CN104450590B - 一株具有抑菌活性的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株具有抑菌活性的枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌JYM841(Bacillus subtilis JYM841)，已于2014年1月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2014012。本发明提供的枯草芽孢杆菌JYM841对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌都具有较强的抑制作用，该菌株抑菌性强、抑菌谱广、产酶比较高，对细菌抗生素敏感，对真菌抗生素耐药；耐高温能力较强，在100℃处理20min还有较强的抑菌性，对胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K等多种酶具有耐受性；对酸碱较耐受，能耐酸碱pH值的范围为6‑10，代谢产物稳定。因此该菌株可以在制备治疗生殖道感染的药物中应用。

Description

一株具有抑菌活性的枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株具有抑菌活性的枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

抗生素是某些微生物通过酶促反应将初级代谢产物转变为结构性的次级代谢产物。抗生素不合理的大量使用、滥用，加上缺乏严格的监管，导致死亡、耐药微生物及超级耐药菌株的产生，抗生素的误用也置病人于不必要的抗药性风险中；由不良药物反应导所致的住院治疗费用已增长至亿万美元，大大增加了医疗成本，滥用抗生素产生的副作用已成为全球性亟待解决的问题。

外阴阴道假丝酵母菌(Vulvovaginal candidiasis，VVC)及细菌性阴道病(Bacterial Vaginosis，BV)是阴道微生态失衡所致的一种感染，即由白色念珠菌(Candidaalbicans)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)等大量繁殖所致，常常表现为分泌物增多、有异味，外阴瘙痒、白带异常，颜色发黄或灰白、质稀薄或呈豆渣样、有腥臭味，或有烧灼感、下腹疼痛或腰疼、腰酸等，严重影响广大女性的工作和生活。据调查：75％的育龄妇女一生中至少有一次发病，全球数以万计的妇女一直被这种阴道病困扰着。

目前治疗阴道感染的措施主要是运用抗生素、灭滴灵、雌激素以及酸化阴道的制剂等来杀灭阴道内的病原微生物。抗生素在杀死病源微生物的同时也杀死正常菌群，引起致病菌或条件致病菌的过度繁殖，造成反复感染、多重感染，产生耐药性、抗药性，增加治疗的难度和成本。中药治疗，采用熏洗的方法，往往对BV效果不佳，目前市面上常见的中成药物凝胶剂、栓剂、泡腾片等，主要是用于抗菌药物的辅助治疗。据调查很多药物效果不佳，特别是对VVC、复发性念珠阴道病(recurrent vulvovaginal candidiasis，RVVC)，疗程长易反复。

因此，开发无毒副作用、安全高效的具有抗感染性能的益生菌菌株，可以减少、替代甚至取代抗生素的使用，有效降低抗生素带来的一系列的副作用。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是自然界中广泛存在的一种非致病性细菌，能产生多种抗真菌和细菌的代谢物，不会产生耐药性，将其作为抗生素的替代品，其研究和开发意义重大，市场前景广阔。

发明内容

本发明的目的是提供一株具有抑菌活性的枯草芽孢杆菌及其应用。

本发明提供的具有抑菌活性枯草芽孢杆菌，该菌株命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JYM841，已于2014年1月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 2014012。

所述菌株的主要生物学特征为：该菌种的细胞大小为通常为(0.7μm～0.8μm)×(2.0μm～3.0μm)，杆状，很少成链，染色均匀，无荚膜，鞭毛侧生，能运动；芽孢呈椭圆形或柱状，中生或偏生，大小为0.8μm×(1.5μm～1.8μm)；游离孢子表面着色弱；培养基上的菌落圆或者不规则形，表面色暗，变厚和不透明，可起皱，可呈奶油色或微粉色；革兰氏阳性，接触酶阳性，能发生V-P反应；能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇产酸，能水解淀粉，分解色氨酸形成吲哚；生长温度最高值45℃～55℃，最低值5℃～20℃，最适温度为37℃。

本发明还提供一种菌剂，它的活性成分为枯草芽孢杆菌JYM841，CCTCC NO:M2014012。

生产所述菌剂的工艺为：斜面接种-摇瓶接种-种子罐-发酵罐-产品，产品的包装剂型为液体菌剂或粉剂。

用所述菌株制备所述菌剂具体可采用如下步骤：

(1)菌种：选用枯草芽孢杆菌JYM841；

(2)斜面培养：将冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在35℃～40℃培养24h～26h；

(3)一级种子培养：取培养好的斜面，在无菌条件下接种，用接种环取一到两环于50mL～100mL种子液体培养基中，在35℃～40℃，180rpm下震荡培养24h～30h，制得一级种子液；

(4)扩大培养：以0.5～1％的接种量(按体积百分数)，将一级种子液接于500mL～1000mL种子液体培养基中，在35℃～40℃，180rpm下震荡培养24h～26h，制得二级种子液；

(5)发酵罐培养：以0.5～1％的接种量(按体积百分数)，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于25℃～28℃，罐压0.05MPa，通气量600m³/h条件下培养18h～22h；

上述步骤(3)和(4)中，所述种子液体培养基的配方为：按质量百分数计，硫酸镁0.01％，葡萄糖1.5％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，磷酸二氢钾0.15％，氯化钠1％，使用时调节pH为6.5～7.0；

步骤(5)中所述液体发酵培养基的配方为：按质量百分数计，葡萄糖0.4％，蛋白胨0.75％，氯化钠0.25％，酵母膏0.4％，使用时调节pH为6.5～7.0；

步骤(2)中所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加质量百分数为1.5～2.0％的琼脂粉。

所述菌株和/或所述菌剂在制备治疗生殖道感染的药物中的应用也属于本发明的保护范围；所述生殖道感染是由白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌大量繁殖引起的。

