CN109966357A - 一种中药微生态复方制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种中药微生态复方制剂及其制备方法和应用,该中药微生态复方制剂中包含中药微生态复方组合物,该组合物以益生菌和中药复方为原料;其中,所述益生菌为嗜酸乳杆菌和/或其发酵物;所述中药复方包含原料:黄连、桑叶、蒲公英和连翘。本发明所述的中药微生态复方组合物及其制剂具有较好的抑菌活性,能够很好地防治母猪生殖道感染。
Description
技术领域
本发明涉及微生态制剂技术领域,具体涉及一种中药微生态复方制剂及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
母猪生殖道(包括子宫和阴道)疾病是养猪生产中的常见和多发病。在母猪养殖过程中,由于饲养、生产的环境条件差,营养失调,应激反应强烈,受精不卫生等因素,均导致待产母猪、已生产母猪出现生殖道炎症的相应症状,如生殖道有流出黄白色或褐色有臭味的分泌物,母猪尿频、阴道黏膜充血、肿胀、创伤或糜烂、体温升高等。这些均会导致母猪食欲降低、抵抗力下降、屡孕不育,乏情,产子数减少,流产死胎数增加等。集约化猪场平均每年大约需要淘汰25~30%的母猪,这些母猪中因生殖道疾病淘汰的母猪通常占到30~50%,由此带来的最直接经济损失是经营者在后备母猪更新方面需要投入更多。另外,一些管理比较粗放的规模化猪场,断奶母猪炎症发病率高达50~80%,尤其是部分母猪由于长期患有生殖疾病导致繁殖效率低下(年提供活仔不足15头),对猪场的核心竞争力和经济效益影响更大。
母猪生殖道疾病的发病病因很多,主要是母猪在发情、分娩时生殖道处于开放状态,环境中病菌侵入,导致阴道炎,甚至引发子宫内膜炎。目前,治疗母猪生殖道疾病的主要方法有加强猪舍卫生管理,提高母猪营养水平和机体免疫力,做好病原菌导致的繁殖障碍疾病的净化工作,另外还可以采用抗生素疗法。
目前抗生素治疗仍然是控制母猪生殖道疾病的主要手段,特别是在防止急性感染变成慢性感染、清除其它病原菌可能引起的感染方面仍然很重要,但发明人发现因长期、大量的使用抗生素进行治疗,引起母猪体内菌群的变化,在消除敏感菌的同时,耐药菌株得以生存与繁殖下来,细菌耐药严重;某些抗菌药物对吞噬细胞功能的损害作用导致宿主的免疫功能降低;另一方面,抗生素残留严重危害消费者健康,因而抗生素疗法日益受到限制。
发明内容
因此,本发明的目的是提供一种中药微生态复方组合物,以及包含该组合物的制剂及其制备方法,以及该组合物及其制剂在制备用于治疗母猪生殖道感染的药物中的应用。将本发明的中药微生态复方组合物及其制剂用于治疗母猪生殖道感染,其治愈率高于80.0%,总有效率高于90.0%,具有理想的治疗效果。
具体地,本发明是通过如下所述的技术方案实现的:
在本发明的第一方面,本发明提供了一种中药微生态复方组合物,其以益生菌和中药复方为原料;其中,所述益生菌为嗜酸乳杆菌和/或其发酵物;所述中药复方包含原料:黄连、桑叶、蒲公英和连翘。
其中,所述嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)BLCC2-0111,已于2017年3月8日保藏于中国典型培养物保藏中心,简称CCTCC,地址为:武汉市武汉大学,其保藏编号为CCTCC NO:M 2017098,并且该菌种已在中国专利CN106967645A中公开。
在先前的研究中,发明人发现嗜酸乳杆菌BLCC2-0111能够高产单宁酶,并能够与蒲公英、乌梅和五味子制备成中药益生菌制剂治疗产肠毒素性大肠杆菌(EnterotoxigenicEscherichia coli,ETEC)K88引起的仔猪腹泻。在对嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的进一步研究中,发明人偶然发现嗜酸乳杆菌BLCC2-0111和/或其发酵物能够同时抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和化脓链球菌,并且具有特别优异的抑制效果。而且,这种抑制效果在与黄连、桑叶、蒲公英和连翘组成中药微生态复方组合物时会有特别显著的增强。
此外,特别值得注意的是,在对嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的研究中发明人还进一步发现,嗜酸乳杆菌BLCC2-0111和/或其发酵物可用于治疗动物的生殖道感染,尤其是,发明人发现嗜酸乳杆菌BLCC2-0111和/或其发酵物特别适用于对于母猪生殖道感染的治疗,并且当嗜酸乳杆菌BLCC2-0111和/或其发酵物与黄连、桑叶、蒲公英和连翘组成中药微生态复方组合物时,对于母猪生殖道感染的治愈率高于80.0%,总有效率高于90.0%。
在本发明的一些实施方式中,所述益生菌为嗜酸乳杆菌BLCC2-0111和/或其发酵物,发酵物通过发酵嗜酸乳杆菌BLCC2-0111得到,发酵物可以为固体发酵物或者液体发酵液。发酵可采用常规的发酵方法,或者如本发明中某些实施方式中所述的方法进行,比如,在无菌条件下挑取嗜酸乳杆菌BLCC2-0111斜面菌苔,接入装有灭菌100mL MRS液体培养基的100mL盐水瓶中,37℃恒温培养箱培养20h左右时停止发酵,得到嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的发酵液。
在本发明的一些实施方式中,所述嗜酸乳杆菌BLCC2-0111和/或其发酵物的制备方法包括以下步骤:
菌种:选用嗜酸乳杆菌BLCC2-0111。
斜面培养:将菌种一环接种于固体斜面培养基上,在37℃下培养18~24h。
一级种子液:挑取一环斜面菌苔,接入1000mL灭菌液体种子培养基中,在37℃条件下,静置培养10~16h,制得一级种子液;
种子罐培养:以2%(v/v)的接种量,将一级种子液接于灭菌的含有300L~500L液体种子培养基的种子罐中,在37℃条件下,静置培养10~16h,制得种子液;
发酵罐培养:以2%(v/v)的接种量,将种子罐发酵所得种子液接于灭菌的发酵罐液体发酵培养基中,于37℃条件下,静置培养14~22h,即得嗜酸乳杆菌BLCC2-0111及其发酵物。
可通过本领域常规的方法分别获取菌体和发酵物,比如,去除菌体可采用离心后过微滤膜(比如可过0.22μm孔径滤膜)的方式。
在本发明的实施方式中,本发明所述的液体种子培养基(获取一级种子液和种子液的培养基)和液体发酵培养基配方均为:葡萄糖2.0%、柠檬酸铵0.2%、乙酸钠0.5%、磷酸氢二钾0.5%、硫酸锰0.02%、硫酸镁0.05%、蛋白胨1.0%、牛肉膏1.0%、酵母膏0.5%、吐温-80 0.1%,pH6.0,115℃条件下灭菌20min;所述固体斜面培养基为上述液体种子培养基中添加1.5%的琼脂粉。以上均以质量百分比计。
