CN102302721A - 一种治疗支气管炎的药物组合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗支气管炎的药物组合物,它是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂:川贝母12-18份、紫菀9.6-14.4份、甘草4-6份、陈皮7.2-10.8份、百部16-24份、白前7.2-10.8份、桔梗7.2-10.8份、荆芥7.2-10.8份、苦杏仁9.6-14.4份、黄芩9.6-14.4份。本发明药物组合物宣肺疏风,止咳化痰,用于外感咳嗽,症见咳而咽痒,咯痰不爽,或微有恶风发热者,其止咳、化痰、平喘、抗菌、抗炎药效良好,对急性支气管炎具有较好的治疗作用。其中,本发明药物组合物在中剂量时就能发挥显著的治疗作用,其作用效果与高剂量相当,甚至优于高剂量。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗支气管炎的药物组合物;还涉及该药物组合物的制备方法和用途,属药物领域。
背景技术
急性支气管炎为临床常见病、多发病,它是由感染、物理、化学刺激或过敏引起的急性炎症,为一种自限性下呼吸道疾病。多为散发,无流行倾向,年老体弱者易感。其临床主要症状为持久和严重咳嗽、咳痰。急性支气管炎迁延不愈可发展为慢性支气管炎,尤其对有慢性心、肺基础疾病者,支气管炎可导致严重缺氧或通气不足,对患者产生极大的危害。因此,采取有力措施积极治疗急性支气管炎,是医学研究的一个热点。
急性支气管炎是一种气管平滑肌痉挛、粘膜充血、水肿、分泌物增多性疾病,是由病毒或细菌感染、物理、化学刺激或过敏反应对支气管粘膜造成的急性炎症,临床以咳嗽、咳痰、发热、喘鸣为主要症状,属中医咳嗽、痰饮、喘证范畴,其致病原因为外感与内伤。外感为六淫外邪侵袭肺系;内伤主要是脏腑功能失调。六淫之邪侵袭肺是因为肺的卫外功能减退或失调,以致在天气冷热失常,气候突变的情况下,六淫外邪从口鼻而入,或从皮毛而受。脏腑功能失调主要指肺脏功能失调,外邪易侵,内外合邪而为病。此外,饮食不当,嗜烟好酒、熏灼肺胃;或过食肥厚辛辣,脾失健运,痰浊内生,上干于肺而发病。
目前,治疗急性支气管炎的方法主要有中医疗法、西医疗法以及中西医结合疗法。在中医药治疗中,川贝、枇杷叶为常用的中药材,目前也有较多治疗支气管炎的中药组合物,如川贝枇杷颗粒,其处方为:川贝母150g,桔梗150g,枇杷叶999g,薄荷脑1.13g、杏仁香精0.5ml及其他辅料。该药物清热宣肺、化痰止咳,可用于治疗感冒咳嗽及支气管炎。
在西医、中西医结合疗法中,多采用抗生素进行治疗。而近年来,抗生素在世界范围内的滥用,已经使得很大一部分人群产生了耐药性,因此,寻找一种能够有效治疗急性支气管炎的非抗生素类药物,显得尤为必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够有效治疗急性支气管炎的药物组合物,以及提供该药物组合物的制备方法和它的用途。
本发明提供了一种治疗支气管炎的药物组合物,它是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂:
川贝母12-18份、紫菀9.6-14.4份、甘草4-6份、陈皮7.2-10.8份、百部16-24份、白前7.2-10.8份、桔梗7.2-10.8份、荆芥7.2-10.8份、苦杏仁9.6-14.4份、黄芩9.6-14.4份。
进一步地,它是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂:
川贝母15份、紫菀12份、甘草5份、陈皮9份、百部20份、
白前9份、桔梗9份、荆芥9份、苦杏仁12份、黄芩12份。
其中,所述的制剂是由原料药的水或有机溶剂提取物为活性成分,加上药学上可用的辅料或辅助性成分制备而成。
其中,所述的制剂为口服制剂;进一步地,所述的制剂为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸或口服液。
其中,所述的制剂中,每日用单位制剂中有效成分的含量以生药计为0.9g/Kg。
本发明还提供了上述的药物组合物的制备方法,它包括下列步骤:
按照重量配比称取原料药,加水或有机溶剂提取,合并提取液,加上药学上可接受的辅料制备成制剂。
进一步地,具体方法如下:
(1)按照重量配比称取原料药;
(2)取紫菀、陈皮、黄芩、白前、荆芥、苦杏仁、甘草七味原料药,加水煎煮1-3次,每次0.5-3h,过滤,合并滤液,浓缩,浓缩液醇沉后,静置,滤过,浓缩滤液得浓缩液A;
(3)取川贝母粗粉,以60-95%乙醇浸渍,渗漉,将渗漉液浓缩得浓缩液B;
(4)取川贝母渗漉后的药渣与桔梗、百部粗粉一起加水温浸1-4次,过滤,浓缩滤液得浓缩液C;
(5)取浓缩液A、B、C,合并后,加入药学上常用的辅料制备制剂。
进一步地,步骤(2)中,加水煎煮2-3次,每次1-2h;浓缩液用乙醇调至含醇量达到50%以上,进行醇沉;步骤(3)中,以70-80%乙醇浸渍16-24h后,渗漉;步骤(4)中,加水温浸2-3次,每次1-2h,温度控制在70-95℃。
更进一步地,步骤(2)中,加水煎煮2次,每次1h;浓缩液用乙醇调至含醇量达到50%以上,进行醇沉;步骤(3)中,以75%乙醇浸渍20h后,渗漉;步骤(4)中,加水温浸2次,每次1h,温度控制在70-95℃。
本发明还提供了上述药物组合物在制备治疗支气管炎的药物中的用途。
进一步地,所述的药物是治疗急性支气管炎的药物。
本发明还提供了上述药物组合物在制备镇咳、祛痰、平喘、抗炎或抗菌药物中的用途。
本发明中所述川贝母为百合科植物川贝母Fritillaria cirrhosa D.Don、暗紫贝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia、甘肃贝母Fritillariaprzewalskii Maxim.、梭砂贝母Fritillaria delavayi Ftanch.、太白贝母Fritillaria taipaiensis P.Y.Li或瓦布贝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia var.wabuensis(S.Y.Tang.et S.C.Yue)Z.D.Liu,S.Wang et S.C.Chen的干燥鳞茎。苦、甘,微寒,归肺、心经;清热润肺,化痰止咳,用于肺热燥咳,干咳少痰,阴虚劳嗽,咯痰带血。
紫菀为菊科植物紫菀Aster tataricusL.f.的干燥根和根茎。辛、苦,温,归肺经。润肺下气,消痰止咳,用于痰多喘咳,新久咳嗽,劳嗽咳血。
百部为百部科植物直立百部Stemona sessilifolia(Miq.)Miq.、蔓生百部Stemona japonica(B1.)Miq.或对叶百部Stemona tuberosa lour.的干燥块根。甘、苦,微温,归肺经。润肺下气止咳,杀虫灭虱。用于新久咳嗽,肺痨咳嗽,顿咳;外用于头虱,体虱,蛲虫病,阴痒。蜜百部润肺止咳。用于阴虚劳嗽。
桔梗为桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根。苦、辛,平。归肺经。宣肺,利咽,祛痰,排脓。用于咳嗽痰多,胸闷不畅,咽痛音哑,肺痈吐脓。
