CN105647891B - 地衣芽孢杆菌在产氨肽酶中的应用 - Google Patents

地衣芽孢杆菌在产氨肽酶中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物筛选及发酵技术领域，公开了一种地衣芽孢杆菌在产氨肽酶中的应用。所述地衣芽孢杆菌为Bacillus licheniformis SWJS33，于2013年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7388。该菌株可应用于发酵生产氨肽酶，所得氨肽酶的最适温度为60℃，最适pH为8.0～8.5，对N端为亮氨酸的肽键具有水解特异性。

Description

地衣芽孢杆菌在产氨肽酶中的应用
技术领域
本发明属于微生物筛选及发酵技术领域，具体涉及一种地衣芽孢杆菌在产氨肽酶中的应用。
背景技术
蛋白质控制酶解制备功能性蛋白、功能性肽和呈味基料是实现食物蛋白资源高值化利用的重要途径。随着酶解技术的成熟及蛋白质控制酶解产业的高速发展，开发新型特异性蛋白酶的需求日益迫切。目前已有的商业蛋白酶种类繁多，但大多是内切蛋白酶，仅少数是内切蛋白酶与外切蛋白酶的复合物。内切蛋白酶对大多数水产、动物蛋白有较高的水解效率，但对大豆蛋白、小麦面筋蛋白、花生蛋白等植物蛋白的水解效率则不高，存在蛋白利用率低、水解度低、苦味重等问题，加强外切蛋白酶的开发利用提高植物蛋白酶解利用效率有重要意义。氨肽酶的研究已有几十年历史，目前已经商业化的氨肽酶种类极少。与从动植物中提取相比，利用微生物产氨肽酶得到了更多的关注，主要集中在产氨肽酶菌株的选育、酶的分离纯化、酶学性质研究、基因克隆及外源表达、氨肽酶的应用等方面。从合适的菌株的筛选到最终的扩大发酵生产及应用是一个漫长的过程，有很多理论基础和技术难题需要解决，因此对氨肽酶相关的研究一直在继续。
地衣芽孢杆菌有非常强的合成分泌大量水解酶类的能力，能广泛利用各种营养物质生长，蛋白的分泌量达到20-25g/L，在工业上被应用于大量生产胞外酶。其中碱性蛋白酶是其主要生产酶类，年产量更是达到500吨。关于地衣芽孢杆菌产氨肽酶的研究及应用却相对较少。Rodriguez-Absi等在1978年从Bacillus licheniformis中纯化得到一种氨肽酶并对酶学性质进行了研究。等于1989年从一株耐热地衣芽孢杆菌中分离纯化到了一种亮氨酸氨肽酶并研究了其酶学性质。有研究者克隆了地衣芽孢杆菌的氨肽酶基因并在枯草芽孢杆菌中实现表达。本发明中产氨肽酶的地衣芽孢杆菌筛选自深海沉积物，对其液体发酵产氨肽酶的条件进行初步优化的产氨肽酶的活力达3.6LAP·mL-1左右，对其所产氨肽酶的酶学性质进行了研究，旨在为食品级氨肽酶产品的开发提供安全的生产菌种。
发明内容
为了解决以上现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种地衣芽孢杆菌在产氨肽酶中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种通过上述地衣芽孢杆菌所产的氨肽酶。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种地衣芽孢杆菌在产氨肽酶中的应用，所述地衣芽孢杆菌为Bacilluslicheniformis SWJS33，于2013年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7388。该菌株申请专利号为CN201310214063.2。
优选地，所述地衣芽孢杆菌在产氨肽酶中的培养基及培养条件如下：碳源5～6质量份，氮源10～15质量份，磷酸二氢钾0～0.5质量份，硫酸镁0.1～0.3质量份，硫酸铵0～1质量份，氯化钙0.5～1质量份，氯化钠20～50质量份，水1000质量份，pH7.0～7.6；装液量10％～40％，摇床转速150～250rpm，在25～40℃发酵36～60h。
更优选地，所述地衣芽孢杆菌在产氨肽酶中的培养基及培养条件如下：碳源5质量份，氮源10质量份，磷酸二氢钾0.5质量份，硫酸镁0.3质量份，硫酸铵1质量份，氯化钙1质量份，氯化钠40质量份，水1000质量份，pH7.2；装液量10％，摇床转速150rpm，在37℃发酵48h。
优选地，所述的碳源为可溶性淀粉、果糖或葡萄糖；更优选可溶性淀粉。
优选地，所述的氮源为酵母粉、SIP酶解物或大豆蛋白胨；更优选酵母粉。
一种通过上述地衣芽孢杆菌所产的氨肽酶，所述氨肽酶的最适温度为60℃，最适pH为8.0～8.5，对N端为亮氨酸的肽键具有水解特异性。
相对于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：
本发明将深海来源的菌株Bacillus licheniformis SWJS33应用于发酵生产氨肽酶，其培养条件简单，产氨肽酶活力较高，且所产氨肽酶有较强的底物特异性；该菌株可能成为安全的氨肽酶生产菌种，值得继续加强理论研究和基础应用研究。
附图说明
图1为实施例1在不同发酵温度下菌株SWJS33所产氨肽酶活性测定结果图；
图2为实施例2在不同装液量条件下菌株SWJS33所产氨肽酶活性测定结果图；
图3为实施例3以不同物质作为碳源时菌株SWJS33所产氨肽酶活性测定结果图；
图4为实施例4以不同物质作为氮源时菌株SWJS33所产氨肽酶活性测定结果图；
图5为实施例5在不同氯化钠浓度下菌株SWJS33所产氨肽酶活性测定结果图；
