CN102533887A - 利用大肠杆菌产γ-谷氨酰转肽酶高效合成L-茶氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用大肠杆菌产γ-谷氨酰转肽酶高效合成L-茶氨酸的方法，包括如下步骤：a)将大肠杆菌原始发酵液利用孔径为0.001-0.01um的超滤膜进行过滤；b)往酶和菌体的截留液中加入乙胺溶液调节pH至10-11，放置2-3小时得到酶浓缩液；c)取步骤b）中得到的酶浓缩液加入到含有L-谷氨酰胺的水溶液中形成酶反应体系，然后通过往酶反应体系中加入乙胺溶液控制酶反应体系的pH为9-10.5，酶转化温度为30-35℃。该方法具有操作简单、耗时耗能少、避免了引进杂质和γ-谷氨酰转肽酶的失活，避免了盐酸的引入而腐蚀反应器，提高了L-茶氨酸的产率和纯度、降低了成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用大肠杆菌产γ-谷氨酰转肽酶高效合成L-茶氨酸的方法。
背景技术
L-茶氨酸(N-乙基-γ-谷氨酰胺，theanine)是一种天然的氨基酸,是茶叶中的特征氨基酸，也是茶叶中有效的呈味物质。L-茶氨酸主要用于：（1）作为一种新兴的食品添加剂，可用作为茶饮料的品质改良剂、改善食品风味的添加剂、功能食品的添加剂、“情绪食品”的添加剂等；已在欧美、日本、中国台湾等国家、地区广泛使用。如日本已开发出添加茶氨酸的巧克力、果冻、布丁、口香糖、保健茶和各种清凉饮料。（2）作为医药中间体领域，茶氨酸可以用作抗肿瘤、降血压、安神镇静、抗疲劳等药物中。此外L-茶氨酸现已作为镇静剂中的有效成分，对帕金森氏症、老年性痴呆、传导神经功能紊乱等疾病起预防效果。
L-茶氨酸的生产方法主要有茶叶提取法、化学合成法、微生物发酵酶转化法。（1）茶叶提取法由于茶叶中茶氨酸的含量不高，从茶叶提取茶氨酸无法实际生产价值。所以植物提取法实际上是从提取茶多酚后的残留液中用离子交换树脂法提取茶氨酸。缺点是生产工序复杂、产品纯度低、产量小、价格高。（2）化学合成L-茶氨酸需要高温、高压及化学催化剂等条件，反应条件要求比较高，副产物多，且产生的都是DL-型消旋体， 还需要进行拆分才能得到L-型产品。因此，消旋体的拆分是制约茶氨酸的化学合成法的主要因素。由于化学合成方法在解决手性方面有一定难度，因此会使成本提高以及质量难以控制，且易混杂有毒物质，产品不宜用于食品行业应用，同时生产工艺复杂，且易造成环境污染。（3）微生物发酵酶转化法生产的L-茶氨酸都是L型的，且生产成本低，可大量生产，由于生物酶法合成具有高度的专一性，所以在产品质量方面更接近天然的L-茶氨酸，其发展前景非常广阔。此外酶转化法生产L-茶氨酸还具有纯度高、副产物少、纯化步骤少、生产能力强等优点，因此微生物发酵酶转化法是目前国内外研究人员公认的最直接、最经济的L-茶氨酸生产方法。
利用微生物发酵酶转化法生产L-茶氨酸的酶主要有谷氨酰酶和γ-谷氨酰转肽酶，本实验是研究利用大肠杆菌发酵产γ-谷氨酰转肽酶，专利号为200910035096.4的文件中公开了“高效转化谷氨酰胺合成L-茶氨酸的大肠杆菌菌株及其应用”，所述的“大肠杆菌”是指大肠杆菌（Escherichia coli）南师一号CCTCC No.M209166，该大肠杆菌高产茶氨酸合成酶,高效转化谷氨酰胺和乙胺为L-茶氨酸；大肠杆菌（Escherichia coli）南师一号CCTCC No.M209166的原始发酵液的制备方法参见该文件说明书第4页中的实施例2，包括如下步骤：（1）将大肠杆菌南师一号接种于LB固体培养基，每升培养基含蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，37℃培养12h，（2）挑单菌落接种于10ml LB液体培养基，每升培养基含蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用去离子水定容至1升，37℃震荡培养12h，（3）然后接种到液体发酵培养基，37℃震荡培养12h后获得大肠杆菌（Escherichia coli）南师一号CCTCC No.M209166的原始发酵液。