白前为萝藦科植物柳叶白前Cynanchum stauntonii(Decne.)Schltr.ex Lévl.或芫花叶白前Cynanchum glaucescens(Decne.)Hand.-Mazz.的干燥根茎和根。辛、苦,微温。归肺经。降气,消痰,止咳。用于肺气壅实,咳嗽痰多,胸满喘急。
陈皮为芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的干燥成熟果皮。苦、辛,温。归肺、脾经。理气健脾,燥湿化痰。用于脘腹胀满,食少吐泻,胸闷气短,咳嗽痰多。
荆芥为唇形科植物荆芥Schizonepeta tenuifolia Briq.的干燥地上部分。辛,微温。归肺、肝经。解表散风,透疹,消疮。用于感冒,头痛,麻疹,风疹,疮疡初起。
苦杏仁为蔷薇科植物山杏Prunus armeniaca L.var.ansu Maxim.、西伯利亚杏Prunus sibirica L.、东北杏Prunus mandshurica(Maxim.)Koehne或杏Prunus armeniaca L.的干燥成熟种子。苦,微温;有小毒。归肺、大肠经。降气止咳平喘,润肠通便。用于咳嗽气喘,胸满痰多,肠燥便秘。
黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。苦,寒。归肺、胆、脾、大肠、小肠经。清热燥湿,泻火解毒,止血,安胎。用于湿温、暑湿,胸闷呕恶,湿热痞满,泻痢,黄疸,肺热咳嗽,高热烦渴,血热吐衄,痈肿疮毒,胎动不安。
甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhizainflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根及根茎。甘,平。归心、肺、脾、胃经。补脾益气,清热解毒,祛痰止咳,缓急止痛,调和诸药。用于脾胃虚弱,倦怠乏力,心悸气短,咳嗽痰多,脘腹、四肢挛急疼痛,痈肿疮毒,缓解药物毒性、烈性。
本发明处方中川贝母味苦、甘,微寒,能清肺泄热、润肺止咳化痰,尤其适宜于内伤久咳、燥痰、热痰之证;紫菀味甘、辛、苦,性温,长于润肺下气,开肺郁、化痰浊而止咳,无论新久、寒热虚实之咳嗽均可运用;百部味甘、苦,微温,归肺经,无论外感内伤、暴咳、久嗽,皆可用之,所以紫菀、百部均为味苦,都入肺经,其性温而不热,润而不腻,皆可止咳化痰,对于新久咳嗽都能使用;因此,川贝母、紫菀、百部三药具有润肺止咳、清热化痰之功,共为君药;荆芥、陈皮、桔梗合用开宣肺气,用于外感咳嗽;川贝母、白前、紫菀、杏仁、百部、黄芩合用肃降肺气,用于内伤咳嗽;甘草调和诸药。纵观全方:一宣一降,以恢复肺气宣发肃降之功能,对于新久咳嗽、咯痰不爽者,均可获效。
本发明药物组合物宣肺疏风,止咳化痰。用于外感咳嗽,症见咳而咽痒,咯痰不爽,或微有恶风发热者,能够明显改善急性支气管炎模型大鼠及小鼠支气管的病理状态;下调大鼠血清中升高的IL-6、IL-8、TNF-α、NF-kB、sICAM-1,下调小鼠血清中升高的IL-8及TNF-α;止咳、化痰、平喘、抗菌、抗炎药效良好,表明本发明药物组合物对急性支气管炎具有较好的治疗作用。其中,本发明药物组合物在中剂量时就能发挥显著的治疗作用,其作用效果与高剂量相当,有的甚至优于高剂量。
附图说明
图1病理组织学观察(大鼠支气管HE染色),其中,1-空白组:支气管正常(10X10倍),2模型组:支气管大量炎细胞浸润(10X10倍),3-阳性组:支气管见少量炎细胞浸润(10X10倍),4-高剂量组:支气管见少量炎细胞浸润(10X10倍),5-中剂量组:支气管偶见炎细胞浸润(10X10倍),6-低剂量组:支气管偶见炎细胞浸润(10X10倍)
图2透射电镜超微结构观察;其中,1-空白组:支气管纤毛上皮线粒体正常(X8000倍),2-模型组:支气管纤毛上皮线粒体肿胀(X8000倍),3-阳性组:支气管纤毛上皮线粒体正常(X8000倍),4-高剂量组:支气管纤毛上皮线粒体正常(X8000倍),5-中剂量组:支气管纤毛上皮线粒体正常(X8000倍),6-低剂量组:支气管纤毛上皮线粒体轻度肿胀(X8000倍)
图3病理组织学观察(小鼠支气管HE染色);1-空白组:支气管正常(10X10倍),2-模型组:支气管大量炎细胞浸润(10X10倍),3-阳性组:支气管偶见炎细胞浸润(10X10倍),4-高剂量组:支气管偶见炎细胞浸润(10X10倍),5-中剂量组:支气管偶见炎细胞浸润(10X10倍),6-低剂量组:支气管见少量炎细胞浸润(10X10倍)。
具体实施方式
实施例1本发明药物组合物的制备
按照下列用量称取原料药:瓦布贝母15g、紫菀12g、甘草5g、陈皮9g、百部20g、白前9g、桔梗9g、荆芥9g、苦杏仁12g、黄芩12g;将紫菀、陈皮、黄芩、白前、荆芥、苦杏仁、甘草七味,加水煎煮两次,第一次加水12倍量,第二次加水10倍量,每次1h,过滤,合并滤液,浓缩滤液,浓缩液用95%乙醇调含醇量达到50%,静置,抽滤,浓缩滤液;瓦布贝母粗粉75%乙醇16倍量,浸渍20h,渗漉,渗漉液浓缩;瓦布贝母渗漉药渣与桔梗、百部粗粉90℃,20倍量水,温浸2次,每次1h,过滤,浓缩滤液;以上三种浓缩液合并,加入适量糊精,减压干燥,制得干膏以85%乙醇混匀制成软材,制粒,干燥,即得。
实施例2本发明药物组合物的制备
按照下列用量称取原料药:瓦布贝母18g、紫菀9.6g、甘草4g、陈皮7.2g、百部16g、白前7.2g、桔梗7.2g、荆芥7.2g、苦杏仁9.6g、黄芩9.6g;将紫菀、陈皮、黄芩、白前、荆芥、苦杏仁、甘草七味,加水煎煮三次,第一次加水10倍量,第二次加水10倍量,第三次加水8倍量,每次30min,过滤,合并滤液,浓缩滤液,浓缩液用80%乙醇调含醇量达到50%以上,静置,抽滤,浓缩滤液;瓦布贝母粗粉60-65%乙醇20倍量,浸渍24h,渗漉,渗漉液浓缩;瓦布贝母渗漉药渣与桔梗、百部粗粉85℃,22-24倍量水,温浸3次,每次1h,过滤,浓缩滤液;以上三种浓缩液合并,加入适量糊精,减压干燥,制得干膏以75%乙醇混匀制成软材,制粒,干燥,即得。
实施例3本发明药物组合物的制备
按照下列用量称取原料药:瓦布贝母12g、紫菀14.4g、甘草6g、陈皮10.8g、百部24g、白前10.8g、桔梗10.8g、荆芥10.8g、苦杏仁14.4g、黄芩14.4g;将紫菀、陈皮、黄芩、白前、荆芥、苦杏仁、甘草七味,加水煎煮两次,第一次加水12倍量,第二次加水10倍量,每次1.5h,过滤,合并滤液,浓缩滤液,浓缩液用95%乙醇调含醇量达到50%以上,静置,抽滤,浓缩滤液;瓦布贝母粗粉85-95%乙醇14倍量,浸渍20h,渗漉,渗漉液浓缩;瓦布贝母渗漉药渣与桔梗、百部粗粉70℃,20倍量水,温浸2次,每次1.5h,过滤,浓缩滤液;以上三种浓缩液合并,加入适量糊精,减压干燥,制得干膏以85%乙醇混匀制成软材,制粒,干燥,即得。
实施例4本发明药物组合物的制备
按照下列用量称取原料药:瓦布贝母15g、紫菀12g、甘草5g、陈皮9g、百部20g、白前9g、桔梗9g、荆芥9g、苦杏仁12g、黄芩12g将药材混合后,加水共煎3次,第1、2次煎煮1h,第3次煎煮0.5h,合并水煎液,滤过,滤液浓缩后,加入适量辅料,喷雾干燥后,即得颗粒剂。
实施例5本发明药物组合物的制备
按照下列用量称取原料药:暗紫贝母15g、紫菀12g、甘草5g、陈皮9g、百部20g、白前9g、桔梗9g、荆芥9g、苦杏仁12g、黄芩12g;取暗紫贝母,加入乙醇,回流提取2次,每次2h,药渣备用;将暗紫贝母药渣与其余9味药材混合,加水共煎2次,每次1.5h,合并水煎液,滤过,滤液浓缩后,干燥,加入适量微晶纤维素混匀后,装胶囊,即得本发明胶囊剂。