图6为菌株SWJS33所产氨肽酶的辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定图；
图7为菌株SWJS33所产氨肽酶在不同温度下的活力对比图；
图8为菌株SWJS33所产氨肽酶在不同pH条件下的活力对比图；
图9为菌株SWJS33所产氨肽酶对不同底物的特异性对比图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下实施例所得氨肽酶活性测定如下：将粗酶液用pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液稀释到合适的浓度，取80μL样品稀释液加入96孔板中，加20μL L-亮氨酸对硝基苯胺(L-leu-pNA)，在40℃准确反应10min后，加入100μL无水乙醇终止反应，测定405nm下的吸光值。以不同浓度对硝基苯胺在405nm下的吸光值绘制标准曲线。40℃每分钟酶解L-亮氨酸-对硝基苯胺产生1μmol对硝基苯胺所需的酶量即为一个酶活单位。
实施例1
本实施例的一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis SWJS33,CGMCCNo.7388)在产氨肽酶中的应用，取地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis SWJS33,CGMCCNo.7388)于种子培养基(蛋白胨5g，酵母粉1g，人工海水1L，pH 7.4)中培养，将所得菌株用于发酵的培养基及培养条件如下：可溶性淀粉5g，酵母粉10g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.3g，硫酸铵1g，氯化钙1g，氯化钠40g，去离子水1L，pH7.2；装液量10％，摇床转速150rpm，分别在25℃、30℃、37℃和40℃温度下发酵48h，得到氨肽酶的粗酶液。
本实施例在不同发酵温度下所得粗酶液的氨肽酶活性测定结果如图1所示。由图1可以看出，在37℃下发酵所得氨肽酶活力最高，温度升高到40℃或降低到30℃，菌株产氨肽酶的活力都大大减少。
实施例2
本实施例的一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis SWJS33,CGMCCNo.7388)在产氨肽酶中的应用，取地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis SWJS33,CGMCCNo.7388)于种子培养基(蛋白胨5g，酵母粉1g，人工海水1L，pH 7.4)中培养，将所得菌株用于发酵的培养基及培养条件如下：可溶性淀粉5g，酵母粉10g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.3g，硫酸铵1g，氯化钙1g，氯化钠40g，去离子水1L，pH7.2；装液量分别为10％、20％、30％和40％，摇床转速150rpm，在37℃温度下发酵48h，得到氨肽酶的粗酶液。
本实施例在不同装液量条件下所得粗酶液的氨肽酶活性测定结果如图2所示。由图2可以看出，装液量在10％时氨肽酶活力最高，装液量继续增加时，氨肽酶产量迅速降低。
实施例3
本实施例的一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis SWJS33,CGMCCNo.7388)在产氨肽酶中的应用，取地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis SWJS33,CGMCCNo.7388)于种子培养基(蛋白胨5g，酵母粉1g，人工海水1L，pH 7.4)中培养，将所得菌株用于发酵的培养基及培养条件如下：分别以甘油、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、可溶性淀粉作为碳源5g，酵母粉10g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.3g，硫酸铵1g，氯化钙1g，氯化钠40g，去离子水1L，pH7.2；装液量为10％，摇床转速150rpm，在37℃温度下发酵48h，得到氨肽酶的粗酶液。
本实施例以不同物质作为碳源时所得粗酶液的氨肽酶活性测定结果如图3所示。由图3可以看出，以可溶性淀粉作为碳源时，氨肽酶活力最高，其次是果糖、葡萄糖。
实施例4
本实施例的一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis SWJS33,CGMCCNo.7388)在产氨肽酶中的应用，取地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis SWJS33,CGMCCNo.7388)于种子培养基(蛋白胨5g，酵母粉1g，人工海水1L，pH 7.4)中培养，将所得菌株用于发酵的培养基及培养条件如下：可溶性淀粉5g，分别以酵母粉、蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白、牛肉膏、SIP酶解物、酪蛋白酶解物、大豆蛋白胨、硫酸铵和尿素作为氮源10g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.3g，硫酸铵1g，氯化钙1g，氯化钠40g，去离子水1L，pH7.2；装液量为10％，摇床转速150rpm，在37℃温度下发酵48h，得到氨肽酶的粗酶液。