上述发酵液中γ-谷氨酰转肽酶是在大肠杆菌细胞内产生，60%的γ-谷氨酰转肽酶分泌到细胞外，40%的γ-谷氨酰转肽酶仍在细胞内，为了充分利用细胞内的酶，有人在发酵末期离心收集菌体，然后破壁收集酶液，目前国际上报道的主要采用煮沸、冻融、酶解、超声波等破壁方式，使微生物菌体破碎释放出酶液；这些破壁方式操作工艺复杂、耗时、耗能、还会引进杂质，更坏的是会降低酶的活性，使L-茶氨酸的转化率降低；另外一种方法是在反应过程中通过加入过量乙胺，以利于酶反应的进行，然后加入盐酸回调pH,然而这种回调pH方式会消耗大量盐酸，大量的盐酸会对金属反应器造成很大的腐蚀，同时引进杂质氯离子，这为后期的分离带来很到的困难。
发明内容
本发明克服了现有技术中的不足，提供一种简单高效、低耗能、不引进杂质的利用大肠杆菌产γ-谷氨酰转肽酶高效合成L-茶氨酸的方法。
本发明的技术方案如下：
利用大肠杆菌产γ-谷氨酰转肽酶高效合成L-茶氨酸的方法，包括如下步骤：
a) 将大肠杆菌（Escherichia coli）南师一号CCTCCNo.M209166的原始发酵液利用孔径为0.001-0.01um的超滤膜进行过滤，得到酶和菌体的截留液；
b) 往酶和菌体的截留液中加入乙胺溶液调节pH至10-11，放置2-3小时使菌体解体释放出细胞内的γ-谷氨酰转肽酶，得到酶浓缩液；
c)取步骤b）中得到的酶浓缩液加入到含有 L-谷氨酰胺的水溶液中形成酶反应体系，然后通过往酶反应体系中加入乙胺溶液控制酶反应体系的pH为9-10.5，酶转化温度为30-35℃。
作为改进，步骤a）中超滤膜的操作压力为0.15-0.45MPa，温度为30-35℃。
作为改进，步骤b）和步骤c）中所使用的乙胺溶液的质量浓度为50-70%。
作为改进，步骤c）中的酶反应体系中L-谷氨酰胺的浓度为40-50g/L。
作为改进，步骤c）中的酶反应体系中酶活力为4000-6000 U/L。
作为改进，步骤c）中的酶转化时间为12-14小时。
本发明与现有的方法相比具有如下优点：
1、利用超滤膜截留微生物菌、γ-谷氨酰转肽酶；操作简单且易实现自动化，收率高，酶含量高，耗能少，污染物少。
2、通过乙胺溶液调节pH使大肠杆菌细胞解体释放γ-谷氨酰转肽酶，与采用煮沸、冻融、酶解、超声波等破壁获取酶液的方式相比，具有操作简单、耗时少、耗能少、还避免了引进杂质和γ-谷氨酰转肽酶的失活。
3、在酶的转化过程中采用底物乙胺溶液控制pH，避免了先加入底物乙胺再用盐酸回调pH后引入杂质和腐蚀反应器。
4、利用本发明所述的合成L-茶氨酸的方法，提高了L-谷氨酰胺的转化率和产品的纯度、降低了成本。
具体实施方式
实施例1
a）取大肠杆菌（Escherichia coli）南师一号CCTCC No.M209166的原始发酵液100升，选用0.5m2孔径为0.001-0.01um的管式超滤膜，在操作压力为0.3Mpa， 温度为35℃的条件下进行过滤，当截留液体积约15L时，加10L纯化水稀释后再过滤一次，得到酶和菌体的截留液10升，经γ-萘胺比色法检测酶活力为100000U/L；
b）然后向酶和菌体的截留液中加入质量浓度为70%的乙胺水溶液使pH维持在11，放置2小时使菌体解体释放出细胞内的γ-谷氨酰转肽酶，得到酶浓缩液，经γ-萘胺比色法检测酶浓缩液的酶活力为138000U/L；
c）取步骤b）中得到的酶浓缩液3.62升加入到96.38升的 L-谷氨酰胺水溶液中形成酶反应体系，酶反应体系中含 L-谷氨酰胺4kg，然后往酶反应体系中加入质量浓度为50%的乙胺水溶液控制PH为10.5, 酶转化温度为30℃，酶转化时间为12小时，所得酶转化液经高效液相-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）检测，L-茶氨酸的产量为25.4g/L，产率提高了41.1%。
实施例2
a）取大肠杆菌（Escherichia coli）南师一号CCTCC No.M209166原始发酵液100升，选用0.5m2孔径为0.001-0.01um的管式超滤膜，在操作压力为0.15Mpa， 温度为30℃的条件下进行过滤，当截留液体积约15L时，加10L纯化水稀释后再过滤一次，得酶和菌体的截留液10升，经γ-萘胺比色法检测酶活力为105000U/L；
