁焰等，精细化工2009，26：288-292)。

目前，文献报道的酶促转化法生产SAM所使用的腺苷甲硫氨酸合成酶均为游离酶，Park等研究发现在800mmol/L pTsONa存在的条件下，大肠杆菌腺苷甲硫氨酸合成酶可以将30mmol/L的L-甲硫氨酸在8h内完全转化(Park J，Junzhe Tai，Roessner C A，et al Bioorg Med Chem，1995，5(19)：2203～2206)；关晶华等在450L的生物反应罐中使用大肠杆菌腺苷甲硫氨酸合成酶游离酶催化合成SAM，反应8h后SAM的收率达到87％左右(关晶华；许晓；陈新玲等，中国医药导报2009，6：28-30)；席玥在毕赤酵母中表达了SAM2，在50L发酵罐中诱导表达5d后，SAM2表达量达到2.49g/L，占到菌体总可溶性蛋白的20％左右，破碎细胞提取粗酶液催化合成SAM，反应8h可以将约20mmol/L的L-甲硫氨酸几乎完全转化(席玥.酶法生产S-腺苷甲硫氨酸的研究[D].吉林：吉林大学，2005)。未见使用固定化腺苷甲硫氨酸合成酶催化合成SAM的报道。

与游离酶催化相比，固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不稳定性，具有可反复或连续使用、易与反应产物分离等显著优点，酶的利用效率高、可连续操作及自动化控制、工艺简便、生产成本低等一系列优点。在工业化生产中，固定化酶载体通常采用强度较高的氨基树脂载体或者环氧载体。这两种树脂载体性质非常稳定，适宜长期运输、储存及酶与载体长时间反应，载体均表现出很高的稳定性。但是我们在研究中发现使用环氧树脂固定化的腺苷甲硫氨酸合成酶没有催化活性，可能是因为树脂的环氧基团和酶催化中心的氨基酸发生交联反应，从而导致酶失活。而氨基树脂固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的蛋白固定率以及酶活性回收率均较高，是固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的理想载体。

发明内容

要解决的技术问题

为了避免现有技术的不足之处，本发明提出一种制备固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的方法，以及采用制备的固定化腺苷甲硫氨酸合成酶制备腺苷甲硫氨酸的方法。

本发明的思想在于：首先，对重组腺苷甲硫氨酸合成酶进行固定化，然后通过固定化酶催化底物DL-甲硫氨酸和三磷酸腺苷(ATP)生产腺苷甲硫氨酸。固定化酶作为催化剂，便于酶的回收和重复使用、提高酶的稳定性、可连续操作及自动化控制、工艺简便，从而大幅度降低腺苷甲硫氨酸的生产成本，涉及酶固定化以及利用固定化酶催化合成高价值化合物的技术领域。

技术方案

一种固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的制备方法，其特征在于步骤如下：

步骤1：将氨基树脂载体Seplite LX-1000HA与1～5％的戊二醛溶液交联2～10h；

步骤2：将步骤1经过戊二醛交联的氨基树脂载体与重组腺苷甲硫氨酸合成酶溶液在20～35℃下反应10～25h，得到固定化腺苷甲硫氨酸合成酶；所述重组腺苷甲硫氨酸合成酶与氨基树脂载体Seplite LX-1000HA的比例为5～40mg/g树脂。

所述重组腺苷甲硫氨酸合成酶是将来源于大肠杆菌的腺苷甲硫氨酸合成酶基因经大肠杆菌表达得到的腺苷甲硫氨酸合成酶。

所述重组腺苷甲硫氨酸合成酶与氨基树脂载体Seplite LX-1000HA的比例为20mg/g树脂。

一种利用上述任一种固定化腺苷甲硫氨酸合成酶生产腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于步骤如下：

步骤1：配制固定化腺苷甲硫氨酸合成酶催化生产腺苷甲硫氨酸的反应液，反应液组成如下：Tris 100mmol.L-1、三磷酸腺苷10～30mmol.L-1、DL-甲硫氨酸25～75mmol.L-1、氯化钾100mmol.L-1、硫酸镁20～60mmol.L-1和对甲基苯磺酸钠400～800mmol.L-1，溶解后调pH值至6.0～8.0；