在本发明的一些实施方式中,本发明所述的嗜酸乳杆菌BLCC2-0111和/或其发酵物可以为粉剂,比如冻干粉。冻干粉的制备可采用本领域的常规手段对嗜酸乳杆菌BLCC2-0111和/或其发酵物进行真空冷冻干燥(以下也简称为冻干)。真空冷冻干燥时,可选择加或不加冻干保护剂,本领域技术人员知晓如何选取适宜的冻干保护剂,以及冻干保护剂的加入量。此外,应当考虑到为了避免对菌体的伤害,本领域技术人员知晓如何选取更为温和的冻干方式,比如注意冻干速度、冻干温度的选取,比如可适宜降低冻干温度、延长冻干时间等等;对菌体影响较小的情况下,本领域技术人员可选择不加入冻干保护剂。在本发明的一些实施方式中,所述嗜酸乳杆菌BLCC2-0111和/或其发酵物的冻干粉的具体制备方法包括:将嗜酸乳杆菌BLCC2-0111和/或其发酵物(比如发酵液)加入或不加入冻干保护剂(冻干保护剂比如6%(w/v)的脱脂奶粉)进行真空冷冻干燥,即得到冻干粉,其中嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的活菌数在2.5×1010~3.0×1010CFU/g。
比如,在本发明的一些实施方式中,所述嗜酸乳杆菌BLCC2-0111及其发酵物的冻干粉的制备包括:发酵嗜酸乳杆菌BLCC2-0111(可按常规方式或本发明某些实施方式中所述的方式进行发酵),待其发酵液黏度达12000~15000cP时,收集发酵液,加入或不加入冻干保护剂进行真空冷冻干燥,过筛(比如过40目筛)后混匀,即为嗜酸乳杆菌BLCC2-0111及其发酵物的冻干粉(其中含有嗜酸乳杆菌活菌及其代谢产物),其中嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的活菌数在2.5×1010~3.0×1010CFU/g。
在本发明的某些实施方式中,所述中药微生态复方组合物中益生菌的活菌数为5.0×109~9.0×109CFU/g,比如活菌数为5.0×109CFU/g、5.5×109CFU/g、6.0×109CFU/g、6.25×109CFU/g、6.5×109CFU/g、7.0×109CFU/g、7.5×109CFU/g等等,或者两者之间的任意范围,5.0×109CFU/g~7.5×109CFU/g、或者比如5.5×109CFU/g~6.25×109CFU/g。随着活菌数量的增多,组合物的抑菌效果及治疗效果也会有所增长,但当其活菌浓度为5.0×109CFU/g时,即可实现理想的效果。
在本发明的一些实施方式中,所述中药复方包含以下重量份的原料:黄连2~4份、桑叶1~3份、蒲公英5~15份、连翘10~20份;或由这些重量份的原料组成。
在本发明的一些实施方式中,所述中药复方中的原料比如黄连可以取2、3或4份,桑叶可以取1、2或3份,蒲公英可以取5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15份,连翘可以取10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20份;当然,以上示例均为重量份取整的情况,各原料的重量份也可以是上述任意两个整数值之间的任意数值,比如黄连的重量份可以为2-3份或者3-4份,例如可以为2.0份、2.1份、2.5份、3.2份、3.5份、3.8份等等,也可以是这些数值两两间的任意其他值,比如黄连的取用量也可以是2.0-3.8份或者2.0-2.5份或者2.5-3.8份或者2.5-3.5份等等;比如桑叶可以为1-3份或者1-2份,例如可以是1.1份、1.5份、1.8份、2.5份、2.8份等等,也可以是这些数值两两间的任意其他值,比如1-2.8份或者1-1.8份或者1-1.5份或者1.5-2.8份或者1.8-2.5份等等;比如蒲公英可以为5-10份、8-15份或者10-15份,例如可以为8.2份、8.8份、10.5份、12.3份、13.5份等等,也可以是这些数值两两间的任意其他值,比如8.2-13.5份或者8.8-14.3份等等;比如连翘可以为10-19份、10-15份等等,例如可以为10.1份、10.5份或者15.8份等等,也可以是这些数值两两间的任意其他值,比如10-18.5份、10-15.8份或者10-15.5份等等。
在本发明的一些实施方式中,所述中药复方包含以下重量份的原料:黄连2~4份、桑叶1~2份、蒲公英5~15份、连翘10~20份;或由这些重量份的原料组成。
在本发明的一些实施方式中,所述中药复方包含以下重量份的原料:黄连2~3份、桑叶1~2份、蒲公英5~15份、连翘15~20份;或由这些重量份的原料组成。
在本发明的一些实施方式中,所述中药复方包含以下重量份的原料:黄连3~4份、桑叶1~2份、蒲公英5~10份、连翘10~20份;或由这些重量份的原料组成。
在本发明的一些实施方式中,所述中药复方包含以下重量份的原料:黄连3~4份、桑叶1~2份、蒲公英10-15份、连翘15~20份;或由这些重量份的原料组成。
在本发明的一些实施方式中,所述中药复方包含或由以下重量份的原料组成:黄连3份、桑叶1份、蒲公英10份、连翘15份。
在本发明的一些实施方式中,所述中药微生态复方组合物由20-30重量份的益生菌与70~80重量份的中药复方复配而成,其中复配形成的组合物中,嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的活菌数为5.0×109~9.0×109CFU/g。
采用本发明的中草药治疗母猪生殖道疾病,不仅具有抑杀细菌、活血化瘀的作用,而且能提高母猪生殖道中细胞的免疫功能,达到标本兼治的效果。避免了在治疗母猪生殖道疾病中使用抗生素,解决了动物源产品中的抗生素残留问题。此外,本发明的中药复方组合物与本发明的益生菌复配使用可实现特别优异的协同作用,能够显著提高抑菌活性,更好的实现母猪生殖道疾病的治疗。
在本发明的第二方面,本发明提供了制备上述中药微生态复方组合物的方法,其包括将中药复方与益生菌混合。
在本发明的一些实施方式中,所述中药复方为中药提取液或中药复方粉。
在本发明的一些实施方式中,中药复方提取液的制备方法包括:按配方称取中药复方的原料,混合,加水浸泡煎煮后过滤,合并滤液,即得中药复方提取液,可选地,将该提取液干燥即可制得中药复方粉。
在本发明的又一些实施方式中,所述中药复方提取液的制备方法包括:按配方称取中药复方的原料,混合,加水浸泡煎煮后过滤,得到第一滤液和第一滤渣,第一滤渣加水进行第二次煎煮,煎煮后过滤得第二滤液和第二滤渣,第一滤液和第二滤液合并,真空冷冻干燥,制备得到中药复方粉;或者,将上述第二次煎煮过滤后得到的第二滤渣加水进行第三次煎煮,煎煮后过滤得第三滤液,将第一、第二和第三滤液合并,即得中药复方提取液。可选地,对该中药复方提取液进行真空冷冻干燥,即可制备得到中药复方粉。
