CN101298608A - 一种大规模制备腺苷蛋氨酸合成酶的方法 - Google Patents

一种大规模制备腺苷蛋氨酸合成酶的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101298608A
CN101298608A CNA2008101137059A CN200810113705A CN101298608A CN 101298608 A CN101298608 A CN 101298608A CN A2008101137059 A CNA2008101137059 A CN A2008101137059A CN 200810113705 A CN200810113705 A CN 200810113705A CN 101298608 A CN101298608 A CN 101298608A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fermentation
large scale
metal ion
substratum
divalent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2008101137059A
Other languages
English (en)
Inventor
张春丽
周德胜
吉春
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Kawin Technology Co., Ltd.
Original Assignee
BEIJING KAWIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BEIJING KAWIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd filed Critical BEIJING KAWIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority to CNA2008101137059A priority Critical patent/CN101298608A/zh
Publication of CN101298608A publication Critical patent/CN101298608A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种大规模制备腺苷蛋氨酸合成酶的方法。该方法通过选择性添加二价金属离子使酶的表达量由22％提高到31％，同时通过添加絮凝剂磷酸氢二钠和氯化钙，使发酵液中的悬浮颗粒聚集沉淀，发酵液的浊度由18.7下降到10.9，有利于下一步酶的提取。

Description

一种大规模制备腺苷蛋氨酸合成酶的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的涉及大规模制备腺苷蛋氨酸合成酶的方法。
背景技术
中国是人口大国，同时也是“肝炎大国”。据1992年全国病毒性肝炎流行病学调查，全国约有1.2亿人携带乙型肝炎病毒，丙型肝炎在一般人群中感染率为3.1％。我国现有2000万例慢性乙型肝炎患者，其中部分有可能转化为肝硬化，甚至肝癌。
腺苷蛋氨酸(SAM)是人体内一种极为重要的中间代谢产物。它可以通过转硫途径生成体内关键的抗氧化及解毒物质——半胱氨酸，再生成另一种关键的抗氧化和解毒物质——谷胱甘肽，解除肝内的氧化物应激状态，从而达到防治肝病的目的。另外SAM还可以促进依赖性脂磷脂的合成，降低胆固醇和磷脂的比例，恢复细胞膜的流动性，促进胆汁的主动转运和甘油酸三脂的分泌。因此SAM对肝内胆汁郁积、各种急、慢性肝炎以及脂肪肝、肝硬化等肝脏疾病有很好的疗效。SAM于20世纪80年代出现在欧洲医药市场上，1999年美国FDA正式批准SAM上市，使其迅速成为畅销的营养保健品之一，年销售额超过10亿美元。由于其疗机理清楚、效显著、起效快、副作用小，近年来在国内的需求量也越来越大，有广阔的市场前景。
目前，SAM的生产方法主要有化学合成法、发酵法和酶促转化法3种。