本发明还提供一种用于治疗女性生殖道感染的药物制剂；所述药物制剂的剂型为凝胶剂。

该药物制剂的配方组成为：按质量百分数计，卡波姆1.5～3％，壳聚糖0.2～0.6％，甘油3～5％，薄荷油0.2～0.5％，中药提取浓缩液40～45％(生药量与浓缩液体积比m/V为1:1)，菌株JYM841发酵离心液30～35％，余量为水。

所述中药提取浓缩液为黄芩、苦参、薄荷和桑叶按质量比为10:8:3:2混合的混合药材的水提液，浓缩至中药生药量与中药液体积的比为1:1，单位g/mL。

本发明还提供了该药物制剂的制备方法，步骤为：称取卡波姆，用菌株JYM841发酵离心液溶解，边加边搅拌，再加入中药提取浓缩液、壳聚糖，搅匀，直至细腻均匀无颗粒，用质量浓度为10％的氢氧化钠调节pH值至4.0-6.5，加入甘油及薄荷油，加水至总量，搅匀，即得。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的枯草芽孢杆菌JYM841对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌都具有较强的抑制作用，该菌株抑菌性强、抑菌谱广、产酶比较高，对细菌抗生素敏感，对真菌抗生素耐药。

(2)本发明提供的枯草芽孢杆菌JYM841耐高温能力较强，在100℃处理20min还有较强的抑菌性，对胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K等多种酶具有耐受性，对酸碱较耐受：能耐酸碱pH值的范围为6.0～10.0，代谢产物稳定。

(3)本发明提供的枯草芽孢杆菌JYM841的发酵周期为18～22h，抑菌性蛋白含量较高，抑菌性较强，发酵液的活菌数数量级最高达到10¹⁰cfu/g，喷干粉的芽孢活菌数到达1.4×10¹³cfu/g，酶活10940U/g，最低抑菌浓度为2％。

(4)急性毒性试验结果表明菌株JYM841是安全无毒的，以菌株JYM841或/和菌剂作为活性成分制备的用于治疗阴道感染的药物不会产生副作用和不良药物反应，安全性好。避免应用抗生素带来反复发作、耐药性、超级细菌的产生等不良反应，还能够保留体内的固有菌，再补充优势菌加速微生态菌群的平衡。

附图说明

图1a为分离菌株对白色念珠菌的抑菌图片；

图1b为分离菌株对金黄色葡萄球菌的抑菌图片；

图2为菌株JYM841系统发育树；

图3为菌株JYM841凝胶蛋白分子量大小分析图；

图4a为阴性对照组阴道切片(×40)；图4b为阴性对照组阴道切片(×200)；

图5a为染毒组阴道切片(×40)；图5b为染毒组阴道切片(×200)；

图6a为阳性对照组阴道切片(×40)；图6b为阳性对照组阴道切片(×200)；

图7为治疗7天后家兔的饮食变化趋势图；

图8为造模期间家兔阴道分泌物菌群变化；

图9为正常对照组阴道分泌物镜检涂片；

图10为灌注抗生素后阴道分泌物镜检涂片；

图11为攻毒后阴道分泌物镜检涂片；

图12实验结束后各实验组家兔阴道分泌物菌群变化；

图13为自然恢复组阴道分泌物镜检涂片；

图14为治疗组阴道分泌物镜检涂片；

图15为阳性对照组阴道分泌物镜检涂片；

图16为正常对照组阴道组织切片图(×40)；

图17为模型组阴道组织切片图(×40)；

图18为治疗组阴道组织切片图(×40)；

图19为阳性对照组阴道组织切片图(×40)。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

本发明中未详尽描述的试剂、方法均为所属领域的常规试剂、方法。

实施例1：菌株JYM841的获得和鉴定

一、菌株JYM841的获得

1.培养基

(1)胰蛋白胨大豆琼脂培养基：胰蛋白胨1.5％，大豆蛋白胨0.5％，氯化钠0.5％，琼脂1.6％，pH7.2；

(2)沙堡琼脂培养基：葡萄糖4％，蛋白胨1％，琼脂2％，pH5；

(3)营养琼脂培养基：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，PH 7.2-7.4，琼脂1.6％。

(4)芽孢菌基础培养基：葡萄糖0.2％，蛋白胨1.0％，氯化钠0.5％，酵母膏0.5％，pH7.0。

(5)乳酸菌培养基(MRS培养基)：葡萄糖2.0％，柠檬酸铵0.2％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸锰0.02％，硫酸镁0.05％，蛋白胨1.0％，牛肉膏1.0％，酵母膏0.5％，吐温-80 0.1％，pH6.0。

(6)LB液体培养基：葡萄糖0.2％，蛋白胨1.0％，氯化钠0.5％，酵母膏0.5％，pH值7.0。

(7)LB斜面培养基：葡萄糖0.2％，蛋白胨1.0％，氯化钠0.5％，酵母膏0.5％，pH值7.0，琼脂1.6％。

(8)液体发酵培养基：葡萄糖0.4％，蛋白胨0.75％，氯化钠0.25％，酵母膏0.4％，使用时调节pH为7.0。上述均按质量百分数计。

2.菌株的分离、筛选:无菌取中药金银花、苦参、黄芩各0.8g，分别加入到盛有100mL灭菌生理盐水的三角烧瓶中，震荡摇匀，然后用接种环蘸取溶液于盛有已凝固的LB培养基的平板中，划线，37℃培养箱中恒温培养24h，挑取单菌落继续划线，革兰氏染色镜检，直至纯化的无杂菌。

3.菌株的纯化：将筛选到的单菌落转接到LB液体培养基中，37℃，150rpm震摇24h，能够形成芽孢，将发酵液在80℃的水浴锅中处理30min，用接种环在平板中划线，挑取单菌落保存到试管斜面上，做革兰氏染色，镜检。