在本发明中,每次煎煮后过滤得到的滤渣可加水再次煎煮,将每次过滤得到的滤液合并后真空冷冻干燥即可得到中药复方粉。在本发明的一些实施方式中,所述对滤渣加水浸泡煎煮的操作至少进行二次。
在本发明的一些实施方式中,所述中药复方提取液的制备方法包括:按配方称取中药复方组合物的原料,混合,加入10~12重量倍(此处的重量倍是相较于中药复方原料混合物的重量而言)的水,浸泡30~40min,加热至沸腾,第一次煎煮时间为60~65min,过滤,得第一滤液和第一滤渣,第一滤渣中加入10~12重量倍(此处的重量倍是相较于中药复方原料混合物的重量而言)的水进行第二次煎煮,煎煮时间为50~55min;过滤,得第二滤液和第二滤渣,第二滤渣中加入8~10重量倍的水(此处的重量倍是相较于中药复方原料混合物的重量而言)进行第三次煎煮,煎煮时间为30~35min,合并三次滤液,即得中药复方提取液;可选地,在此基础上对该中药复方提取液真空冷冻干燥,即可制备得到中药复方粉。
本发明所述益生菌如本发明上述第一方面中所述。所述益生菌可以为嗜酸乳杆菌BLCC2-0111和/或其发酵物,其为液态益生菌或固态益生菌,优选为粉状益生菌,比如冻干粉。发酵或冻干方式如本发明上述第一方面中所述。
在本发明的一些实施方式中,所述中药微生态复方组合物包含以下重量份的原料:益生菌冻干粉20~30份与70~80份的中药复方粉复配而成,其中嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的活菌数为5.0×109~9.0×109CFU/g。
在本发明的第三方面,本发明提供了一种中药微生态复方制剂,其包含本发明上述第一方面中所述的中药微生态复方组合物。
在本发明的一些实施方式中,本发明所述制剂为外用制剂,比如可以为粉剂,比如直接由本发明上述第一方面中所述的中药微生态复方组合物组成,按照本发明上述第二方面中所述方法制备时,所述中药复方为中药复方粉,所述益生菌为粉状益生菌(比如冻干粉),中药复方粉与粉状益生菌混合制备得到中药微生态复方制剂粉剂;所述粉剂在使用时加溶剂(比如水)溶解后使用。
或者,在本发明的一些实施方式中,本发明上述第一方面中所述的中药微生态复方组合物为粉状混合物时,也可通过将该粉状中药微生态复方组合物溶解于或分散于适宜的溶剂(比如水)中制备得到液体制剂。
或者,在本发明的一些实施方式中,所述制剂为液体制剂,比如直接由本发明上述第一方面中所述的中药微生态复方组合物组成,按照本发明上述第二方面中所述方法制备时,所述中药复方为中药复方提取液,所述益生菌为益生菌的发酵液(包含嗜酸乳杆菌BLCC2-0111及其发酵物);可选地,所述液体制剂可进一步经真空冷冻干燥制备成粉剂。粉剂可在使用时加溶剂(比如水)溶解后使用。冻干时可选择加入或不加入冻干保护剂,选择加入冻干保护剂时,本领域技术人员可根据常规操作选择适宜的冻干保护剂及其用量。比如,在一个实施方式中,所述冻干保护剂为脱脂奶粉,加入量为6%(w/v)。
在本发明的一些实施方式中,所述中药微生态复方制剂为液体制剂或者为粉剂,其使用方式优选阴道灌注,粉剂在进行阴道灌注时,可在临用前将其溶解于适宜的溶剂(比如水)中。
在进行阴道灌注,将粉剂溶解使用时,粉状中药微生态复方组合物或中药微生态复方粉剂与溶剂(比如水)的质量体积比为20~30g/60~100mL,该质量体积比优选为25g/75mL,比如,在本发明的实施方式中,粉剂中嗜酸乳杆菌BLCC2-0111活菌数为5.0×109~9.0×109CFU/g,取25g该粉剂溶解于75mL蒸馏水中溶解,其活菌数为1.25×109~2.25×109CFU/mL,在该较低的浓度下,将其用于治疗母猪生殖道感染时,每日一次,每次20mL,仅连续使用3天,其治愈率即可高于80.0%,总有效率高于90.0%,具有理想的治疗效果。阴道灌注的方式能够有效扩大药物与炎症部位的接触面积,并且提高局部药物的浓度,延长炎症部位与药物的接触时间。
在本发明的实施方式中,粉剂相较于液体制剂可能更为优异,原因主要在于液体制剂保存过程中容易出现分层或沉淀的现象,保存时间相较于粉剂较短,而且液体制剂使用不当容易出现腐败现象;粉剂包装在使用前溶解即可,随用随配,药物质量更为稳定,并且易于携带和保存。
当然,本领域技术人员可根据需要在本发明的中药微生态复方组合物或制剂的基础上,加入适宜的辅料或赋形剂,制备为其他的剂型使用,比如泡腾剂、膏剂、凝胶剂等等。
在本发明的第四方面,本发明提供了上述中药微生态复方组合物或上述含有该组合物的制剂在制备用于防治动物生殖道感染的药物中的应用;优选地,所述动物为母猪或雌性家兔,尤其为母猪。
在本发明的实施方式中,本发明上述第一方面中所述的中药微生态复方组合物是作为活性物质使用的,尤其在将其应用于制备防治动物尤其母猪的生殖道感染的药物中时,因此,本发明上述第三方面中涉及的包含中药微生态复方组合物的制剂可以是多种类型的,比如灌注剂、粉剂、泡腾剂等等,这些制剂均是便于进行阴道灌注的。本发明的发明人在研究中发现,阴道灌注的方式往往能够有效扩大药物与炎症部位的接触面积,并且提高局部药物的浓度,延长炎症部位与药物的接触时间,能够更快、更直接的发挥活性物质的效果。
在本发明的实施方式中,将本发明的中药微生态复方制剂使用阴道灌注的方式应用于患有生殖道炎症的母猪,在较低使用浓度下,比如,在本发明的实施方式中,粉剂中嗜酸乳杆菌BLCC2-0111活菌数为5.0×109CFU/g,取25g该粉剂溶解于75mL蒸馏水中溶解,其活菌数为1.25×109CFU/mL,在该较低的浓度下,将其用于治疗母猪生殖道感染时,每日一次,每次20mL,仅连续使用3天,其治愈率即可高于80.0%,总有效率高于90.0%,对母猪生殖道炎症具有很好的治疗效果。
与现有技术相比,本发明的技术方案的特点和有益效果如下:
(1)本发明的中药微生态复方组合物及其制剂的主要成分为益生菌和中药成分,不会产生耐药性,无抗生素残留问题,保证了动物源食品的安全。
(2)传统灌注剂体积较大,使用中发生沉淀,使用不当会出现腐败现象,保存时间短。本发明提供了粉剂制剂,使用前加溶剂比如蒸馏水溶解即可进行灌注使用,药物质量稳定,随配随用,并且容易携带和保存,克服了以上传统灌注剂的缺点。且本发明的中药微生态复方制剂对粘膜的刺激性温和,无不良反应。
(3)本发明筛选得到与嗜酸乳杆菌BLCC2-0111复配效果较好的中药复方,制备得到防治母猪生殖道感染效果较突出的中药微生态复方制剂,对母猪生殖道的病原菌具有很好的抑制作用,该中药微生态复方制剂相比于单独使用嗜酸乳杆菌BLCC2-0111及其发酵物或中药复方,防治母猪生殖道感染的效果更加优异。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解,本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请,并不构成对本申请的不当限定。以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案,其中:
图1为实施例6中中药微生态复方制剂对家兔阴道黏膜的刺激试验对照组家兔阴道黏膜剖检图。
图2为实施例6中中药微生态复方制剂对家兔阴道黏膜的刺激试验中药微生态复方制剂组家兔阴道黏膜剖检图。
图3为实施例7中药微生态复方制剂对家兔阴道炎作用试验空白对照组家兔阴道组织的HE染色光镜照片。
图4为实施例7中中药微生态复方制剂对家兔阴道炎作用试验造模不治疗组家兔阴道组织的HE染色光镜照片。
图5为实施例7中中药微生态复方制剂对家兔阴道炎作用试验市售中药制剂组家兔阴道组织的HE染色光镜照片。
图6为实施例7中中药微生态复方制剂对家兔阴道炎作用试验中药微生态复方制剂组家兔阴道组织的HE染色光镜照片。
图7为实施例8中中药微生态复方制剂对母猪生殖道炎症的治疗效果试验使用前照片。
图8为实施例8中中药微生态复方制剂对母猪生殖道炎症的治疗效果试验使用本发明中药微生态复方制剂1天后阴道口照片。
图9为实施例8中中药微生态复方制剂对母猪生殖道炎症的治疗效果试验使用本发明中药微生态复方制剂1天后阴道流出物照片。
图10为实施例8中中药微生态复方制剂对母猪生殖道炎症的治疗效果试验使用本发明中药微生态复方制剂2天后阴道口照片。
图11为实施例8中中药微生态复方制剂对母猪生殖道炎症的治疗效果试验使用本发明中药微生态复方制剂2天后阴道流出物照片。
图12为实施例8中中药微生态复方制剂对母猪生殖道炎症的治疗效果试验使用本发明中药微生态复方制剂3天后阴道口照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
中药微生态复方组合物及其制剂的制备
制备例1
嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的冻干粉的具体制备方法如下:
(Ⅰ)菌种:选用嗜酸乳杆菌BLCC2-0111;
(Ⅱ)斜面培养:将菌种一环接种于固体斜面培养基上,在37℃下培养18h,制得斜面菌种;
(Ⅲ)一级种子液:挑取一环斜面菌种,接入1000mL灭菌液体种子培养基中,在37℃条件下,静置培养16h,制得一级种子液;
(Ⅳ)种子罐培养:以2%(v/v)的接种量,将一级种子液接于灭菌的含有300L液体种子培养基的种子罐中,在37℃条件下,静置培养10h,制得种子液;
(Ⅴ)发酵罐培养:以2%(v/v)的接种量,将种子罐发酵所得种子液接于灭菌的发酵罐液体发酵培养基中,于37℃条件下,静置培养14h;
(Ⅵ)嗜酸乳杆菌BLCC2-0111冻干粉的制备:待发酵液黏度达12000cP时,收集发酵液,加入6%(w/v)的脱脂奶粉作为冻干保护剂进行真空冷冻干燥,过40目筛后混匀,即为嗜酸乳杆菌BLCC2-0111及其发酵物的冻干粉(含有2.5×1010CFU/g的嗜酸乳杆菌活菌及其代谢产物);
所述步骤(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)、(Ⅴ)中的液体种子培养基和液体发酵培养基配方均为:葡萄糖2.0%、柠檬酸铵0.2%、乙酸钠0.5%、磷酸氢二钾0.5%、硫酸锰0.02%、硫酸镁0.05%、蛋白胨1.0%、牛肉膏1.0%、酵母膏0.5%、吐温-80 0.1%,pH6.0,115℃条件下灭菌20min;所述步骤(Ⅱ)中的固体斜面培养基为上述液体种子培养基中添加1.5%的琼脂粉。以上均以质量百分比计。
中药复方组成为:黄连3份、桑叶1份、蒲公英10份、连翘15份。
中药复方提取液及其粉剂制备方法为:按配方称取中药复方的原料,混合,加入10重量倍(即水的加入量为混合药材重量的10倍)的水,浸泡30min,加热至沸腾,第一次煎煮时间为60min,过滤,得第一滤液和第一滤渣,第一滤渣中加入混合药材原始重量10重量倍的水进行第二次煎煮,煎煮时间为50min;过滤,得第二滤液和第二滤渣,第二滤渣中再加入混合药材原始重量8重量倍的水进行第三次煎煮,煎煮时间为30min,合并三次滤液,即得中药复方提取液;对该中药复方提取液冻干,即可制备得到中药复方粉。
将中药复方粉80份与益生菌(嗜酸乳杆菌BLCC2-0111及其发酵物的冻干粉)20份混合,即得中药微生态复方制剂粉剂,其中嗜酸乳杆菌的活菌数为5.0×109CFU/g。
该粉剂可在使用时溶解,使用方法为:粉剂在使用时可溶解于蒸馏水,比如取25g该中药微生态复方(粉剂)溶解于75mL蒸馏水中,使用方式为阴道灌注。
或者,该制备得到的粉剂也可直接溶解于水中制备成液体制剂,比如取25g该中药微生态复方制剂粉剂溶解于75mL蒸馏水中制备得到液体制剂。
实施例1 乳酸菌的筛选
1、材料方法
1.1菌株
1.1.1乳酸菌
选取屎肠球菌BLFC-3-7、植物乳酸菌LP、嗜酸乳杆菌BLCC2-0111作为备选菌株。上述三株乳酸菌由山东宝来利来生物工程股份有限公司生物工程研究院菌种资源保藏中心提供。
1.1.2母猪生殖道病原菌菌株
从山东省泰安市某养猪场母猪生殖道内分离的3株病原菌:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌。
1.2培养基:
乳酸菌培养基:MRS培养基。
病原菌培养基:BHI脑心浸液培养基。
1.3试验方法
1.3.1乳酸菌发酵液的制备
在无菌条件下分别挑取1环上述各乳酸菌斜面菌苔,分别接入装有灭菌100mL MRS液体培养基的100mL盐水瓶中,37℃恒温培养箱培养20h左右时停止发酵,得到乳酸菌发酵液。
1.3.2病原菌发酵液的制备
在无菌条件下分别挑取1环上述各病原菌斜面菌苔,分别接入装有灭菌50mL BHI脑心浸液培养基的250mL三角瓶中,37℃恒温振荡培养箱培养(180r/min)12h左右,发酵液OD600值达到1.6~2.0时停止发酵。
1.3.3乳酸菌对母猪生殖道病原菌的抑菌试验
采用牛津杯法测定各乳酸菌菌株发酵液对母猪生殖道病原菌菌株的体外抑菌试验。
2、试验结果
乳酸菌对母猪生殖道病原菌菌株的体外抑菌试验结果见表1,结果表明嗜酸乳杆菌BLCC2-0111对大肠杆菌的抑菌圈直径达15.21mm,对金黄色葡萄球菌的抑菌圈达到17.36mm,对化脓链球菌的抑菌圈直径达16.30mm,对各病原菌均具有理想的抑制与杀灭作用。
表1乳酸菌对母猪生殖道病原菌的抑菌试验结果(抑菌圈直径:mm)
注:同列数据肩标以不同字母标注表示差异显著(P<0.05);同列肩标以相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。
实施例2 嗜酸乳杆菌BLCC2-0111发酵物中抗菌活性物质的确定及抗菌物质的粗提
2.1嗜酸乳杆菌BLCC2-0111发酵物中抗菌活性物质的确定