实施例6本发明药物组合物的制备
取实施例1制备得到的颗粒,再加入适量硬脂酸镁,压片,制得本发明片剂。
以下通过药效试验进一步证明本发明的有益效果。
实验药物与试剂
本发明药物组合物流浸膏(按实施例1方法制备得到,其中,每ml流浸膏含原生药3.12g,);急支糖浆(国药准字Z50020615,太极集团重庆涪陵制药厂有限公司);川贝枇杷颗粒(国药准字Z20025472,太极集团重庆中药二厂);天下秀牌香烟(焦油量:12mg、烟气烟碱量:1.0mg、烟气一氧化碳量:13mg,川渝中烟工业公司);大鼠TNF-αElisa试剂盒(进口分装,上海西唐生物有限公司);大鼠NF-kB Elisa试剂盒(进口分装,上海西唐生物有限公司);大鼠sICMA-1Elisa试剂盒(进口分装,上海西唐生物有限公司);大鼠IL-6Elisa试剂盒(进口分装,上海西唐生物有限公司);大鼠IL-8Elisa试剂盒(进口分装,上海西唐生物有限公司);复方磷酸可待因口服溶液(香港澳美制药厂);枸橼酸(柠檬酸,Citric acidmonohydrate,含量≥99.5%,天津博迪化工股份有限公司,用蒸馏水配置成17.5%的枸橼酸水溶液);氨茶碱片(国药准字H50021419,太极集团西南药业股份有限公司);Krebs-Henseleit缓冲液;盐酸溴己新(国药准字H33021315,浙江万邦药业有限公司);乌来糖(氨基甲酸乙酯)(含量≥98.0%,国药集团化学试剂公司);营养琼脂培养基(批号:20100831-02,杭州微生物试剂有限公司);Mueller-Hinton agar(英国OXOID公司生产);Mucin from porcine stomach(Type II)(SIGMA公司生产);TRYPTONE(英国OXOID公司生产);YEASTEXTRACT(英国OXOID公司生产);阿莫西林克拉维酸甲片(国药准字H20063684,山西同达药业有限公司);头孢拉定胶囊(国药准H220216041,吉林省六福堂昌隆生化药业有限公司);醋酸泼尼松片(国药准字H33021207,浙江仙琚制药股份有限公司)
实验动物
SD大鼠,体重200±20g,雌雄均有,由成都中医药大学实验动物研究中心提供。实验动物生产许可证号:SCXK(川)2008-11,实验动物使用许可证号:SYXK(川)2008-049,检疫后备用。
KM小鼠,体重20±2g,雌雄均有,由成都中医药大学实验动物研究中心提供。实验动物生产许可证号:SCXK(川)2008-11,实验动物使用许可证号:SYXK(川)2008-049,检疫后备用。
英国种豚鼠,雌雄兼用,体重250±50g,由四川实验动物专委会养殖场提供。实验动物生产许可证号SCXK(川)2008-14;实验动物使用许可证号:SYXK(川)2008-049,检疫后备用。
试验例1本发明药物组合物对大鼠急性支气管炎的作用研究
1.1实验方法
将空白对照组(n=10)以外的50只大鼠置于特制的80cm×80cm×40cm的烟室中,每次用20支香烟加锯末面10g,每次混合烟熏30min,2次/d,持续15d。空白对照组则置于正常无烟环境中饲养。第15d时取模型大鼠50只,随机分为5组,每组10只。组别设置分别为:模型对照组(蒸馏水)、急支糖浆组(20ml/kg)、本发明药物组合物高剂量组(18.6g生药/kg)、中剂量组(9.3g生药/kg)、低剂量组(4.65g生药/kg)。各组大鼠均采取灌胃给药方式,急支糖浆组按20ml/kg给药容积给药,其余各组的给药容积均为10ml/kg,1次/d,连续5d。末次给药后1h,随机取8只动物的气管、支气管做病理组织学观察和透射电镜观察;股动脉取血,2500rpm室温离心20分钟,分离血清,采用Elisa法测定各指标。
1.1.1病理组织学观察与支气管炎细胞浸润病理定量测定
HE染色,显微镜下分辨气道组织结构,结果见图1;并使用BL-2000医用图像分析系统对病理切片全视野下所有支气管进行炎细胞浸润定量测定,测定结果使用积分光密度和目标面积表示,结果见表1。
1.1.2透射电镜超微结构观察结果见图2。
1.1.3本发明药物组合物对大鼠血清IL-6的影响
(1)加样:每孔各加入大鼠血清100μl,将反应板充分混匀后置37℃120分钟。(2)洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上印干。(3)每孔中加入第一抗体工作液100μl。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。(4)洗板:同前。(5)每孔加酶标抗体工作液100μl。将反应板置37℃30分钟。(6)洗板:同前。(7)每孔加入底物工作液100μl,置37℃暗处反应15分钟。(8)每孔加入100μl终止液混匀。(9)30分钟内用VARIOSKAN酶标仪在450nm处测吸光值。(10)所有OD值都应减除空白值后再行计算。(11)以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上作图,画出标准曲线。(12)根据样品OD值在该曲线图上查出相应IL-6含量。结果见表2。
1.1.4本发明药物组合物对大鼠血清IL-8的影响
(1)加样:每孔各加入大鼠血清100μl,将反应板充分混匀后置37℃120分钟。(2)洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上印干。(3)每孔中加入第一抗体工作液100μl。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。(4)洗板:同前。(5)每孔加酶标抗体工作液100μl。将反应板置37℃30分钟。(6)洗板:同前。(7)每孔加入底物工作液100μl,置37℃暗处反应15分钟。(8)每孔加入100μl终止液混匀。(9)30分钟内用VARIOSKAN酶标仪在450nm处测吸光值。(10)所有OD值都应减除空白值后再行计算。(11)以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上作图,画出标准曲线。(12)根据样品OD值在该曲线图上查出相应IL-8含量,再乘上大鼠血清稀释倍数即可。结果见表3。
1.1.5本发明药物组合物对大鼠血清TNF-α的影响
(1)加样:每孔各加入大鼠血清100μl,将反应板充分混匀后置37℃120分钟。(2)洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上印干。(3)每孔中加入第一抗体工作液100μl。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。(4)洗板:同前。(5)每孔加酶标抗体工作液100μl。将反应板置37℃30分钟。(6)洗板:同前。(7)每孔加入底物工作液100μl,置37℃暗处反应15分钟。(8)每孔加入100μl终止液混匀。(9)30分钟内用VARIOSKAN酶标仪在450nm处测吸光值。(10)所有OD值都应减除空白值后再行计算。(11)以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上作图,画出标准曲线。(12)根据样品OD值在该曲线图上查出相应TNF-α含量。结果见表4。