步骤2：固定化腺苷甲硫氨酸合成酶装柱，在35℃下将反应液以1.0～4.0倍柱床体积/小时的流速过柱，收集流出液，得到腺苷甲硫氨酸溶液。

有益效果

本发明提出的制备固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的方法，以及采用制备的固定化腺苷甲硫氨酸合成酶制备腺苷甲硫氨酸的方法，有益效果如下：本发明使用氨基树脂制备固定化腺苷甲硫氨酸合成酶，固定化酶的酶活力回收率较高，稳定性和装柱后连续操作性能优良，便于连续化生产，且反应产物组成简单稳定易于控制，降低了SAM的后续纯化成本；与游离重组腺苷甲硫氨酸合成酶相比，本发明制备的固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的稳定性得到较大幅度的提高，并具有良好的操作稳定性，固定化酶的连续化操作可以节约酶的用量，还可实现酶与反应液的分离，大幅度降低生产成本并提高生产效率。

另外，本发明解决了目前酵母菌发酵法生产SAM中存在的生产周期长、能源消耗大、底物转化率低、酵母菌破碎后成分复杂、提取方法繁琐以及产品回收率低等问题；同时也解决了游离腺苷甲硫氨酸合成酶催化合成SAM中存在的游离酶稳定性差、活性损失大、不适合连续化操作以及酶与反应液分离难度大等问题，固定化腺苷甲硫氨酸合成酶应用于SAM的生产不仅节约了酶制剂，而且简化了后续分离过程。因此，本发明为SAM的工业化生产提供了一条新的途径，具有巨大的经济效益和社会效益。

具体实施方式

现结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例的材料和方法：

1、细胞和试剂：

大肠杆菌K12、大肠杆菌JM109、大肠杆菌表达质粒pBR322均为本室保存，也可以购买得到；质粒DNA抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自北京博大泰克公司。T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶和各种限制性内切酶、Protein Marker购自Takara公司。Phenyl-Sepharose Fast Flow预装柱购自GE公司，腺苷甲硫氨酸标准品购于Sigma公司，用于固定化酶的氨基树脂载体Seplite LX-1000HA购自西安蓝晓科技有限公司，其余试剂均为国产或进口分析纯。

大肠杆菌工程菌，携带有编码野生型大肠杆菌K12腺苷甲硫氨酸合成酶基因。使用PCR方法以大肠杆菌K12基因组DNA为摸板扩增得到腺苷甲硫氨酸合成酶基因，将该基因连接到表达载体pBR322中并转化到大肠杆菌JM109中进行表达，腺苷甲硫氨酸合成酶基因的表达受到其自身启动子的调控。

所用T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶和限制性内切酶均购自Takara公司。质粒DNA抽提试剂盒、基因组DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自北京博大泰克公司。其它所有试剂均为国产或进口分析纯试剂。

2、培养基：

液体LB/Tet培养基：(10g/L蛋白胨；5g/L酵母粉；10g/L NaCl；15μg/ml四环素盐酸盐)。将蛋白胨、酵母粉和NaCl用去离子水溶解后调节pH＝7.0，在121℃灭菌20分钟，然后在接种时加入四环素盐酸盐，使其终浓度为15μg/ml。

固体LB/Tet培养基：在液体LB/Tet培养基中加入1.5％的琼脂，即制成固体琼脂平板培养基。

3、常规分子生物学操作：

大肠杆菌基因组DNA的提取、腺苷甲硫氨酸合成酶基因的PCR扩增、基因表达等技术参照精编分子生物学实验指南(奥斯伯等.1995)进行。

高效表达腺苷甲硫氨酸合成酶的重组大肠杆菌的发酵：

构建高效表达腺苷甲硫氨酸合成酶的重组大肠杆菌已经在我们课题组发表的论文中公开(牛卫宁；左晓佳；丁焰等，精细化工2009，26：288-292)。

在固体LB/Tet平板上挑取单克隆，然后接入5ml液体LB/Tet培养基中，37℃培养16小时(220转/分钟)。将上述菌液转接到2L液体LB/Tet培养基中，30℃培养16小时(280转/分钟)，使菌体生长达到稳定期。

