CN103224917B - 一种恢复SAMe合成酶活力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种恢复活力下降的SAMe合成酶活力的方法，将经多批次反应后并且活力下降的固定化酶置事先配置好的复苏液中处理，并于室温下搅拌，滤去液体，即可将活力下降的酶的活力再一次提高。

Description

一种恢复SAMe合成酶活力的方法

技术领域

本发明涉及一种腺苷甲硫氨酸合成酶酶活恢复的方法，具体涉及一种经多次使用的腺苷甲硫氨酸合成酶经处理后使其活力恢复的方法，属于生物制药领域。 

背景技术

中国是人口大国，同时也是“肝炎大国”。据1992年全国病毒性肝炎流行病学调查，全国约有1.2亿人携带乙型肝炎病毒，丙型肝炎在一般人群中感染率为3.1%。我国现有2000万例慢性乙型肝炎患者，其中部分有可能转化为肝硬化，甚至肝癌。 

腺苷甲硫氨酸（SAMe）是人体内一种极为重要的中间代谢产物。它可以通过转硫途径生成体内关键的抗氧化及解毒物质——半胱氨酸，再生成另一种关键的抗氧化和解毒物质——谷胱甘肽，解除肝内的氧化物应激状态，从而达到防治肝病的目的。另外SAMe还可以促进依赖性脂磷脂的合成，降低胆固醇和磷脂的比例，恢复细胞膜的流动性，促进胆汁的主动转运和甘油酸三脂的分泌。因此SAM对肝内胆汁郁积、各种急、慢性肝炎以及脂肪肝、肝硬化等肝脏疾病有很好的疗效。SAMe于20世纪80年代出现在欧洲医药市场上，1999年美国FDA正式批准SAMe上市，使其迅速成为畅销的营养保健品之一，年销售额超过10亿美元。由于其疗机理清楚、效显著、起效快、副作用小，近年来在国内的需求量也越来越大，有广阔的市场前景。 

目前，SAMe的生产方法主要有化学合成法、发酵法和酶促转化法3种。 

化学合成法采用S一腺苷同型半胱氨酸(S－adenosythomocysteine)和甲基供 体(CH₃I)合成，腺苷甲硫氨酸有(R,S)和(S,S)两种构型，只有(S,S)构型才有生物活性，但合成产物中含有大量(R,S)腺昔甲硫氨酸，且难以分离，合成产率也低。 

发酵法采用在培养基中添加L－甲硫氨酸，用酵母发酵生产(一)型腺苷甲硫氨酸，是60年代至80年代生产腺普甲硫氨酸的主要方法，但发酵法的缺点是终产物积累量低、原料转化率低、产品生产周期长以及SAM的纯化工艺复杂等，从而导致了腺苷甲硫氨酸的价格居高不下，限制了SAM的广泛生产机应用。 

酶促转化法主要利用腺苷甲硫氨酸合成酶催化底物L一甲硫氨酸和ATP生成(一)型腺昔甲硫氨酸。酶作为生物催化剂具有快速、专一的特点，因此酶促转化法生产腺苷甲硫氨酸具有高效、工艺简单、产品生物活性高且无污染的优势。但是，SAMe合成酶在动物、植物和微生物中含量少、酶活低，且分离纯化困难，因此通过酶促转化法生产SAMe受到SAMe合成酶活力的限制，基因工程的发展使获得大量高活性的SAMe合成酶成为可能，利用DNA重组技术构建高效表达SAMe合成酶的基因工程菌，重组菌表达SAMe合成酶活性为野生菌的几十倍到上百倍，经初步分离纯化后的游离酶可用于体外SAMe的合成，但游离酶不稳定，容易失活。 

固定化酶技术是近年来发展起来的一项技术，它是模拟体内酶的作用方式，通过化学或无力的手段，用载体将酶束缚或限制在一定的区域内，使酶分子在此区域进行特有和活跃的催化作用，并可回收及重复使用。尽管固定化技术可多次重复利用SAMe合成酶，但经使用一定次数后，其酶活会大大降低，导致合成SAMe能力下降。下降的SAMe合成酶，大都被丢弃处理，导致资源浪费，生产SAMe的成本升高。 

发明内容

为解决现有技术中利用SAMe合成酶合成SAMe时，多次使用后酶活降低 而产能下降、成本升高的问题，本发明，本发明的目的在于提供一种恢复经多次使用后的SAMe合成酶活性的方法，多次使用后酶活降低的SAMe合成酶，经本发明方法处理后，其酶活可恢复到相当于初始酶活的水平。 

