发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于由外感风寒引起的头痛、身痛、咳嗽、胸闷不畅的中药颗粒剂,该中药颗粒剂具有解表散寒,祛风止痛,化痰止咳的功效,同时,还具有抗病毒、体外抗菌、抗炎、解热等药效。
本发明的另一目的是提供该治疗外感风寒药物的制备方法。
本发明的技术方案:一种治疗外感风寒的中药颗粒剂,其特征在于由以下重量配比的原料药制成:荆芥60~100份,淡豆豉150~180份,白芷150~180份,防风150~180份,桔梗150~180份,紫苏叶200~300份,苦杏仁80~120份,辛荑60~110份,干姜60~100份,薄荷60~100份,甘草50~80份。
所述的一种治疗外感风寒的中药颗粒剂,其特征在于各原料药的重量配比为:
荆芥80~90份,淡豆豉160~170份,白芷160~170份,防风160~170份,
桔梗160~170份,紫苏叶240~260份,苦杏仁90~110份,辛荑80~90份,干姜80~90份,薄荷80~90份,甘草60~70份。
所述的一种治疗外感风寒的中药颗粒剂,其特征各原料药的重量配比为:荆芥80~85份,淡豆豉165~170份,白芷165~170份,防风165~170份,桔梗165~170份,紫苏叶245~255份,苦杏仁95~105份,辛荑80~85份,干姜80~85份,薄荷80~85份,甘草65~70份。
所述的一种治疗外感风寒的中药颗粒剂,其特征在于各原料药的重量配比为:
荆芥83份,淡豆豉167份,白芷167份,防风167份,桔梗167份,紫苏叶250份,苦杏仁100份,辛荑83份,干姜83份,薄荷83份,甘草67份。
所述的一种治疗外感风寒的中药颗粒剂,其特征在于所述的颗粒剂中还包括以下重量份的辅料:玉米糊精60~70份,糖粉900~1100份。
所述一种颗粒剂中包含的辅料的优选重量份为:玉米糊精67份,糖粉1000份。
所述的治疗外感风寒的中药颗粒剂的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
1)、将上述配比的荆芥、淡豆豉、白芷、防风、桔梗、紫苏叶、苦杏仁、辛荑、干姜、薄荷、甘草混合,加4~6倍重量的水煎煮二次,每次0.5~2小时,过滤,合并滤液,所得滤液浓缩至95-100℃时相对密度为1~1.1;
2)、将上述浓缩液放入5-10℃下冷藏,静置24小时以上,吸取上清液后继续加热浓缩,浓缩液再次浓缩,至95-100℃时相对密度为1.1~1.2,得浸膏;
3)、将制备得到的浸膏按照常规工艺真空干燥,干品粉碎过50目筛后,同时加入适量的玉米糊精和糖粉,制成颗粒;
4)、将制备得到的颗粒在60℃下干燥、过50目筛后,包装。
所述的治疗外感风寒的中药颗粒剂的制备方法,其特征在于步骤1)中加入5倍重量的水煎煮,每次煎煮1小时,所得滤液浓缩至98℃时相对密度为1.08。
所述的治疗外感风寒的中药颗粒剂的制备方法,其特征在于步骤2)中浓缩液再次浓缩至98℃时相对密度为1.2,得浸膏。
所述的治疗外感风寒的中药颗粒剂的制备方法,其特征在于步骤3)中加入玉米糊精的重量百分比为8-12%,加入糖粉的重量百分比为70-90%。
本发明中各原料药的详细说明为:甘草为豆科植物甘草Glycyrrhizauralensis Fish.胀果甘草Glycyrrhiza inflata.或光果甘草Glycyrrhiza L的干燥根及根茎。主产我国西北、华北、东北。春秋二季采挖,除去须根,干燥;或趁未完全干燥时切厚片,细小者可切为短段,干燥。甘草气微,味甜而特异;甘草的功能与主治:补脾益气,清热解毒,祛痰止咳,缓急止痛,调和诸药。用于脾胃虚弱,倦怠乏力,心悸气短,脘腹,四肢挛急疼痛,俑肿疮毒,缓解药物毒性、烈性。炙甘草补脾和胃,益气复脉。用于脾胃虚弱,倦怠乏力,心动悸,脉结代。