4.分离菌株的抑菌性比较：用接种环取纯化好的斜面菌株两环于LB液体培养基中，37℃，180rpm震荡培养20h，用无菌镊子取直径为6mm，并加有20μL经10000rpm离心10min之后的发酵上清液的滤纸片，贴在已涂白色念珠菌的沙堡培养基，涂金黄色葡萄球菌的胰蛋白胨大豆琼脂培养基、涂大肠杆菌营养琼脂培养基中，每个菌贴有3片，在37℃培养箱中恒温培养16h，观察并用游标卡尺量取抑菌圈的直径。(纸片琼脂扩散法)。初筛得到32株较纯的菌株，对32株菌进行抑菌性的复筛，得到7株抑菌性能较好的菌株，其形态学特征见表1。测定7株菌株的抑菌性能，方法为：将活化后的7株菌以及枯草芽孢杆菌N9-1-35、B7348分别接种于20mL/50mL的三角瓶中，37℃培养箱中恒温培养22h后，然后以1％的接种量(体积百分比)转接到装有100mL LB液体培养基的300mL三角瓶中，10000rpm离心10min，取上清分别做抑菌性试验，结果见表2，图1a和图1b。最终获得1株最高效抑制白色念珠菌和金黄色葡萄球菌的菌株，编号为JYM841。

表1各株菌的形态学结果

表2菌株的抑菌性比较(单位：mm)

试验结果表明：经过分离纯化的7株菌对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌都有较强的抑菌性，菌株JYM811、JYM841、JYM851对大肠杆菌也有明显的抑菌性，但是，从抑菌圈的直径来看，对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌性显著高于大肠杆菌的抑菌性(p＜0.01)，而分离各株菌JYM811、JYM812、JYM831、JYM841、JYM851、JYM862、JYMX的抑菌性显著高于芽孢杆菌N9-1-35、B7348抑菌性(p＜0.01)。JYM841为最高效抑制白色念珠菌和金黄色葡萄球菌的菌株。

5.筛选菌株代谢产物的制备：用接种环取纯化好的斜面菌株两环于LB斜面培养基中，37℃培养复壮，24h后接种到装有100mLLB液体培养基的300mL三角瓶中，37℃恒温振荡培养箱180rpm培养24h，然后接种到装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，37℃恒温振荡培养箱18rpm培养22h，10000rpm离心10min，取上清液经细菌滤器过滤(滤膜直径为0.22μm)，即为芽孢杆菌的代谢产物。

二、菌株JYM841的鉴定

根据分离菌的菌落和菌体形态，革兰氏染色以及生理生化反应，按《伯杰氏细菌鉴定手册》进行初步归属。枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7×2.0μm，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6×1.0μm，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面不透明，污白色或微粉红色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。

对菌株JYM841进行分子鉴定，按以下步骤进行：将菌株JYM841进行液体发酵，采用天根公司的试剂盒提取菌体DNA，并对其进行16s rDNA序列扩增。所用引物为通用引物：5’-ggttaccttgttacgactt-3’，5’-agagttgatcctggctcag-3’，PCR反应体系(50μL)为:Mixture25μL(含Taq DNA聚合酶及dNTP等，天根生化科技有限公司)，上下游引物各1μL，模板DNA 2μL，超纯水21μL。PCR扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，25个循环，72℃延伸10min。PCR产物送北京博尚生物技术有限公司进行序列测定。

菌株JYM841的16S rDNA的序列长度为1381bp，其序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，将测序结果登录GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)对菌株16S rDNA测序结果利用Blast进行检索，并下载相关属种的16S rDNA序列，采用DNAMAN、DNAclub、MEGA3.1等软件进行同源性分析，并构建系统进化树。(如图2所示)，以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，该序列与Bacillus subtitis AJ276351菌种的16S rDNA有高达99％的同源性，结合形态，将其鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtitis)JYM841。

三、菌株JYM841的保藏

通过以上鉴定结果，确认菌株JYM841为来自枯草芽孢杆菌属(Bacillussubtitis)的新菌，将其命名为枯草芽孢杆菌JYM841，保藏于位于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2014012，保藏时间为2014年1月10日。

实施例2：菌株JYM841代谢产物的特性研究

1.试验材料：

1.1供试菌株：枯草芽孢杆菌N9-1-35(已于2011年08月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M 2011301)；枯草芽孢杆菌B7348(已于2010年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010260)；实施例1筛选得到的菌株JYM811、JYM812、JYM831、JYM841、JYM851、JYM862和JYMX。

1.2指示菌：白色念珠菌(标记为BN)、金黄色葡萄球菌(标记为JP)。

2.试验方法与结果：

(1)胞外抗菌蛋白对温度的耐受性

菌株代谢产物的制备同实施例1，将菌株JYM812、JYM831、JYM841、JYM851、JYM862的代谢产物在60℃、80℃、100℃下分别处理20min、40min、60min，冷却后做抑菌试验，用滤纸片法测定抑菌活性，同时设不处理样品做对照。结果见表3至表7。

表3菌株JYM841的胞外抗菌蛋白对温度耐受试验结果

注：YY表示原液温度，即37℃发酵的温度；-表示没有明显的抑菌圈。

表4菌株JYM812的胞外抗菌蛋白对温度耐受试验结果

注YY：表示原液温度，即37℃发酵的温度；-表示没有明显的抑菌圈。

表5菌株JYM831的胞外抗菌蛋白对温度耐受试验结果

注YY：表示原液温度，即37℃发酵的温度；-表示没有明显的抑菌圈。

表6菌株JYM851的胞外抗菌蛋白对温度耐受试验结果

注YY：表示原液温度，即37℃发酵的温度；-表示没有明显的抑菌圈。

表7菌株JYM862的胞外抗菌蛋白对温度耐受试验结果

注YY：表示原液温度，即37℃发酵的温度；-表示没有明显的抑菌圈。

试验结果表明：菌株JYM812、JYM831不耐受高温，在60℃20min就没有抑菌性，菌株JYM841、JYM851及JYM862比较耐受高温，在100℃处理20min还有较强的抑菌性，在80℃处理40min对白色念珠菌有较强的抑菌性，但是80℃处理40min对金黄色葡萄球菌无抑菌性。由此说明各菌株的代谢产物不是同一种代谢产物。