1.1.6本发明药物组合物对大鼠血清NF-kB的影响
(1)加样:每孔各加入标准品或待测样品(已激活)100μl,将反应板充分混匀后置37℃120分钟。(2)洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上印干。(3)每孔中加入第一抗体工作液100μl。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。(4)洗板:同前。(5)每孔加酶标抗体工作液100μl。将反应板置37℃30分钟。(6)洗板:同前。(7)每孔加入底物工作液100μl,置37℃暗处反应15分钟。(8)每孔加入100μl终止液混匀。(9)30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。(10)所有OD值都应减除空白值后再行计算。(11)以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上作图,画出标准曲线。(12)根据样品OD值在该曲线图上查出相应NF-kB的含量,再乘上大鼠血清稀释倍数即可。结果见表5。
1.1.7本发明药物组合物对大鼠血清sICAM-1的影响
(1)加样:每孔各加入标准品或待测样品100μl,将反应板充分混匀后置37℃120分钟。(2)洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上印干。(3)每孔中加入第一抗体工作液100μl。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。(4)洗板:同前。(5)每孔加酶标抗体工作液100μl。将反应板置37℃30分钟。(6)洗板:同前。(7)每孔加入底物工作液100μl,置37℃暗处反应15分钟。(8)每孔加入100μl终止液混匀。(9)30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。(10)所有OD值都应减除空白值后再行计算。(11)以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上作图,画出标准曲线。(12)根据样品OD值在该曲线图上查出相应sICAM-1含量,再乘上大鼠血清稀释倍数即可。结果见表6。
1.2实验结果
1.2.1病理组织学观察与支气管炎细胞浸润病理定量测定
由图1可知,与空白组比较,急性支气管炎模型组大鼠支气管出现大量炎细胞浸润;与模型组大鼠比较,本发明药物组合物组高、中、低剂量组大鼠支气管偶见或见少量炎细胞浸润。由表1可知,与空白组比较,急性支气管炎模型组大鼠积分光密度值、目标面积显著升高;与模型组大鼠比较,本发明药物组合物组高、中、低剂量组大鼠积分光密度值、目标面积显著降低。
表1大鼠支气管炎细胞浸润病理定量测定
注:与空白对照组比较,△P<0.05,△△P<0.01,△△△P<0.001,与模型对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
1.2.2透射电镜超微结构观察
由图2可知,与空白组比较,模型组大鼠支气管纤毛上皮线粒体肿胀;与模型组比较,本发明药物组合物高、中剂量组支气管纤毛上皮线粒体正常,低剂量组支气管纤毛上皮线粒体轻度肿胀。
1.2.3本发明药物组合物对大鼠血清IL-6的影响
由表2可知,与空白对照组比较,模型对照组能够显著升高大鼠血清中IL-6的含量;与模型对照组比较,急支糖浆、本发明药物组合物高、中剂量组均能够显著降低大鼠血清中IL-6的含量。
表2本发明药物组合物对大鼠血清IL-6的影响
注:与空白对照组比较,△P<0.05,与模型对照组比较,*P<0.05
1.2.4本发明药物组合物对大鼠血清IL-8的影响
由表3可知,与空白对照组比较,模型对照组能够显著升高大鼠血清中IL-8的含量;与模型对照组比较,本发明药物组合物高剂量组、中剂量组均能够显著降低大鼠血清中IL-8的含量。
表3本发明药物组合物对大鼠血清IL-8的影响
注:与空白对照组比较,△P<0.05,与模型对照组比较,*P<0.05
1.2.5本发明药物组合物对大鼠血清TNF-α的影响
由表4可知,与空白对照组比较,模型对照组能够显著升高大鼠血清中TNF-α的含量;与模型对照组比较,本发明药物组合物高剂量组、中剂量组、低剂量组均能够显著降低大鼠血清中TNF-α的含量。
表4本发明药物组合物对大鼠血清TNF-α的影响
注:与空白对照组比较,△P<0.05,与模型对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
1.2.6本发明药物组合物对大鼠血清NF-kB的影响
由表5可知,与空白对照组比较,模型对照组能够显著升高大鼠血清中NF-kB的含量;与模型对照组比较,急支糖浆组、本发明药物组合物高剂量组、中剂量组、低剂量组均能够显著降低大鼠血清中NF-kB的含量。
表5本发明药物组合物对大鼠血清NF-kB的影响
注:与空白对照组比较,△P<0.05,△△P<0.01,与模型对照组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001
1.2.7本发明药物组合物对大鼠血清sICAM-1的影响
由表6可知,与空白对照组比较,模型对照组能够显著升高大鼠血清中sICAM-1的含量;与模型对照组比较,急支糖浆组、本发明药物组合物高剂量组、中剂量组、低剂量组均能够显著降低大鼠血清中sICAM-1的含量。
注:与空白对照组比较,△P<0.05,△△P<0.01,△△△P<0.001,与模型对照组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001
试验例2本发明药物组合物对小鼠急性支气管炎的作用研究
2.1实验方法
将空白对照组(n=10)以外的50只小鼠置于特制的80cm×80cm×40cm的烟室中,每次用20支香烟加锯末面10g,每次混合烟熏30min,2次/d,持续15d。空白对照组则置于正常无烟环境中饲养。第15d时取模型大鼠50只,随机分为5组,每组10只。组别设置分别为:模型对照组(蒸馏水)、急支糖浆组(20ml/kg)、本发明药物组合物高剂量组(18.6g生药/kg)、中剂量组(9.3g生药/kg)、低剂量组(4.65g生药/kg)。各组小鼠均采取灌胃给药方式,急支糖浆组按20ml/kg给药容积给药,其余各组的给药容积均为10ml/kg,1次/d,连续5d。末次给药后1h,眼眶取血,2500rpm室温离心20min,分离血清,采用Elisa法测定各指标。取气管、支气管做病理组织学观察。
2.1.1病理组织学观察与支气管炎细胞浸润病理定量测定
HE染色,显微镜下分辨气道组织结构,结果见图3;并使用BL-2000医用图像分析系统对病理切片全视野下所有支气管进行炎细胞浸润定量测定,测定结果使用积分光密度和目标面积表示。结果见表7。
2.1.2本发明药物组合物对小鼠血清IL-8的影响
操作方法同大鼠,结果见表8。
2.1.3本发明药物组合物对小鼠血清TNF-α的影响
操作方法同大鼠,结果见表9。
2.2实验结果
2.2.1病理组织学观察与支气管炎细胞浸润病理定量测定