荆芥为唇形科植物荆芥Schizonepeta tenuifolia(benth.)Briq的干燥带花序的地上部分。主产江苏、浙江、河北、湖南。夏、秋二季花开、穗绿是采收,除去杂质,低温干燥。荆芥气香,味微涩,辛凉。荆芥功能与主治:解表散风,透疹。用于感冒,头痛。麻疹,风疹,疮疡初起。荆芥炭收涩止血。用于便血,崩漏,产后血晕。
淡豆豉为豆科植物大豆Glycine max(L.)Merr.的黑色成熟种子的发酵加工品。淡豆豉气香,味微甘。淡豆豉功能与主治:解表,除烦,宣发郁热。用于感冒,寒热头痛,烦躁胸焖,虚烦不眠。
防风为伞形科植物防风Saposhnikovia divaricata(Turcz)Schischk的干燥根。主产黑龙江、吉林、内蒙古、河北。春、秋二季未抽花时采挖,除去须根及泥沙,干燥。防风气特异,味微甘。防风功能与主治:解表祛风,胜湿,止痉。用于感冒头痛,风湿痹痛,破伤风。
桔梗为桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.干燥根。主产我国东北、华北、华东。春、秋二季采挖,洗净,趁鲜刮去外皮,干燥。桔梗气微,味微甜后苦。桔梗功能与主治:宣肺,利咽,驱痰,排脓。用于咳嗽痰多,胸闷不畅,咽痛,音哑,肺痈吐脓,疮疡脓成不溃。
紫苏叶为唇形科植物紫苏Perilla frutescens(L.)Britt.的干燥带茎的叶。本省有产。夏季采收,阴干;或趁鲜切断,阴干。紫苏叶气清香,味微辛。紫苏叶功能与主治:解表散寒,行气和胃。用于风寒感冒,咳嗽呕恶,妊娠呕吐,鱼蟹中毒。
苦杏仁为蔷薇科植物山杏Prunus armeniaca L.var.ansu Maxin.、西伯利亚杏Prunus sibirica L.东北杏Prunus mandshurica(Maxim.)Koehne或杏Prunus armeniaca L.苦杏仁气微,味苦。苦杏仁功能与主治:降气止咳平喘,润肠通便。用于咳嗽气喘,胸满痰多,血虚津枯,肠燥便秘。
辛夷为木兰科植物望春玉兰(望春花)Magnolia biondii Pamp.、玉兰Magnolia denudata Desr.或武当玉兰Magnolia sprengeri Pamp.的干燥花蕾。主产河南、安徽、浙江。东末春初花未开放时采收,除去枝梗,阴干。辛夷气芳香,味辛凉而微苦。辛夷功能与主治:散风寒,通鼻窍。用于风寒头痛,鼻塞,鼻渊,鼻流浊涕。
薄荷为唇形科植物薄荷Mentha haplocalyx Briq.的干燥部分。主产江苏、江西、本省有产。夏、秋二季茎叶茂盛或花开至三轮时,择晴分次采收,低温干燥。薄荷味辛、凉,功能与主治:宣肺风热,清头目,透诊。用于风热感冒,风温除起,头痛,目赤,喉痹,口疮,风疹,麻疹,胸胁胀闷。
干姜为姜科植物姜Zingber officinale Rose.的干燥根茎。主产四川、贵州、广西。冬季采挖,除去须根及泥沙,低温干燥。气香特异,味辛辣。干姜功能与主治:温中散寒,回阳通脉,燥湿消痰。用于腕腹冷痛,呕吐泻泄,肢冷脉微,痰饮喘咳。
白芷为伞形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.EtHook.f.ex Franch.Et Sav.或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.exHoffm.)Benth.Et Hook.f.ex Franch.Cv的干燥根。主产浙江、四川、河南。夏、秋二季采挖,除去须根及泥沙,低温干燥。气芳香,味辛、微苦。白芷功能与主治:散风除湿,通窍止痛,消肿排脓。用于感冒头痛,眉棱骨痛,鼻塞,鼻渊,牙痛,白带,疮疡肿痛。