化学合成法采用S一腺苷同型半胱氨酸(S-adenosythomocysteine)和甲基供体(CH3I)合成，腺苷蛋氨酸有(+)和(一)两种构型，只有(一)构型才有生物活性，但合成产物中含有大量(+)腺昔蛋氨酸，且难以分离。发酵法采用在培养基中添加L-甲硫氨酸，用酵母发酵生产(一)型腺苷蛋氨酸，是60年代至80年代生产腺普蛋氨酸的主要方法。酶促转化法主要利用腺苷蛋氨酸合成酶催化底物L一甲硫氨酸和ATP生成(一)型腺昔蛋氨酸。酶作为生物催化剂具有快速、专一的特点，因此酶促转化法生产腺苷蛋氨酸具有高效、工艺简单、产品生物活性高且无污染的优势。
要将酶促合成法应用于工业化生产，大量获得催化用的腺苷蛋氨酸合成酶成为关键。本发明采用基因工程重组技术，获得了高效表达腺苷蛋氨酸合成酶的工程菌，通过在发酵过程中选择性的加入二价金属离子，提高了合成酶在工程菌中的表达量，同时在发酵液中加入了絮凝剂，更有利于后期酶的提取。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种大规模制备腺苷蛋氨酸合成酶的方法。
(二)技术方案
本发明提供了一种大规模制备腺苷蛋氨酸合成酶的方法，技术关键点在于向发酵液中选择性的加入二价金属离子和絮凝剂。
其中，所述的二价金属离子选自Mg2+，Cu2+，Zn2+中的一种或几种。优选地，所述二价金属离子为Mg2+。
所述絮凝剂为磷酸氢二钠和氯化钙。
优选地，该发酵方法的配方如下：
(1)种子培养基(LB培养基)(％)：蛋白胨∶酵母粉∶氯化钠＝2∶1∶2
(2)发酵基础培养基(％)：
葡萄糖：1.47       蛋白胨：0.4
酵母粉：0.55       磷酸二氢钾：0.4
磷酸氢二钾：0.3    磷酸氢二钠：0.35
硫酸铵：0.047      硫酸镁：0.05
氯化铵：0.01       硫酸亚铁：0.002
氯化钙：0.002      硫酸锰：0.0007
200mg/ml氧化四环素：0.0125(V/V)
(3)补料培养基(％)：
葡萄糖：1.12    酵母粉：0.55
硫酸镁：0.035
发酵方法如下：
a)将含有重组菌的甘油种以1∶100的比例接入一级种子培养基(LB培养基)中，37℃、180rpm摇床培养约8个小时。
b)将一级种子液以1∶20的比例接入二级种子培养基(LB培养基)中，37℃、180rpm摇床培养约8个小时。
c)将二级种子液以1∶6接入种子罐，37℃、溶氧40～60、PH7.0。
d)当种子罐中菌液的OD600＝1.5～2.0时，按1∶10的比例接入发酵罐中发酵，发酵条件为温度37℃、溶氧60～90、PH7.0。
e)在大罐开始发酵1个小时后开始以流加的方式补料。
f)发酵的过程中监控发酵液的PH值、OD600、溶氧、浊度等各项参数，当发酵液的OD600为12～13时，发酵进入平衡期后停止发酵，收集菌体，取样测量目的蛋白的表达量。
(三)有益效果
采用本发明所述的方法，通过选择性添加二价金属离子使酶的表达量由22％提高到31％，同时通过添加絮凝剂磷酸氢二钠和氯化钙，使发酵液中的悬浮颗粒聚集沉淀，发酵液的浊度由18.7下降到10.9，有利于下一步酶的提取，，对酶促催化腺苷蛋氨酸的工业化生产具有重要意义。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实验中所用到的主要试剂及设备
1、主要材料
本次试验所用的蛋白胨、酵母粉购于OXOID公司；葡萄糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁购于北京凤礼精求公司；硫酸铵、氯化铵、硫酸亚铁、氯化钙、硫酸锰、氯化钠购于北京化学试剂厂；氧化四环素购于Sigma公司。
2、主要设备
恒温摇床：Infors公司；电泳仪：Bio-Rad公司；紫外投射仪及其成像装置：法玛西亚公司；发酵罐：比欧公司。
实施例1未加二价金属离子和絮凝剂的发酵实验
一、发酵液的配制：
按以下配方分别配制种子培养基、发酵培养基和补料培养基：
(1)种子培养基(LB培养基)(％)：蛋白胨∶酵母粉∶氯化钠＝2∶1∶2
(2)发酵基础培养基(％)：
葡萄糖：1.47        蛋白胨：0.4
酵母粉：0.55        磷酸二氢钾：0.4
磷酸氢二钾：0.65    硫酸铵：0.047
氯化铵：0.01        硫酸亚铁：0.002