由表7可知,与空白组比较,急性支气管炎模型组小鼠支气管出现大量炎细胞浸润;与模型组小鼠比较,本发明药物组合物组高、中、低剂量组小鼠支气管偶见或见少量炎细胞浸润。由表7可知,与空白组比较,急性支气管炎模型组小鼠积分光密度值、目标面积显著升高;与模型组小鼠比较,本发明药物组合物组高、中、低剂量组小鼠积分光密度值、目标面积显著降低。
表7小鼠支气管炎细胞浸润病理定量测定
注:与空白对照组比较,△P<0.05,△△P<0.01,△△△P<0.001;与模型对照组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001
2.2.1本发明药物组合物对小鼠血清IL-8的影响
由表8可知,与空白对照组比较,模型对照组能够显著升高小鼠血清中IL-8的含量;与模型对照组比较,急支糖浆组、本发明药物组合物高剂量组、中剂量组、低剂量组均能够显著降低小鼠血清中IL-8的含量。
注:与空白对照组比较,△P<0.05,△△P<0.01,△△△P<0.001;与模型对照组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001
2.2.2本发明药物组合物对小鼠血清TNF-α的影响
由表9可知,与空白对照组比较,模型对照组能够显著升高小鼠血清中TNF-α的含量;与模型对照组比较,急支糖浆组、本发明药物组合物高、中剂量组均能够显著降低小鼠血清中TNF-α的含量。
注:与空白对照组比较,△P<0.05,△△P<0.01与模型对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
试验例3本发明药物组合物的止咳作用研究
3.1本发明药物组合物对氨水致小鼠咳嗽的影响
3.1.1实验方法
取体重20±2g的小鼠60只,随机分为6组,每组10只。分别为:空白对照组(蒸馏水);川贝枇杷颗粒组(3g/kg);复方磷酸可待因口服溶液(10ml/kg);本发明药物组合物高剂量组(18.6g生药/kg)、中剂量组(9.3g生药/kg)、低剂量组(4.65g生药/kg)。各组小鼠均采用灌胃方式进行给药,给药容积为10ml/kg,1次/d,连续3d。末次给药后30min,将小鼠置于倒置的1L玻璃烧杯中,使用1ml注射器抽取0.5ml氨水注入100mg灭菌棉球中。观察小鼠咳嗽潜伏期及2min内咳嗽次数,咳嗽以小鼠腹肌剧烈收缩、张嘴为界定标准。数据处理:实验数据均以表示,采用统计软件SPSS 15.0进行单因素方差分析。
3.1.2实验结果
由表10可知,与空白对照组相比,本发明药物组合物中、低剂量组、川贝枇杷颗粒组及复方磷酸可待因组能显著提高咳嗽潜伏期;本发明药物组合物高、中、低剂量组、川贝枇杷颗粒组及复方磷酸可待因组能显著降低2min咳嗽次数。
注:与空白对照组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001
3.2本发明药物组合物对枸橼酸喷雾致豚鼠咳嗽的影响
3.2.1实验方法
预先筛选:于实验前1日,取体重250±50g的豚鼠,雌雄兼用,置于4L容积的密闭玻璃钟罩内,使用980-A型超声雾化器喷入预先配置好的17.5%枸橼酸,以最大喷雾量喷雾10秒,记录5min内豚鼠的咳嗽次数,咳嗽次数小于10次者弃除。
正式实验:取通过初筛的豚鼠42只,随机分为6组,每组7只。分别为:空白对照组(蒸馏水);川贝枇杷颗粒组(3g/kg);复方磷酸可待因口服溶液(10ml/kg);本发明药物组合物高剂量(18.6g生药/kg)组、中剂量(9.3g生药/kg)组、低剂量(4.65g生药/kg)组,各组动物均采用灌胃给药方式,给药容积为10ml/kg,1次/day,连续5d。末次给药后30min,将豚鼠置于4L容积的玻璃钟罩内,使用980-A型超声雾化器喷入预先配置好的17.5%枸橼酸,以最大喷雾量喷雾10秒,记录5min内豚鼠的咳嗽次数及咳嗽潜伏期。豚鼠的咳嗽声响亮,以听到咳嗽声为计算标准。数据处理:实验数据均以表示,采用统计软件SPSS 15.0进行单因素方差分析。
3.2.2实验结果
由表11可知,与空白对照组相比,本发明药物组合物高、中、低剂量组、川贝枇杷颗粒组及复方磷酸可待因组均能显著降低枸橼酸致豚鼠5min内的咳嗽次数;且本发明药物组合物高、中、低剂量组能够显著提高咳嗽潜伏期。
注:与空白对照组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001
3.3本发明药物组合物对辣椒素喷雾致豚鼠咳嗽的影响
3.3.1实验方法
3.3.1.1本发明药物组合物对辣椒素喷雾致豚鼠咳嗽次数的影响
预先筛选:于实验前1日,取体重250±50g的豚鼠,雌雄兼用,置于4L容积的密闭玻璃钟罩内,使用980-A型超声雾化器喷入预先配置好的30μmol辣椒素,以0.7ml/min喷雾量持续喷雾40s,记录5min内豚鼠的咳嗽次数,咳嗽次数小于10者弃除。
正式实验:取通过初筛的豚鼠48只,随机分为6组,每组8只。分别为:空白对照组(蒸馏水);川贝枇杷颗粒组(3g/kg);复方磷酸可待因口服溶液(10ml/kg);本发明药物组合物高剂量(18.6g生药/kg)组、中剂量(9.3g生药/kg)组、低剂量(4.65g生药/kg)组。各组动物均采用灌胃给药方式,给药容积为10ml/kg,1次/d,连续5d。末次给药后30min,将豚鼠置于4L容积的玻璃钟罩内,使用980-A型超声雾化器喷入预先配置好的30μmol辣椒素,以0.7ml/min喷雾量持续喷雾40s,记录5min内豚鼠的咳嗽次数。豚鼠的咳嗽声响亮,以听到咳嗽声为计算标准。
3.3.1.2本发明药物组合物对辣椒素喷雾致豚鼠血清P物质含量的影响
将豚鼠测定咳嗽次数后,增设同批次空白对照组(n=6,非辣椒素喷雾),再从辣椒素止咳实验组中各组随机选取6只豚鼠,股动脉取血,将血液在室温状态自然凝固10-20分钟,转速2500转/分,离心20分钟。仔细收集上清液在450nm波长用酶标仪测定分光光度值,并根据标准曲线计算结果。操作方法如下:
(1)标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10孔,在第一、第二孔中分别加标准品100μl,然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl,混匀;然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl,混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉,再各取50μl分别加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀;混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl,浓度分别为600ng/L,400ng/L,200ng/L,100ng/L,50ng/L)。(2)加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。(3)温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。(4)配液:将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。(5)洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。(6)加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。(7)温育:操作同3。(8)洗涤:操作同5。(9)显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟.(10)终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。(11)测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