(2)胞外抗菌蛋白对酸碱的耐受性

菌株代谢产物的制备同实施例1，将菌株JYM812、JYM831、JYM841、JYM851、JYM862的代谢产物用酸碱分别调节pH值分别为2、4、6、7、8、9、10、原液(未调)，放到37℃培养箱中放置2h或3h，然后再用酸碱调回原来pH值，用滤纸片法测定其抑菌活性。结果见表8、表9。

表8菌株JYM812、JYM831、JYM841的代谢产物对酸碱耐受试验结果(单位：mm)

表9菌株JYM851、JYM862的代谢产物对酸碱耐受试验结果(单位：mm)

注YQ：是晕圈，还没有形成透明圈；-表示没有明显的抑菌圈。

试验结果表明：菌株JYM812、JYM831、在pH值小于4时，对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌没有抑菌性，当pH大于6时，三株菌对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌都有抑菌性，在原液自然pH值下其抑菌性显著高于其它pH；菌株JYM841在6﹤pH﹤10时，对白色念珠菌有抑菌性，且pH值为6时的抑菌性显著高于其它pH的抑菌性，对金黄色葡萄球菌的是在pH值为7时，抑菌性显著高于其它pH值。菌株JYM851在4﹤pH﹤9时，对两株致病菌都有抑菌性，但是pH值为8时抑菌性最强。菌株JYM862只有在原液的pH状态下有抑菌性，其它pH对代谢产物较为敏感，使其失去活性，无抑菌性。

(3)胞外抗菌蛋白对蛋白酶的耐受性

菌株代谢产物的制备同实施例1，将菌株JYM812、JYM831、JYM841、JYM851、JYM862的代谢产物调至胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶作用的最适pH值(pH值分别为2.0、7.5、7.5和6.5)，按终质量浓度1.0mg/mL分别加入上述各酶液，在上述各蛋白酶的最适温度下(分别为40℃、37℃、58℃和60℃)恒温水浴酶解3h后，将酶解液的pH值调回原发酵液的pH值，以金黄色葡萄球菌和白色念珠菌为指示菌，以未酶解处理的代谢产物为对照，滤纸片法做抑菌试验，试验做三个平行。结果见表10。

表10各株菌对不同蛋白酶的耐受性试验结果

试验结果表明：菌株JYM812耐受胰蛋白酶，对其他几种酶不耐受，能够被胃蛋白酶、木瓜蛋白酶及蛋白酶K酶解，菌株JYM831耐受木瓜蛋白酶，JYM862对各种酶都不耐受，只有JYM841有较强的耐酶能力，对胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K都有较强的耐受性。

总之，菌株JYM841能耐高温，对胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K比较耐受，对酸碱的耐受较强，而且其抑菌性显著高于其它各株菌的抑菌性。因此JYM841是一株代谢产物较稳定的抑菌性较好的菌株。因此，菌株JYM841为筛选的最佳试验菌株。

(4)菌株JYM841与芽孢杆菌N9-1-35、芽孢杆菌B7348的产酶性能比较

将菌株JYM841与枯草芽孢杆菌N9-1-35、枯草芽孢杆菌B7348在28℃180rpm发酵22h，终止发酵，测定酶活，结果见表11。

表11酶活测定结果(单位：U/mL)

试验结果表明：菌株JYM841所产中性蛋白酶显著高于芽孢杆菌N9-1-35、芽孢杆菌B7348的中性蛋白酶(p＜0.050)，淀粉酶未测到。

(5)不同温度下中性蛋白酶酶活测定

将芽孢杆菌N9-1-35、芽孢杆菌B7348、菌株JYM841的斜面活化后，接入液体培养基中28℃发酵24h，转接到发酵培养基中分别在28℃、34℃、37℃180rpm发酵22h，终止发酵，测定酶活。结果见表12。

表12不同温度下中性蛋白酶酶活测定结果(单位：U/mL)

(A表示差异极显著)

试验结果表明，在不同温度下，菌株JYM841发酵液中所产的中性蛋白酶都显著高于菌株N9-1-35、B7348。

实施例3：菌株JYM841的抑菌谱研究

1.试验材料：

1.1供试菌株：实施例1筛选得到的菌株JYM841。

1.2指示菌：白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、植物乳杆菌LP、嗜热链球菌1.2471、嗜酸乳杆菌1.2467、干酪乳杆菌1.0062、瑞士乳杆菌1.1877。其中植物乳杆菌LP(已于2010年06月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M2010150，记载在中国专利申请CN201010240725.X中)；其余指示菌均为市售产品。

2.方法与结果：

取菌株JYM841的发酵液10000rpm离心10min，取上清液，进行抑菌性试验；选取的指示菌分别为白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌1.2471、嗜酸乳杆菌1.2467、干酪乳杆菌1.0062、瑞士乳杆菌1.1877。试验结果见表13。

表13菌株JYM841对各指示菌的抑菌圈的直径(单位：mm)

注：-表示没有明显的抑菌圈。

试验结果表明：菌株JYM841对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌都有较强的抑菌性，对干酪乳杆菌1.0062也有较弱的抑菌性，而对嗜热链球菌1.2471、瑞士乳杆菌1.2567、植物乳杆菌LP和嗜酸乳杆菌1.2467无抑菌性。因此，此菌株是选择性抑制致病菌白色念珠菌和金黄色葡萄球菌较强的菌株。