硫酸锰：0.0007
200mg/ml氧化四环素：0.0125(V/V)
(3)补料培养基(％)：
葡萄糖：1.12    酵母粉：0.55
硫酸镁：0.035
二、发酵过程：
(1)将含有重组菌的甘油种以1∶100的比例接入一级种子培养基(LB培养基)中，37℃、180rpm摇床培养约8个小时。
(2)将一级种子液以1∶20的比例接入二级种子培养基(LB培养基)中，37℃、180rpm摇床培养约8个小时。
(3)将二级种子液以1∶6接入种子罐，37℃、溶氧40～60、PH7.0。
(4)当种子罐中菌液的OD600＝1.5～2.0时，按1∶10的比例接入发酵罐中发酵，发酵条件为温度37℃、溶氧60～90、PH7.0。
(5)在大罐开始发酵1个小时后开始以流加的方式补料。
(6)发酵的过程中监控发酵液的PH值、OD600、溶氧、浊度等各项参数。
发酵过程如下表所示：
 发酵时间h  搅拌转速rpm   PH值   OD600   溶氧   浊度
  0   200   7.0   0.18   80   0.8
  1   280   6.8   1.6   65   2.0
  2   320   6.9   3.4   68   4.3
  3   350   6.8   5.8   64   8.0
  4   380   6.8   7.5   65   11.3
  5   380   6.9   9.0   66   14.5
  6   380   7.0   10.4   62   16.2
  7   380   6.9   11.5   63   17.8
  8   380   6.9   12.1   62   18.7
(7)8.5小时后停止发酵，取样测定目的酶的表达量为22％。
实施例2加入二价金属离子和絮凝剂的发酵实验
一、发酵液的配制：
按以下配方分别配制种子培养基、发酵培养基和补料培养基：
(1)种子培养基(LB培养基)(％)：蛋白胨∶酵母粉∶氯化钠＝2∶1∶2
(2)发酵基础培养基(％)：
葡萄糖：1.47    蛋白胨：0.4
酵母粉：0.55         磷酸二氢钾：0.4
磷酸氢二钾：0.3      磷酸氢二钠：0.35
硫酸铵：0.047        硫酸镁：0.05
氯化铵：0.01         硫酸亚铁：0.002
氯化钙：0.002        硫酸锰：0.0007
200mg/ml氧化四环素：0.0125(V/V)
(3)补料培养基(％)：
葡萄糖：1.12    酵母粉：0.55
硫酸镁：0.035
二、发酵过程：
(1)将含有重组菌的甘油种以1∶100的比例接入一级种子培养基(LB培养基)中，37℃、180rpm摇床培养约8个小时。
(2)将一级种子液以1∶20的比例接入二级种子培养基(LB培养基)中，37℃、180rpm摇床培养约8个小时。
(3)将二级种子液以1∶6接入种子罐，37℃、溶氧40～60、PH7.0。
(4)当种子罐中菌液的OD600＝1.5～2.0时，按1∶10的比例接入发酵罐中发酵，发酵条件为温度37℃、溶氧60～90、PH7.0。
(5)在大罐开始发酵1个小时后开始以流加的方式补料。
(6)发酵的过程中监控发酵液的PH值、OD600、溶氧、浊度等各项参数。
发酵过程如下表所示：
 发酵时间h  搅拌转速rpm   PH值   OD600   溶氧   浊度
  0   200   7.0   0.17   80   0.8
  1   280   6.9   1.5   62   1.5
  2   320   6.8   3.5   64   2.8
  3   350   6.8   5.9   65   3.9
  4   380   6.9   7.8   64   5.5
  5   380   7.0   9.2   65   7.0
  6   380   7.0   10.5   63   8.4
  7   380   6.8   11.8   65   9.6
  8   380   6.8   12.5   65   10.9
(7)8.5小时后停止发酵。取样测定目的酶的表达量为31％，相对未加二价金属离子的表达量提高了9％，同时发酵液浊度下降了7.8，有利于酶的提纯。