2.1.1酸抑制排除试验:由于乳酸菌在发酵过程中产生大量的乳酸,乳酸菌发酵上清液pH值可达4.0左右,对指示菌的抑制作用也可能是乳酸菌分泌的乳酸。为了排除乳酸的干扰,用乳酸调蒸馏水和乳酸调MRS培养基的pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0作为对照。取1g嗜酸乳杆菌BLCC2-0111及其发酵物的冻干粉(取自制备例1)用蒸馏水复溶至冻干前其发酵液的体积,8000r/min离心20min,弃沉淀,上清用0.22μm孔径滤膜过滤除菌,用lmoL/L NaOH和lmoL/L HCl将其调至与对照相应的pH值,以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌为指示菌,采用牛津杯法进行抑菌试验。结果见表2。
表2酸抑制排除试验结果(抑菌圈直径:mm)
注:-表示无抑菌性,下同。
试验结果表明,相同pH值的乳酸对指示菌没有抑菌作用。说明嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的发酵产物中有其他的抑菌活性物质存在。
2.1.2蛋白酶敏感性试验:取4g嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的冻干粉(取自制备例1)用蒸馏水复溶至冻干前其发酵液的体积,平均分为4份,8000r/min离心20min,弃沉淀,上清用0.22μm孔径滤膜过滤除菌,其中3份分别用胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶对其进行酶分解实验,先用1moL/LNaOH和1moL/LHCl分别调上述上清液到胰蛋白酶的最适作用pH5.4、蛋白酶K的最适作用pH7.5、木瓜蛋白酶的最适作用pH6.2,按0.5mg/mL分别加入胰蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶,37℃水浴酶解2h后沸水浴处理3min使酶失活,再将pH值调回嗜酸乳杆菌BLCC2-0111离心上清液的pH值;1份以不加酶试剂的相同浓度的BLCC2-0111及其发酵物复溶后离心上清液(0.22μm孔径滤膜过滤除菌)做对照,牛津杯法做以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌为指示菌,采用牛津杯法进行抑菌试验,试验做3个平行。结果见表3。
表3蛋白酶敏感性试验(抑菌圈直径:mm)
注:同列数据肩标以不同字母标注表示差异显著(P<0.05);同列肩标以相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。
试验结果如表3所示,嗜酸乳杆菌BLCC2-0111代谢产物中的抑菌物质经胰蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶处理后,抑菌活性明显下降,说明,嗜酸乳杆菌BLCC2-0111产生的抑菌活性物质对胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶敏感,表明该抑菌活性物质是蛋白类物质。
2.2嗜酸乳杆菌BLCC2-0111发酵物中抑菌活性物质的粗提
取7g嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的冻干粉用蒸馏水复溶至冻干前其发酵液的体积后平均分为7份,4℃条件下8000r/min离心20min,弃沉淀。上清用0.22μm孔径滤膜过滤除菌,然后边搅拌边滴加饱和硫酸铵溶液,使硫酸铵饱和度分别为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%,4℃静置过夜。第二天10000r/min离心10min,收集沉淀分别得到不同浓度的硫酸铵沉淀蛋白,用真空冷冻干燥法干燥即得粗提抑菌活性物质。
抑菌试验:各取0.5g上述粗提抑菌活性物质(不同浓度的硫酸铵沉淀蛋白),分别溶解在5mL蒸馏水中,以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌为指示菌,以饱和硫酸铵溶液为对照,采用牛津杯法测定该粗提物的抑菌活性,试验做3个平行。结果见表4。
表4抗菌活性物质抑菌试验结果(抑菌圈直径:mm)
注:同列数据肩标以不同字母标注表示差异显著(P<0.05);同列肩标以相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。
试验结果表明:嗜酸乳杆菌BLCC2-0111及其发酵物复溶后经过离心、滤膜过滤后用饱和硫酸铵沉淀蛋白,复溶后的蛋白对3株病原菌均有很好的抑菌性。但是不同饱和度的硫酸铵沉淀的蛋白其抑菌能力不同,其中以30%饱和度沉淀的蛋白抑菌圈直径最大,随硫酸铵饱和度的增大其抑菌圈呈缩小的趋势。试验结果进一步证实了嗜酸乳杆菌BLCC2-0111代谢产物中的抑菌物质为蛋白类物质,将这些具有抗菌活性物质的蛋白统称为嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的细菌素。
实施例3 中药复方的筛选
3.1单味中药的筛选
分别选取苦参、金银花、苦丁、桑叶、蒲公英、黄连、连翘、紫花地丁8味中药,分别按相同重量份称取,每味中药加入其取用量10重量倍的水,浸泡30分钟,加热至沸腾,第一次煎煮时间为60min,过滤,滤渣中再加入每味中药原始取用量10重量倍的水进行第二次煎煮,煎煮时间为50min;过滤,滤渣中再加入每味中药原始取用量8重量倍的水进行第三次煎煮,煎煮时间为30min,合并三次滤液。以分离到的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和化脓链球菌为指示菌,采用牛津杯法检测其对病原菌的抑菌效果,试验设3个平行。
单味中药筛选抑菌试验结果
试验结果表明所选单味中药对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及化脓链球菌均具有一定的抑菌效果,结果如表5所示。由表5可知,对大肠杆菌抑菌效果较好的中药为黄连、连翘、桑叶、蒲公英,对金黄色葡萄球菌抑菌效果较好的中药为黄连、连翘、蒲公英、桑叶,对化脓链球菌抑菌效果较好的中药为黄连、桑叶、蒲公英、连翘,故选取黄连、桑叶、蒲公英、连翘作为中药复方的备选中药。
表5单味中药对病原菌的抑菌效果(抑菌圈直径:mm)
注:同列数据肩标以不同字母标注表示差异显著(P<0.05);同列肩标以相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。
3.2中药复方的筛选