本发明所得的治疗外感风寒的中药颗粒剂,由传统名方荆防败毒散、杏苏散、苍耳子散三方化裁而成,方中荆芥、豆豉、防风、白芷、苏叶皆性味辛温,均具发汗解表之力,能疏散客于肌表之风寒,故为主药;辅以薄荷疏风散热,以加强解表发汗之力;杏仁、桔梗宣肺利咽,化痰止咳;辛夷功擅祛风通窍,能治鼻塞不通;佐以干姜温暖中阳,以防寒邪入里;甘草调和诸药,与桔梗配合,善治咽喉疼痛。诸药合用,共奏解表散寒,祛风止痛,化痰止咳之功效,在临床上治疗风寒型感冒取得良好的治疗效果。此外,经药理实验证明,该中药颗粒剂还具有抗病毒、体外抗菌、抗炎、解热等药效。
本发明中涉及的配比及其百分含量均以重量计。
具体实施方式
以下所述实施例详细说明了本发明。在这些实施例中,除另有说明外,所有百分含量均以重量计。
实施例1:
一种治疗外感风寒的中药颗粒剂,其包含的各原料药的重量配比为:荆芥60份,淡豆豉150份,白芷150份,防风150份,桔梗150份,紫苏叶200份,苦杏仁80份,辛荑60份,干姜60份,薄荷60份,甘草50份。
首先取上述配比的荆芥、淡豆豉、白芷、防风、桔梗、紫苏叶、苦杏仁、辛荑、干姜、薄荷、甘草混合,加4倍重量的水煎煮二次,每次0.5小时,过滤,合并滤液,所得滤液浓缩至95℃时相对密度为1;再将上述浓缩液放入5℃下冷藏,静置24小时以上,吸取上清液后继续加热浓缩,浓缩液再次浓缩至95℃时相对密度为1.1,得浸膏;将制备得到的浸膏按照常规工艺真空干燥,干品粉碎过50目筛后,同时加入重量百分比为8%的玉米糊精和重量百分比为70%的糖粉后,制成颗粒;将制备得到的颗粒在60℃下干燥、过50目筛后,包装。其中10克为一袋。
实施例2:
一种治疗外感风寒的中药颗粒剂,其包含的各原料药的重量配比为:荆芥100份,淡豆豉180份,白芷180份,防风180份,桔梗180份,紫苏叶300份,苦杏仁120份,辛荑110份,干姜100份,薄荷100份,甘草80份。
首先取上述配比的荆芥、淡豆豉、白芷、防风、桔梗、紫苏叶、苦杏仁、辛荑、干姜、薄荷、甘草混合,加6倍重量的水煎煮二次,每次2小时,过滤,合并滤液,所得滤液浓缩至100℃时相对密度为1.1;再将上述浓缩液放入10℃下冷藏,静置24小时以上,吸取上清液后继续加热浓缩,浓缩液再次浓缩至100℃时相对密度为1.2,得浸膏;将制备得到的浸膏按照常规工艺真空干燥,干品粉碎过50目筛后,同时加入重量百分比为12%的玉米糊精和重量百分比为90%的糖粉后,制成颗粒;将制备得到的颗粒在60℃下干燥、过50目筛后,包装。其中10克为一袋。
实施例3:
一种治疗外感风寒的中药颗粒剂,其包含的各原料药的重量配比为:荆芥85份,淡豆豉165份,白芷165份,防风165份,桔梗165份,紫苏叶250份,苦杏仁100份,辛荑85份,干姜85份,薄荷85份,甘草65份。
首先取上述配比的荆芥、淡豆豉、白芷、防风、桔梗、紫苏叶、苦杏仁、辛荑、干姜、薄荷、甘草混合,加5倍重量的水煎煮二次,每次1小时,过滤,合并滤液,所得滤液浓缩至97℃时相对密度为1.05;再将上述浓缩液放入8℃下冷藏,静置24小时以上,吸取上清液后继续加热浓缩,浓缩液再次浓缩至97℃时相对密度为1.15,得浸膏;将制备得到的浸膏按照常规工艺真空干燥,干品粉碎过50目筛后,同时加入重量百分比为10%的玉米糊精和重量百分比为80%的糖粉后,制成颗粒;将制备得到的颗粒在60℃下干燥、过50目筛后,包装。其中10克为一袋。
实施例4:
一种治疗外感风寒的中药颗粒剂,其包含的各原料药的重量配比为:荆芥85份,淡豆豉165份,白芷165份,防风165份,桔梗165份,紫苏叶250份,苦杏仁100份,辛荑85份,干姜85份,薄荷85份,甘草65份。
首先取上述配比的荆芥、淡豆豉、白芷、防风、桔梗、紫苏叶、苦杏仁、辛荑、干姜、薄荷、甘草混合,加6倍重量的水煎煮二次,每次1.5小时,过滤,合并滤液,所得滤液浓缩至98℃时相对密度为1.08;再将上述浓缩液放入7℃下冷藏,静置24小时以上,吸取上清液后继续加热浓缩,浓缩液再次浓缩至98℃时相对密度为1.2,得浸膏;将制备得到的浸膏按照常规工艺真空干燥,干品粉碎过50目筛后,同时加入重量百分比为11%的玉米糊精和重量百分比为85%的糖粉后,制成颗粒;将制备得到的颗粒在60℃下干燥、过50目筛后,包装。其中10克为一袋。