该重组大肠杆菌也可以在15-38℃的条件下进行培养表达腺苷甲硫氨酸合成酶。当在15℃条件下进行培养，细胞生长到稳定期需要超过30小时，而且腺苷甲硫氨酸合成酶的表达量较低，酶活性为野生大肠杆菌的8倍左右；当在38℃条件下进行培养，细胞生长到稳定期仅需要8小时左右，但是表达的重组腺苷甲硫氨酸合成酶形成的包涵体较多，酶活性为野生大肠杆菌的58倍左右；当在30℃条件下进行培养时，经过16小时左右细胞就能生长达到稳定期，并且表达的腺苷甲硫氨酸合成酶活性最高，经测定为大肠杆菌K12腺苷甲硫氨酸合成酶活性的150多倍。所以重组大肠杆菌表达腺苷甲硫氨酸合成酶在30℃条件下为最佳。将培养后的菌液进行离心，转速为6000rpm，离心10分钟，弃去上清液，收集沉淀的菌体用于后续试验。

重组腺苷甲硫氨酸合成酶的纯化：

(1)粗提取：1L培养液通过离心收集细胞，清洗后用100mL裂解液(100mmol/LTris-HCl，pH 8.0)在冰水浴中超声波(300W，超声3s，间隔5s)处理12min破碎细胞，破碎液在4℃下10000r/min，离心30min，上清液即为粗酶液。

(2)硫酸铵分级盐析：粗酶液中加入终浓度为40％的硫酸铵进行盐析。盐析时缓慢加入硫酸铵并充分搅拌溶解，10000r/min离心20min分离沉淀和可溶组分，沉淀用100mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶解并加入(NH4)₂SO4至终浓度为0.75mol/L，0.22um的滤膜过滤溶液备用。

(3)Phenyl-Sepharose Fast Flow疏水层析：将上述(NH4)₂SO4沉淀的蛋白溶液加入到经Buffer A(Tris-HCl 50mmol/L，EDTA-Na2 2mmol/L，(NH4)₂SO4 0.75mol/L，pH8.0)预平衡的Phenyl-Sepharose Fast Flow柱，流速1ml/min洗脱至基线。然后使用Buffer B(Tris-HCl 50mmol/L，EDTA-Na2 2mmol/L，pH 8.0)直接洗脱得到腺苷甲硫氨酸合成酶溶液，收集备用。

纯化的腺苷甲硫氨酸合成酶的酶活为32μ/mg，纯化倍数3.3倍，酶活总得率73％。

氨基树脂Seplite LX-1000HA固定化腺苷甲硫氨酸合成酶：

取氨基树脂1g于三角瓶中，加入pH＝3.0的1mol/L乳酸-乳酸钠缓冲液浸泡2h活化载体。后倾去缓冲液，除去悬浮于液体中的树脂碎渣等杂志。加入50％戊二醛1.0mL，加入去离子水至体积为25mL，使终浓度为2％，室温下放置5h，期间每隔20min轻轻震荡数次，然后用去离子水洗3次，再用缓冲液淋洗2次，后加入10mL pH＝7的2mg/mL腺苷甲硫氨酸合成酶液，使m(腺苷甲硫氨酸合成酶)∶m(氨基树脂)为1∶50。轻轻摇晃数次，置于室温中(20-35℃)，每隔1h取出轻轻震荡数次，持续15h，弃去上清液，去离子水淋洗3次，得到固定化腺苷甲硫氨酸合成酶。