3.3.1.3本发明药物组合物对辣椒素喷雾致豚鼠支气管肺泡灌洗液中P物质含量的影响
将豚鼠取血后,立即用冰蒸馏水进行支气管肺泡灌洗3次,每次4ml,收集支气管肺泡灌洗液,2500转/分离心20分钟,取上清液在450nm波长用酶标仪测定分光光度值,并根据标准曲线计算结果。操作方法同3.3.1.2。
3.3.2实验结果
3.3.2.1本发明药物组合物对辣椒素喷雾致豚鼠咳嗽次数的影响
由表12可知,与空白对照组相比,本发明药物组合物高、中、低剂量组、川贝枇杷颗粒组及复方磷酸可待因组均能非常显著降低辣椒素致豚鼠5min内的咳嗽次数。
注:与空白对照组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001
3.3.2.2本发明药物组合物对辣椒素喷雾致豚鼠血清P物质含量的影响
由表13可知,与空白对照组相比,模型对照组能够显著升高豚鼠血清中P物质含量;与模型对照组比较,复方磷酸可待因组、川贝枇杷颗粒组、本发明药物组合物高、中、低剂量组均能显著降低豚鼠血清中P物质含量。
注:与空白对照组相比,△P<0.05,△△P<0.01与模型对照组相比,*P<0.05,**P<0.01
3.3.2.3对辣椒素喷雾致豚鼠支气管肺泡灌洗液中P物质含量的影响
由表14可知,与空白对照组相比,模型对照组能够显著升高豚鼠支气管肺泡灌洗液中P物质含量;与模型对照组比较,川贝枇杷颗粒组、本发明药物组合物中、低剂量组均能显著降低豚鼠支气管肺泡灌洗液中P物质含量。
注:与空白对照组相比,△P<0.05与模型对照组相比,*P<0.05
试验例4本发明药物组合物的平喘作用研究
4.1本发明药物组合物对磷酸组胺乙酰胆碱混合喷雾致豚鼠哮喘的影响
4.1.1实验方法
预先筛选:于实验前1日,取体重250±50g的豚鼠,置于4L容积的玻璃钟罩内,使用980-A型超声雾化器喷入预先配置好的混合喷雾溶液(0.1%磷酸组胺和2%氯化乙酰胆碱),雾化速率为1ml/min,喷雾时间25s。观察记录自喷雾开始至动物出现呼吸困难,抽搐跌倒的时间,即为引喘潜伏期,引喘潜伏期大于180s的弃除。
正式实验:取通过筛选的的豚鼠48只,随机分为6组,每组8只。分别为:空白对照组(蒸馏水);氨茶碱组(0.07g/kg);川贝枇杷颗粒组(3g/kg);本发明药物组合物高剂量组(18.6g生药/kg)、中剂量组(9.3g生药/kg)、低剂量组(4.65g生药/kg)。各组动物均采用灌胃给药方式,给药容积为10ml/kg,1次/d,连续5d。末次给药后30min,将豚鼠置于4L容积的玻璃钟罩内,置于4L容积的玻璃钟罩内,预先配置好的混合喷雾溶液(0.1%磷酸组胺和2%氯化乙酰胆碱),雾化速率为1ml/min,喷雾时间25s,观察记录自喷雾开始至动物出现呼吸困难,抽搐跌倒的时间,即为引喘潜伏期。数据处理:实验数据均以表示,采用统计软件SPSS 15.0进行单因素方差分析。
4.1.2实验结果
由表15可知,与空白对照组比较,本发明药物组合物高、中剂量组及氨茶碱组均能显著提高引喘潜伏期。
注:与空白对照组相比,*P<0.05,**P<0.01
4.2本发明药物组合物对豚鼠离体气管螺旋条的影响
4.2.1实验方法
取体重250±50g的豚鼠,将其击头致死后迅速剖开颈至胸部皮肤及皮下组织,小心分离出气管,自甲状软骨下面至气管分叉处剪下完整气管段,浸入5%CO2和95%O2混合的Krebs-Henseleit试液中,轻柔地除去气管周围疏松结缔组织和脂肪后,剪成约3mm×20mm的气管螺旋条。气管条两端用细线结扎,将其放入装有20ml Krebs-Henseleit试液的气管浴槽中,并持续通入5%CO2和95%O2混合气体。细线的一端靠近浴槽底部结扎,另一端附着在张力换能器上,用BL-420F型多道生物信号采集处理系统记录实验过程中张力的变化。每15min换1次Krebs-Henseleit试液,孵育1h后,加入氯化乙酰胆碱(终浓度为1×10-7g/ml)0.2ml,气管平滑肌张力收缩出现平台后,用Krebs-Henseleit试液冲洗2次,直至气管平滑肌张力出现最大收缩。反复此操作2-3次,使气管达到最大与收缩程度。
用Krebs-Henseleit试液冲洗气管,平衡5min后,加入氯化乙酰胆碱(终浓度为1×10-7g/m1)0.2ml,观察记录标本5min后曲线平均张力,加入生理盐水0.2ml,再次记录标本5min后曲线平均张力,用Krebs-Henseleit试液冲洗2次。按上述方法依次分别加入川贝枇杷颗粒0.2ml(终浓度为0.00007g/ml)、本发明药物组合物高剂量组0.2ml(终浓度为0.0186g/ml)、本发明药物组合物中剂量组0.2ml(终浓度为0.0093g/ml)、本发明药物组合物低剂量组0.2ml(终浓度为0.00465g/ml)。计算解痉百分率,解痉百分率=(给药前张力-给药后张力)/给药前张力×100%。数据处理:实验数据均以表示,采用统计软件SPSS 15.0进行单因素方差分析。
4.2.2实验结果
由表16可知,与空白对照组相比,本发明药物组合物高、中、低剂量组、氨茶碱组均能显著降低氯化乙酰胆碱(终浓度1×10-7g/ml)引起的离体豚鼠气管螺旋条的收缩张力。
注:与空白对照组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001
试验例5本发明药物组合物的化痰作用研究
5.1本发明药物组合物对小鼠酚红排泌的影响
5.1.1实验方法
酚红标准曲线绘制:于电子分析天平称取酚红1.95mg,加5%NaHCO3至3.9ml溶解,含酚红量0.5mg/ml,作为原液。取原液0.1ml加5%NaHCO33.9ml溶解,得到浓度为12.5μg/ml。并依次将其稀释到10μg/ml、5μg/ml、3μg/ml、1μg/ml、0.7μg/ml、0.3μg/ml、0.1μg/ml。使用紫外/可见光分光光度计(UVmini.1240,SHIMADZU)于546nm处测OD值,绘制标准曲线。
取体重20±2g的KM小鼠84只(实验前禁食16小时,不禁水),随机分为6组,每组14只。分别为:空白对照组(蒸馏水);川贝枇杷颗粒组(3g/kg);盐酸溴己新(9.6mg/kg);本发明药物组合物高剂量(18.6g生药/kg)组、中剂量(9.3g生药/kg)组、低剂量(4.65g生药/kg)组。各组均采取灌胃给药方式,给药容积为10ml/kg,1次/d,连续3d。末次给药后30min,于腹腔注射5%酚红生理盐水溶液0.1ml/10g,注射后30min脱颈处死。剪开颈部皮肤,分离气管、气管插管并与注射器相连,用5%NaHCO30.8ml,缓慢注入气管内,然后轻轻吸出,如此反复3次,合并3次灌洗液,放置一定时间使杂质沉淀,得到的透明红色上清液,使用紫外/可见光分光光度计(UVmini.1240,SHIMADZU)于546nm处测OD值。根据标准曲线计算酚红含量(μg/ml)。数据处理:实验数据均以表示,采用统计软件SPSS 15.0进行单因素方差分析。