通过用L9(3)4正交表设计确定正交试验的各因素水平(见表6),按重量份(表7)称取黄连、桑叶、蒲公英、连翘,混合,加入混合药材重量10重量倍的水,浸泡30分钟,加热至沸腾,第一次煎煮时间为60min,过滤,滤渣中再加入混合药材原始重量10重量倍的水进行第二次煎煮,煎煮时间为50min;过滤,滤渣中再加入混合药材原始重量8重量倍的水进行第三次煎煮,煎煮时间为30min,合并滤液,作为试药,以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和化脓链球菌为指示菌,采用牛津杯法检测各中药复方对病原菌的抑菌效果,设3个平行,选出最佳中药复方。
表6因素水平表
表7中药复方设计表(单位:g)
中药复方筛选结果
由表8可知,中药复方Ⅳ黄连3份、桑叶1份、蒲公英10份、连翘15份水煎提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、化脓链球菌抑菌效果显著优于其他各组方(P<0.05)。
表8不同中草药复方抑菌效果(抑菌圈直径:mm)
注:同列数据肩标以不同字母标注表示差异显著(P<0.05);同列肩标以相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。
相较于单味中药,本实施例中的复方表现出优异的抑菌活性,尤其中药复方Ⅳ、Ⅲ、Ⅵ和Ⅸ抑菌效果优异,特别是中药复方Ⅳ具有相对最优的抑菌效果,相较于其他复方组其抑制效果具有显著的差异。
实施例4 中药微生态复方制剂配方筛选试验
分别将100份中药复方粉与0份嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的冻干粉混合(1组)、90份中药复方粉与10份嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的冻干粉混合(2组)、80份中药复方粉与20份嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的冻干粉混合(3组)、70份中药复方粉与30份嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的冻干粉混合(4组)、60份中药复方粉与40份嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的冻干粉混合(5组)、50份中药复方粉与50份嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的冻干粉混合(6组)、40份中药复方粉与60份嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的冻干粉混合(7组)、30份中药复方粉与70份嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的冻干粉混合(8组)、20份中药复方粉与80份嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的冻干粉混合(9组)、10份中药复方粉与90份嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的冻干粉混合(10组)、0份中药复方粉与100份嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的冻干粉混合(11组)为不同组分比例的中药微生态复方制剂。以上各组制剂分别以每25g中药微生态复方制剂(粉剂)兑75mL蒸馏水溶解后使用,以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和化脓链球菌为指示菌,采用牛津杯法检测各中药微生态复方制剂对病原菌的抑菌效果,每组设3个平行,选出中药微生态复方制剂(粉剂)中中药复方粉与嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的冻干粉的最佳复配比例。
其中,上述中药微生态复方制剂(即第1-11组)中的中药复方粉与嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的冻干粉的制备方法同制备例1,中药均取自同批次。此实施例中配制得到的中药微生态复方制剂均可单独构成独立的制备例。
表9不同比例中药复方粉与嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的冻干粉复配的抑菌效果(抑菌圈直径:mm)
注:同列数据肩标以不同字母标注表示差异显著(P<0.05);同列肩标以相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。
表9显示,中药与益生菌对病原菌的抑菌有协同作用,这种协同作用因复配组方的不同呈现差异。其中3组、4组对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、化脓链球菌抑菌效果最好,显著优于其他各组方(P<0.05),可见20~30份中药复方粉与70~80份嗜酸乳杆菌BLCC2-0111的冻干粉混合复配而成的中药微生态复方制剂对上述3种猪生殖道内的病原菌抑菌效果最好。
实施例5 中药微生态复方制剂对2株乳酸菌菌株的抑菌试验
因母猪健康阴道中含有乳酸杆菌类益生菌,故我们以从泰安市某猪场健康母猪生殖道中分离的2株乳酸菌动物乳杆菌和约氏乳杆菌为指示菌,采用牛津杯法检测本发明筛选的中药微生态复方制剂(制备例1的粉剂)(每25g中药微生态复方制剂(粉状)兑75mL蒸馏水溶解后使用)对2株乳酸菌菌株的抑菌效果,每组3个平行。
1、材料与方法
1.1中药微生态复方制剂
本发明制备例1制备的中药微生态复方制剂(粉剂)。
1.2指示菌菌株
动物乳杆菌和约氏乳杆菌为抑菌试验指示菌菌株。
1.3培养基:
乳酸菌培养基:MRS液体培养基。
抑菌试验培养基:MRS固体培养基。
1.4试验方法
1.4.1乳酸菌发酵液的制备
在无菌条件下分别挑取1环动物乳杆菌和约氏乳杆菌的斜面菌苔,分别接入装有灭菌100mL MRS液体培养基的100mL盐水瓶中,37℃恒温培养箱培养20h左右时停止发酵。
1.4.2中药微生态复方制剂对动物乳杆菌和约氏乳杆菌的抑菌试验
取25g制备例1制备的中药微生态复方制剂与75mL蒸馏水混匀,采用牛津杯法测定中药微生态复方制剂对动物乳杆菌和约氏乳杆菌的体外抑菌效果试验,做3个平行。
2、试验结果
中药微生态复方制剂对动物乳杆菌和约氏乳杆菌的体外抑菌试验见表10,试验结果表明本发明所述中药微生态复方制剂对上述2株乳酸菌均没有抑制作用,说明本发明所述中药微生态复方制剂对母猪生殖道内正常乳酸菌没有抑制作用。
表10乳酸菌对母猪生殖道乳酸菌的抑菌试验结果(抑菌圈直径:mm)
动物乳杆菌 | 约氏乳杆菌 | |
中药微生态复方制剂 | - | - |
实施例6 中药微生态复方制剂对家兔阴道黏膜的刺激试验