实施例4：菌株JYM841抗菌活性物质的粗提及抗菌物质的确定

取7份50mL菌株JYM841发酵液，10000rpm离心10min，取上清，在磁力搅拌器上边搅拌边一滴滴加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵饱和度分别为30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，4℃静置过夜。第二天10000rpm离心10min，收集沉淀溶解在500μL蒸馏水中，平均分成两份，一份用于做抑菌试验，发酵离心液和饱和硫酸铵溶液为对照。另一份用于SDS-PAGE跑凝胶电泳。

(1)不同饱和度的硫酸铵沉淀蛋白后，用水复溶，其各个硫酸铵饱和度的抑菌性试验结果见表14。

表14菌株JYM841沉淀蛋白复溶后抑菌性试验结果(单位：mm)

注：L表示发酵离心液；-表示无抑菌性。

试验结果表明：用饱和硫酸铵沉淀蛋白后，透析袋透析，复溶后的蛋白都有抑菌性，但是不同饱和度的硫酸铵的沉淀的蛋白其抑菌性不同，其中以30％的饱和度沉淀的蛋白的抑菌圈最大，对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈分别达到14mm、16mm以上。

(2)不同饱和度的硫酸铵沉淀蛋白后，用水复溶，其SDS-PAGE电泳图谱，由软件分析其分子量大小，结果见图3。

试验结果表明：不同硫酸铵饱和度沉淀出的蛋白分子量大小不同，其对应的抗菌活性物质的分子量的大小分别是26.94KD、27.48KD、33.01KD、26.30KD、27.71KD、34.0KD、33.5KD、27.43KD、33.54KD，共9种分子量大小，其中，最小的是26.3KD，最大的是34.0KD，将这些具有抗菌活性物质的蛋白统称为抗菌肽。

实施例5：菌株的生产工艺研究

将实施例1筛选得到的枯草芽孢杆菌JYM841，经扩大培养，制备得到菌粉，具体生产工艺如下：

(1)菌种：选用枯草芽孢杆菌JYM841；

(2)斜面培养：将冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在37℃培养24h；

(3)一级种子培养：取培养好的斜面，在无菌条件下接种，用接种环取两环于100mL种子液体培养基中，在37℃，180rpm下震荡培养24h，制得一级种子液；

(4)扩大培养：以0.8％的接种量(按体积百分数)，将一级种子液接于500mL种子液体培养基中，在37℃，180rpm下震荡培养24h，制得二级种子液；

(5)发酵罐培养：以0.8％的接种量(按体积百分数)，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于28℃，罐压0.05MPa，通气量600m³/h条件下培养约20h，进行喷雾干燥，得菌粉。

上述步骤(3)和(4)中，所述种子液体培养基的配方为：按质量百分数计，硫酸镁0.01％，葡萄糖1.5％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，磷酸二氢钾0.15％，氯化钠1％，使用时调节pH为7.0；

步骤(5)中所述液体发酵培养基的配方为：按质量百分数计，葡萄糖0.4％，蛋白胨0.75％，氯化钠0.25％，酵母膏0.4％，使用时调节pH为7.0；

步骤(2)中所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加1.6％的琼脂粉。

实施例6动物试验：菌株的安全性试验

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1动物健康昆明种小鼠，体重为18g-22g，雌雄各半。

1.1.2供试菌粉：实施例5制备的JYM841菌粉。

1.1.3仪器与试剂

生化分析仪，谷草转氨酶(ALT)测定试剂盒，谷丙转氨酶(AST)测定试剂盒，谷氨酰转肽酶(γ-GT)测定试剂盒。

1.2方法

小白鼠购买后适应环境3d-5d，按照GB-15193.3-2003寇氏(korbor)法进行，口服灌胃(p.o)，实验分组见表15。

用JYM841菌粉对小鼠连续喂养14d，灌胃0.5mL/只，试验期间按照实际体重调整剂量，观察其是否有中毒、死亡现象，2周后摘取眼球采集血液，4000rpm离心10min分离血清，分别使用试剂盒测定γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)活性、丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性，处死小鼠，取肝、脾、肾等称重。

表15不同试验小鼠分组及灌胃剂量

1.2.1一般体征的观察测定试验开始后，每2d早晨称量小鼠体重，每8h观察小鼠精神、生长、呼吸及排便等状况。

1.2.2肝脏功能的测定饲养结束后，取小鼠肝脏0.3g，定容3mL无菌生理盐水中，匀浆后使用试剂盒测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性和γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)活性。

1.2.3脏器指数的测定小鼠处死前12h禁食，然后称量小鼠体重，断颈猝死小鼠后，立即取心、肝、脾、肾，生理盐水冲洗，滤纸吸干后称重，计算脏器指数。

1.2.4数据分析采用Spss软件进行单因素ANOVA分析。

2.结果与分析

2.1各试验组体征表现

试验6组高剂量组反应比较强烈，灌胃5min后，精神萎靡，倦怠无力，行动迟缓，不饮食，次日雄鼠死亡1只，解剖后肠道内胀气，肝、脾、肾无病变；其余的精神好转，能饮食饮水，较活泼，试验5组比试验6组反应较弱，其它各组没有明显的反应。

2.2试验期间各试验组饮食变化情况：结果见表16。

表16各试验组的饮食变化(单位：g)

试验结果表明：试验期间各试验组与空白对照组之间采食量无显著性差异(P﹥0.05)。

2.3试验期间各试验组小鼠体重的变化情况：结果见表17。

表17试验期间各试验组小鼠体重的变化(单位：g)

试验结果表明：各试验组在试验期间体重变化与空白对照组无显著性差异(P﹥0.05)。

2.4菌粉对试验小鼠内脏指数的影响：结果见表18。

表18菌粉对各组试验小鼠的内脏指数影响结果

试验结果表明：各试验组的肝脾肾指数与空白对照组比较没有显著性差异(P﹥0.05)。

2.5菌粉对试验小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)及γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)活性的测定：结果见表19。