在制备固定化腺苷甲硫氨酸合成酶过程中，氨基树脂载体和戊二醛的交联时间随着戊二醛的浓度改变而改变。

在氨基树脂载体Seplite LX-1000HA与1～5％的戊二醛溶液的组分配中进行选择，反应时间在2～10h选择；以上述实施例为基准，戊二醛浓度升高5％，交联反应时间就可以缩短为2h；戊二醛浓度1％反应时间需要延长至10h，随着戊二醛浓度的增高，树脂上的氨基能够更快地被醛基交联饱和。腺苷甲硫氨酸合成酶被戊二醛交联的氨基载体固定化的反应温度为20-35℃，反应时间为15h，在20-35℃的温度范围内腺苷甲硫氨酸合成酶的蛋白固定率、酶活回收率以及固定化酶活性差别不大。温度低于20℃反应速度过慢，温度高于35℃会加速腺苷甲硫氨酸合成酶的失活。

重组腺苷甲硫氨酸合成酶与氨基树脂载体Seplite LX-1000HA的比例为5-40mg/g树脂，优选为20mg/g树脂。当与氨基树脂载体反应的腺苷甲硫氨酸合成酶的量较低时，树脂表面的醛基不能被酶分子所饱和，随着酶浓度的增加树脂表面基团逐渐被饱和，固定化酶的单位酶活在逐渐提高，当氨基载体与酶的比例超过20mg/g时，固定化酶的单位酶活趋于稳定，上升缓慢，而总酶活回收率下降较快，表明树脂已经基本被酶分子所饱和。当氨基载体与酶的比例为5mg/g时，蛋白固定率为95.7％，酶活回收率为85.3％，固定化酶的单位酶活为130.6U/g树脂；当氨基载体与酶的比例为20mg/g时，蛋白固定率为85.2％，酶活回收率为76.4％，固定化酶的单位酶活为416.6U/g树脂；当氨基载体与酶的比例为30mg/g时，蛋白固定率为73.7％，酶活回收率为57.1％，固定化酶的单位酶活为404.0U/g树脂。当氨基载体与酶的比例为40mg/g时，蛋白固定率为61.3％，酶活回收率为47.6％，固定化酶的单位酶活为373.5U/g树脂。因此，优选氨基载体与酶的比例为20mg/g。

固定化腺苷甲硫氨酸合成酶活性的测定：

在3ml的反应体系(100mmol/L Tris、100mmol/L KCl、2mmol/L MgSO₄、1mmol/LL-Met、1mmol/L ATP、0.5％的β-巯基乙醇，pH 8.5)中加入适量固定化腺苷甲硫氨酸合成酶进行反应，37℃下温育1h后，离心去除固定化酶，然后加入ω(三氯乙酸)＝10％的水溶液终止反应，离心除去沉淀。以不加酶液的反应液做空白对照。反应上清液用高效液相色谱(HPLC)进行分析，色谱条件为：色谱柱Kromasil C18(5μm，4.6×250mm)；检测波长260nm；流动相(在900mL纯水中加入40mmol乙酸钠和50mL甲醇，使用乙酸溶液调pH 4.6，定容至1L)；流速0.6mL/min。产物腺苷甲硫氨酸(SAM)的保留时间约为8min，底物ATP的保留时间约为5.5min。使用SAM标准品制作色谱峰峰面积和SAM质量浓度之间的标准曲线，计算样品中SAM的质量浓度。酶活力单位定义为：在上述反应条件下，37℃，1h催化形成1μmol SAM所需要的酶量为1个活力单位(1u)。游离腺苷甲硫氨酸合成酶活性测定和固定化酶活性测定方法一致，将固定化酶换成游离酶即可。

固定化酶酶活性回收率＝固定化酶酶活/被固定化的游离酶酶活×100％。

固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的酶学性质：

研究了固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的酶学特性，包括固定化酶的最适反应温度以及温度稳定性、固定化酶的最适pH以及pH稳定性、固定化酶的米氏常数等性质，同时比较了固定化酶与游离酶的酶学性质。