1材料与方法
1.1试验设计与分组
取健康雌性新西兰家兔8只,体重2.0kg~2.5kg,随机分为生理盐水对照组和中药微生态复方制剂组,每组4只。中药微生态复方制剂(制备例1的粉剂)临用前按每25g中药微生态复方制剂兑75mL蒸馏水的比例溶解混匀制成中药微生态复方制剂溶液。分别用导尿管在家兔阴道(距阴道口4~5cm)中灌入2mL的中药微生态复方制剂溶液,抽出导尿管,完成染毒。对照组用生理盐水做同样处理。每日给药1次,连续6d,每次给药前观察家兔局部及全身反应,末次给药24h后处死家兔,取出完整阴道组织纵向切开剖检观察有无充血、水肿等表象,然后制作HE染色切片,观察切片并评价。
1.2评价方法
肉眼观察家兔阴道,记录有无充血、红肿和溃疡等情况,进行肉眼检查刺激分级评分,记录刺激反应现象:无改变或无明显改变为0分;轻度充血、有少量分泌物为1分;中度充血、分泌物较多为2分;重度淤血、水肿、分泌物很多、黏膜变性为3分。
刺激性分级标准:平均分值为0~0.4为无刺激性;0.41~1.5为轻度刺激性;1.51~2.5为中度刺激性;>2.5为重度刺激性。
对试验家兔阴道组织切片进行组织病理学检查,进行刺激反应镜下观察和分级评分,阴道黏膜刺激反应(镜下检查)评分标准:A上皮组织:正常,完好无损为0分;细胞变性或变扁平为1分;组织变形为2分;局部糜烂为3分;广泛糜烂为4分。B白细胞浸润(每个高倍视野):无为0分;极少(<25个)为1分;轻度(26~50个)为2分;中度(51~100个)为3分;重度(>100个)为4分。C血管充血:无为0分;极少为1分;轻度为2分;中度为3分;重度伴血管破裂为4分。D水肿:无为0分;极少为1分;轻度为2分;中度为3分;重度为4分。刺激反应积分=A+B+C+D。阴道黏膜刺激强度分级按照刺激反应积分的分值来评价:<1为无刺激;1~<5为极轻刺激;5~<9为轻度刺激;9~<12为中度刺激;≧12为重度刺激。
2试验结果
每日给药时观察,试验家兔生理盐水对照组和中药微生态复方制剂组外阴部和阴道口均无异常分泌物,也无充血和水肿现象,末次给药24h后解剖家兔阴道,中药微生态复方制剂组以及生理盐水对照组家兔阴道均未见有溃疡、坏死等异常病变;病理组织学剖检结果显示,中药微生态复方制剂组以及生理盐水对照组各家兔阴道组织结构清晰、黏膜完整,黏膜下结缔组织和肌层未见充血、水肿或炎性细胞浸润等异常病变,组间未见明显差异。
在本试验条件下,中药微生态复方制剂供试品每日1次家兔阴道内给药,每次2mL,连续6d,对家兔阴道黏膜不产生明显的刺激反应。中药微生态复方制剂阴道刺激性(肉眼观察)评价结果:试验家兔的刺激反应评分均为0分,分级为无刺激。中药微生态复方制剂对阴道黏膜刺激强度分级(病理观察)评价结果:中药微生态复方制剂和生理盐水对照组家兔阴道组织结构清晰、黏膜完整,组间未见明显差异,见表11和图1、图2。本试验确认了在试验使用剂量下,中药微生态复方制剂对家兔阴道黏膜无刺激,证明该药对机体黏膜使用是安全的。
表11中药微生态复方制剂对家兔阴道黏膜刺激强度分级(病理观察)
实施例7 中药微生态复方制剂对家兔阴道炎的作用试验
1试验材料与方法
1.1试验动物:初成年雌性未孕新西兰试验兔,体重2.5~3.0kg,试验前适应性饲养7d。每天上下午饲喂家兔全价颗粒型饲料,自由饮水。
1.2动物阴道和宫颈感染用病原菌:实施例1中使用的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌。
1.3试验模型制作
细菌性阴道宫颈炎动物模型,制作动物模型前对家兔阴道pH值检测为7.2±0.2,把液体发酵培养的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌离心后制作成浓度均为1×109CFU/mL的高浓度病原菌悬浮液,按1:1:1比例混匀,取0.2mL混匀的悬浮液,经导管注进家兔阴道内,每天1次,连续造模3天后,临床检查动物外阴及阴道红肿及出现分泌物情况,取外阴及阴道分泌物染色后镜检,并进行划线培养,检测是否含有染病病原菌,以外阴及阴道发生明显水肿及阴道分泌物经微生物检测含有染病病原菌,判断阴道炎模型制作成功。
1.4分组与给药、观察及检测方法
将造模成功的90只家兔随机分为造模不治疗组(自然恢复组)、市售中药制剂组、中药微生态复方制剂组(制备例1的粉剂)组,每组10只,各做3个平行。市售中药制剂组按该药剂使用说明使用,中药微生态复方制剂组每25g中药微生态复方制剂(粉剂)兑75mL蒸馏水溶解后使用,每只兔每次使用2mL,每天1次;另外取30只未造模雌性家兔作为空白对照组,给予每只兔每次2mL无菌生理盐水,每天1次,连续给药6d,给药剂量为灌满阴道和到达宫颈部及涂抹阴门周围为准。每日对动物一般行为和外阴情况进行观察,末次给药6h后临床检查动物外阴及阴道红肿及出现分泌物情况,取阴道及宫颈分泌物经微生物检测是否含染病病源菌。外阴及阴道红肿判为阳性(+),否则判为(-),分泌物经微生物检验含病原菌判为阳性(+),否则判为(-),末次给药24h后处死家兔,取出阴道组织制作HE染色切片,观察切片并评价。试验开始和试验结束时分别称量各组家兔体重,取平均值。
2试验结果
各组动物造模后,外阴出现明显红肿,并出现分泌物,而空白对照组未观察到明显变化,造模不治疗组(自然恢复组)和各给药组动物出现焦躁不安舔舐外阴的症状,随着不断给药,各给药组动物的红肿现象逐步减轻;造模后动物食量和饮水减少,空白组饮食正常,造模不治疗组体重明显下降,具体结果见表12。
表12中药微生态复方制剂对家兔阴道炎的影响(x±s,n=10)
注:同列数据肩标以不同字母标注表示差异显著(P<0.05);同列肩标以相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。
试验结果显示,造模不治疗组(自然恢复组)家兔阴道上皮组织恢复慢、体质差;在微生物培养鉴定过程中观察到大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和化脓链球菌为优势菌群,其他细菌几乎观察不到,患病家兔出现焦躁不安现象,饮食明显减少,体重下降(P<0.05)。市售中药制剂组家兔阴道上皮组织和体质恢复一般,在微生物培养鉴定过程中仍然可以观察到大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和化脓链球菌数量约占微生物总数的50%;本发明微生态复方制剂组家兔阴道上皮组织和体质恢复较好,在微生物培养鉴定过程中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和化脓链球菌数量明显减少,同时体重较造模不治疗组显著增加(P<0.05)。
HE染色切片结果如图3至图6,HE染色切片显示,与空白对照组相比,造模不治疗组阴道粘膜上皮组织不完整,萎缩,细胞脱落、坏死;市售中药制剂组和中药微生态复方制剂组阴道粘膜的上皮细胞比较完整,无脱落、坏死。
