CN101363014B - 一种枯草芽孢杆菌生产γ-谷氨酰转肽酶的方法 - Google Patents
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Abstract
一种枯草芽孢杆菌生产γ-谷氨酰转肽酶的方法，属于食品生物技术领域。本发明对γ-谷氨酰转肽酶产生菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SK11.004进行斜面、种子、发酵三级培养；从发酵液中分离纯化得到γ-谷氨酰转肽酶酶粉。本发明提供的利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SK11.004生产γ-谷氨酰转肽酶的方法，其育种工作量小，费用低，安全性能可靠，可以进行液体发酵生产，成本低，可用于大规模生产，本发明使用的枯草芽孢杆菌所产γ-谷氨酰转肽酶酶活可达4U/mL以上。其发酵产品无毒，可以直接用于生产许多有价值的γ-谷氨酰类化合物，如L-γ-谷氨酰-L-多巴、γ-谷氨酰牛磺酸、γ-谷氨酰色氨酸、谷胱甘肽、茶氨酸等。
Description
技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌生产γ-谷氨酰转肽酶的方法，属于食品生物技术领域。
背景技术
γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase，γ-GTP，EC2.3.2.2)，即γ-谷氨酰转移酶，是生物体内谷胱甘肽代谢的相关酶之一，也是催化转移L-γ-谷氨酰基的特异性酶。γ-谷氨酰转肽酶可以催化以下3类反应：
(1)转肽反应：
(2)自转肽反应：
(3)水解反应：
它在生物体中分布相当广泛，从细菌到高等哺乳动物体中都有该酶的存在。血清中γ-谷氨酰转肽酶活性是肝胆疾病的相当灵敏的指示剂，在临床上已经用于肝脏细胞癌变和肝癌形成的检测指标物，现也研究其在其他组织病变过程中的作用。该酶还是γ-谷氨酰循环中的关键酶，在细胞中通过转肽反应可以进行细胞间的氨基酸分子运输。目前，广大研究者更为关注的是该酶在生物催化合成中的重要应用：(1)催化合成药物或药物前体，如帕金森综合症的前体药物L-γ-谷氨酰-L-多巴的合成、谷胱甘肽的合成、L-γ-谷氨酰-牛磺酸的合成(该物质会影响脑中的单胺的浓度、猫的攻击性行为、以及电击引起的失忆症，还有抗癫痫等)，γ-D-谷氨酰-L-色氨酸(SCV-07)合成(SCV-07是一种新型的广谱免疫调节类化合物，其作用类似胸腺素α1)、以及茶氨酸的合成(该物质更是具有降血压、抗肿瘤、提高免疫力、抗抑郁、神经保护作用、改善经期综合征、减轻体脂等保健作用)。(2)氨基酸的修饰和改性，将具有苦味的氨基酸(L-型的芳香氨基酸、碱性氨基酸及有支链的氨基酸)通过γ-谷氨酰化可对其进行风味的改变，通过γ-谷氨酰化还能增强某些物质的稳定性和可溶性，如胱氨酸通过γ-谷氨酰化转变为γ-谷氨酰-胱氨酸后，其可溶性极大增强；γ-谷氨酰-皮啡肽因其稳定性增强可用作具有镇痛作用的前体药物。(3)氨基头孢菌烷酸(7-ACA)的制备，7-ACA是生产头孢菌素的关键性中间体。
γ-谷氨酰基化合物是一类重要的氨基酸衍生物，在食品、医药、化妆品等领域具有广泛的应用前景。利用γ-GTP生物催化合成γ-谷氨酰基化合物是制备系列γ-谷氨酰基化合物的有效手段。
γ-谷氨酰转肽酶制备主要有这样两个途径：一是从动植物中富含酶的组织中提取纯化；二是微生物法生产酶蛋白。由于以前采用这两种方法获得γ-GTP都比较困难，导致γ-GTP的产量较低，使得采用酶法合成γ-谷氨酰基类化合物一直处于实验室的研究阶段。自从1952年有人尝试从普通变形杆菌中分离γ-GTP，才开始了微生物法生产酶蛋白的研究。此后Suzuki等利用基因工程构建E.Coli的γ-GTP生产菌，但由于γ-GTP含量极低，无法分离而不具有商业价值。近来浅田芳宏等发现有些芽孢杆菌可在体外分泌γ-GTP，并得到一株最高可产γ-GTP每毫升3.0U的菌株。国内南京工业大学徐虹教授等人从土壤里筛选分离得到一株产胞外γ-GTP的Bacillus subtilis NX-2，其酶活力达到每毫升3.2U。可见采用产酶性能优良的菌种，尤其是产胞外γ-谷氨酰转肽酶的菌株，摸索出成熟的工艺条件，对以后大规模生产γ-GTP至关重要。