5.1.2实验结果
由表17可知,与空白对照组相比较,本发明药物组合物中、低剂量组、川贝枇杷颗粒组及盐酸溴己新组均能显著促进小鼠酚红排泌。
注:与空白对照组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001
5.2本发明药物组合物对大鼠痰液量的影响
5.2.1实验方法
取体重200±20g的SD大鼠60只(实验前禁食16小时,不禁水),随机分为6组,每组10只。分别为:空白对照组(蒸馏水);川贝枇杷颗粒组(3g/kg);盐酸溴己新(5.6mg/kg);本发明药物组合物高剂量(18.6g生药/kg)组、中剂量(9.3g生药/kg)组、低剂量(4.65g生药/kg)组。各组动物均采用灌胃给药方式,给药容积为10ml/kg,1次/d,连续5d。末次给药1h后,20%乌来糖0.5ml/100g腹腔注射麻醉后,大鼠仰位固定,剪开颈中部皮肤,暴露并分离气管,在甲状软骨下缘正中处,两软骨环之间用尖锐的注射针头扎一小孔,插入毛细玻管(内径0.5mm,管长100mm)一根,使毛细玻管刚好接触气管底部,借以吸取气管后部之痰液,并开始计时。当毛细玻管被分泌液充满时,立即更换一根,2h后,取出毛细玻管,用游标卡尺测定痰液长度。以痰液长度作为评价祛痰效果的指标。
5.2.2实验结果
由表18可知,与空白对照组比较,本发明药物组合物高、中、低剂量组、川贝枇杷颗粒组及盐酸溴己新组均能显著促进大鼠毛细玻管排痰。
注:与空白对照组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001
5.3HPLC法测定支气管肺泡灌洗液中肺泡表面活性物质(DPPC)的含量
5.3.1实验方法
取体重200±20g的SD大鼠24只(实验前禁食16小时,不禁水),随机分为6组,每组4只。分别为:空白对照组(蒸馏水);川贝枇杷颗粒组(3g/kg);盐酸溴己新(0.0019g/kg);本发明药物组合物高剂量(18.6g生药/kg)组、中剂量(9.3g生药/kg)组、低剂量(4.65g生药/kg)。各组动物均采用灌胃给药方式,给药容积为10ml/kg,1次/d,连续5d。末次给药1h后,20%乌来糖0.5ml/100g腹腔注射麻醉后,取支气管肺泡灌洗液,采用支气管肺泡灌洗液中磷脂的提取方法提取磷脂类成分。HPLC定量测定支气管肺泡灌洗液中肺泡表面活性物质(DPPC)的含量
5.3.2实验结果
由表19可知,与空白对照组比较,本发明药物组合物高、中、低剂量组及盐酸溴己新组均能不同程度地提高大鼠肺泡表面活性物质(DPPC)的含量,但差异不显著(p>0.05)。
与空白对照组相比,*P<0.05
试验例6本发明药物组合物的抗菌作用的研究
6.1本发明药物组合物的体外抗菌作用的研究
6.1.1菌株CMCC(B)26003金黄色葡萄球菌、CMCC(B)44102大肠埃希氏菌、ATCC25923金黄色葡萄球菌、ATCC25922大肠埃希氏菌。
6.1.2实验方法
6.1.2.1含药平板的制备
采用倍比稀释法用无菌水对本发明药物组合物流浸膏(3.12g生药/ml)进行倍比稀释,将药物分别稀释成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128共7个梯度。在一次性无菌培养皿中分别加入原药以及不同浓度梯度的稀释药液1ml和14ml灭菌的MH培养基,充分混匀,烘干后备用。以平板内加入1ml蒸馏水代替药物制备阳性对照平板。
6.1.2.2菌液调制
将菌液复活培养至对数生长期的实验菌株用无菌蒸馏水调至菌液浓度1.5×106CFU/ml备用。
6.1.2.3体外抑菌活性测定
采用多点接种仪将受试菌株的菌液5μL加入不同浓度梯度的含药平板和阳性对照平板,并以5μl蒸馏水代替菌液作阴性对照。37℃恒温培养18~24h后观察各菌株在不同浓度梯度药物中的生长情况。在阴性和阳性对照成立的条件下,以平板内无细菌生长的药物最小浓度为此药对该菌株的最低抑菌浓度(MIC)。
6.1.3实验结果实验结果表20。
表20实验菌株的种类、数量及最小抑菌浓度
备注:1)芽孢杆菌属包括3株矮小芽孢杆菌,3株蜡样芽胞杆菌和2株弯曲芽孢杆菌;2)单胞菌属包括3株少动鞘氨醇单胞菌及铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌各1株;3)其它为豚鼠气单菌;4)1-8代表药物的不同浓度,从高到底浓度依次为原药浓度(3.12g/ml)的1/15,1/30,1/60,1/120,1/240,1/480,1/960,1/1920,0代表在药物最大浓度时没有抑菌作用。
6.2本发明药物组合物的体内抗菌作用的研究
6.2.1实验方法
6.2.1.1菌液最小致死量(MLD)的测定
菌株:CMCC(B)26003金黄色葡萄球菌、CMCC(B)44102大肠埃希氏菌、ATCC25923金黄色葡萄球菌、ATCC25922大肠埃希氏菌。
复活金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌并培养至对数生长期,采用2倍稀释法用蒸馏水分别对其进行稀释。取不同浓度梯度的菌液1g与10%胃膜素1g混合,配置成以下浓度的菌液(0.5/512MCF、0.5/256MCF、0.5/128MCF、0.5/64MCF、0.5/32MCF、0.5/16MCF、0.5/8MCF、0.5/4MCF、0.5/2MCF、0.5MCF、1MCF、2MCF、3MCF、4MCF、5MCF、6MCF、8MCF、12MCF、16MCF、20MCF、24MCF、28MCF、32MCF)
按0.5ml/20g的菌液量腹腔注射SPF小鼠,并以5%胃膜素做对照。在对照小鼠不死亡的前提下,记录攻毒小鼠24~48h内的死亡率,测定SPF小鼠全部死亡的最低细菌量,即该菌液的MLD。
6.2.1.2体内抗菌活性的测定
取20±2g SPF级小鼠,雌雄各半,随机分为16组(每个菌8组),每组12只。分别为:空白对照组(蒸馏水组,不给药也不攻毒);胃膜素组(不含细菌的5%胃膜素为胃膜素对照组,不攻毒);模型组;川贝枇杷颗粒组(3g/kg);头孢拉定胶囊(革兰氏阳性菌对照组,0.4g/kg);阿莫西林克拉维酸甲片(革兰氏阴性菌对照组,0.1875g/kg);本发明药物组合物低剂量(4.65g生药/kg)、中剂量(9.3g生药//kg)、高剂量(18.6g生药//kg)组。各组动物均采用灌胃给药方式,1次/d,连续10d,并在第10d给药的同时进行攻毒。观察小鼠攻毒后7d内的存活情况,统计其存活率。
6.2.2实验结果
6.2.2.1菌液最小致死量(MLD)的测定
通过预实验我们发现金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌MLD分别为20MCF、0.5/64MCF,见表21、表22。
表21金黄色葡萄球菌MLD的测定
表22大肠埃希菌MLD的测定
6.2.2.2体内抗菌活性的测定
6.2.2.2.1体内抗菌活性测定(金黄色葡萄球菌)
由表23可知,本发明药物组合物高、中、低剂量组的存活率分别为33.33%、41.67%、25%。
表23本发明药物组合物体内抗菌活性测定(金黄色葡萄球菌)
