CN101343618A - 天然茶氨酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
天然茶氨酸的制备方法，属于生物工程技术领域。本发明从中国传统发酵食品中分离筛选到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SK11.004菌株是一株产谷氨酰转肽酶的茶氨酸生产菌，保藏编号：CCTCC NO：M 208083；将γ－谷氨酰转肽酶作用于谷氨酰胺和乙胺，在pH 10的条件下，能高效地生产茶氨酸。本发明的酶法制备茶氨酸的方法具有反应时间短、酶活性源制备简单、能使茶氨酸的生产简单，以及产品安全可靠的优点，适于进行大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种天然茶氨酸的制备方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
茶氨酸(N-乙基-γ-谷氨酰胺)是茶叶特有的一种氨基酸，是绿茶中有效的呈味物质，其含量直接决定茶叶的品质。此外，茶氨酸还具有降血压、抗肿瘤、保护神经、放松、抗抑郁、抗疲劳、提高免疫力、减轻体脂等作用。因此，茶氨酸越来越受到人们的重视，并有望添加于食品和药物中开发出新型的功能食品和功能药物。
迄今为止，茶氨酸的制造方法，主要有三种。第一，是从茶叶中提取的方法。但由于干茶叶中的茶氨酸含量仅有1.5％左右，且光合作用会使茶氨酸损失一部分，致使产量很低。随后，便发明了适合于工业化生产的第二种方法，即化学有机合成茶氨酸的方法。但该法可能会残留毒性物质，且生成物包括D、L-型茶氨酸异构体，需要进行拆分才能得到L型产品，使得分离精制操作复杂。第三种制造方法，是利用微生物酶法进行生产。目前报道了利用来自假单孢菌属的谷氨酰胺酶的γ-谷氨酰基转移反应，由L-谷氨酰胺和乙胺合成茶氨酸的酶法和固定化酶法，以及2005年公开的利用来自香茅醇假单孢菌GEA和2007年公开的利用来自芽孢杆菌属、霉菌或酵母菌中的1种或2种以上的谷氨酰胺酶酶法生产。但利用谷氨酰胺酶酶法生产存在着因谷氨酰胺酶的水解反应而在生产茶氨酸的同时，还生成副产物谷氨酸，而使茶氨酸的精制变得复杂的问题。
发明内容
本发明是鉴于上述问题而完成的发明，其目的在于提供有效的制备茶氨酸的方法。
本发明的技术方案：一株产生γ-谷氨酰转肽酶的菌株，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SK11.004，已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 208083。
一种天然茶氨酸的制备方法：
(1)制备粗酶粉：使用枯草芽孢杆菌SK11.004为出发菌株；
培养基，以g/L计为：蔗糖25、胰蛋白胨5、玉米浆15、MgSO4·7H2O 0.5、K2HPO41，pH 7.0；37℃，200rpm的条件下培养16h；冷冻离心，制得的发酵液上清液，即为粗酶液；
将粗酶液进行浓缩后，按酶液∶酒精体积比4∶1的比例添加酒精进行沉淀，将沉淀后的蛋白冷冻干燥，即得粗酶粉；
(2)酶反应制备天然茶氨酸：使用制得的粗酶粉，以0.2U/mL加入到含谷氨酰胺0.02M、乙胺0.15-0.25M的pH 9～10.5、100mM Na2B4O7-NaOH硼酸钠缓冲液中，在35～40℃下进行2小时的酶反应，合成了茶氨酸；
(3)茶氨酸的精制：将酶反应液通过减压浓缩除去乙胺后，再依次使用001×7的732强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，201×7的717强碱性阴离子交换树脂，和乙醇处理得到茶氨酸的精制品。
本发明的有益效果：发明人等为了解决上述问题，从中国传统发酵制品中分离筛选得到一株新型的可用于生产茶氨酸的菌株，其所产的γ-谷氨酰转肽酶，在pH 9～10.5、35～40℃的条件下，通过作用于谷氨酰胺和乙胺，可以高效的生产茶氨酸，转化率可达80％以上。
本发明的酶法制备茶氨酸的方法具有反应时间短、酶活性源制备简单、能使茶氨酸的生产简单，以及产品安全可靠的优点，适于进行大规模工业化生产。生物材料样品保藏
上述茶氨酸生产菌是本发明人等首次发现鉴定的新型菌株，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SK11.004，保藏机关名称：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2008年07月10日，保藏编号：CCTCC NO：M 208083。
附图说明
图1用枯草芽孢杆菌SK11.004所产的γ-谷氨酰转肽酶作用于谷氨酰胺和乙胺合成茶氨酸时的氨基酸测定结果。glu：谷氨酸，gln：谷氨酰胺，the：茶氨酸。
具体实施方式
下面，详细说明本发明的实施方式，但本发明的技术范围不受限于下述实施方式，在不改变其要点的前提下，可做各种改变进行实施。另外，本发明的技术范围延及均等的范围。
本发明的茶氨酸是指N-乙基-γ-谷氨酰胺，是茶叶特有的一种氨基酸，是绿茶中有效的呈味物质，可以用作品质、风味改良剂及功能食品添加剂。