表19血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)及γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)活性测定结果(单位：U/L)

试验结果表明：各试验组中小鼠血清中ALT、AST、γ-GT与空白对照组比较差异不显著(P﹥0.05)。

2.6菌粉对试验小鼠肝脏中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)活性的测定：结果见表20。

表20菌粉对试验小鼠肝脏中ALT、γ-GT活性的测定结果(单位：U/L)

试验结果表明：各试验组中小鼠肝脏中ALT、γ-GT与空白对照组比较(P﹥0.05)，差异不显著。这说明菌株JYM841对小鼠是安全的。

小结：

1.由灌胃试验可知，菌株JYM841的菌粉给试验小鼠灌服剂量为1100cfu/kg时，前期死亡2只，后来未见死亡及行为异常，或许是肠道的菌群在短时间内引起的应激反应导致小鼠死亡。

2.试验期间给小鼠灌胃两周，未引起小鼠采食及体重的异常。

血清ALT、AST转氨酶活性是肝细胞损害的敏感指标，其升高在一定程度上反映了肝细胞损害和坏死的程度。不同剂量的菌粉未引起小鼠内脏指数的变化，而且通过测定小鼠血清中及肝脏中的ALT、AST、γ-GT，与空白对照组比较差异都不显著(P﹥0.05)，因此菌株JYM841对试验小鼠是安全的。

实施例7一种用于治疗女性生殖道感染的凝胶剂

1、原料：黄芩、苦参、桑叶、薄荷(皆购于泰安同仁堂药店)提取液，菌株JYM841发酵液(宝来利来公司发酵车间发酵)，卡波姆940(购于青岛天力源生物科技有限公司)，薄荷油(购于江西省巨仁香料有限公司)，甘油、氢氧化钠(购于天津市开通化学试剂有限公司)。

2、产品配方：按质量百分比计，卡波姆940 3％，甘油5％，薄荷油0.3％，中药提取浓缩液40％(生药量与浓缩液体积比m/V为1:1)，菌株JYM841发酵离心液35％，壳聚糖0.3％，余量为水。

制法：每100g凝胶剂的制备方法如下：

(1)中药提取浓缩液的制备：称取黄芩100g，苦参80g，薄荷30g，桑叶20g，混合，向混合后的中药材中加入10倍量的水(质量体积比，单位g/mL)，浸泡2h(泡透为准)，煮沸提取2h，过滤，收集滤液，滤渣再次加8倍量的水(质量体积比，单位g/mL)，煮沸提取1.5h，过滤，合并两次滤液，浓缩，至中药生药量与中药液的体积比为1:1(g/mL)。

(2)菌株JYM841发酵离心液的制备：

种子：JYM841；

种子培养基：LB液体培养基(葡萄糖0.2％，蛋白胨1.0％，氯化钠0.5％，酵母膏0.5％，pH值7.0)；

发酵培养基：葡萄糖0.4％，蛋白胨0.75％，氯化钠0.25％，酵母膏0.4％，使用时调节pH为7；

取两环经过活化的斜面种子于LB液体培养基中，37℃，180rpm震荡培养24h，以0.8％的接种量(按体积百分比)转接到发酵培养基中，26℃，180rpm震荡培养20h，将发酵液10000rpm离心10min，取上清液，即得。

(3)凝胶剂的制备：称取卡波姆940 3g，用步骤(2)制备的菌株JYM841发酵离心液35mL溶解，边加边搅拌，再加入步骤(1)制备的中药提取浓缩液40mL，壳聚糖0.3g，搅匀，直至细腻均匀无颗粒，用质量浓度为10％的氢氧化钠调节pH值至5.0，加入甘油5g及薄荷油0.3g，加水至100g搅匀，即得。

3.产品成本核算及效益分析

目前市场同类产品如：妇净康(消)、纳米黄柏苦参凝胶+黄柏苦参洗剂(消)、舒康凝胶剂(准)、邦尔洁纳米银抗菌水凝胶(准)，每盒4～6只价格都在37元左右，平均每只6元～9元，而本实施例制备的凝胶剂每只原料成本在0.22元。目前，在同类产品中还未曾报道用益生菌来抑制病原菌，避免应用抗生素带来反复发作、耐药性、超级细菌的产生等不良反应，还能够保留体内的固有菌，再补充优势菌加速微生态菌群的平衡，这在同类产品中还是独树一帜。

实施例8家兔阴道刺激试验(依据2002消毒产品检验技术规范-阴道黏膜刺激试验)

1.试验动物选用健康、初成年的非动情期的雌性白色家兔，比利时兔，体重2.5kg。试验前检查动物阴道口有无分泌物、充血、水肿和其它损伤情况。如有炎症或(和)损伤，应弃用。

2.试验分组分为染毒组、阴性对照组和阳性对照组，每组3只。其中，染毒组采用本发明实施例7制备的凝胶剂，阴性对照组灌入生理盐水，阳性对照组灌入市售产品樟树达尼斯保健品有限公司生产的纳米银黄柏苦参金凝胶。

3.试验操作方法

3.1将长度为8cm左右的钝头软管与5mL的注射器连接。注射器和导管注满受试液备用。每只动物各准备一套。

3.2黏膜刺激试验的染毒方法：将动物仰面固定，将导管用受试液或对照液湿润后轻柔地插入阴道(4cm-5cm)，并用注射器缓慢注入2mL受试液，抽出导管，完成染毒。阴性对照组动物用生理盐水作同样处理。

3.3多次阴道黏膜刺激试验的染毒方法：按上述3.2染毒方法，每隔24h重复染毒一次，连续5d。阴性对照组动物用生理盐水作同样处理，阳性对照用市售产品樟树达尼斯保健品有限公司生产的纳米银黄柏苦参金凝胶。