b）然后向酶和菌体的截留液中加入质量浓度为60%的乙胺水溶液使pH维持在10.5，放置3小时使菌体解体释放出细胞内的γ-谷氨酰转肽酶，得到酶浓缩液，经γ-萘胺比色法检测酶浓缩液的酶活力为140000U/L；
C）取步骤b）中得到的酶浓缩液2.86升加入到97.14升的 L-谷氨酰胺水溶液中形成酶反应体系，酶反应体系中含中含 L-谷氨酰胺4.5kg，然后往酶反应体系中加入质量浓度为70%的乙胺水溶控制PH为10, 酶转化温度为33℃，酶转化时间为13小时，所得酶转化液经高效液相-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）检测，L-茶氨酸的产量为25.8g/L，产率提高了43.3% 。
实施例3
a） 取大肠杆菌（Escherichia coli）南师一号CCTCC No.M209166原始发酵液100升，选用0.5m2孔径为0.001-0.01um的管式超滤膜，在操作压力为0.45Mpa， 温度为33℃的条件下进行过滤，当截留液体积约15L时，加10L纯化水稀释后再过滤一次，得酶和菌体的截留液10升，经γ-萘胺比色法检测酶活力为110000U/L；
b）然后向酶和菌体的截留液中加入质量浓度为50%的乙胺水溶液使pH维持在10，放置2小时使菌体解体释放出细胞内的γ-谷氨酰转肽酶，得到酶浓缩液，经γ-萘胺比色法检测酶浓缩液的酶活力为145000U/L；
c）取步骤b）中得到的酶浓缩液4.14升加入到95.86升的 L-谷氨酰胺水溶液中形成酶反应体系，酶反应体系中含中含 L-谷氨酰胺5kg,，然后往酶反应体系中加入质量浓度为60%的乙胺水溶液控制PH为9, 酶转化温度为35℃，酶转化时间为14小时，所得酶转化液经高效液相-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）检测，L-茶氨酸的产量为26.1g/L，产率提高了45%。
本发明的酶转化时间为12-14个小时，改进前的方法为：取大肠杆菌（Escherichia coli）南师一号CCTCC No.M209166的原始发酵液100升，所述的原始发酵液与实施例中的原始发酵液相同，对原始发酵液采取离心收集菌体、然后用均质仪机械破壁释放胞内酶、在酶反应过程中先加过量乙胺再用盐酸回调pH,该方法L-茶氨酸的产量为18g/L；与改进前的方法相比，本发明L-茶氨酸的产量达到25g/以上，产率提高了40%以上，酶转化时间缩短了6-8个小时。
Claims (6)
1.利用大肠杆菌产γ-谷氨酰转肽酶高效合成L-茶氨酸的方法，其特征在于包括如下步骤：
a) 将大肠杆菌（Escherichia coli）南师一号CCTCCNo.M209166的原始发酵液利用孔径为0.001-0.01um的超滤膜进行过滤，得到酶和菌体的截留液；
b) 往酶和菌体的截留液中加入乙胺溶液调节pH至10-11，放置2-3小时使菌体解体释放出细胞内的γ-谷氨酰转肽酶，得到酶浓缩液；
c)取步骤b）中得到的酶浓缩液加入到含有 L-谷氨酰胺的水溶液中形成酶反应体系，然后通过往酶反应体系中加入乙胺溶液控制酶反应体系的pH为9-10.5，酶转化温度为30-35℃。
2.根据权利要求1所述的利用大肠杆菌产γ-谷氨酰转肽酶高效合成L-茶氨酸的方法，其特征在于所述步骤a）中超滤膜的操作压力为0.15-0.45MPa，温度为30-35℃。
3.根据权利要求1所述的利用大肠杆菌产γ-谷氨酰转肽酶高效合成L-茶氨酸的方法，其特征在于所述步骤b）和步骤c）中所使用的乙胺溶液的质量浓度为50-70%。
4.根据权利要求1所述的利用大肠杆菌产γ-谷氨酰转肽酶高效合成L-茶氨酸的方法，其特征在于步骤c）中的酶反应体系中L-谷氨酰胺的浓度为40-50g/L。
5.根据权利要求1所述的利用大肠杆菌产γ-谷氨酰转肽酶高效合成L-茶氨酸的方法，其特征在于步骤c）中的酶反应体系中酶活力为4000-6000 U/L。
6.根据权利要求1所述的利用大肠杆菌产γ-谷氨酰转肽酶高效合成L-茶氨酸的方法，其特征在于步骤c）中的酶转化时间为12-14小时。
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