总之,中药微生态复方制剂组对家兔阴道炎具有很好的治疗效果,与市售中药制剂组相比,治疗效果更为理想,可以更好地维持阴道微生态的平衡。
实施例8 中药微生态复方制剂对母猪生殖道炎症的治疗试验
1试验材料与方法
1.1试验动物与分组:泰安市宁阳县某大型猪场患有生殖道炎症的母猪600头。随机分为4组,每组各做3个平行,Ι组为市售中药制剂组,Ⅱ组为发明专利《具有抑菌作用的格式乳杆菌与中药复方及其在治疗妇科炎症中的应用》(申请公布号CN 106957811A)所述方剂,Ⅲ组为发明专利《一株具有抑菌活性的枯草芽孢杆菌及其应用》(申请公布号CN104450590A)所述方剂,Ⅳ组为本发明的中药微生态复方制剂(制备例1的粉剂)组。Ⅱ、Ⅲ组均按对应专利所述中药组份复配好,并按本发明所述提取制备方法进行提取、制备,然后按相应专利所述中药与益生菌复配复方进行复配,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组每次按每25g相应制剂兑75mL蒸馏水溶解后使用。使用方法为分别向阴道内灌注市售中药制剂与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组所复配中药微生态复方制剂,每次用量为20mL,每天用药一次,连续用药3~5天。
1.2临床诊断标准
1.2.1母猪阴道炎临床诊断标准:阴唇肿胀,有时见有溃疡,自阴道流出浑浊或脓性分泌物,子宫洗出液细菌学检查有病原菌。
1.2.2疗效判定标准
治愈:用药后病猪临床症状消失,臭味消失,不再有脓性或浑浊的分泌物排出,细菌检验一般子宫内无病原菌。
好转:排出物由脓性变为浑浊半透明、分泌物量较少,子宫基本恢复正常。
无效:治疗前后子宫炎症无变化。
2试验结果如图7至图12以及表13所示。
表13 4种药物临床效果(3d)比较
注:同列数据肩标以不同字母标注表示差异显著(P<0.05);同列肩标以相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。
临床疗效统计结果显示,用本发明中药微生态复方制剂即试验Ⅳ组治疗后治愈率高于80.0%,总有效率高于90.0%,显著优于其他各组(P<0.05),表明相较于其他3组产品本发明筛选出的中药微生态复方制剂对母猪生殖道炎症具有更为理想的治疗效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种中药微生态复方组合物,其以益生菌和中药复方为原料;其中,所述益生菌为嗜酸乳杆菌和/或其发酵物;所述中药复方包含原料:黄连、桑叶、蒲公英和连翘;
其中,所述嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)BLCC2-0111,其生物保藏编号为CCTCC NO:M 2017098。
2.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述益生菌为嗜酸乳杆菌BLCC2-0111及其发酵物;
优选地,所述嗜酸乳杆菌BLCC2-0111及其发酵物可通过发酵培养嗜酸乳杆菌BLCC2-0111得到;
优选地,所述中药微生态复方组合物中益生菌的活菌数为≥5.0×109CFU/g。
3.根据权利要求1或2所述的组合物,其特征在于,所述中药复方包含以下重量份的原料:黄连2~4份、桑叶1~3份、蒲公英5~15份、连翘10~20份。
4.制备权利要求1至3中任一项所述的中药微生态复方组合物的方法,其包括将中药复方与益生菌混合。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述中药复方为中药复方提取液或中药复方粉;
其中,中药复方提取液的制备方法包括:按配方称取中药复方的原料,混合,加水浸泡煎煮后过滤,合并滤液,即得中药复方提取液;可选地,将该提取液干燥即可制得中药复方粉;
优选地,所述中药复方提取液的制备方法包括:按配方称取中药复方的原料,混合,加水浸泡煎煮后过滤,得到第一滤液和第一滤渣,第一滤渣加水进行第二次煎煮,煎煮后过滤得第二滤液和第二滤渣,第一滤液和第二滤液合并,冻干,制备得到中药复方粉;或者,对上述第二次煎煮过滤后将得到的第二滤渣加水进行第三次煎煮,煎煮后过滤得第三滤液,将第一、第二和第三滤液合并,即得中药复方提取液;可选地,取该中药复方提取液冻干,制备得到中药复方粉;
优选地,所述对滤渣加水浸泡煎煮的操作至少进行二次。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述中药复方提取液的制备方法包括:按配方称取中药复方的原料,混合,加入10~12重量倍的水,浸泡30~40min,加热至沸腾,第一次煎煮时间为60~65min,过滤,得第一滤液和第一滤渣,第一滤渣中加入10~12重量倍的水进行第二次煎煮,煎煮时间为50~55min;过滤,得第二滤液和第二滤渣,第二滤渣中加入8~10重量倍的水进行第三次煎煮,煎煮时间为30~35min,合并三次滤液,即得中药复方提取液;可选择地,取该中药复方提取液冻干,即可制备得到中药复方粉。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法,其特征在于,所述益生菌为嗜酸乳杆菌BLCC2-0111和/或其发酵物,其为液态益生菌或固态益生菌,所述固态益生菌优选为固态粉状益生菌。
8.一种中药微生态复方制剂,其为权利要求1至3中任一项所述的中药微生态复方组合物或包含权利要求1至3中任一项所述的中药微生态复方组合物和至少一种辅料;
优选地,所述制剂为外用制剂;优选地,所述制剂为液体制剂或固体制剂。
9.制备权利要求8中所述的中药微生态复方制剂的方法,其特征在于,所述中药微生态复方制剂为粉剂,其由中药微生态复方组合物组成,其制备方法如权利要求4至7中任一项中所述;其中,所述中药复方为中药复方粉,所述益生菌为粉状益生菌,优选为益生菌冻干粉;可选地,所述粉剂可溶解或分散于溶剂中制备成液体制剂;优选地,粉剂与溶剂的质量体积比为20~30g/60~100mL,优选为25g/75mL;优选地,所述溶剂为蒸馏水;
优选地,所述中药微生态复方制剂为液体制剂,其由中药微生态复方组合物组成,其制备方法如权利要求4至7中任一项中所述;其中,所述中药复方为中药复方提取液,所述益生菌为益生菌发酵液;可选地,所述液体制剂可进一步经真空冷冻干燥制备得到粉剂。
10.权利要求1至3中任一项所述的中药微生态复方组合物或权利要求8所述的中药微生态复方制剂在制备用于防治动物生殖道感染的药物中的应用;优选地,所述动物为母猪或雌性家兔。
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