3.4受试液注入后可能有溢出，可用消毒棉或软纸拭去。

3.5末次染毒后24h，采用气栓法处死动物，剖腹取出完整的阴道，纵向切开，肉眼观察是否有充血、水肿等表现，供病理取材时参考。然后将阴道放入10％福尔马林溶液中固定24h以上，选取阴道的两端和中央3个部位的组织制片，HE染色后，进行组织病理学检查。

4结果评价

组织病理学检查结果，按表21规定对阴道黏膜的刺激反应进行评分。将试验组3只动物3个部位的刺激反应积分相加后，再除以观察总数(动物数×3)，得出试验组阴道黏膜刺激反应的平均积分，最大记分为16(见表21)。对照组评分方法同上。将试验组平均积分减去对照组平均积分得出刺激指数后，按表22进行刺激强度分级。

4.1阴道黏膜刺激反应评分标准见表21。

表21阴道黏膜刺激反应评分标准

刺激反应积分＝A+B+C+D.

表22阴道黏膜刺激强度分级

4.2各试验组阴道组织图片及HE染色切片图

阴性对照组阴道上皮完整，无细胞坏死、脱落及炎症细胞浸润，染毒组及阳性对照组也是同样的，结果见图4a-图6b。

4.3各试验组阴道黏膜刺激得分结果见表23。

表23各试验组阴道黏膜刺激指数

试验结果表明：试验干预组的阴道黏膜刺激指数＜1，根据阴道黏膜刺激强度分级标准可知，试验组对家兔阴道黏膜无刺激性，由阴道组织图片及HE染色切片也可以看出，阴道无充血、水肿及炎性细胞，阴道黏膜完整、无细胞坏死、脱落现象。

实施例9凝胶剂对家兔阴道炎的抑制作用研究

1材料与方法

1.1试验动物健康雌性家兔，体重为3.0kg，以生产2次以上，由道朗镇鱼池村庞性养殖户提供，共30只。

1.2药物及试剂盐酸林可霉素购于泰安市绿地大药房；白色念珠菌CMCC(F)98001购于中国药品生物制品鉴定所；本发明实施例7制备的凝胶剂；妇净康(武汉新生态生物工程有限公司生产)购于泰安市绿地大药房；

1.3培养基选择性培养基：EMB，LBS，TSA，CQ、MRS，均购于青岛海波生物技术有限公司。

1.4方法

将家兔先分为两组，A组为正常对照组，共6只，B组为模型组，共24只，预饲5天后，随机取阴道分泌物镜检并计数大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、乳酸菌数。A组外阴部消毒后用18号大鼠灌胃器注入生理盐水1mL，灌注11天后，气拴法杀死家兔，取阴道组织10％甲醛固定制片，HE染色后，进行病理学检查评分、分级。B组灌注盐酸林可霉素注射液1mL，每天1次，灌注5天，恢复1天，然后用白色念珠菌活菌数1.5×10⁷cfu/mL灌注0.5mL，每天1次，4天后，随机取阴道分泌物镜检并计数大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、白色念珠菌和乳酸菌数，确定造模成功后，模型组家兔气拴法杀死家兔5只，取阴道组织10％甲醛固定制片，HE染色后，进行病理学检查并参照表评分。然后家兔重新分组，分为3组，C组为自然恢复组，D组为治疗组，E组为阳性对照组，每组5只，开始治疗。C组灌注生理盐水1.5mL/只，D组灌注实施例7制备的凝胶剂1.5g/只，E组灌注市售产品妇净康1.5g/只。治疗期间每天称取饲料重量，治疗6天后，全部取阴道分泌物镜检并计数大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、白色念珠菌和乳酸菌数，7天后气拴法杀死家兔，取阴道组织10％甲醛固定制片，HE染色后，进行病理学检查并参照表21、表22评分、分级。

2结果与分析

2.1试验期间各试验组家兔的体征变化

2.1.1造模期间家兔的体征变化

预饲5天后，模型组家兔被毛洁白光滑，饮食精神良好，表现活泼。用抗生素之后，精神沉郁，食量下降，成匍匐状，轻微拉稀，有3只死亡，白色念珠菌攻毒后，精神沉郁，不思饮食，成匍匐状，拉稀，有1只死亡。

2.1.2造模后治疗期间各组家兔的体征变化：结果见表24。

表24造模后治疗期间各组家兔的体征变化

2.1.3治疗7天后家兔的饮食变化趋势结果见图7。

试验结果表明：自然恢复组、治疗组、阳性对照组三组在第一天饮食量是治疗组最多、自然恢复组最少。但是，自然恢复组的饮食量是逐渐增多的，治疗组饮食量一直较高，在3天后阳性对照组一直处于最低状态。

2.2造模期间家兔阴道分泌物菌群变化结果见图8-图11。

由图8可以看出：家兔正常情况下，在使用抗生素前，阴道中有大量的菌株，其中以乳酸杆菌为主要菌株，数量较多；在使用抗生素之后，各种菌都大量减少；而攻毒之后，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及白色念珠菌等致病菌繁殖增多，为家兔阴道内的主要菌株，而乳酸杆菌相应的减少，这说明家兔阴道炎的模型建立成功。

图9为正常对照组阴道分泌物镜检图片，可见有大量的杆菌；图10为灌注抗生素后阴道分泌物镜检图片，菌群数量很少；图11为攻毒之后的镜检图片，有大量的白色念珠菌、滴虫、球菌等致病菌，很少有杆菌，这也说明模型建立成功。