本发明中使用的乙胺衍生物，可以列举乙胺、乙胺盐酸盐等。
本发明所用的枯草芽孢杆菌SK 11.004是由本发明人等发现的新菌株，是具有产生γ-谷氨酰转肽酶的茶氨酸生产菌。另外，本发明所用的枯草芽孢杆菌SK11.004鉴定，是通过根据一定法则的菌类学性质、生物化学性质的分析和16sRNA序列的测定而得出的。
本发明的γ-谷氨酰转肽酶是来自枯草芽孢杆菌SK11.004的酶。该酶在碱性条件下，水解活性很低，而其谷氨酰基转移活性很高，大大优于谷氨酰胺酶。该反应的酶活性源可直接使用发酵液上清液或各种处理样品，例如经超滤、酒精沉淀或精制等所得的酶制品。
本发明中的谷氨酰转肽酶活性，是通过使酶作用于γ-谷氨酰对硝基苯胺和双甘肽，定量所生成的对硝基苯胺而测定。该酶的单位定义为每1分钟生成1μmol对硝基苯胺的酶量。
实施例1产谷氨酰转肽酶菌的分离
采用中国传统发酵制品虾酱，取少许加入到分离培养基中(以g/L计)：葡萄糖20、酵母膏15、玉米浆10、MgSO4·7H2O 0.5、K2HPO41，pH7.0。在37℃，200rpm的条件下培养24h，经稀释涂布后，获得纯培养物，37℃培养30h，得到20株酶活较高的菌株，选定一株酶活可达2U/mL的菌株SK11.004为实验菌株。
实施例2粗酶粉的制备
使用实施例1所得到的枯草芽孢杆菌SK11.004，在发酵培养基中(以g/L计)：蔗糖25、胰蛋白胨5、玉米浆15、MgSO4·7H2O 0.5、K2HPO41，pH7.0，37℃，200rpm的条件下培养16h，冷冻离心，制得发酵液上清液，即为粗酶液。将粗酶液进行浓缩后，按酶液∶酒精＝4∶1(V∶V)比例添加酒精，将沉淀后的蛋白冷冻干燥，即得粗酶粉。
实施例3酶反应
使用实施例2的粗酶粉，以0.2U/mL加入到含谷氨酰胺0.02M、乙胺0.15M的100mM硼酸钠缓冲液(Na2B4O7-NaOH、pH10)中，在37℃下进行2小时的酶反应，合成了茶氨酸。
实施例4茶氨酸产量的测定
将实施例3中进行的酶反应液经TCA沉淀、稀释，通过安捷伦液相色谱仪，分别对茶氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸进行定量。分析条件如下：仪器型号：Ag1100，色谱柱：(250×4.6)mm 5μm ODS HYPERSIL，柱温：40℃。
实施例5芽孢杆菌SK 11.004培养条件的优化
本发明人等研究了使用实施例1中的培养基以外的培养基进行枯草芽孢杆菌SK11.004的培养。在研究了麦芽糖、乳糖、蔗糖、淀粉、糊精、果糖、谷氨酸钠等碳源后，结果发现，使用蔗糖时发酵液上清液酶活最高。在研究了鱼粉蛋白胨、胰蛋白胨、大豆粕、柠檬酸钠、谷氨酸钠、尿素、(NH4)2SO4等氮源后，结果发现，使用胰蛋白胨可以达到最佳效果。同时研究了蔗糖、胰蛋白胨和玉米浆最佳浓度比后发现，蔗糖、胰蛋白胨和玉米浆分别为25g/L、5g/L、15g/L的条件下，可得到酶活达4U/mL的发酵液。
实施例6使用来自枯草芽孢杆菌SK 11.004的发酵液上清液的酶反应条件的最优化。按照实施例3中的酶反应条件，研究了使用来自枯草芽孢杆菌SK11.004的发酵液上清液时的最适酶反应条件，发现使用20mM谷氨酰胺与200mM乙胺，在37℃，pH 10条件下反应2时可得到最大收率80％的茶氨酸。
实施例7精制茶氨酸。从反应液中分离精制茶氨酸是先通过减压浓缩除去乙胺后，再依次使用001×7(732)强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，201×7(717)强碱性阴离子交换树脂，和乙醇处理得到。
Claims (2)
1.一株产生γ-谷氨酰转肽酶的菌株，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SK11.004，已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 208083。
2、一种天然茶氨酸的制备方法，其特征在于，
(1)制备粗酶粉：
使用枯草芽孢杆菌SK11.004为出发菌株；
培养基，以g/L计为：蔗糖25、胰蛋白胨5、玉米浆15、MgSO4·7H2O 0.5、K2HPO41，pH 7.0；37℃，200rpm的条件下培养16h；冷冻离心，制得的发酵液上清液，即为粗酶液；
将粗酶液进行浓缩后，按酶液∶酒精体积比4∶1的比例添加酒精进行沉淀，将沉淀后的蛋白冷冻干燥，即得粗酶粉；
(2)酶反应制备天然茶氨酸：
使用制得的粗酶粉，以0.2U/mL加入到含谷氨酰胺0.02M、乙胺0.15-0.25M的pH 9～10.5、100mM Na2B4O7-NaOH硼酸钠缓冲液中，在35～40℃下进行2小时的酶反应，合成了茶氨酸；
(3)茶氨酸的精制：将酶反应液通过减压浓缩除去乙胺后，再依次使用001×7的732强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，201×7的717强碱性阴离子交换树脂，和乙醇处理得到茶氨酸的精制品。
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