(1)固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的最适反应温度和温度稳定性

取一定量固定化酶和游离酶分别在不同温度(20～55℃)下催化反应5h，测定酶活性，研究温度对酶催化反应的影响，固定化酶活性测定方法同实施例4。研究发现固定化酶的最适温度为45℃，当温度升高至55℃时固定化酶活性为最大酶活性的58％；而游离酶的最适反应温度为40℃，当温度升高至55℃时游离酶的活性已经检测不到。固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的最适反应温度提高了5℃，固定化酶活力随温度的变化曲线较游离酶平缓，说明固定化酶对温度的适应性增强，扩大了固定化酶的应用范围。

取一定量的固定化酶和游离酶分别在20～55℃下保温10h，测定酶的残余活性。结果表明固定化酶的热稳定性较好，在45℃保温10h还残余63％的活性，在55℃保温10h还残余58.8％的活性；而游离酶在45℃保温10h仅残余19％的酶活性，在50℃保温10h检测不到活性。固定化酶的温度耐受性得到了大幅度的提高。

(2)固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的最适pH和pH稳定性

取一定量固定化酶和游离酶分别在pH5～10条件下反应1h，测定产物SAM的生成量，计算酶活性。结果表明固定化酶的最适pH为9，而游离酶的最适pH为8.5；固定化酶在pH＝6的条件下酶活性为最高酶活性的62.1％，游离酶在pH＝6的条件下酶活性仅为最高酶活性的23.6％；固定化酶在pH＝10的条件下酶活性为最高酶活性的85.4％，游离酶在pH＝10的条件下酶活性为最高酶活性的54.7％；因此，固定化酶的最适pH为游离酶有所提高，固定化酶对反应液pH变化的适应性增强。

取一定量固定化酶和游离酶分别在pH5～10条件下保温10h，结果表明，固定化酶的pH稳定性得到了大幅度的提高，固定化酶在pH＝6的条件下保存10h，酶活性为最高酶活性的76.8％，而游离酶仅为4.7％；固定化酶在pH＝9的条件下保存10h，酶活性为最高酶活性的87.8％，而游离酶仅为41.3％。固定化酶在pH5～10的保存条件下稳定性比游离酶得到了大幅度的提高。

(3)固定化腺苷甲硫氨酸合成酶动力学常数的测定

以不同浓度的L-Met和ATP分别与一定量的固定化酶或者游离酶反应，利用HPLC测定产物SAM的量，并计算其反应速度。采用双倒数作图法确定K_m及V_max值。

研究结果表明固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的Km^L-Met为0.28mmol/L，Vmax^L-Met为0.48mmol/(L h)，Km^ATP为0.14mmol/L，Vmax^ATP为0.55mmol/(L h)；而游离酶的Km^L-Met为0.22mmol/L，Vmax^L-Met为1.07mmol/(L h)，Km^ATP为0.52mmol/L，Vmax^ATP为1.05mmol/(L h)。结果表明固定化腺苷甲硫氨酸合成酶对底物L-甲硫氨酸的亲和力略低于游离酶，这可能是因为腺苷甲硫氨酸合成酶被固定化后产生了空间立体障碍和扩散阻力，导致固定化酶的Km^L-Met有所增大；而固定化酶对底物ATP的亲和力大于游离酶，导致固定化酶的Km^ATP减小，这可能是因为氨基树脂载体带正电荷，而底物ATP带有负电荷，氨基树脂对底物ATP有吸附作用，从而使载体周围微环境内底物ATP的浓度高于整个反应体系平均的底物ATP浓度。

(4)固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的储存稳定性和操作稳定性

将固定化酶在4℃冰箱中保存，每10天检测一次其活性，测定其相对酶活力，得到固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的储存稳定性。研究结果表明，固定化腺苷甲硫氨酸合成酶连续储存30天后酶活性没有明显下降，连续储存50天后酶活性还残留86％，而游离酶连续储存10天后，酶活性仅残留28％，连续储存20天后检测不到酶活性。腺苷甲硫氨酸合成酶经固定化后储存稳定性大大提高。