该中药颗粒剂的功能:解表散寒,祛风止痛,化痰止咳之功效,故适用于感冒属风寒型者。制备得到的中药颗粒剂冲服,12岁以上每天二次,每次二袋;5-12岁,每天二次,每次一袋;1-5岁,每天二次,每次半袋或遵医嘱。
以下通过具体药效试验对本发明提供的治疗外感风寒的中药颗粒剂(以下简称为寒感冲剂)的有意效果作进一步说明。
试验一:体外抗病毒实验:
1、目的:明确寒感冲剂的抗病毒作用。
2、药物:实施例1中提供的寒感冲剂配方。
3、实验方法
3.1含药血清的制备:大鼠灌胃给药2次,连续3天,末次灌胃后1小时采血、分离血清。
3.2流感病毒悬液制备:
从液氮中取出狗肾传代细胞(MDCK细胞,P20)一支,转种于含10ml完全培养基的培养瓶中,待细胞长成单层接种病毒。取流感甲1型、甲3型毒株各1支,接种至单层MDCK细胞,待细胞出现病变收获病毒,即为病毒悬液。用终点稀释法测定其病毒滴度,TCID50对数值/100ul均为4.0,分装,-80℃保存。
3.3细胞毒性试验:
将药物做2倍和5倍稀释,分别取原液、2倍和5倍不同浓度稀释药液接种至单层MDCK细胞,每细胞孔接种200ul药液,每一浓度药液分别接种6孔细胞,35℃吸附2小时后在每孔补加800ul细胞培养液,35℃培养7天,每天观察细胞形态和生长情况,并与正常对照细胞对比。
3.4抗流感病毒试验:
取2倍和5倍稀释浓度的药液,同时以流感维持液代替药液做为阳性对照,分别与甲1型、甲3型流感病毒作用10分钟和20分钟,取适量连续10倍稀释接种至已长成单层的MDCK细胞中,每天观察细胞病变(CPE)并用豚鼠红细胞和细胞上清液做红细胞凝集试验(HA),连续操作5天以确定细胞的病毒感染情况。
3.5试验时环境:
温度28℃,相对湿度70%。
3.6计算方法:
用终点稀释法计算残留流感病毒的感染滴度,以半数细胞感染剂量(TCID50)表示,计算公式如下:
TCID50对数值=病变率高于50%组稀释度的对数值+距离比例
3.7平均灭活对数值的计算:
根据各组的平均病毒感染滴度(TCID50),分别计算药液对病毒的灭活指数。阳性(病毒)对照组平均病毒感染滴度(TCID50)为No,试验(消毒)组平均病毒感染滴度(TCID50)为Nx。
平均灭活对数值=logNo-logNx
4、实验结果
4.1细胞毒性试验:
细胞镜下形态观察,MDCK细胞贴壁生长良好,呈不规则圆形;未见细胞病变。观察判定细胞毒性阴性。
4.2该药物不同浓度药液作用:
甲1型流感病毒和甲3型流感病毒(10分钟;20分钟)平均灭活对数值结果见表1-4
表1 药液作用甲1、甲3型流感病毒后,细胞病变(血凝素)结果
通过上述实验数据表明,1、试验时,环境温度28℃,相对湿度70%,阴性对照组培养基无污染,细胞生长良好。2、“-”为无细胞病变(CPE)或血凝试验(HA)阴性,“+”为有细胞病变或血凝试验(HA)阳性。
表2 药液作用甲1、甲3型流感病毒后,残留流感病毒的感染滴度(TCID50对数值)
试验时,环境温度28℃,相对湿度70%,通过上述试验表明,该阴性对照组培养基无污染,细胞生长良好。
表3 药液作用甲1、甲3型流感病毒后灭活对数值结果
试验时,环境温度28℃,相对湿度70%,通过上述试验表明,该阳性对照组平均病毒感染滴度(TCID50对数值)=3.58,符合国家标准的TCID50对数值范围3.50~3.67;观察阴性对照组培养基无污染,细胞生长良好。
表4 不同浓度药液对流感病毒的灭活效果
试验时,环境温度28℃,相对湿度70%。通过上述试验表明,该阳性对照组作用时间为10分钟时的平均病毒感染滴度TCID50,对数值为3.58,符合国家标准的TCID50对数值范围3.50~3.67;该阳性对照组作用时间为20分钟时的平均病毒感染滴度TCID50,对数值为3.15,符合国家标准的TCID50对数值范围3.0~3.3。观察阴性对照培养基无污染,细胞生长良好。