本发明所述方法，通过配置复苏液，将活性下降的SAMe合成酶室温下在复苏液中浸泡处理而得。 

本发明中，所述的复苏液，由摩尔浓度为0.5-5mM的底物ATP、0.5-5mM的底物L-甲硫氨酸、0.001%-0.1%（重量）载体，所述载体选自海藻糖、壳聚糖、葡聚糖、蔗糖、明胶或PEG40、0.01%-0.5%（V/V）的表面活性剂，及以及摩尔浓度为0.01-0.5mM其它金属离子盐如含Mg²⁺、K⁺的盐组成。 

更为优选地，所述载体为海藻糖，所述表面活性剂为吐温20，所述金属离子的盐为盐酸盐。 

具体地，本发明恢复活力下降的腺苷甲硫氨酸合成酶活力的方法包括： 

（1）配置复苏液； 

（2）将经过多次反应而导致活力下降的SAMe合成酶用水冲洗干净，并于室温下置于复苏液中，搅拌3-6小时；； 

（3）滤去液体，得到复苏后的SAMe合成酶； 

本发明中，在酶促反应步骤中，反应底物中进一步还包括金属离子盐，比如含Mg²⁺、K⁺的金属盐，可以是氯化镁、硫酸镁、硼酸钾、硼酸钠等。 

经复活后的SAMe合成酶，催化生产腺苷甲硫氨酸，ATP的转化率几乎与之前的第一批酶活相当，效果明显。 

具体是实施例 

本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结 合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。 

主要材料 

所用工程菌：重组大肠埃希氏菌（携带腺苷甲硫氨酸合成酶的metK基因），公司自主构建，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2299，并已在中国专利申请CN101392230A中公开记载。 

实施例1 利用含腺苷甲硫氨酸合成酶的基因菌种发酵制备腺苷甲硫氨酸合成酶 

一、发酵液的配制： 

按以下配方分别配制种子培养基、发酵培养基和补料培养基： 

⑴种子培养基（LB培养基）（%）：蛋白胨：酵母粉：氯化钠=2：1：2 

⑵发酵基础培养基（g/100ml培养基）： 

⑶补料培养基（g/100ml培养基）： 

葡萄糖：1.12  酵母粉：0.55 

硫酸镁：0.035 

二、发酵过程： 

⑴将含有重组菌的甘油种以1：100的比例接入一级种子培养基（LB培养基）中，37℃、180rpm摇床培养约8个小时。 

⑵将一级种子液以1：20的比例接入二级种子培养基（LB培养基）中，37℃、180rpm摇床培养约8个小时。 

⑶将二级种子液以1：6接入种子罐，37℃、溶氧40～60、PH7.0。 

⑷当种子罐中菌液的OD600=1.5～2.0时，按1:10的比例接入发酵罐中发酵，发酵条件为温度37℃、溶氧60～90、PH7.0。 

⑸在大罐开始发酵1个小时后开始以流加的方式补料。 

⑹发酵的过程中监控发酵液的PH值、OD600、溶氧、浊度等各项参数。 

发酵过程如下表所示： 

⑺8.5小时后停止发酵。8.5小时后停止发酵，取样用SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳测定其中SAM合成酶的表达量，测定目的酶的表达量占菌体可溶性蛋白的41.4％。 

实施例2 固定化酶的制备 

1、材料：海藻酸钠、硼酸、氯化钡、吸附剂（硅藻土、活性炭或三氧化二铝）。 

2、固定化酶的制备 

海藻酸钙（CA）固定化酶：配置2%海藻酸钠的水溶液10ml，然后与一定浓度的粗酶液混合均匀，使用6号针头注射器滴入2%CaCl₂的水溶液，在4℃冰箱中固定化4h，在10%甲苯的水溶液通透处理1h，清洗后备用。 

实施例3 酶促反应 

将上述固定化酶按3.0mg/ml(这算成SAM合成酶的量)加入反应体系中，反应体系包括：100mM四硼酸钠+50mM K₂SO₄+40mM MgSO₄+20mM ATP+60mMD,L-Met，35℃、pH为6.5的条件下，反应8小时，将固定化酶与反应液分离，用纯水漂洗固定化酶3-4次，滤干后待下次使用。 

实施例4 固定化酶经过连续批反应后ATP转化率及酶活回收率的比较 

按实施例3的条件，对固定化酶进行连续批次反应，分别检测器ATP转化率及SAM产量、酶活回收率，结果见表1 

实施例5 经过多批次反应后的固定化酶活力的复苏 

(1)配置复苏液：1mM的ATP+1mM的L-蛋氨酸+0.01%(W/W)的海藻糖+0.1mM的MgCl2+0.02mM的KCl+0.1%的吐温20。 

(2)固定化酶回收：将实施例4中经多次反应后的固定化酶用水冲洗干净，备用； 

(3)步骤(2)中所得洗净的固定化酶，室温下浸泡于复苏液中，搅拌4h，而后滤去液体，即得。 

实施例6 经复活后的固定化酶经过连续批反应后ATP转化率及酶活回收 率的比较 

按实施例3的条件，对经多批反应后活力下降的固定化酶经复活处理，进行连续批次反应，分别检测器ATP转化率及SAM产量、酶活回收率，结果见表1，复苏后的第一批次计为第16批次，第二批次计为第17批次，后面依次类推。 