本实施例以不同物质作为氮源时所得粗酶液的氨肽酶活性测定结果如图4所示。由图4可以看出，以酵母粉作为氮源时，氨肽酶活力最高，以SIP酶解物、大豆蛋白胨作为氮源时活力为酵母粉作为氮源时的50％左右，其它有机或无机氮源则不合适本发明菌株生产氨肽酶。
实施例5
本实施例的一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis SWJS33,CGMCCNo.7388)在产氨肽酶中的应用，取地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis SWJS33,CGMCCNo.7388)于种子培养基(蛋白胨5g，酵母粉1g，人工海水1L，pH 7.4)中培养，将所得菌株用于发酵的培养基及培养条件如下：可溶性淀粉5g，酵母粉10g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.3g，硫酸铵1g，氯化钙1g，氯化钠分别为0g、20g、30g、40g和50g，去离子水1L，pH7.2；装液量为10％，摇床转速150rpm，在37℃温度下发酵48h，得到氨肽酶的粗酶液。
本实施例在不同氯化钠浓度下(0、2％、3％、4％、5％)所得粗酶液的氨肽酶活性测定结果如图5所示。由图5可以看出，添加一定量的氯化钠能显著提高产氨肽酶的水平，氯化钠添加量4％时产氨肽酶活力最高。
对以上实施例Bacillus licheniformis SWJS33所产氨肽酶进行串联质谱鉴定：
将菌株所产氨肽酶经分离纯化后凝胶电泳只有一个条带，将此条带回收后用trypsin酶解，利用辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和Mascot数据库检索对酶蛋白进行鉴定，结果如图6所示。在得到的数条肽段中，“HLDDKASVALLIELIR”与“AGHDIVHGLIGPGIDASHAFER”与Bacillus licheniformis ATCC 14580的氨肽酶(gi|52079505)相匹配。蛋白质评分为395，可信度为100％，鉴定此酶为氨肽酶。
对以上实施例Bacillus licheniformis SWJS33所产氨肽酶酶学性质进行分析：
最适温度：分别测定纯化后的氨肽酶在20～90℃下的活力，结果如图7所示。由图7可以看出，所得氨肽酶在60℃时活性最高，将此时活力作为100％，50～80℃范围内活力在50％以上，温度低于或高于此范围，酶活力大大降低，温度升高至90℃时，氨肽酶基本上失去活力。因此该氨肽酶的最适温度为60℃。
最适pH：分别测定纯化后的氨肽酶在pH 3～10下的活力，结果如图8所示。由图8可以看出，所得氨肽酶在pH 8.0～9.6范围内有较高的活力，其中pH 8.0～8.5活力最高，pH低于7或高于10，酶的活力都较低。因此该氨肽酶的最适pH为8.0～8.5，属于碱性蛋白酶。
底物特异性：在相同的条件下，分别测定不同的氨基酸-对硝基苯胺AA-pNA(Leu-pNA、Phe-pNA、Ala-pNA、Arg-pNA、Glu-pNA、Lys-pNA、Pro-pNA和Met-pNA)作为底物时氨肽酶的活力，结果如图9所示。由图9可以看出，氨肽酶对Leu-pNA的底物特异性最强，氨肽酶活力较高，以Leu-pNA作为底物时的活力为100％，对其他底物的特异性则较弱，不及Leu-pNA作为底物时的10％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种地衣芽孢杆菌在产氨肽酶中的应用，其特征在于：所述地衣芽孢杆菌为Bacillus licheniformis SWJS33，于2013年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7388；
所述地衣芽孢杆菌在产氨肽酶中的培养基及培养条件如下：碳源5~6质量份，氮源10~15质量份，磷酸二氢钾0~0.5质量份，硫酸镁0.1~0.3质量份，硫酸铵0~1质量份，氯化钙0.5~1质量份，氯化钠20~50质量份，水1000质量份，pH7.0~7.6；装液量10%~40%，摇床转速150~250rpm，在25~40℃发酵36~60h；
所述的碳源为可溶性淀粉、果糖或葡萄糖；所述的氮源为酵母粉、SIP酶解物或大豆蛋白胨。
2.根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌在产氨肽酶中的应用，其特征在于：所述地衣芽孢杆菌在产氨肽酶中的培养基及培养条件如下：碳源5质量份，氮源10质量份，磷酸二氢钾0.5质量份，硫酸镁0.3质量份，硫酸铵1质量份，氯化钙1质量份，氯化钠40质量份，水1000质量份，pH7.2；装液量10%，摇床转速150rpm，在37℃发酵48h。
3.根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌在产氨肽酶中的应用，其特征在于：所述的碳源为可溶性淀粉。
4.根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌在产氨肽酶中的应用，其特征在于：所述的氮源为酵母粉。
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