综上所述,根据上述4组试验说明,本发明提供的实施例1配方的寒感冲剂对细胞无毒性作用。实施例1配方的寒感冲剂抗甲1型流感病毒试验平均灭活对数值为3.00~3.67之间,抗甲3型流感病毒试验平均灭活对数值为2.5~3.3之间,有一定抑制作用。
试验二:体外抑菌实验:
1、目的:明确寒感冲剂的抑菌作用。
2、药物:实施例2中提供的寒感冲剂配方。
盐酸左氧氟沙星,浙江省医药股份有限公司新昌制药厂生产(批号:060220)。
药物原液均用灭菌PBS(pH7.4)稀释至所需浓度。
2、菌种:
根据药物研究目的,选择金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动菌等4种致病菌共100株,其中质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923株和大肠杆菌ATCC25922株由浙江大学微生物教研室提供,其余菌株均从病人临床标本中分离得到,并进行了系统的细菌学鉴定(表5)。
表5 用于药物敏感试验的100株细菌分类
3、培养基及培养条件:
采用MH培养基培养细菌。所有培养基经配制和灭菌后置于37℃培养24h检菌,无菌生长者方能使用。接种细菌后于37℃培养18-24h。
4、MIC的测定:
采用试管倍比稀释法,使盐酸左氧氟沙星在试管中的终浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.12、0.06、0.03μg/ml;使寒感冲剂在试管中的终浓度分别为40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312mg/ml。采用麦氏比浊法(标准管购自北京中国药品生物制品鉴定所)将新鲜培养的上述细菌均配制成2×106cfu/ml的细菌悬液,各取0.1ml加入试管中,使细菌终浓度为1×105cfu/ml。于37℃培养24h后观察结果,以细菌菌株未生长的药物最高稀释度为其MIC值。实验中以接种等量细菌的PBS作为无药对照(正常对照)。
5、试验结果
5.1正常对照:正常对照的试管中所接种的细菌菌株均生长。
5.2药敏质控:
细菌质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923株和大肠杆菌ATCC25922株对盐酸左氧氟沙星的MIC100分别为1μg/ml和2μg/ml,均在NCCLS规定的范围内。
5.3体外抑制细菌的效果:
寒感冲剂体外抑制细菌试验(MIC)结果见表6。
表6 寒感冲剂体外抑制细菌的效果
6、结论
寒感冲剂体外抑制细菌试验(MIC)测定结果表明,寒感冲剂对金黄葡萄球菌和鲍曼不动菌的MIC均为5mg/ml;寒感冲剂对大肠杆菌和铜绿假单胞无作用。
试验三:抗炎实验:
1、目的:明确寒感冲剂对小鼠毛细血管通透性的影响。
2、药物:实施例3中提供的寒感冲剂配方。
3、实验操作:
3.1实验分组
去健康昆明种小鼠50只,体重18-22g,雌雄各半。小鼠随机分为寒感冲剂高、中、低剂量组,阳性药对照组(醋酸泼尼松)及空白对照组(生理盐水组)各10只。
3.2试验方法
空白组、阳性药对照组、高寒感冲剂组、中寒感冲剂组、低寒感冲剂组,分别灌服试验药物20g/kg、10g/kg、2g/kg体重(意思是:高寒感冲剂组为每公斤小鼠灌服20克实施例3中提供的寒感冲剂、中寒感冲剂组每公斤小鼠灌服10克实施例3中提供的寒感冲剂、低寒感冲剂组每公斤小鼠灌服2克实施例3中提供的寒感冲剂)。阳性药对照组,剂量为0.05g/kg。空白组(按高剂量给予同体积溶媒)0.4ml/20g体重。每日灌胃给药1次,连续5天,于末次给药后半小时各组小鼠尾静脉注射0.5%伊文思蓝生理盐水溶液0.1ml/10g,并立即每只腹腔注射0.6%醋酸0.2ml/只,半小时后脱颈椎处死小鼠,剪开腹部,用生理盐水每次2ml清洗腹腔3次,吸取腹腔冲洗液后合并至试管中,以3000r/min,离心10min,取上清液于590nm处比色。