2.3治疗期间家兔阴道分泌物菌群变化结果见图12-图15。

由图12可以看出，自然恢复组中的乳酸杆菌比图8中攻毒之后的乳酸杆菌有所升高，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及白色念珠菌有所下降，但是，仍以致病菌为主要优势菌，而阳性对照组及治疗组中的乳酸杆菌比图8中攻毒之后的乳酸杆菌显著升高，以治疗组的乳酸菌升高最显著，其它3种致病菌显著下降，治疗组与阳性对照组的乳酸杆菌为主要优势菌，就菌群平衡来说，治疗组恢复最快，而自然恢复组未见恢复。

阴道分泌物镜检图片的结果标明：自然恢复组(图13)可见极少量的杆菌，而治疗组(图14)有大量的杆菌，阳性对照组(图15)虽然有大量的杆菌但也有白色念珠菌，这说明实施例7制备的凝胶剂对混合感染引起的阴道炎治疗是有很好的抑制病原菌的作用。

2.4造模期间阴道组织切片，见图16至图19。

由图16可以看出，正常对照组阴道粘膜的上皮细胞无病变及坏死现象；由图17可以看出，模型组阴道粘膜上皮组织不完整，萎缩，细胞脱落、坏死；由图18、图19可以看出，治疗组和阳性对照组阴道粘膜的上皮细胞比较完整，无脱落、坏死现象。说明治疗组及阳性对照组阴道粘膜恢复效果显著。

3结论

3.1用盐酸林可霉素注射液1mL，每天灌注1次，共5天，恢复1天，然后用白色念珠菌活菌数1.5×10⁷cfu/mL灌注0.5mL，每天1次，灌注4天，通过观察阴道分泌物菌群变化、镜检阴道分泌物可以看出模型成立。

3.2通过镜检阴道分泌物中的菌群、查看阴道病变情况、以及阴道组织切片都可以看出：模型组阴道严重充血，上皮细胞不完整，黏膜层出现病变、脱落等现象，而用实施例7制备的凝胶剂灌注的治疗组与正常对照组的阴道上皮组织完整，黏膜光滑，无病变等现象；阳性对照组，有个别药物不吸收，黏膜与肌层脱开，说明治疗组对有阴道炎的实验家兔的致病菌有很好的抑制作用，对菌群恢复有促进作用，能够快速的恢复阴道阴道粘膜；且安全无刺激，不影响其饮食。

Claims (10)

1.一株具有抑菌活性的枯草芽孢杆菌，其特征在于，命名为枯草芽孢杆菌JYM841(Bacillus subtilis JYM841)，已于2014年1月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2014012。

2.一种菌剂，其特征在于，其活性成分为权利要求1所述的枯草芽孢杆菌JYM841,CCTCCNO:M 2014012。

3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的剂型为液体菌剂或粉剂。

4.权利要求2所述菌剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)斜面培养：将枯草芽孢杆菌JYM841菌种接种于固体斜面培养基上，在35℃～40℃培养24h～26h；

(2)一级种子培养：取培养好的斜面，在无菌条件下接种，用接种环取一到两环于50mL～100mL种子液体培养基中，在35℃～40℃，180rpm下震荡培养24h～30h，制得一级种子液；

(3)扩大培养：以0.5～1％的接种量，将一级种子液接于500mL～1000mL种子液体培养基中，在35℃～40℃，180rpm下震荡培养24h～26h，制得二级种子液；

(4)发酵罐培养：以0.5～1％的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于25℃～28℃，罐压0.05MPa，通气量600m³/h条件下培养18h～22h；

上述步骤(2)和(3)中，所述种子液体培养基的配方为：按质量百分数计，硫酸镁0.01％，葡萄糖1.5％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，磷酸二氢钾0.15％，氯化钠1％，使用时调节pH为6.5～7.0；

步骤(4)中所述液体发酵培养基的配方为：按质量百分数计，葡萄糖0.4％，蛋白胨0.75％，氯化钠0.25％，酵母膏0.4％，使用时调节pH为6.5～7.0；

步骤(1)中所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加质量百分数为1.5～2.0％的琼脂粉。

5.权利要求1所述菌株和/或权利要求2所述菌剂在制备治疗生殖道感染的药物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述生殖道感染是由白色念珠菌、金黄色葡萄球菌或大肠杆菌大量繁殖引起的。

7.一种用于治疗女性生殖道感染的药物制剂，其特征在于，其活性成分为权利要求1所述的枯草芽孢杆菌JYM841,CCTCC NO:M 2014012的发酵离心液；

所述发酵离心液的制备方法为：将经过活化的枯草芽孢杆菌JYM841斜面种子于LB液体培养基中，37℃，180rpm震荡培养24h，以体积百分比为0.8％的接种量转接到发酵培养基中，26℃，180rpm震荡培养20h，将发酵液10000rpm离心10min，取上清液，即得；

其中，发酵培养基的组成为：葡萄糖0.4％，蛋白胨0.75％，氯化钠0.25％，酵母膏0.4％，使用时调节pH为7。

8.如权利要求7所述的用于治疗女性生殖道感染的药物制剂，其特征在于，是由以下质量百分数比的原料制成的：

卡波姆940 1.5～3％，壳聚糖0.2～0.6％，甘油3～5％，薄荷油0.2～0.5％，中药提取浓缩液40～45％，菌株JYM841发酵离心液30～35％，余量为水；

所述中药提取浓缩液为黄芩、苦参、薄荷和桑叶按质量比为10:8:3:2混合的混合药材的水提液，浓缩至中药生药量与中药液体积的比为1:1，单位g/mL。

9.如权利要求8所述的药物制剂，其特征在于，该药物制剂的剂型为凝胶剂。

10.权利要求8所述的药物制剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：

将卡波姆940用菌株JYM841发酵离心液溶解，边加边搅拌，再加入中药提取浓缩液、壳聚糖，搅匀，直至细腻均匀无颗粒，用氢氧化钠调节pH值至4.0-6.5，加入甘油及薄荷油，加水至总量，搅匀，即得。