ATP转化率：ATP转化率是通过计算反应前后ATP的含量的比值，间接评价腺苷蛋氨酸的产量（理论上认为消耗的ATP全部转化为腺苷蛋氨酸）。ATP含量是通过面积归一法测定。 

酶活回收率：每批反应的酶活回收率是通过每批反应后腺苷蛋氨酸的含量与第一批反应结束后腺苷蛋氨酸的含量的比值得出。 

表1 固定化酶批次反应后经复苏处理后ATP转化率及酶活回收率 

由上表可知，海藻酸钙固定化酶可以连续反应15批而酶活回收率在89%左右，ATP转化率下降到80%左右，而经复活处理后，首批的酶活回收率几乎达到了之前第一批的水平，ATP转化率也与之前的第一批相当，酶活力复苏效果明显。 

实施例7 经过多批次反应后的固定化酶活力的复苏 

(1)配置复苏液：0.5mM的ATP+0.5mM的L-蛋氨酸+0.002%(W/W)的壳聚糖+0.05mM的MgCl₂+0.01mM的KCl+0.02%(V/V)的吐温80。 

(2)固定化酶回收：将实施例4中经多次反应后的固定化酶用水冲洗干净，备用； 

(3)步骤(2)中所得洗净的固定化酶，室温下浸泡于复苏液中，搅拌4h，而后滤去液体，即得。 

实施例8 经过多批次反应后的固定化酶活力的复苏 

(1)配置复苏液：5mM的ATP+5mM的L-蛋氨酸+0.1%(W/W)的葡聚糖+0.2mM的MgCl₂+0.1mM的KCl+0.5%(V/V)的Pluronic F68。 

(2)固定化酶回收：将实施例4中经多次反应后的固定化酶用水冲洗干净，备用； 

(3)步骤(2)中所得洗净的固定化酶，室温下浸泡于复苏液中，搅拌4h，而后滤去液体，即得。 

实施例9 经过多批次反应后的固定化酶活力的复苏 

(1)配置复苏液：3mM的ATP+3mM的L-蛋氨酸+0.03%(W/W)的明胶+0.15mM的MgCl₂+0.05mM的KCl+0.2%(V/V)的吐温20。 

(2)固定化酶回收：将实施例4中经多次反应后的固定化酶用水冲洗干净，备用； 

(3)步骤(2)中所得洗净的固定化酶，室温下浸泡于复苏液中，搅拌4h，而后滤去液体，即得。 

实施例10 实施例7、8、9中经复活后的固定化酶经过连续批反应后ATP转化率及酶活回收率测定 

测定方法同实施例6，结果见表2 

表2 经复苏后的酶活回收率及ATP转化率 

经复苏处理后，均能较处理前，酶活性有明显提高。 

Claims (5)

1.一种恢复SAMe合成酶活力的方法，所述方法通过将已使用后活性降低的SAMe合成酶浸泡在配置好的复苏液中，并于室温浸泡并搅拌后滤去液体，所述复苏液是由摩尔浓度为0.5-5mM的底物ATP、0.5-5mM的L-甲硫氨酸，质量浓度为0.001%-0.1%的载体，所述载体选自海藻糖、壳聚糖、葡聚糖、蔗糖、明胶或PEG40，摩尔浓度为0.01-0.5mM的Mg²⁺或/和K⁺的盐酸盐、浓度为0.01%-0.5%（V/V）的表面活性剂组成。 

2.权利要求1所述的方法，其中所述载体为质量浓度为0.01%-0.1%海藻糖。 

3.权利要求1所述的方法，所述Mg²⁺的摩尔浓度为0.05-0.2mM，所述K⁺的摩尔浓度为0.01-0.1mM。 

4.权利要求1所述的方法，其中所述表面活性剂是浓度为0.01%-0.5%（V/V）的吐温-20。 

5.权利要求1-4中任意一权利要求所述的方法，具体包括如下步骤： 

(1)配置复苏液，所述复苏液由0.5-5mM的ATP、0.5-5mM的L-甲硫氨酸、0.001%-0.1%（重量）的海藻糖、0.01%-0.5%（V/V）的吐温20以及0.05-0.2mM的MgCl₂、0.01-0.1mM的KCl组成； 

(2)将经过多次反应而导致活力下降的SAMe合成酶用水冲洗干净，并于室温下置于复苏液中，搅拌3-6小时；

(3)滤去液体，得到复苏后的SAMe合成酶。