3.3实验结果
4、结论
表7中的“*”表示与生理盐水组比,P<0.05,实验具有显著性,即说明实施例3中提供的寒感冲剂配方的高剂量组与空白对照组显示对毛细血管通透性有一定的抑制作用。
(2)致大鼠足肿胀的影响
1、实验分组
取健康SD雄性大鼠40只,称重后按照随机数字表分4组,空白模型对照组10只、寒感冲剂(高、中、低三个剂量组同上述实验一致,每组10只)。
2、试验方法
寒感冲剂高、中、低三个剂量组分别于35g/kg,17.5g/kg,3.5g/kg灌胃给药,空白模型对照组不给药,60min后,将1%琼脂0.1ml注入大鼠右后足跖腱膜下致炎,分别于致炎后的5min、30min、1h、2h、4h、6h用毛细管放大测量足跖体积。
3、实验结果:见表8
4、结论:实施例3中提供的寒感冲剂配方对琼脂致大鼠足肿胀有一定的抑制作用。
试验四:解热实验:
1、目的:明确寒感冲剂对家兔的体温影响。
2、药物:实施例4中提供的寒感冲剂配方。
3、实验
3.1动物分组
取健康家兔,每天测体温(肛温)1次,连续3天,使兔子适应测温操作,选择体温在38.6℃-39.6℃,且体温波动在0.2℃以下的兔子作为合格兔。取合格兔40只,间隔30min连续测体温2次,以每兔平均体温作为该兔基础体温,按基础体温分层随机分为4组,每组10只,雌雄各半。分别为寒感冲剂高、低剂量组,阳性药物对照组(阿司匹林组),和空白对照组。
3.2实验方法
各组兔子按寒感冲剂高、低剂量组18.7g/kg、4.68g/kg;阿司匹林阳性对照组给药100mg/kg;空白对照组给等量的生理盐水灌胃一次。0.5h后按照内毒素致热法复制兔子发热模型(即各组家兔耳缘静脉注射大肠杆菌内毒素10EU/kg),记录内毒素注射后1h、2h、3h、4h、5h家兔肛门温度。
3.3实验结果:见表9
4、结论:
表9中的“*”表示与生理盐水组比,P<0.05。
由表9可知,静脉注射内毒素后体,模型组体温1h后上升达最高将近1℃,之后呈逐渐下降趋势,低剂量组体温较同时间点模型组比较偏低,但无统计学意义,高低剂量给药组,阿司匹林组与同时间点模型组相比有较好的解热作用,有统计学意义,(P<0.05),表明寒感冲剂对家兔内毒素致热有一定的解热作用。
试验五:免疫功能实验:
1、目的:
(1)支气管哮喘小鼠的BALF中的白细胞数与嗜酸性粒细胞的影响
(2)对模型组血清中的IL-5值的影响
2、药物:实施例1、2、3、4中提供的寒感冲剂配方总和的1/4份。
3、实验:
3.1实验动物
健康C57BL/6小鼠,60只,体重20±2g,雄性,浙江省中医药研究院实验动物中心提供,实验动物许可证号:SYXK(浙)2004-0034
3.2实验药品
卵白蛋白(OVA):批号052K1275,Sigma公司。佐剂液态铝(imjectAlum,PIERCE),瑞氏染色液(天和微生物试剂公司)。
氯化钠注射液:批号070206,浙江天瑞药业有限公司
小鼠IL-5试剂盒:批号EK0408,武汉博士德生物工程有限公司
3.3仪器
低温离心机:美国,CR4-11,光学显微镜:LECIA DMLB,石蜡切片机:LEICA RM2135,便携式雾化器:道芬电子有限公司S-888E型,Wellscan MK2型酶标仪,芬兰产各种规格微量加样器,各种规格器官插管和灌洗针及消耗品。
4、方法
4.1试验剂量与分组
C57小鼠随机分为6组,模型对照组(OVA)、桂龙咳喘宁组阳性对照组(0.58g/kg),寒感冲剂高、中、低三个剂量组(该方法与上述实验相同,即按照进药量的大小进行分配)、同时设生理盐水(N.S)刺激健康小鼠对照组。
4.2动物致敏、激发程序及药物干预程序