将固定化酶装填于内径15mm的不锈钢夹套层析柱中，酶床高度为300mm，连接衡流泵将反应液以1.5倍柱床体积/h连续反应，使不锈钢夹套的温度保持在35℃，收集流出液，通过HPLC检测流出液中反应产物腺苷甲硫氨酸的含量测定酶的相对活力，每天测定一次。结果表明随着固定化酶反应器连续催化天数的递增，在开始阶段酶活力下降不明显，在第5天酶活力下降为86.3％，在第17天酶活力下降为53.1％，由此可以判断出固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的半衰期在17天左右。

利用固定化腺苷甲硫氨酸合成酶连续催化生产腺苷甲硫氨酸：

将制备的固定化腺苷甲硫氨酸合成酶装填于内径15mm的不锈钢夹套层析柱中，酶床高度为300mm，连接衡流泵将反应液以1.5倍柱床体积/h连续反应，反应液组成为：Tris 100mmol.L-1、三磷酸腺苷10～30mmol.L-1、DL-甲硫氨酸25～75mmol.L-1、氯化钾100mmol.L-1、硫酸镁20～60mmol.L-1和对甲基苯磺酸钠400-800mmol.L-1，溶解后调pH值至7.0。使不锈钢夹套的温度保持在35℃，收集流出液，通过HPLC检测流出液中反应产物腺苷甲硫氨酸的含量。合并流出液即可用于腺苷甲硫氨酸的后续纯化精制。

固定化腺苷甲硫氨酸合成酶连续催化生产腺苷甲硫氨酸的反应底物DL-甲硫氨酸的浓度可以达到75mmol.L-1，相对应ATP的浓度可以达到30mmol.L-1，添加的用于避免催化反应中酶产物抑制作用的对甲基苯磺酸钠浓度为800mmol.L-1；同时，固定化腺苷甲硫氨酸合成酶连续催化生产腺苷甲硫氨酸的反应底物DL-甲硫氨酸的浓度也可以为25mmol.L-1，相对应ATP的浓度为10mmol.L-1，添加的用于避免催化反应中酶产物抑制作用的对甲基苯磺酸钠浓度为400mmol.L-1。在以上的优化条件下，固定化酶催化的底物三磷酸腺苷转化率可以达到95％以上。

Claims (4)

1.一种固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的制备方法，其特征在于步骤如下：

步骤1：将氨基树脂载体Seplite LX-1000HA与1～5％的戊二醛溶液交联2～10h；

步骤2：将步骤1经过戊二醛交联的氨基树脂载体与重组腺苷甲硫氨酸合成酶溶液在20～35℃下反应10～25h，得到固定化腺苷甲硫氨酸合成酶；所述重组腺苷甲硫氨酸合成酶与氨基树脂载体Seplite LX-1000HA的比例为5～40mg/g树脂。

2.根据权利要求1所述的固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的制备方法，其特征在于：所述重组腺苷甲硫氨酸合成酶是将来源于大肠杆菌的腺苷甲硫氨酸合成酶基因经大肠杆菌表达得到的腺苷甲硫氨酸合成酶。

3.根据权利要求1所述的固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的制备方法，其特征在于：所述重组腺苷甲硫氨酸合成酶与氨基树脂载体Seplite LX-1000HA的比例为20mg/g树脂。

4.一种利用权利要求1～3所述的任一种固定化腺苷甲硫氨酸合成酶生产腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于步骤如下：

步骤1：配制固定化腺苷甲硫氨酸合成酶催化生产腺苷甲硫氨酸的反应液，反应液组成如下：Tris 100mmol.L-1、三磷酸腺苷10～30mmol.L-1、DL-甲硫氨酸25～75mmol.L-1、氯化钾100mmol.L-1、硫酸镁20～60mmol.L-1和对甲基苯磺酸钠400～800mmol.L-1，溶解后调pH值至6.0～8.0；

步骤2：固定化腺苷甲硫氨酸合成酶装柱，在35℃下将反应液以1.0～4.0倍柱床体积/小时的流速过柱，收集流出液，得到腺苷甲硫氨酸溶液。