6.2.2.2.2体内抗菌活性测定(大肠埃希菌)
由表24可知,本发明药物组合物高、中、低剂量组的存活率分别为58.33%、58.33%、41.67%。
表24本发明药物组合物体内抗菌活性测定(大肠埃希菌)
试验例7本发明药物组合物的抗炎作用的研究
7.1本发明药物组合物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响
7.1.1实验方法
取体重20±2g的雄性小鼠60只,随机分为6组,每组10只。分别为:空白对照组(蒸馏水);醋酸泼尼松组(12mg/kg);川贝枇杷颗粒组(3g/kg);本发明药物组合物高剂量(18.6g生药/kg)组、中剂量(9.3g生药/kg)组、低剂量(4.65g生药/kg)组。各组均采取灌胃给药方式,给药容积为10ml/kg,1次/d,连续3d。末次给药后30min,使用微量加样枪于小鼠右耳正反两面各均匀涂抹二甲苯溶液25μl,30min后脱颈处死,剪下双耳,使用直径为8mm的不锈钢冲子,冲下左右耳片,于电子天平称重。以左右两侧耳片重量差作为肿胀程度的指标,抗炎作用强度使用肿胀度(mg)和肿胀抑制率(%)表示。
7.1.2实验结果
由表25可见,与空白对照组相比,本发明药物组合物高、中、低剂量组、及醋酸泼尼松组均能显著抑制二甲苯引起小鼠耳廓肿胀的作用。表明其本发明药物组合物高、中、低剂量组对急性炎症有明显的抗炎作用。
注:与空白对照组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001
7.2本发明药物组合物对蛋清致大鼠足跖肿胀的影响
7.2.1实验方法
取体重200±20g的雄性SD大鼠60只,随机分为6组,每组10只。分别为:空白对照组(蒸馏水);醋酸泼尼松组(7mg/kg);川贝枇杷颗粒组(3g/kg);本发明药物组合物高剂量(18.6g生药/kg)组、中剂量(9.3g生药/kg)组、低剂量(4.65g生药/kg)组。各组动物均采用灌胃给药方式,给药容积为10ml/kg,1次/d,连续5d。末次给药30min后,于每只大鼠右后足跖皮下注射10%蛋清(0.1ml/只)。测量注入致炎剂10%蛋清后0.5h、1h、2h、4h、6h各时间点右后足体积,并减去致炎前大鼠右后足正常体积,作为各大鼠在不同时间点的足肿胀度。
7.2.2实验结果
由表26可见,本发明药物组合物高、中、低剂量组,醋酸泼尼松组均能显著抑制新鲜鸡蛋清所致大鼠足跖肿胀的作用。
表26本发明药物组合物对10%新鲜鸡蛋清所致大鼠足跖肿胀影响
注:与空白对照组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001
7.3本发明药物组合物对小鼠棉球肉芽肿的的影响
7.3.1实验方法
取体重20±2g的雄性KM小鼠72只,使用20%乌来糖进行腹腔注射麻醉,在无菌条件下,切开腹部皮肤,将10±2mg的无菌棉球植入小鼠右侧腋窝。于手术后第2日,将小鼠随机分为6组,每组12只。分别为:空白对照组(蒸馏水);醋酸泼尼松组(12mg/kg);川贝枇杷颗粒组(3g/kg);本发明药物组合物高剂量组(18.6g生药/kg)、中剂量组(9.3g生药/kg)、低剂量组(4.65g生药/kg)。各组动物均采用灌胃给药方式,给药容积为10ml/kg,1次/d,连续7d。末次给药后1h,将小鼠脱颈椎处死,取出棉球肉芽肿,置于70℃烘箱12小时,此时的棉球肉芽肿重量减去原棉球重量即得到肉芽肿干重。数据处理:实验数据均以表示,采用统计软件SPSS 15.0进行单因素方差分析。
7.3.2实验结果
由表27可知,与空白对照组比较,本发明药物组合物高、中、低剂量组、川贝枇杷颗粒组及醋酸泼尼松组均能显著抑制肉芽组织增生,提示其对亚急性炎症有显著的抗炎作用。
注:与空白对照组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001
综上所述,本发明药物组合物能够明显改善急性支气管炎模型大鼠及小鼠支气管的病理状态;下调大鼠血清中升高的IL-6、IL-8、TNF-α、NF-kB、sICAM-1,下调小鼠血清中升高的IL-8及TNF-α;其止咳、化痰、平喘、抗菌、抗炎药效良好,表明本发明药物组合物对急性支气管炎具有明显的治疗作用。其中,本发明药物组合物在中剂量时就能发挥显著的治疗作用,其作用效果与高剂量相当,有的甚至优于高剂量,因此,按照动物与人用药物剂量的换算标准,即可将动物实验的中剂量换算得出每日人用最佳剂量为:以生药量计为0.9g/Kg。
Claims (10)
1.一种治疗支气管炎的药物组合物,其特征在于:它是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂:
川贝母12-18份、紫菀9.6-14.4份、甘草4-6份、陈皮7.2-10.8份、百部16-24份、白前7.2-10.8份、桔梗7.2-10.8份、荆芥7.2-10.8份、苦杏仁9.6-14.4份、黄芩9.6-14.4份。
2.根据权利要求1所述的药物组合物,其特征在于:它是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂:
川贝母15份、紫菀12份、甘草5份、陈皮9份、百部20份、白前9份、桔梗9份、荆芥9份、苦杏仁12份、黄芩12份。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物,其特征在于:所述的制剂是由原料药的水或有机溶剂提取物为活性成分,加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的药物组合物,其特征在于:所述的制剂为口服制剂。
5.根据权利要求4所述的药物组合物,其特征在于:所述的制剂为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸或口服液。
6.根据权利要求1-5任意所述的药物组合物,其特征在于:所述的制剂中,每日用单位制剂中有效成分的含量以生药计为0.9g/Kg。
7.权利要求1-6任意一项所述的药物组合物的制备方法,其特征在于:具体方法如下:
(1)按重量配比取原料药;
(2)取紫菀、陈皮、黄芩、白前、荆芥、苦杏仁、甘草七味原料药,加水煎煮1-3次,每次0.5-3h,过滤,合并滤液,浓缩,浓缩液醇沉后,静置,滤过,浓缩滤液得浓缩液A;
(3)取川贝母粗粉,以60-95%乙醇浸渍,渗漉,将渗漉液浓缩得浓缩液B;
(4)取川贝母渗漉后的药渣与桔梗、百部粗粉一起加水温浸1-4次,过滤,浓缩滤液得浓缩液C;
(5)取浓缩液A、B、C,合并后,加入药学上常用的辅料制备成制剂。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于:
步骤(2)中,加水煎煮2-3次,每次1-2h;浓缩液用乙醇调至含醇量达到50%以上,进行醇沉;
步骤(3)中,以70-80%乙醇浸渍16-24h后,渗漉;
步骤(4)中,加水温浸2-3次,每次1-2h,温度控制在70-95℃。
9.权利要求1-5任意一项所述的药物组合物在制备治疗支气管炎的药物中的用途。
10.权利要求1-5任意一项所述的药物组合物在制备镇咳、祛痰、平喘、抗炎或抗菌药物中的用途。
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