发明内容
本发明目的是提供一种枯草芽孢杆菌生产γ-谷氨酰转肽酶的方法。
本发明所使用的枯草芽孢杆菌，是本发明人等先前从发酵食品虾酱中筛选得到的一株可以高产γ-谷氨酰转肽酶的菌株，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SK11.004，已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2008年7月10日，保藏编号：CCTCC NO：M 208083。
本发明的技术方案：一种枯草芽孢杆菌生产γ-谷氨酰转肽酶的方法：
(1)对γ-谷氨酰转肽酶产生菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SK11.004进行斜面、种子、发酵三级培养；
斜面培养：培养基组分以g/L计：蛋白胨8～10，牛肉膏3～5，氯化钠3～5，琼脂20，pH7.0～7.2，121℃灭菌20min，培养条件为：培养温度35～40℃，培养时间8～16小时；
种子培养：培养基组分以g/L计：葡萄糖15～20，酵母膏10～15，玉米浆8～12，MgSO4·7H2O 0.3～0.5，K2HPO4 0.5～2，含消泡剂聚氧乙烯氧丙烯甘三油0.5mL/L，pH7.0～7.2，121℃灭菌20min；培养条件为：250mL三角瓶装液30mL，摇瓶转速200rpm，培养温度37℃，培养时间8～12小时；一级种子培养基按体积百分2.5％接入装液量为18升液体种子培养基的30升二级种子罐中，培养条件为：搅拌速度200rpm，控制通风量：0～5小时为8～10L/min，5～12小时为12～15L/min；控制培养温度为35～40℃，培养时间8～12小时；
发酵培养：培养基组分以g/L计：蔗糖15～35，胰蛋白胨5～8，玉米浆12～15，MgSO4·7H2O 0.3～0.5，K2HPO4 0.5～2，消泡剂聚氧乙烯氧丙烯甘三油2mL/L，pH7.0～7.2，121℃灭菌20min，调pH7.0～7.2；种子培养基按体积百分2.5％接入装液量700升液体发酵培养基的1吨发酵罐中，培养条件为：搅拌速度200rpm，控制通风量：0～8小时为10～12L/min，8～16小时为14～16L/min；控制培养温度为35～40℃，培养时间14～16小时；
(2)从发酵液中分离纯化得到γ-谷氨酰转肽酶酶粉；
将制得的发酵液经离心或板框过滤去菌体，制得发酵液上清液，经超滤除去盐和杂蛋白，再经20％酒精沉淀，离心得沉淀，最后将沉淀进行冷冻干燥，即得γ-谷氨酰转肽酶酶粉。
本发明中的谷氨酰转肽酶活性，是通过使酶作用于γ-谷氨酰对硝基苯胺和双甘肽，定量所生成的对硝基苯胺而测定。该酶的单位定义为每1分钟生成1μmol对硝基苯胺的酶量。
本发明的有益效果：枯草芽孢杆菌SK11.004最初来源于发酵食品虾酱，是无人体寄生性的高度安全的菌类，通过细菌进行液体发酵生产成本低。本发明得到的枯草芽孢杆菌所产γ-谷氨酰转肽酶酶活可达4U/mL以上。其发酵产品无毒，可以直接用于生产许多有价值的γ-谷氨酰类化合物，如L-γ-谷氨酰-L-多巴、γ-谷氨酰牛磺酸、γ-谷氨酰色氨酸、谷胱甘肽、茶氨酸等。
具体实施方式
实施例1
将枯草芽孢杆菌SK11.004在下述条件下进行发酵：
斜面培养：培养基组分(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏5，氯化钠5，琼脂20，pH7.0，121℃灭菌20min，培养条件为：培养温度37℃，培养时间14小时；