Claims (4)

1、一种大规模制备腺苷蛋氨酸合成酶的方法，其特征在于向发酵液中选择性的加入二价金属离子和絮凝剂。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的二价金属离子选自Mg2+，Cu2+，Zn2+中的一种或几种。
3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述二价金属离子为Mg2+。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述絮凝剂为磷酸氢二钠和氯化钙。
CNA2008101137059A 2008-05-29 2008-05-29 一种大规模制备腺苷蛋氨酸合成酶的方法 Pending CN101298608A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNA2008101137059A CN101298608A (zh) 2008-05-29 2008-05-29 一种大规模制备腺苷蛋氨酸合成酶的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNA2008101137059A CN101298608A (zh) 2008-05-29 2008-05-29 一种大规模制备腺苷蛋氨酸合成酶的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101298608A true CN101298608A (zh) 2008-11-05

Family

ID=40078566

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2008101137059A Pending CN101298608A (zh) 2008-05-29 2008-05-29 一种大规模制备腺苷蛋氨酸合成酶的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101298608A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102643887A (zh) * 2012-04-28 2012-08-22 长春生物制品研究所有限责任公司 一种重组戊型肝炎疫苗抗原p179蛋白的发酵制备方法
CN102731601A (zh) * 2012-06-14 2012-10-17 广东肇庆星湖生物科技股份有限公司 一种提取腺苷的方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102643887A (zh) * 2012-04-28 2012-08-22 长春生物制品研究所有限责任公司 一种重组戊型肝炎疫苗抗原p179蛋白的发酵制备方法
CN102643887B (zh) * 2012-04-28 2014-11-26 长春生物制品研究所有限责任公司 一种重组戊型肝炎疫苗抗原p179蛋白的发酵制备方法
CN102731601A (zh) * 2012-06-14 2012-10-17 广东肇庆星湖生物科技股份有限公司 一种提取腺苷的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101230373B (zh) 一种s-腺苷蛋氨酸的制备方法
Toohey Methylthio group cleavage from methylthioadenosine. Description of an enzyme and its relationship to the methylthio requirement of certain cells in culture
CN101979645B (zh) 一种腺苷甲硫氨酸的制备方法
KR102222953B1 (ko) 난배양성 혐기성 미생물의 고수율 배양을 위한 배지 보충제 및 그를 포함하는 배지 조성물
JPWO2018155485A1 (ja) 新規微生物、およびそれを用いたウロリチン類の製造方法
CN101870964B (zh) 一种提高sam合成酶表达量的方法
CN101298608A (zh) 一种大规模制备腺苷蛋氨酸合成酶的方法
CN101343618A (zh) 天然茶氨酸的制备方法
CN116333948B (zh) 一种食气梭菌增菌培养基及其制备方法
CN104878059B (zh) 一种制备s-腺苷蛋氨酸的方法
Xue et al. Enhanced Production of Acarbose and Concurrently Reduced Formation of Impurity C by Addition of Validamine in Fermentation of Actinoplanes utahensis ZJB‐08196
CN101437934A (zh) 含s-腺苷-l-甲硫氨酸的干燥酵母的制备方法以及口服用组合物
WO2023060761A1 (zh) 一种利用海水微拟球藻生产蜂王浆主效成分24-亚甲基胆固醇的方法
CN114134056A (zh) 酿酒酵母zjs10041及其在发酵产s-腺苷蛋氨酸中的应用
CN112430636B (zh) 一种生物法制造腺苷蛋氨酸的方法
CN114703243A (zh) 一种发酵生产腺苷的方法
CN107058417B (zh) 一种色氨酸提质增效新工艺
CN101781625B (zh) 一株乙硫氨酸抗性产朊假丝酵母及其应用
CN110408667A (zh) 一种提高β-胸苷产量的发酵工艺
CN103224917B (zh) 一种恢复SAMe合成酶活力的方法
CN115125177B (zh) 一种发酵方法及发酵生产辅酶q10的方法
CN113957110B (zh) 一种提高金色产色链霉菌线粒体复合体酶系的方法
CN111073830B (zh) 一株高产γ-谷氨酰转肽酶的干酪乳杆菌及其在L-茶氨酸生产中的应用
CN113817654A (zh) 一种生产核黄素的发酵培养基及发酵方法
Peng et al. Cultivation of Lactobacillus casei LT-L614 in High Density with Sugarcane Molasses: Optimization of Processing

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20090116

Address after: Beijing economic and Technological Development Zone Rong 6 Jingdong Street Building No. 3, zip code: 100176

Applicant after: Beijing Kawin Technology Co., Ltd.

Address before: Beijing economic and Technological Development Zone, Rong Jingdong street, No. 6, zip code: 100176

Applicant before: Beijing Kawin Biotechnology Co., Ltd.

ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: BEIJING KAIYIN SCIENCE CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: BEIJING KAIYIN BIOISYSTECH CO., LTD.

Effective date: 20090116

C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20081105