致敏液的配制称取20mg OVA加入lml生理盐水中,充分溶解后,取出0.4ml加入9.6ml生理盐水中,混匀,取该液与等体积的佐剂液态铝混合,在4℃下放置30分钟后使用。于第0天与第14天分别给每只小鼠腹腔注射上述致敏液0.2ml,阴性组注射等体积的生理盐水。于第24天、25天、26天,将小鼠置于一自制密闭容器中,以1%OVA溶液雾化吸入10ml,每天一次。于最后一次抗原激发后48小时(第28天),小鼠处死,收集标本。于第17天各组开始用药,共计10天。
4.3标本收集及指标测定
4.3.1小鼠血清中IL-5浓度的测定:摘眼球取血,4℃离心,分离血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清中IL-5的浓度。
4.3.2 BALF:小鼠颈前暴露气管,做一横形切口,插入改良的18G气管插管针,用0.7ml PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)灌洗3次,回收率在80%以上,以2000rpm离心10min(4℃下)。取200μl BALF(支气管肺泡灌洗液)加入200μl白细胞计数液中,在显微镜下计数白细胞总数。将BALF离心后的沉淀重新溶于0.4ml PBS(磷酸盐缓冲液)中,混匀,制备3张涂片,以瑞氏染液染色。每个标本计数400个细胞,计算其中的Eos数(嗜酸性粒细胞数目)。
5、统计分析
试验数据采用SPSS10.0软件进行统计,所得结果均数±标准误表示,对各组数据先进行χ2正态检验和方差分析,若符合正态分布和方差齐性,则进行单因素方差分析,多重比较采用LSD法;若不符合方差齐性的要求,则进行多重秩和检验,多重比较用Mannn-Whiteney法,取P<0.05作为显著性差异水平。
6、结果
6.1不同剂量寒感冲剂干预后BALF中细胞总数及Eos的变化,结果见表10
表10 不同剂量寒感冲剂干预后BALF中细胞总数及Eos的变化
结论:本实验例中的寒感冲剂用药组与OVA组比较*P<0.05,**P<0.01;寒感冲剂用药组的BALF中的白细胞数与嗜酸性粒细胞都较模型组减少,减少值与剂量相关。表明对免疫炎症反应过程中气道粘膜的分泌有一定抑制作用,即对炎症反应有一定的抑制作用。
6.2寒感冲剂对小鼠血清中IL-5的影响,结果见表11
表11 各组小鼠血清中IL-5的浓度
结论:表11中的数据表示的是:均数±标准差,表11中的“*”表示与正常对照组比较,P<0.05,说明具有显著性差异水平;“△△”表示与哮喘模型组比较,P<0.01,说明具有突出的显著性差异水平。
经实验表明:寒感冲剂用药组对模型组血清中的IL-5值无差异性,未能显示寒感冲剂对模型组的免疫指标的影响。
试验六止咳化痰实验:
1、目的:明确寒感冲剂对小鼠的止咳化痰影响。
2、药物:实施例1、2、3、4中提供的寒感冲剂配方总和的1/4份。
3、实验:
3.1动物分组与方法:取ICR健康小鼠,体重(20±2)g,雌雄各半,随机分为5组,每组10只.
3.2方法:高剂量组1ml/只,中剂量组为0.5ml/只,低剂量组为0.25ml/只,给药30分钟后,腹腔注射0.25%苯酚红溶液0.8ml/只,注射后30分钟,将实验小鼠脱颈处死,仰位固定于手术板上,剪开颈正中皮肤,分离气管,于喉头下将头磨平的7号针头插入气管内约0.3cm,用丝线结扎固定后,用1ml注射器5吸取5%碳酸氢钠溶液0.5ml,通过针头来回灌洗呼吸道3次(每次不作停留),将灌洗液注入一比色管中,重新吸取碳酸氢钠溶液0.5ml,如上再灌洗3次,然后第3次重复上述灌洗。将3次的冲洗液合并置比色管中,与苯酚红标准管在721型分光光度计的波长546nm处进行比色,测出吸光度,计算酚红浓度。
3.3试验结果:
表12 各组酚红浓度(mg/L)
结论:表12中的各组酚红浓度与正常对照组比较,P<0.05,说明具有显著性差异水平;由表12数据可知,寒感冲剂用药组对酚红祛痰有一定的效果。