种子培养：培养基组分(g/L)：葡萄糖20，酵母膏10，玉米浆10，MgSO4·7H2O0.5，K2HPO41，pH7.0，121℃灭菌20min，培养条件为：250mL三角瓶装液30mL，摇瓶转速200rpm，培养温度37℃，培养时间12小时；一级种子培养基按体积百分2.5％接入30升二级种子罐(装液量18升)液体种子培养基中，其中消泡剂聚氧乙烯氧丙烯甘三油0.5(mL/L)，培养条件为：搅拌速度200rpm，控制通风量：0～5小时为10L/min，5～12小时为15L/min；控制培养温度为37℃，培养时间12小时；
发酵培养：培养基组分(g/L)：蔗糖25，胰蛋白胨5，玉米浆15，MgSO4·7H2O0.5，K2HPO41，消泡剂聚氧乙烯氧丙烯甘三油2(mL/L)，pH7.2，121℃灭菌20min；种子培养基按体积百分2.5％接入1吨发酵罐(装液量700升)液体发酵培养基中，培养条件为：搅拌速度200rpm，控制通风量：0～8小时为12L/min，8～16小时为15L/min；控制培养温度为37℃，培养时间16小时，得到发酵液的酶活为4.1U/mL；
实施例2
酶粉的制备：
将制得的发酵液经离心(4000rpm)去菌体，制得发酵液上清液，再经截流分子量为1万的超滤膜超滤除去盐和杂蛋白，后经20％酒精沉淀，离心得沉淀，最后将沉淀进行冷冻干燥，即得γ-谷氨酰转肽酶酶粉，酶活达3.8U/mL。
Claims (1)
1.一种枯草芽孢杆菌生产γ-谷氨酰转肽酶的方法，其特征在于：
(1)对γ-谷氨酰转肽酶产生菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CCTCC NO：M 208083进行斜面、种子、发酵三级培养；
斜面培养：培养基组分以g/L计：蛋白胨8～10，牛肉膏3～5，氯化钠3～5，琼脂20，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min，培养条件为：培养温度35～40℃，培养时间8～16小时；
种子培养：培养基组分以g/L计：葡萄糖15～20，酵母膏10～15，玉米浆8～12，MgSO4·7H2O 0.3～0.5，K2HPO4 0.5～2，含消泡剂聚氧乙烯氧丙烯甘三油0.5mL/L，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min；培养条件为：250mL三角瓶装液30mL，摇瓶转速200rpm，培养温度37℃，培养时间8～12小时；一级种子培养基按体积百分2.5％接入装液量为18升液体种子培养基的30升二级种子罐中，培养条件为：搅拌速度200rpm，控制通风量：0～5小时为8～10L/min，5～12小时为12～15L/min；控制培养温度为35～40℃，培养时间8～12小时；
发酵培养：培养基组分以g/L计：蔗糖15～35，胰蛋白胨5～8，玉米浆12～15，MgSO4·7H2O 0.3～0.5，K2HPO40.5～2，消泡剂聚氧乙烯氧丙烯甘三油2mL/L，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min，调pH 7.0～7.2；种子培养基按体积百分2.5％接入装液量700升液体发酵培养基的1吨发酵罐中，培养条件为：搅拌速度200rpm，控制通风量：0～8小时为10～12L/min，8～16小时为14～16L/min；控制培养温度为35～40℃，培养时间14～16小时；
(2)从发酵液中分离纯化得到γ-谷氨酰转肽酶酶粉；
将制得的发酵液经离心或板框过滤去菌体，制得发酵液上清液，经超滤除去盐和杂蛋白，再经20％酒精沉淀，离心得沉淀，最后将沉淀进行冷冻干燥，即得γ-谷氨酰转肽酶酶粉。
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